Summary
Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.
Abstract
Le microbiote intestinal joue un rôle important dans l’éducation du système immunitaire. Cette relation est extrêmement importante pour comprendre les maladies auto-immunes qui ne sont pas seulement motivées par des facteurs génétiques, mais aussi par des facteurs environnementaux qui peuvent déclencher l’apparition et / ou aggraver l’évolution de la maladie. Une étude publiée précédemment sur la dynamique du microbiote intestinal chez les souris femelles LMR/LPR sujettes au lupus a montré comment les changements du microbiote intestinal peuvent modifier la progression de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour extraire des échantillons représentatifs du microbiote intestinal pour des études d’auto-immunité. Des échantillons de microbiote sont prélevés dans l’anus et traités, à partir desquels l’ADN est extrait selon une méthode phénol-chloroforme et purifié par précipitation alcoolique. Une fois la PCR effectuée, les amplicons purifiés sont séquencés à l’aide d’une plate-forme de séquençage de nouvelle génération au laboratoire national d’Argonne. Enfin, les données de séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S sont analysées. À titre d’exemple, les données obtenues à partir de comparaisons du microbiote intestinal de souris LMR/LPR avec ou sans CX3CR1 sont présentées. Les résultats ont montré des différences significatives dans les genres contenant des bactéries pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria, ainsi que du genre Bifidobacterium, qui est considéré comme faisant partie du microbiote commensale sain. En résumé, cette méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN est fiable et peut aider à étudier les changements du microbiote intestinal associés aux maladies auto-immunes.
Introduction
Les humains et les bactéries coexistent depuis longtemps. Ils ont établi une relation de codépendance avec des effets bénéfiques mutuels qui influencent les réponses immunitaires de l’hôte de manière quantitative et qualitative1. Des études récentes suggèrent une association entre la composition du microbiote intestinal et la pathogenèse des maladies auto-immunes qui comprennent la sclérose en plaques 2, la polyarthrite rhumatoïde3, le diabète de type2 4, la maladie inflammatoire de l’intestin5 et le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Cependant, on ne sait toujours pas si le microbiote intestinal est la cause principale ou un effet secondaire de ces maladies auto-immunes7. Potentiellement, le microbiote intestinal pourrait exacerber la maladie pendant la phase effectrice des maladies auto-immunes ou jouer un rôle dans la régulation de l’induction de ces maladies8.
Une dysbiose intestinale a été rapportée chez des souris femelles MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr) sujettes au lupus, et des modifications du microbiote intestinal avec une déplétion significative des lactobacilles ont été observées9. Lorsqu’un mélange de cinq souches de Lactobacillus a été administré par voie orale, les symptômes de type lupus ont été largement atténués chez ces souris, suggérant un rôle essentiel du microbiote dans la régulation de la pathogenèse du LED.
La technique suivante d’extraction d’ADN permet de suivre les fluctuations du microbiote et de les analyser qualitativement et quantitativement au cours de l’évolution de la maladie de type LED murin chez les souris sujettes au lupus. Qu’il s’agisse d’examiner le microbiote intestinal sain ou de définir la dysbiose, il est important d’examiner de manière critique comment les données sont collectées et si elles sont exactes et reproductibles10. Chaque étape est essentielle dans ce processus. Une méthodologie appropriée doit être utilisée pour extraire l’ADN microbien, car tout problème éventuel introduisant des biais pendant le processus d’extraction de l’ADN pourrait entraîner une représentation microbienne inexacte. Bien que la méthode phénol-chloroforme soit décrite ici, il existe des kits disponibles dans le commerce pour extraire l’ADN de bactéries qui fonctionnent bien dans des cas particuliers11. Cependant, leur facilité d’utilisation est limitée par le coût et la quantité d’échantillon requise.
Le protocole présenté ici est rentable et ne nécessite qu’une petite quantité d’échantillon. Il fonctionne bien avec n’importe quel type d’échantillon de selles et est utile pour étudier la dynamique du microbiote intestinal au fil du temps ainsi que les comparaisons entre les groupes. L’ADN est isolé avec une méthode de purification de l’alcool, qui utilise du phénol, du chloroforme et de l’alcool isoamylique. L’extraction à base d’alcool aide à nettoyer et à éliminer l’échantillon de protéines et de lipides, où l’ADN est précipité à l’étape finale. La méthode proposée a une efficacité et une qualité significativement élevées et s’est avérée précise dans l’identification des populations bactériennes. Une remarque critique au cours de la procédure est que la contamination de l’ADN peut se produire, et donc une manipulation appropriée des échantillons est nécessaire12.
