Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et optimeret enkeltmolekyle pull-down assay til kvantificering af proteinfosforylering

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Denne protokol beskriver prøveforberedelse og dataanalyse for at kvantificere proteinfosforylering ved hjælp af et forbedret enkeltmolekyle pull-down (SiMPull) assay.

Abstract

Fosforylering er en nødvendig posttranslationel modifikation, der regulerer proteinfunktionen og styrer cellesignaleringsresultater. Nuværende metoder til måling af proteinfosforylering kan ikke bevare heterogeniteten i phosphorylering på tværs af individuelle proteiner. Enkeltmolekyle pull-down (SiMPull) assay blev udviklet til at undersøge sammensætningen af makromolekylære komplekser via immunoprecipitation af proteiner på en glasdæksler efterfulgt af enkeltmolekylebilleddannelse. Den nuværende teknik er en tilpasning af SiMPull, der giver robust kvantificering af phosphoryleringstilstanden af membranreceptorer i fuld længde på enkeltmolekyleniveau. Billeddannelse af tusindvis af individuelle receptorer på denne måde giver mulighed for kvantificering af proteinfosforyleringsmønstre. Den nuværende protokol beskriver den optimerede SiMPull-procedure, fra prøveforberedelse til billeddannelse. Optimering af glasforberedelse og antistoffikseringsprotokoller forbedrer datakvaliteten yderligere. Den nuværende protokol giver kode til enkeltmolekyledataanalysen, der beregner fraktionen af receptorer phosphoryleret i en prøve. Mens dette arbejde fokuserer på phosphorylering af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), kan protokollen generaliseres til andre membranreceptorer og cytosoliske signalmolekyler.

Introduction

Membranassocieret signalering indstilles ved en kombination af ligandinduceret membranreceptoraktivering og rekruttering af downstream tilbehørsproteiner, der udbreder signalet. Phosphorylering af nøgletyrososiner i receptorcytoplasmatiske haler er afgørende for at starte dannelsen af signalkomplekser eller signalosomer 1,2. Derfor er et vigtigt spørgsmål i biologi, hvordan fosforyleringsmønstre oprettes og vedligeholdes for at rekruttere signalpartnere og diktere cellulære resultater. Dette omfatter forståelse af heterogeniteten af receptorfosforylering, både i overflod og i de specifikke phosphotyrosinmønstre, der kan tilvejebringe et middel til at manipulere signaludgange ved at diktere sammensætningen af signalosomet 3,4,5,6,7. Der er dog begrænsninger i de nuværende metoder til at forhøre proteinfosforylering. Western blot-analyse er fremragende til at beskrive tendenser inden for proteinfosforylering, men er semikvantitativ8 og giver ikke information om systemets heterogenitet, fordi tusinder til millioner af receptorer er gennemsnitlige sammen. Mens western blots tillader sondering af en prøve ved hjælp af phospho-specifikke antistoffer mod specifikke tyrosiner, kan de ikke give information om multisite phosphoryleringsmønstre inden for det samme protein. Kvantitativ phosphoproteomics rapporterer om phosphotyrosin overflod, men der er begrænsninger for påvisning af multisite phosphorylering, da resterne af interesse skal placeres inden for det samme peptid (typisk 7-35 aminosyrer), der genereres ved enzymatisk fordøjelse 9,10,11.

For at overvinde de ovennævnte begrænsninger er enkeltmolekylet pull-down (SiMPull) assay blevet tilpasset til at kvantificere phosphoryleringstilstandene for intakte receptorer på enkeltmolekyleniveau. SiMPull blev først demonstreret som et kraftfuldt værktøj til forhør af makromolekylære komplekser af Jain et al.12,13. I SiMPull blev makromolekylære komplekser immunudforskudt (IP) på antistoffunktionaliserede glasdæksler og derefter analyseret gennem enkeltmolekylemikroskopi for proteinunderenhedsnummer og co-IP med komplekse komponenter12. En modifikation af Kim et al.14, kaldet SiMBlot, var den første til at bruge en variation af SiMPull til at analysere phosphorylering af denaturerede proteiner. SiMBlot-protokollen er afhængig af at fange biotinylerede celleoverfladeproteiner ved hjælp af NeutrAvidin-belagte dækslips, som derefter undersøges til phosphorylering med phospho-specifik antistofmærkning14. På trods af disse fremskridt var der behov for forbedringer for at gøre kvantificeringen af posttranslationel modifikation mere robust og anvendelig på en bredere vifte af proteiner.

Denne protokol beskriver en optimeret SiMPull-tilgang, der blev brugt til at kvantificere phosphoryleringsmønstre af intakt epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) som reaktion på en række ligandbetingelser og onkogene mutationer15. Mens dette arbejde fokuserer på EGFR, kan denne tilgang anvendes på enhver membranreceptor og cytosoliske proteiner af interesse (POI), for hvilke der findes kvalitetsantistoffer. Protokollen indeholder trin til reduktion af prøveautofluorescens, et prøvearraydesign, der kræver minimal prøvevolumen med samtidig forberedelse af op til 20 prøver og optimering af antistofmærkning og fikseringsforhold. Dataanalysealgoritmer er udviklet til enkeltmolekyledetektion og kvantificering af phosphorylerede proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af coverslip

BEMÆRK: Til dette trin skal man bære personlige værnemidler (PPE), som inkluderer et dobbelt lag nitrilhandsker, sikkerhedsbriller eller ansigtsskærm og en laboratoriefrakke.

