Summary
Denne protokol giver en enkel, omkostningseffektiv DNA-isoleringsmetode til analyse af murine tarmmikrobiotaændringer under udviklingen af autoimmun sygdom.
Abstract
Tarmmikrobiota har en vigtig rolle i uddannelsen af immunsystemet. Dette forhold er ekstremt vigtigt for at forstå autoimmune sygdomme, der ikke kun er drevet af genetiske faktorer, men også miljømæssige faktorer, der kan udløse begyndelsen og / eller forværre sygdomsforløbet. En tidligere offentliggjort undersøgelse af dynamikken i tarmmikrobiotaen i lupus-tilbøjelige MRL / lpr-hunmus viste, hvordan ændringer i tarmmikrobiotaen kan ændre sygdomsprogression. Her beskrives en protokol til ekstraktion af repræsentative prøver fra tarmmikrobiotaen til undersøgelser af autoimmunitet. Mikrobiotaprøver indsamles fra anus og behandles, hvorfra DNA'et ekstraheres ved hjælp af en phenol-chloroformmetode og renses ved alkoholudfældning. Efter at PCR er udført, sekventeres rensede ampliconer ved hjælp af en Next Generation Sequencing platform på Argonne National Laboratory. Endelig analyseres 16S ribosomale RNA-gensekventeringsdata. Som et eksempel vises data opnået fra tarmmikrobiotasammenligninger af MRL / lpr-mus med eller uden CX3CR1. Resultaterne viste signifikante forskelle i slægter, der indeholder patogene bakterier, såsom dem i phylum Proteobacteria, såvel som slægten Bifidobacterium, som betragtes som en del af den sunde kommensale mikrobiota. Sammenfattende er denne enkle, omkostningseffektive DNA-isoleringsmetode pålidelig og kan hjælpe undersøgelsen af tarmmikrobiotaændringer forbundet med autoimmune sygdomme.
Introduction
Mennesker og bakterier har eksisteret sammen i lang tid. De har etableret et medafhængigt forhold med gensidige gavnlige virkninger, der påvirker værtsimmunresponser på kvantitative og kvalitative måder1. Nylige undersøgelser tyder på en sammenhæng mellem tarmmikrobiotasammensætningen og patogenesen af autoimmune sygdomme, der omfatter multipel sklerose 2, reumatoid arthritis3, type2-diabetes 4, inflammatorisk tarmsygdom5 og systemisk lupus erythematosus (SLE)6. Men om tarmmikrobiotaen er hovedårsagen eller en sekundær effekt af disse autoimmune sygdomme, er stadig uklart7. Potentielt kan tarmmikrobiota forværre sygdommen i effektorfasen af autoimmune lidelser eller spille en rolle i reguleringen af induktionen af disse sygdomme8.
Intestinal dysbiose er blevet rapporteret hos kvindelige lupus-tilbøjelige MRL / Mp-Faslpr (MRL / lpr) mus, og tarmmikrobiota ændringer med en signifikant udtømning af Lactobaciller blev observeret9. Når en blanding af fem Lactobacillus stammer blev oralt administreret, lupus-lignende symptomer blev stort set svækket i disse mus, tyder på en væsentlig rolle mikrobiota i regulering af SLE patogenese.
Følgende teknik til DNA-ekstraktion gør det muligt at følge mikrobiota-udsving og analysere dem kvalitativt og kvantitativt i løbet af murine SLE-lignende sygdom hos lupus-udsatte mus. Uanset om man skal undersøge den sunde tarmmikrobiota eller definere dysbiose, er det vigtigt at kritisk undersøge, hvordan data indsamles, og om de er nøjagtige og reproducerbare10. Hvert trin er kritisk i denne proces. Der skal anvendes en passende metode til at ekstrahere mikrobielt DNA, da ethvert muligt problem, der introducerer bias under DNA-ekstraktionsprocessen, kan resultere i unøjagtig mikrobiel repræsentation. Mens phenol-chloroformmetoden er beskrevet her, er der kommercielt tilgængelige kits til at ekstrahere DNA fra bakterier, der fungerer godt i særlige tilfælde11. Imidlertid er deres anvendelighed begrænset af omkostningerne og den krævede prøvemængde.