L’ADN est ensuite analysé par les plateformes de séquençage de nouvelle génération pour le gène de l’ARNr 16S, tel que l’Illumina MiSeq. En particulier, la région hyper-variable V4 est analysée pour fournir une meilleure quantification pour les taxons de rangélevé 13. L’analyse bioinformatique ultérieure est externalisée, suivie d’une analyse interne utilisant des méthodes statistiques standard. Il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source disponibles pour le séquençage en aval, et le type d’analyses effectuées dépend fortement de la question biologique spécifique d’intérêt14. Ce protocole se concentre spécifiquement sur les étapes expérimentales précédant le séquençage et fournit une méthode plus polyvalente, rentable, comparable et efficace pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux.
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Protocol
Le locus gfp/gfp Cx3cr1 des souris B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J a été rétrocroisé avec MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) pendant 10 générations pour générer des souris MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. Le criblage du génome à l’aide de panels de polymorphisme mononucléotidique (SNP) a confirmé que le fond génétique des souris nouvellement générées était identique à plus de 97% à celui de MRL / lpr. Après cela, les souris ont été élevées et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques conformément aux exigences spécifiques du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Virginia Tech. Les échantillons ont été prélevés lorsque les souris avaient 13, 14 et 15 semaines.
1. Prélèvement d’échantillons de microbiote chez la souris
- Sortez chaque souris individuellement de sa cage. Prélever une pastille fécale directement dans l’anus et la conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit traitée. Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres.
REMARQUE : Un contenant (p. ex., un bécher) peut être utilisé pour placer la souris en attendant l’échantillon fécal. Nettoyez le récipient avec de l’éthanol avant et après chaque souris. - Ajouter une pastille congelée dans un tube à vis prépesé de 2 mL. Notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 g par pastille fécale.
- Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 mm, 500 μL de tampon de lyse (50 mM NaCl, 5 mM Tris et 50 mM EDTA) et 200 μL de SDS à 20%.
- Battre le tube pendant 4 min dans un homogénéisateur (à puissance maximale), suivi de 3 à 5 min de vortex.
- Essorez pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse (appuyez sur le bouton de la centrifugeuse jusqu’à ce qu’elle atteigne 1 000-1 200 x g, puis relâchez).
2. Extraction de l’ADN
- Transfèrent 350 μL de surnageant obtenu à l’étape 1.5 (en veillant à ne transporter aucun débris) dans un nouveau tube à pression de 1,5 mL. Ajouter 500 μL de mélange phénol-chloroforme-isoamylique (PCI; 25:24:1, v/v) et vortex pendant 1 min.
REMARQUE: Dorénavant, les échantillons doivent être manipulés à l’intérieur d’une hotte chimique. L’ICP est toxique. - Faire tourner à 6 000 x g pendant 3 min à 4 °C. Transfère 180 μL de la phase aqueuse (couche supérieure) dans un nouveau tube à pression de 1,5 mL. Ajouter 180 μL (1:1) de chloroforme, retourner et mélanger.
REMARQUE: Minimisez la contamination de la couche inférieure lors du transfert de la couche supérieure. - Essorage à 18 400 x g pendant 3 min à 4 °C. Transférer 180 μL de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression.
REMARQUE: Après avoir éliminé l’ICP et le chloroforme, les étapes suivantes peuvent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. - Ajouter 180 μL d’isopropanol froid et 36 μL de 5M NH4Ac. Retourner quelques fois pour mélanger et placer le tube sur de la glace pendant 20 min.
- Essorage à 18 400 x g pendant 20 min à 4 °C. Verser pour jeter le surnageant. Lavez la pastille plusieurs fois avec 500 μL d’éthanol froid à 70 % en le retournant.
NOTE: L’éthanol doit être dilué avec de l’eau stérile double désionisée. - Essorage à 18 400 x g pendant 3 min à 4 °C. Jeter le surnageant pour éliminer l’éthanol résiduel.
- Sécher le tube à l’air à l’envers sur du papier de soie pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 μL d’eau de qualité moléculaire. Chauffer le liquide à 37 °C pendant 10 min pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.
- Faire tourner les tubes après chauffage pour récupérer les gouttelettes de condensation sur le couvercle (3 400 x g pendant 1 min).
- Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Utilisez de l’eau de qualité moléculaire comme un blanc. L’ADN de bonne qualité devrait avoir des ratios 260/280 compris entre 1,8 et 2.
REMARQUE : Le rendement attendu en ADN est d’au moins 0,03 g par pastille fécale.
3. Préparation de l’échantillon pour le séquençage du gène de l’ARNr 16S
- Envoyez les échantillons d’ADN au laboratoire national d’Argonne, où ils sont préparés par la bibliothèque et séquencés sur l’Illumina Miseq.
- Envoyez les échantillons dans des plaques de 96 puits entièrement plinquées, avec des échantillons disposés en rangées (A1-A12, B1-B12, etc.) et scellés avec des joints de plaque de feuille.
- Envoyer un volume final de 20 μL par échantillon et par puits, dont la concentration varie de 1 à 50 ng/μL.
NOTE: Les dilutions doivent être effectuées avec de l’eau de qualité moléculaire. - Après préparation des échantillons, faire tourner à 600 x g pendant 1 min à température ambiante avant de congeler les échantillons à -80 °C pendant 24 h.
- Envoyer pendant la nuit sur de la glace sèche.
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Representative Results
Les résultats de l’Argonne National Laboratory sont analysés par un bioinformaticien qualifié, suivis d’une analyse interne des données à l’aide de méthodes statistiques standard. Les analyses typiques du microbiome impliquent le regroupement de séquences similaires en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) ou en variantes de séquence d’amplicon (ASV) comme proxy pour différents micro-organismes dans un échantillon. Les comptages d’OTU ou d’ASV dans les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour tester les changements dans la diversité intra-échantillon (alpha) et entre les échantillons (bêta). Ils peuvent également être utilisés pour tester les taxons qui sont différentiellement abondants dans les catégories de métadonnées d’intérêt.
Comme le montre la figure 1, la souche de souris dépourvue du récepteur CX3CR1 a une composition différente du microbiote intestinal. Par rapport aux souris GMP/gfp/gfp de type sauvage, les souris gfp/gfp/gfp MRL/lpr-CX 3 CR1 (exprimant la protéine fluorescente verteau lieu de CX3CR1) présentent des différences significatives dans certains genres pertinents pour les bactéries potentiellement pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria. En outre, certaines différences ont été notées pour les bactéries commensales « saines » telles que Bifidobacterium, mais pas Lactobacillus.
Figure 1 : Comparaisons du microbiote intestinal au niveau du genre pour les souris MRL/lpr et MRL/lpr-CX3CR1. L’abondance des différents genres à l’âge de 13, 14 et 15 semaines (n = 5 souris femelles par groupe). Une ANOVA bidirectionnelle a été effectuée. Aucune signification ('ns'), *P < 0,05, **P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un microbiote intestinal équilibré peut protéger le corps humain contre les maladies. Une fois que cet équilibre est perturbé par des déclencheurs externes ou internes, les conséquences peuvent être dévastatrices. Cette méthode présente un moyen d’analyser la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins. La méthode convient non seulement aux comparaisons entre groupes, mais aussi au suivi du microbiote intestinal au fil du temps afin de mieux identifier les facteurs dépendants du temps qui perturbent le microbiote intestinal.
Toutes les souris de l’expérience doivent être manipulées dans le même environnement. Une question essentielle à considérer lors de la collecte d’échantillons fécaux est d’être cohérent avec l’heure, le jour et le lieu. Les souris sont coprophagiques. Cela signifie qu’ils mangent leurs excréments ou ceux qui les entourent pour obtenir des nutriments essentiels. Par conséquent, les matières fécales ne peuvent pas être collectées dans la cage. Les échantillons doivent être prélevés frais et directement de l’anus. La meilleure méthode consiste à masser la souris tout en la tenant ou à la placer dans un récipient. En outre, il est recommandé de traiter les échantillons en même temps et de les congeler à -80 °C en attendant que tous les échantillons soient prêts.