  1. Udfør piranha ætsning for at fjerne organisk affald fra glasset.
    FORSIGTIG: Piranha-opløsning er et stærkt oxidationsmiddel, der er ætsende og meget reaktivt, når det kommer i kontakt med organiske materialer. Reaktion med organisk affald er eksoterm og potentielt eksplosiv. Således skal proceduren udføres i en kemisk røghætte med rammen sænket. Pyrex glasvarer er nødvendige for at håndtere piranha-opløsningen.
    1. Forbered arbejdsområdet inde i en kemisk røghætte. Arranger dæksler uden overlapning i bunden af et 4 L glasbægerglas, "reaktionsbægerglasset", og anbring reaktionsbægeret på en kogeplade med blid varme. Lad glasvarerne varme i 10 min. Der anbringes et "affaldsbægerglas" på 1 L glas med 500 ml ddH2O proximalt på reaktionsbægerglasset.
    2. Der tilsættes langsomt 49 ml 12 N svovlsyre (H2SO4) til reaktionsbægerglasset med en serologisk glaspipette. Pipetten skylles i bægerglasset, inden det bortskaffes.
    3. Der tilsættes 21 ml 30% hydrogenperoxid (H2O2) dråbevis med en serologisk glaspipette til reaktionsbægerglasset. H2O2-dråberne fordeles langsomt jævnt over bunden af reaktionskolben for at forhindre lokal slukning af piranha-ætsningsreaktionen. Pipetten skylles i bægerglasset, inden det bortskaffes.
      FORSIGTIG: Tilføj altid H2O2 i H2SO4, og aldrig omvendt.
    4. Piranha ætser dækslerne i 30 min. Omrør forsigtigt indholdet af reaktionsbægeret hvert 5. minut.
    5. Piranhaopløsningen slukkes ved at hælde indholdet af bægerglasset i reaktionsbægeret. Væsken føres langsomt ned ad reaktionsbægerglassets væg for at minimere stænk. Reaktionsbægeret fjernes fra kogepladen.
    6. Når reaktionen er slukket og afkølet, hældes piranhaopløsningen tilbage i affaldsbægeret til neutralisering uden at fjerne de ætsede dækslips fra reaktionsbægeret.
    7. Neutraliser piranha-opløsningen med den gradvise tilsætning af en svag base. Brug for eksempel en overdreven masse 20 g natriumbicarbonat (NaHCO3)/100 ml piranhaopløsning.
      FORSIGTIG: Opbevar ikke piranha-opløsninger i forseglede affaldsbeholdere. Opløsningen skal altid neutraliseres inden bortskaffelse. Neutraliseringsreaktionen producerer kraftige bobler og kan være eksplosiv, hvis den ikke styres af den gradvise tilsætning af den svage base.
    8. Rør den neutraliserede opløsning med en glasrørstang og lad den reagere i 2 timer. Hæv pH til >4, og bortskaf opløsningen.
    9. Mellem tilsætningerne af svag base til piranha-opløsningen overføres de ætsede dækslips fra reaktionsbægeret til en Buchner-tragt med en glasrørestang og skylles i 5 minutter i løbende ddH2O.
      BEMÆRK: Fortsæt straks til næste trin eller opbevar piranha ætsede dækslips i op til 2 uger i ddH2O i en forseglet glasburk eller petriskål (wrap med tætningsfilm, se Materialetabel).
  2. Bath-sonicate dækslips i organiske opløsningsmidler ved at følge nedenstående trin.
    1. Dækslerne anbringes i en koplinglas af glas (se Materialetabel), og der dækkes med methanol (CH3OH). Forsegl låget til krukken med tætningsfilm og bad-sonikat i 10 min. Hæld forsigtigt methanol ud af Coplin-krukken i en glasopbevaringsflaske.
    2. Fyld Coplin-krukken med acetone (C3H6O), forsegl låget og bad-sonikat i 10 minutter. Hæld forsigtigt acetonen ud af Coplin-krukken i en glasopbevaringsflaske.
      FORSIGTIG: Methanol er brandfarligt og akut giftigt. Anvendes i en kemisk røghætte. Aceton er brandfarlig og irriterende. Håndter derfor med og opbevar det i glas, og brug det i en kemisk røghætte. Bortskaf som farligt affald i henhold til lokale regler og retningslinjer.
      BEMÆRK: Methanol og acetone kan genbruges op til fem gange hver.
  3. Aktiver dækslipoverfladen til silanfunktionalisering.
    1. Bad-sonikat med 1 M kaliumhydroxid (KOH) i 20 min. Hæld forsigtigt KOH ud af Coplin-krukken i et 50 ml konisk rør til genbrug.