Protokollen, der præsenteres her, er omkostningseffektiv og kræver kun en lille mængde prøve. Det fungerer fint med enhver form for afføringsprøve og er nyttig til at studere dynamikken i tarmmikrobiotaen over tid samt sammenligninger mellem grupper. DNA isoleres med en metode til alkoholrensning, der bruger phenol, chloroform og isoamylalkohol. Alkoholbaseret ekstraktion hjælper med at rense og fjerne prøven af proteiner og lipider, hvor DNA udfældes i det sidste trin. Den foreslåede metode har betydeligt høj effektivitet og kvalitet og har vist sig at være nøjagtig til identifikation af bakteriepopulationer. En kritisk bemærkning under proceduren er, at DNA-kontaminering kan forekomme, og derfor kræves passende prøvehåndtering12.
DNA'et analyseres derefter af Next Generation Sequencing-platformene for 16S rRNA-genet, såsom Illumina MiSeq. Især analyseres V4 hypervariable region for at give en bedre kvantificering for højtrangerede taxa13. Den efterfølgende bioinformatikanalyse outsources efterfulgt af intern analyse ved hjælp af statistiske standardmetoder. Der er adskillige open source bioinformatiksoftwareprogrammer til rådighed til downstream-sekventering, og den type analyser, der udføres, afhænger i høj grad af det specifikke biologiske spørgsmål af interesse14. Denne protokol fokuserer specifikt på de eksperimentelle trin før sekventering og giver en mere alsidig, omkostningseffektiv, sammenlignelig og effektiv metode til at opnå DNA fra fækale prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cx3cr1 gfp/gfp-locus af B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J-mus blev tilbagekrydset til MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) i 10 generationer for at generere MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfp-mus. Genom screening ved hjælp af enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP) paneler bekræftede, at den genetiske baggrund for nygenererede mus var mere end 97% identisk med MRL / lpr. Derefter blev mus opdrættet og vedligeholdt i et specifikt patogenfrit miljø efter de specifikke krav fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Virginia Tech. Prøver blev indsamlet, da musene var 13, 14 og 15 uger gamle.
1. Indsamling af mikrobiotaprøver fra mus
- Tag hver mus individuelt ud af buret. Saml en fækal pellet direkte fra anus og opbevar den ved -80 ° C, indtil den behandles. Behandl prøverne med sterile og rene tang, rør og handsker.
BEMÆRK: En beholder (f.eks. et bægerglas) kan bruges til at placere musen, mens du venter på fækalprøven. Rengør beholderen med ethanol før og efter hver mus. - Tilsæt en frossen pellet til et forvejet 2 ml skruelågsrør. Optag fækalvægten i gram, som skal være mellem 0,02-0,05 g pr. Fækal pellet.
- Tilsæt pelleten et tyndt lag 0,1 mm glasperler, 500 μL lysisbuffer (50 mM NaCl, 5 mM Tris og 50 mM EDTA) og 200 μL 20% SDS.
- Bead-beat røret i 4 min i en homogenisator (ved maksimal effekt), efterfulgt af 3-5 min hvirvel.
- Drej i kort tid for at fjerne boblerne og skummet (tryk på knappen på centrifugen, indtil den når 1.000-1.200 x g, og slip derefter).
2. DNA-ekstraktion
- Overfør 350 μL supernatant opnået i trin 1.5 (sørg for ikke at bære snavs) til et nyt 1,5 ml snaphætterør. Der tilsættes 500 μL phenol-chloroform-isoamylalkohol (PCI; 25:24:1, v/v) og hvirvel i 1 min.
BEMÆRK: Fra nu af skal prøver håndteres inde i en kemisk hætte. PCI er giftigt. - Spin ved 6.000 x g i 3 minutter ved 4 °C. Overfør 180 μL af den vandige fase (øverste lag) til et nyt 1,5 ml snaphætterør. Tilsæt 180 μL (1:1) chloroform, inverter og bland.
BEMÆRK: Minimer forurening fra bundlaget ved overførsel af det øverste lag. - Centrifugering ved 18.400 x g i 3 minutter ved 4 °C. Overfør 180 μL af den vandige fase til et nyt snaphætterør.
BEMÆRK: Efter kassation af PCI og chloroform kan følgende trin udføres i et biologisk sikkerhedsskab. - Tilsæt 180 μL kold isopropanol og 36 μL 5MNH4Ac. Vend et par gange for at blande, og læg røret på is i 20 min.
- Spin ved 18.400 x g i 20 minutter ved 4 °C. Hæld for at kassere supernatanten. Vask pelleten flere gange med 500 μL kold 70% ethanol, mens den inverteres.