L’extraction de l’ADN est extrêmement sensible au pipetage et à la manipulation, de sorte que tous les échantillons doivent être traités en même temps. Une autre considération est d’éviter la contamination de l’environnement; Par conséquent, chaque étape qui n’est pas nécessairement effectuée dans la hotte chimique en raison des réactifs toxiques doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique. Même si les risques de contamination de l’environnement sont faibles et qu’il n’y a pas de mesure pour permettre aux bactéries de se développer, cette méthode est extrêmement sensible et il est absolument recommandé d’éviter toute contamination possible. De plus, le pesage des granulés aidera à augmenter la cohérence entre les échantillons. En tant qu’avantage par rapport aux kits disponibles dans le commerce, cette méthode est particulièrement efficace pour atteindre des concentrations élevées d’ADN. Le rendement en ADN obtenu avec ce protocole varie entre 0,03 g et 0,07 g en fonction du poids de la pastille fécale. En comparaison, les kits commerciaux peuvent produire entre 0,005 g et 0,05 g, mais avec un risque de saturation plus élevé en raison de l’étape de rétention de la colonne.
L’étape de battage des perles est importante pour briser la pastille fécale en petits morceaux afin que l’agent de lyse puisse atteindre toutes les bactéries. Si cette étape n’est pas bien réalisée, les granulés peuvent être partiellement désintégrés et moins de bactéries représentatives peuvent être atteintes. De plus, lors du transfert de surnageants, un pipetage correct est important, car le transport d’une partie du tampon résiduel de l’étape précédente modifierait le rendement et la qualité de l’ADN à la fin.
Lors de la dilution des échantillons pour le séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S, il est important d’agir rapidement avant que les échantillons ne soient mis au congélateur. Il est également important de bien mélanger les échantillons avant d’effectuer des dilutions. Évitez de laisser les échantillons à température ambiante pendant de longues périodes. Comme les volumes sont faibles, la congélation des échantillons dans la plaque avant de les expédier aidera à minimiser les pertes.
L’Argonne National Laboratory analyse la région V4 du gène de l’ARNr 16S. La région V4 est mieux conservée que les autres régions et a une meilleure estimation pour les taxonsde rang supérieur 13. Alors que les autres régions sont meilleures pour l’analyse des espèces en évolution rapide et peuvent aider à identifier et à mieux distinguer le genre ou l’espèce, ces régions accumulent des mutations plus rapidement que V4.
Une fois les résultats de retour et analysés par un bioinformaticien qualifié, un logiciel statistique peut être utilisé pour tracer les résultats et comparer les groupes. Il est important de comprendre les limites de cette technique et les résultats après analyse bioinformatique. Plus le niveau taxonomique est bas, moins la précision est faible ou plus les variations sont importantes. Du phylum à la famille, et même le niveau du genre peut être analysé avec fiabilité. Cependant, les annotations au niveau de l’espèce ne sont pas exactes avec cette méthode. Le séquençage au fusil de chasse, en revanche, peut atteindre le niveau de l’espèce; Cependant, bien qu’il puisse fournir plus d’informations sur les fonctions biologiques d’une communauté, le séquençage du gène de l’ARNr 16S reste une méthode précise et rentable pour quantifier les distributions taxonomiques d’une communauté microbienne15.
En résumé, un protocole rentable a été décrit pour analyser le microbiote intestinal et étudier sa dynamique avec la précision maximale qui peut aider à révéler les changements longitudinaux au fil du temps ainsi que les différences entre les groupes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous apprécions l’aide du laboratoire national d’Argonne et de nos bioinformaticiens collaborateurs. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | |
| 2 mL screw cap tubes | Thermo Fisher Scientific | 3488 | |
| 20% SDS | FisherScientific | BP1311-1 | SDS 20% |
| 96% Ethanol, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T032021000CS | |
| Ammonium Acetate (5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9071 | NH4AC 5M |
| B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J | Jackson Laboratory | 005582 | |
| Bullet Blender storm 24 | Next Advance | 4116-BBY24M | Homogenizer |
| Chloroform | FisherScientific | C298-500 | |
| DEPC-Treated Water | Thermo Fisher Scientific | AM9916 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | FisherScientific | BP118-500 | EDTA |
| Foil plate seal | FisherScientific | NC0302491 | |
| Kimwipes-Kimtech 34256 | FisherScientific | 06-666C | |
| MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice | Jackson Laboratory | 000485 | |
| Nanodrop 2000 spectrophotomer | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1) | FisherScientific | BP1752I-400 | PCI |
| Scale with 4 decimals | Mettler Toledo | MS205DU | |
| Skirted 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB-0800 | |
| Sodium chloride | FisherScientific | 15528154 | NaCl |
| Tris Hydrochloride | FisherScientific | BP1757-100 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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