      FORSIGTIG: KOH er ætsende og irriterende. Anvendes i en kemisk røghætte og opbevares ikke i glas. Opbevar det i polypropylenrør. Bortskaf som farligt affald i henhold til lokale regler og retningslinjer.
      BEMÆRK: KOH kan genbruges op til fem gange.
    2. Skyl to gange med ddH2O. Dræn ddH2O fra dækslerne, og opvarm derefter hver dækslip ved at vinke gennem flammen på en Bunsen-brænder for at fjerne al overfladefugtighed. Læg dækslerne i en tør Koplin krukke.
  4. Udfør coverslip aminosilanisering.
    1. Aminosilanopløsningen fremstilles ved at blande 69,4 ml methanol med 3,6 ml eddikesyre (CH3COOH) i en konisk kolbe. Der tilsættes 720 μL N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilan (aminosilan) og blandes godt (se materialetabel).
      FORSIGTIG: Eddikesyre er brandfarlig og ætsende. Håndter med glaspipetter og opbevar i glas. Arbejd med eddikesyre i en kemisk røghætte. Aminosilan er en akut giftig indåndingsfare, en sensibilisator og en irritation. Det er skadeligt for vandlevende organismer. Anvendes i en kemisk røghætte. Bortskaf kemikalierne som farligt affald i henhold til lokale regler og retningslinjer.
      BEMÆRK: Aminosilan er lysfølsom og hydrolyserer hurtigt i vand. Alle trin med dette reagens skal udføres under minimale lysforhold for at bevare aktiviteten. Rens flasken med nitrogengas og påfør tætningsfilm inden opbevaring i en mørk ekssikkator. Udskift hver 6-9 måned.
    2. Tilsæt straks aminosilanopløsningen til Coplin-krukken. Dæk og påfør tætningsfilmen, og fortsæt med at beskytte mod lys.
    3. Dækslipsene inkuberes i aminosilanopløsningen i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur (RT). Bad-sonikere i 1 minut og inkuber derefter i yderligere 10 minutter. Hæld forsigtigt aminosilanopløsningen i en affaldsbeholder beregnet tilCH3OH med sporaminosilan ogCH3COOH.
    4. Dækslerne skylles med methanol, og opløsningen hældes i en affaldsbeholder, der er beregnet til methanol.
    5. Skyl dækslerne tre gange i 2 min hver med ddH2O. Tøm dækslerne, dup overskydende fugt væk og lufttør helt i 10 min.
  5. Udfør array-forberedelsen / biotin-PEG-funktionaliseringen af dækslipsene.
    1. 1 M NaHCO3 (pH 8,5) arbejdsmateriale forberedes ved at opløse 84,5 mg NaHCO3 til 1 ml ddH2O. Ved en slutkoncentration på 10 mM NaHCO3 fortyndes 1 M NaHCO3 til ddH2O (1:100).
    2. Tegn et gitterarray på de tørre aminosilaniserede dækslips med en hydrofob barrierepen (se Materialetabel), og vent på, at blækket tørrer. Skriv en identifikator på dækslen for at markere den korrekte retning. Placer dækslerne i et befugtet kammer.
      BEMÆRK: Arrayet skal bestå af 16-20 firkanter, ca. 4 mm x 4 mm i størrelse.
    3. For at fremstille biotin-PEG succinimidylvaleratet (biotin-PEG)/mPEG succinimidylvalerat (mPEG) skal du først fjerne mPEG og biotin-PEG (se materialetabel) fra fryseren og ækvilibrere til RT. Tilsæt 153 mg mPEG og 3,9 mg biotin-PEG (~ 1:39 biotin-PEG: mPEG) til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og resuspend i 609 μL på 10 mM NaHCO3 ved skånsom pipettering. Centrifuger ved 10.000 x g i 1 minut ved RT for at fjerne bobler.
      BEMÆRK: Hydrolysehalveringstiden for succinimidylvalerat i pH 8,5-buffer er ~ 30 min. Når du har tilføjet bufferen til mPEG, skal du fortsætte med følgende trin så hurtigt som muligt. Dette trin er kritisk.
    4. Påfør biotin-PEG/mPEG-opløsningen til fuldstændigt at dække hver firkant i dækslip-arrays, typisk 10-15 μL pr. Kvadrat. Lad ikke væske flyde over det definerede rum. Opbevar dækslerne i et fugtighedskammer i mørke i 3-4 timer ved RT.
    5. Dækslerne vaskes med rigelige mængder vand ved sekventielt at dyppe dem i 3x 250 ml glasbægre fyldt med ddH2O i 10 s hver.
    6. Kør al fugt fra dækslerne af med nitrogengas. Dækslerne opbevares ryg mod ryg i et nitrogenfyldt 50 ml konisk rør indpakket med tætningsfilm ved -20 °C.
      BEMÆRK: Fortsæt straks til trin 2 eller opbevar dæksler ved -20 °C i op til 1 uge før brug.