BEMÆRK: Ethanol skal fortyndes med dobbelt deioniseret sterilt vand. - Centrifugering ved 18.400 x g i 3 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten for at fjerne resterende ethanol.
- Lufttør røret på hovedet på silkepapir i 20 minutter, indtil pelleten bliver klar. Pelleten ophænges i 50 μL vand af molekylær kvalitet. Væsken opvarmes ved 37 °C i 10 minutter for at opløse store DNA-pellets helt.
- Spin rør efter opvarmning for at genvinde kondensdråber på låget (3.400 x g i 1 min).
- Koncentrationen måles, og forholdet 260/280 opnås ved hjælp af et spektrofotometer. Brug vand af molekylær kvalitet som et emne. DNA af god kvalitet skal have 260/280-forhold på mellem 1,8 og 2.
BEMÆRK: Forventet DNA-udbytte er mindst 0,03 g pr. fækal pellet.
3. Prøveforberedelse til 16S rRNA-gensekventering
- Send DNA-prøverne til Argonne National Laboratory, hvor de gennemgår biblioteksforberedelse og sekventeres på Illumina Miseq.
- Send prøver i fuldt skørt 96-brøndplader med prøver arrangeret i rækker (A1-A12, B1-B12 osv.) og forseglet med foliepladeforseglinger.
- Der sendes et slutvolumen på 20 μL pr. prøve pr. boring, der varierer i koncentration fra 1-50 ng/μL.
BEMÆRK: Fortyndinger skal udføres med vand af molekylær kvalitet. - Efter klargøring af prøverne drejes ved 600 x g i 1 minut ved stuetemperatur, inden prøverne fryses ved -80 °C i 24 timer.
- Send natten over på tøris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne fra Argonne National Laboratory analyseres af en kvalificeret bioinformatiker efterfulgt af en intern analyse af dataene ved hjælp af standard statistiske metoder. Typiske mikrobiomanalyser involverer klyngedannelse af lignende sekvenser i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) eller ampliconsekvensvarianter (ASV'er) som en proxy for forskellige mikroorganismer i en prøve. Tællinger af OTU'er eller ASV'er på tværs af prøver kan derefter bruges til at teste for ændringer i diversitet inden for prøven (alfa) og mellem prøver (beta). De kan også bruges til at teste for taxa, der er forskelligt rigelige på tværs af metadatakategorier af interesse.
Som vist i figur 1 har musestammen, der mangler receptoren CX3CR1, en anden tarmmikrobiotasammensætning. Sammenlignet med vildtype MRL/lpr viser MRL/lpr-CX 3CR1 gfp/gfp-mus (der udtrykker det grønne fluorescerende protein i stedet for CX3CR1) signifikante forskelle i visse slægter, der er relevante for potentielt patogene bakterier, såsom dem i phylum Proteobacteria. Derudover blev nogle forskelle noteret for "sunde" kommensale bakterier såsom Bifidobacterium, men ikke Lactobacillus.
Figur 1: Sammenligninger af tarmmikrobiota på slægtsniveau for MRL/lpr- og MRL/lpr-CX3CR1-mus. Forekomsten af forskellige slægter ved 13, 14 og 15 ugers alderen (n = 5 hunmus pr. gruppe). Tovejs ANOVA blev udført. Ingen betydning ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Balanceret tarmmikrobiota kan beskytte menneskekroppen mod sygdomme. Når denne balance forstyrres af eksterne eller interne udløsere, kan konsekvenserne være ødelæggende. Denne metode præsenterer en måde at analysere dynamikken i tarmmikrobiota i murinemodeller. Metoden er ikke kun egnet til sammenligninger mellem grupper, men også til at spore tarmmikrobiotaen over tid for bedre at identificere tidsafhængige faktorer, der forstyrrer tarmmikrobiotaen.
Alle musene i forsøget skal håndteres i samme miljø. Et væsentligt spørgsmål at overveje, når man indsamler fækale prøver, er at være i overensstemmelse med tid, dag og sted. Mus er coprophagic. Det betyder, at de spiser deres afføring eller dem omkring dem for at få vigtige næringsstoffer. Derfor kan afføring ikke opsamles fra buret. Prøver skal indsamles friske og direkte fra anus. Den bedste metode er at massere musen, mens du holder den eller placere musen i en beholder. Derudover anbefales det, at prøverne behandles på samme tid og fryses ved -80 °C, mens man venter på, at alle prøverne er klar.