2. Fremstilling af SiMPull lysat

FORSIGTIG: De nødvendige PERSONLIGE VÆRNEMIDLER til de resterende trin i protokollen er nitrilhandsker, sikkerhedsbriller og laboratoriefrakker.

BEMÆRK: Lysaterne blev fremstillet ud fra de vedhængende CHO-celler, der udtrykker EGFR-GFP. Cellerne blev belagt i en 60 mm vævskultur (TC60) skål natten over12,13. CHO-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin og 500 ng / ml geneticin (se materialetabel). Andre vedhængende cellelinjer eller suspensionsceller kan også anvendes.

  1. Plader cellerne ved at følge nedenstående trin.
    1. Kulturskålen (indeholdende cellerne) vaskes med 1 ml 1x PBS. Tilsæt 1 ml 1x Trypsin og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C for at løsne cellerne. Brug en pipette til at overføre de løsrevne celler fra skålen til et 1,5 ml centrifugerør.
    2. Tag 10 μL trypanblå og bland med 10 μL cellesuspension i et separat centrifugerør. Tæl celler ved hjælp af 10 μL af celleblandingen i en automatisk celletæller i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel).
    3. Plade 8 x 105 celler natten over i en TC60 petriskål. Tallerken en skål pr. Tilstand.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev cellerne enten ubehandlet eller behandlet med Pervanadat og EGF som beskrevet i trin 2.4.1.
  2. Forbered følgende opløsninger til cellelysatpræparatet.
    1. Der forberedes iskold 1x PBS (pH 7,4).
    2. Der fremstilles lysisbuffer, en opløsning af 1% ikke-ionisk, ikke-degenererende vaskemiddel (se materialetabel) i 50 mM Tris-HCl (pH 7.2) og 150 mM NaCl suppleret med Protease/Fosfatasehæmmer (PPI) (1:100 fra lager). Anbring røret på en møtrik og lad bufferen blande i 15 min. Opbevar den tilberedte opløsning på is.
    3. Tyrodens buffer forberedes til en slutkoncentration på 135 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,4 mMMgCl2, 1 mMCaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM glucose og 0,1% bovint serumalbumin (BSA) (se materialetabel). Opløsningen opvarmes til 37 °C.
  3. Forbered den positive kontrol til phosphorylering - 1 mM pervanadatbehandling.
    BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Pervandat er den peroxiderede form af vanadat-en hæmmer af protein tyrosinphosphataser16. Forebyggelse af proteindephosphorylation ved at hæmme phosphataseaktivitet resulterer i en stærkt phosphoryleret prøve.
    1. Forbered en 200 mM bestand af aktiveret natrium orthovanadat (Na3VO4).
      1. For at fremstille 100 ml opløsning tilsættes 3,89 g Na3VO4 (se materialetabel) til 90 ml ddH2O og opløses under omrøring. Juster pH til 10 ved at tilføje HCI eller NaOH dråbevis. Tilføjelse af HCI vil gøre opløsningen gul.
      2. Bring volumen til 100 ml med ddH2O. Kog opløsningen ved at opvarme den i mikrobølgeovnen. Efter kogning vil opløsningen være farveløs.
      3. Opløsningen afkøles til RT, og pH-værdien justeres til 10. Gentag kognings-, afkølings- og pH-justeringen to til fire gange mere, indtil pH-værdien stabiliseres ved 10. Aliquot og opbevares ved -20 °C.
    2. Der fremstilles et lager på 30 mM pervanadat (PV) ved at blande 20,4 μL 3%H2O2med 100 μL 200 mM Na3VO4 og 546,8 μL ddH2O (ækvimolære koncentrationer afH2O2og aktiveretNa3VO4). Inkuber i mørket ved RT i 15 min.
    3. Forbered 1 mM PV i Tyrodes buffer. For 10 ml opløsning tilsættes 0,33 ml 30 ml PV-lager til 9,67 ml 37 ° C Tyrodes buffer. Behandl celler med det samme.
    4. Celler vaskes én gang med 3 ml Tyrodes buffer. Der tilsættes 3 ml 1 mM PV i Tyrodens buffer til cellerne og inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
  4. Udfør ligandstimuleringen.
    1. Stimuler celler med liganden af interesse ved hjælp af passende koncentration, tid og temperatur. For maksimal EGFR-stimulering inkuberes med 1 ml 50 nM epidermal vækstfaktor (EGF, se materialetabel) + 1 mM PV i Tyrodes buffer i 5 minutter ved 37 °C.
  5. Udfør cellelyse.
    1. Efter ønsket cellebehandling anbringes fadet på is og vaskes med iskold 1x PBS. Fjern det fulde volumen PBS helt ved hjælp af en pipette.
    2. Der tilsættes 180 μL lysisbuffer (trin 2.2.2) til pladen. Brug en celleskraber til at trække buffer rundt om pladen for at dække cellerne helt. Påfør fast, ensartet tryk med celleskraberen over hele den dyrkede overflade for at lyse cellerne fuldt ud.
      BEMÆRK: Volumenet af lysisbuffer skal holdes på et minimum for at sikre en høj proteinkoncentration.
    3. Pipette de lyse celler og overfør dem til et 1,5 ml rør. Hold røret på is i 30 min. Vortex lysaterne hvert 5. minut.
      BEMÆRK: Hvis POI består af flere underenheder eller er følsom over for dissociation, må du ikke vortex lysaterne.
    4. De lysede celler centrifugeres ved 16.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml rør ved hjælp af en pipette. Dette indeholder det samlede proteinlysat.
    5. 10 μL af lysatet reserveres, og det fortyndes til 90 μL af lysisbufferen til bicinchoninisk kolorimetrisk analyse (BCA)17. Det resterende totale proteinlysat opbevares ved -80 °C.
    6. Bestem lysat total proteinkoncentration ved hjælp af BCA-analyse (se materialetabel).
      BEMÆRK: Samlede proteinlysater kan fremstilles på forsøgsdagen og anvendes friske eller opbevares som alikvoter til engangsbrug ved -80 °C i op til 12 uger. Du må ikke fryse/tø op.

3. Funktionalisering af arrayet med det biotinylerede antistof

  1. Forbered følgende løsninger.
    1. T50 Buffer, en opløsning af 10 mM Tris-HCi (pH 8,0) og 50 mM NaCl. Opløsningen er stabil i 1 måned hos RT.
    2. T50-BSA ved at supplere T50-bufferen med 0,1 mg/ml BSA. Opbevar den tilberedte opløsning på is.
    3. 10 mg/ml natriumborhydrid (NaBH4) i 1x PBS. Forbered dette umiddelbart før brug.
    4. 0,2 mg/ml NeutrAvidin (se materialetabel) i T50-buffer.
      FORSIGTIG: NaBH4 er et reduktionsmiddel og er brandfarligt. Rengør altid beholderen med nitrogengas efter brug og opbevar den i en ekssikkator.
  2. Funktionaliser arrayet med det biotinylerede antistof.
    1. Fjern PEG-biotin funktionaliserede arrays fra fryseren og ligevægt det koniske rør til RT inden åbning. Dækslippen placeres med arrayet orienteret op på en tætningsfilm foret 100 mm vævskultur (TC100) skål.
      BEMÆRK: Minimer overliggende belysning. Alle løsninger skal "perle op" på firkanterne defineret af det hydrofobe array. Tilsæt et passende volumen opløsning for fuldstændigt at dække hver firkant (typisk 10-15 μL) og lad ikke væske løbe over det definerede rum. For hurtigt at fjerne væsker skal du bruge en intern vakuumledning fastgjort til en vakuumkolbe til at fange affald. Lad NaBH4 afgasse i 1 time før bortskaffelse ved at lade røret stå åbent i den kemiske røghætte. NaBH4-behandling er nødvendig for at reducere baggrundsautofluorescens og derved reducere falsk-positive enkeltmolekyledetektioner.
    2. Behandl hver firkant i arrayet med 10 mg / ml NaBH4 i 1x PBS i 4 minutter ved RT. Vask tre gange med PBS.
    3. Inkuber hver firkant i 5 minutter med 0,2 mg/ ml NeutrAvidin i T50. Vask tre gange med T50-BSA.
      BEMÆRK: NeutrAvidin binder sig til PEG-biotin og giver et bindingssted for biotinylerede antistoffer 12,13,15.
    4. Inkuber hver firkant i 10 minutter med 2 μg/ml biotinyleret POI-specifikt antistof i T50-BSA; vask tre gange med T50-BSA.
      BEMÆRK: Denne protokol bruger biotinyleret anti-EGFR IgG (se materialetabel) til at fange EGFR-GFP.

4. SiMPull af POI fra helcellelysater

BEMÆRK: Læg TC100-skålen med funktionaliserede SiMPull-arrays på is i resten af SiMPull-præparatet. Dette trin er pull-down af en POI fra total proteinlysat. Lysatet må ikke genbruges efter optøning.

  1. Forbered følgende løsninger.
    1. Der fremstilles 4 % paraformaldehyd (PFA)/0,1 % glutaraldehyd (GA) i 1x PBS.
      FORSIGTIG: PFA og GA er giftige kemiske fikseringsmidler og potentielle kræftfremkaldende stoffer. Brug ppe. Bortskaf kemikalierne som farligt affald i henhold til lokale regler og retningslinjer.
    2. 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.
  2. Tø op og bland lysatet ved forsigtigt at pipettere op og ned. Opbevares på is.
  3. 1 μL af lysatet fortyndes til 100 μL iskold T50-BSA/PPI.
    BEMÆRK: Bestem om nødvendigt den passende fortyndingsfaktor for det samlede proteinlysat ved at påføre en række fortyndinger på arrayet. Den optimale tæthed af SiMPull-receptorer pr. array-område er 0,04-0,08/μm2. Lysatfortyndinger kan vurderes i trin 6 (Dataanalyse).
  4. Inkubere lysatet på arrayet i 10 minutter; vask derefter fire gange med iskold T50-BSA/PPI.
  5. Afløb af647-konjugeret antiphosphotyrosinantistof (se materialetabel) fortyndes i iskold T50-BSA/PPI og inkuberes på arrayet i 1 time.
    BEMÆRK: I denne protokol anvendes en pan anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG til at identificere den phosphorylerede population af EGFR-GFP. Anvendelsen af direkte mærkede antistoffer fjerner behovet for sekundære antistoffer, øger mærkningsmulighederne og forbedrer konsistensen af resultaterne. Fluorescerende mærkede antistoffer kan opnås fra kommercielle kilder. Hvis de ikke er kommercielt tilgængelige, kan antistoffer tilpasses ved hjælp af standard biokonjugationsteknikker, og kommercielle biokonjugationssæt er tilgængelige. Hvert parti fluorescerende mærkede antistoffer skal testes for optimale mærkningsforhold ved at udføre SiMPull for at måle en dosiskurve og finde mætningspunktet.
  6. Vask seks gange med iskold T50-BSA i alt 6-8 min.
  7. Vask to gange med iskold 1x PBS.
  8. Inkuber arrayet med 4% PFA/ 0,1% GA-opløsning i 10 minutter for at forhindre antistofdissociation.
  9. Der vaskes to gange i 5 minutter hver med 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS for at inaktivere fikseringsmidlerne.
    BEMÆRK: For forsøg med mere end ét antistof (f.eks. påvisning af flere phosphotyrosinsteder) gentages trin 4.5-4.9. Se trin 6.2.9 for oplysninger om bestemmelse af sterisk hindring mellem to antistoffer.