DNA-ekstraktion er ekstremt følsom over for pipettering og håndtering, så alle prøverne skal behandles på samme tid. En anden overvejelse er at undgå miljøforurening; Derfor skal hvert eneste trin, der ikke nødvendigvis udføres i den kemiske hætte på grund af de giftige reagenser, udføres i et biologisk sikkerhedsskab. Selvom chancerne for miljøforurening er lave, og der ikke er noget skridt til at tillade bakterier at vokse, er denne metode ekstremt følsom, og det anbefales absolut at undgå mulig forurening. Derudover vil vejning af pellets bidrage til at øge konsistensen blandt prøverne. Som en fordel i forhold til kommercielt tilgængelige kits er denne metode særlig god til at opnå høje koncentrationer af DNA. DNA-udbyttet opnået med denne protokol varierer mellem 0,03 g og 0,07 g afhængigt af vægten af fækalpelleten. Til sammenligning kan kommercielle kits give mellem 0,005 g og 0,05 g, men med en større chance for mætning som begrænset af søjleretentionstrinnet.
Perleslagningstrinnet er vigtigt for at bryde fækalpelleten i små stykker, så lysismidlet kan nå alle bakterierne. Hvis dette trin ikke er godt udført, kan pellets delvist opløses, og færre repræsentative bakterier kan nås. Derudover er korrekt pipettering vigtig ved overførsel af supernatanter, da det at bære en del af den resterende buffer fra det foregående trin ville ændre udbyttet og kvaliteten af DNA i slutningen.
Ved fortynding af prøverne til 16S ribosomal RNA-gensekventering er det vigtigt at handle hurtigt, før prøverne lægges i fryseren. Det er også vigtigt at blande prøver godt, inden der udføres fortyndinger. Undgå at efterlade prøver ved stuetemperatur i lange perioder. Da mængderne er små, vil frysning af prøverne i pladen inden forsendelse af dem hjælpe med at minimere tabet.
Argonne National Laboratory analyserer V4-regionen af 16S rRNA-genet. V4-regionen er bedre bevaret end de andre regioner og har et bedre skøn for højtrangerede taxa13. Mens de andre regioner er bedre til analyse af hurtigt udviklende arter og kan hjælpe med at identificere og bedre diskriminere slægter eller arter, akkumulerer disse regioner mutationer hurtigere end V4.
Når resultaterne er tilbage og analyseret af en kvalificeret bioinformatiker, kan statistisk software bruges til at plotte resultaterne og sammenligne grupper. Det er vigtigt at forstå begrænsningerne i denne teknik og resultaterne efter bioinformatikanalyse. Jo lavere det taksonomiske niveau er, desto mindre er nøjagtigheden eller større variationerne. Fra phylum til familie, og endda slægtsniveauet kan analyseres med pålidelighed. Anmærkninger på artsniveau er imidlertid ikke nøjagtige med denne metode. Haglgeværsekventering kan derimod nå artsniveauet; selvom det kan give mere indsigt i et samfunds biologiske funktioner, er 16S rRNA-gensekventering stadig en nøjagtig og omkostningseffektiv metode til at kvantificere taksonomiske fordelinger af et mikrobielt samfund15.
Sammenfattende er der beskrevet en omkostningseffektiv protokol til at analysere tarmmikrobiotaen og studere dens dynamik med den maksimale nøjagtighed, der kan hjælpe med at afsløre langsgående ændringer over tid samt forskelle mellem grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi sætter pris på hjælpen fra Argonne National Laboratory og vores samarbejdende bioinformatikere. Dette arbejde understøttes af forskellige NIH og interne tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system. Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).
- Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4615-4622 (2011).
- Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. The role of the microbiome in rheumatic diseases. Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).
- Larsen, N., et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults. PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).
- Alam, M. T., et al. Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels. Gut Pathogens. 12 (1), (2020).
- Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. Diet, microbiota and autoimmune diseases. Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).
- Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet. Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).
- Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study. Arthritis Care & Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).
- Mu, Q., et al. Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota. Microbiome. 5 (1), 73 (2017).
- Panek, M., et al. Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies. Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).
- Fiedorová, K., et al. The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).
- Gerasimidis, K., et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes. 9, 365 (2016).
- Bukin, Y. S., et al. The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results. Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).
- Galloway-Peña, J., Hanson, B.
- Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).