5. Erhvervelse af billeder

BEMÆRK: Billedoptagelse med et enkelt molekyle udføres ved hjælp af et 150x TIRF-mål og en billedsplitter, der fanger hver spektralkanal i en bestemt kvadrant af emCCD-kameraet (se Materialetabel). Kalibreringsbilleder erhverves først for at muliggøre kanalregistrering og kalibrering af kameraforstærkning med et nanopatterned kanaljusteringsgitter (nanonet), der indeholder 20 x 20 arrays på 200 ± 50 nm huller i en intrahole afstand på 3 ± 1 μm (total størrelse ~ 60 μm × 60 μm).

  1. Udfør kanalregistrering ved at følge nedenstående trin.
    BEMÆRK: Nøjagtig kanalregistrering er nødvendig for korrekt beregning af koloniseringen af emittere. Dette trin er kritisk.
    1. Rens oliemålet og aflejr en dråbe olie på målet. Placer nanonettet på scenen til billeddannelse. Brug transmitteret hvidt lys til at fokusere på gittermønsteret.
      BEMÆRK: Billeder med nanonettet erhverves ved hjælp af transmitteret lys, som passerer gennem nanonettet og detekteres i alle spektrale kanaler. Alternativt kan man bruge multifluorescerende perler, der udsender fluorescens detekteret i hver kanal. Billedoptagelse skal optimeres i henhold til hver mikroskopopsætning.
    2. Anskaf en serie på 20 billeder af gitteret. Sørg for, at pixel ikke er mættede. Gem billedserien som "Fiducial."
    3. Defokuser nanonettet for at skabe et luftigt mønster18. Anskaf en serie på 20 billeder til forstærkningskalibreringer. Gem billedet som "Gain".
    4. Få en serie på 20 billeder til kameraforskydning ved at blokere alt lys fra at gå til kameraet. Gem billedet som "Baggrund".
  2. Anskaf SiMPull-billeder.
    BEMÆRK: Før du afbilder coverslip-arrayet, skal du udskifte Tris-løsningen med T50-BSA og afbalancere arrayet til RT.
    1. Rens oliemålet og aflejr yderligere olie på målet. Fastgør dækslip array på mikroskopstadiet.
    2. Optimer hver fluorofors excitationseffekt, TIRF-vinkel og kameraintegrationstid. Målet er at opnå det højeste signal-til-støj og samtidig minimere fotobleaching af prøven. Registrer lasereffekten for konsistens i fremtidige målinger.
      BEMÆRK: Den nuværende undersøgelse anvendte 300 ms eksponeringstid for den langt røde kanal og 1 s for den grønne kanal. 642 nm laseren blev brugt ved ca. 500 μW lasereffekt, mens 488 nm laseren blev brugt ved 860 μW, målt før rørlinsen.
    3. Indhent billeder for hver prøve. Forestil dig den langt røde kanal først, efterfulgt af hver fluorofor med lavere bølgelængde for at reducere fotobleaching. På grund af den lave volumen, der bruges til hver prøve, skal du kontrollere bufferniveauet hvert 30-45 minut og genopfylde efter behov.

6. Analyse af data

  1. Download demokoderne.
    BEMÆRK: Den medfølgende demokode og eksempeldatasæt demonstrerer den fulde dataanalysearbejdsgang (Supplerende kodningsfiler 1-4). De systemkrav, der er angivet i SiMPullMain.m, findes i Supplerende kodningsfil 1.
    1. Pak ud og gem i en personlig mappe Dokumenter/MATLAB (MacOS/Linux) eller Dokumenter\MATLAB (Windows).
      BEMÆRK: Dette genererer fire nye mapper: SiMPull_class, smite, Sample Data, Sample Analysis Outputs.
    2. Åbn filen "ReadMe_Setup.txt", der findes i mappen SiMPull_class.
    3. Installer MATLAB- og MATLAB-værktøjskasser: Værktøjskasse til tilpasning af kurver, værktøjskasse til parallel databehandling og værktøjskasse til statistik og maskinel indlæring.
    4. Installer DipImage19 i henhold til downloadinstruktionerne.
    5. Installer "smite" enkeltmolekyleanalysepakke som beskrevet i ReadMe_setup.txt.
      BEMÆRK: "smite" er tilgængelig på GitHub-lageret (se Materialetabel).
    6. Åbn SiMPullMain.m, der findes i SiMPull_class mappe, ved at trække filen ind i MATLAB-vinduet.
    7. Skift mappe til ... \ MATLAB \ Sample Data \ ved at klikke på ikonet Søg efter mappe og vælge mappen.
  2. Oversigt over databehandlingstrin
    1. Kør SiMPullMain.m - følg instruktionerne for hvert afsnit. Udfør hvert afsnit individuelt ved at placere markøren i det afsnit og klikke på ikonet Kør sektion.
      BEMÆRK: De generelle trin til dataanalyse er beskrevet i dette afsnit. Detaljerede instruktioner findes i den medfølgende SiMPullMain.m-kode.
    2. Kør afsnittet "Initialisering" for at indstille stien til at definere spektrale kanaler og billedstørrelse.
    3. Kør afsnittet "Find kameraforstærkning og forskydning" for at konvertere kameraforstærkning til fotoner ved hjælp af datasæt for forstærkning og baggrund.
    4. Kør afsnittet "Kanalregistrering" for at beregne den lokale vægtede gennemsnitlige transformation, der bruges til billedregistrering.
    5. Formatér og organiser dataene. Kør afsnittet "Deltag i sekventielle kanaler i et quad-billede". Kør "Fjern dårlige rammer".
    6. Kør afsnittet "Tilpas enkeltmolekyler og find overlappende molekyler".
      BEMÆRK: Dette afsnit udfører flere funktioner for at lokalisere enkelte molekyler i hver kanal og bestemme koloniseringshændelser mellem spektralkanaler.
    7. For at bestemme det mindste fotonantal pr. Ægte GFP-pasform skal du køre "Optimer minimumfotontærskel". Dette er en iterativ proces.
      1. Først skal du indstille smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] og kør sektionen. Vælg "Blank Data" -filer, når du bliver bedt om det. Gentag med "CHO-EGFR-GFP" -filerne.
      2. Vælg en passende minimumstærskelværdi ved at sammenligne de to histogrammer. Indstil smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] og kør sektionen igen.
    8. Kør afsnittet "Beregn procentdel af GFP passer positivt for FR-signal" for at rette baggrundslokaliseringer og beregne endelige værdier.
    9. Udfør mulighed 1 (trin 6.2.10) eller mulighed 2 (trin 6.2.11) i henhold til eksperimentelt behov.
    10. Mulighed 1: Korrigeres for antallet af receptorer, der er tilgængelige ved plasmamembranen til ligandbinding, som beskrevet i reference15.
      1. Først mærke overflade receptorer med mættende niveauer af fluorescerende NHS Ester farvestof (NHS-AF647, se Tabel over materialer). Udfør derefter et SiMPull-eksperiment for at bestemme procentdelen af GFP-lokalisering, der kolocaliseres med AF647.
        BEMÆRK: Dette giver et skøn over den brøkdel af receptorer, der er tilgængelige til NHS-mærkning, og forholdet mellem receptorer på overfladen (SR).
      2. Anvend SR-korrektionen i den endelige beregning: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, hvor NGFP er det korrigerede antal GFP-lokaliseringer, NBG er baggrundslokaliseringsnummeret, og NLOC er samlede lokaliseringer.
        BEMÆRK: I dette eksempel anvendes denne korrektion ikke, fordi Pervanadat ermembrangennemtrængeligt 16 , og derfor er virkningen af fosfatasehæmning ikke begrænset til overfladereceptorer.
    11. Mulighed 2: For multisite phosphoryleringsmålinger skal du overveje potentialet for sterisk hindring, når der anvendes to antistoffer.
      BEMÆRK: Sterisk hindring kan forårsage en reduktion i den observerede procentdel af phosphorylerede receptorer for antistof 1, når det er i nærværelse af antistof 2 (P12), sammenlignet med antistof 1 alene (P1).
      1. Brug SiMPull til at bestemme P1 og P12 og beregne korrektionsfaktoren for sterisk hindring efter tidligere offentliggjort reference15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tegneserie, der viser SiMPull-processen, er vist i figur 1A. Coverslips funktionaliseres ved hjælp af NeutrAvidin som et anker for biotinylerede anti-EGFR-antistoffer til at fange EGFR-GFP fra totale proteinlysater. Efter vask af ubundet protein mærkes de phosphorylerede receptorer med et anti-phosphotyrosin (anti-PY) antistof15. Figur 1B viser et billede af det hydrofobe array, hvor flere prøver kan fremstilles og afbildes på samme dækslip. En fordel ved denne prøveholder er, at der kræves minimale prøvevolumener på ~ 10 μL. Dækslippen kan afbildes ved at placere den direkte på mikroskopstadiet. Det er dog nyttigt at stabilisere dækslippen ved hjælp af en dækslipholder. Dækslipholderen vist i figur 1B blev oprettet ved hjælp af en 3D-printer, og tegningen findes i supplerende kodningsfil 5. Autofluorescensen af det hydrofobe blæk er en nyttig vejledning til at finde prøvens brændplan (figur 1C). Et eksempel på et multikanals raw-billede er vist i figur 1D. En overlejring af de rågrønne og langt røde kanaler vises i figur 1E.

Figur 2 skitserer analysearbejdsgangen og giver repræsentative data. Dataindsamling starter først med at erhverve fiducialer til kanalregistrering, som bruges til at overlejre de enkelte spektralkanaldata (figur 2A). Bright-field billeder tages ved hjælp af et nanogrid mønster, der passerer hvidt lys og registreres i hver spektral kanal i billedsplitteren (ikke vist). Den grønne kanal fungerer som referencekanal, og den langt røde kanal er den skiftede kanal. Den lokale vægtede gennemsnitlige transformation beregnes ved hjælp af fitgeotrans20-funktionen i MATLAB og bruges til at flytte langt røde koordinater ind i koordinatrammen for den grønne kanal. Denne transformation bruger en andenordenspolynomialmodel ved hvert kontrolpunkt. Multikanaldata fra SiMPull-arrayet erhverves derefter. Denne arbejdsproces bestod af en halvautomatisk anskaffelse, hvor der blev valgt et startafkast for den specifikke eksempelfirkant, og tre områder omkring dette område blev afbildet, således at hvert datasæt indeholder det fulde quad-view-billede fra tre uafhængige ROI'er (figur 1D). I hver spektralkanal findes emitterkandidatplaceringerne ved at anvende en forskel på gaussisk filter på billeder og identificere lokale maksima. Underregioner (bokse, figur 2B) er tegnet omkring lokale maksima, og emitterfotontællinger estimeres ved at antage, at hver underregion kun indeholder en emitter. Subregioner, der har emitterkandidater med fotontællinger over en minimumsværdi, bevares til montering. En gaussisk punktspredningsfunktion (PSF) passer til hver emitterkandidat inden for små underregioner, der er omtrent centreret omkring hver emitter. De resulterende lokaliseringer er tærskelværdier baseret på deres fotonantal, baggrund, Cramér-Rao nedre grænse for tilpasningskoordinaterne, PSF-varians (dvs. PSF-bredde) og en p-værdi, der beskriver godheden af pasformen af PSF-modellen. Et gaussisk billede oprettes for hver spektralkanal med ensartet intensitet Gaussiske klatter placeret ved koordinaterne for hver god pasform (figur 2C). Koloralisering visualiseres ved at overlejre de gaussiske billeder fra hver spektralkanal ved hjælp af transformationen beregnet ud fra fiducialprøven (figur 2D). Det er vigtigt at fluorescerende mærke receptoren til identifikation, da der stadig er ikke-specifik binding af antiphosphotyrosinantistofferne til overfladen, når cellelysat er til stede. EGFR-GFP (grøn kanal) bruges til at generere en maske af receptorplaceringerne, og kun AF647-anti-PY-signalet (langt rød kanal) inden for denne maske tælles (figur 2D). Par inden for 1 pixel (pixelstørrelse på 106,7 nm) anses for at være kolokaliserede og gemmes på en liste, der indeholder referencekanalkoordinaterne. Procentdelen af AF647 colocaliseret med GFP beregnes for at bestemme fraktionen af phosphorylerede receptorer (figur 2E).

Der er flere kritiske trin for at sikre god datakvalitet. En sådan indsats er at inkubere coverslip array med NaBH4 som beskrevet i protokollen for at slukke autofluorescens i den grønne kanal. Denne autofluorescens refererer til det ikke-specifikke signal på grund af mulige urenheder på glasset, der indeholder enkelt eller konjugeret π bindinger21. Sådanne urenheder er potentielt fra aminosilan- og PEG-reagenserne, der anvendes i funktionaliseringsprocessen eller støv fra luften og har tendens til at fluorescere i den grønne spektralkanal. På trods af bestræbelser på at holde glas opbevaret under nitrogen, kan disse molekyler også genereres gennem oxidation, der forekommer i opbevaring. NaBH4 er også blevet brugt til at reducere fluorescens fra urenheder på dias og mikroarrays, herunder dem med silanbelægning16. Figur 3A viser reduktionen i antallet af baggrundsdetektioner, der opstår, når piranha-ætset glas behandles med NaBH4. Mens NaBH4 reducerer baggrundsfluorescens dramatisk, registreres nogle emittere stadig i den grønne kanal. Man kan rette op på dette ved at hente baggrundsbilleder fra lysatfrie prøver (figur 3D) og trække det gennemsnitlige antal baggrundslokaliseringer fra de GFP-holdige prøver. Fluorescens fra urenheder blev ikke påvist i den langt røde kanal. Hvis receptortætheden er for høj, kan flere GFP-emittere findes inden for et enkelt diffraktionsbegrænset sted (data ikke vist). Ved hjælp af trinfotobleaching til at identificere antallet af GFP'er pr. sted fandt vi, at en receptortæthed mellem 0,04-0,08 proteiner / μm2 gav tilstrækkelig afstand mellem enkeltemittere til at fjerne potentialet for at finde flere emittere pr. Punkt12. Receptortætheden kan optimeres ved at variere mængden af IP-antistof bundet til glasoverfladen eller mængden af tilsat lysat. Det er afgørende at sikre, at antistoffet rettet mod POI anvendes på mættende niveauer. Det anbefales at erhverve en antistofkoncentrationskurve på phosphorylerede prøver for at bestemme de passende mærkningsbetingelser (figur 3B). Derudover skal et antistofs fosfo-specificitet valideres med hvileprøver og/eller behandling med proteinspecifikke kinasehæmmere (figur 3B). Antistoffer vil dissociere fra receptoren i løbet af billeddannelsestidsvinduet. Behandling af prøven med en kombination af PFA og GA forhindrede signaltab (figur 3C).

Endelig er det vigtigt at optimere parametrene for montering af enkeltmolekyler. Det første "box finding"-trin, der identificerer potentielle emitterkandidater (figur 2B), skal være generøst for at give mange kandidater mulighed for at gennemgå gaussisk tilpasning. Således kan minimumsfotontærsklen for boksfinding være relativt lav for at fange alle reelle emittere og nogle baggrundspletter. Det er også vigtigt ikke at indstille kassens størrelse og overlapningsgodtgørelse for lille. At holde kassestørrelsen inden for 5-7 pixels og tillade overlapning på to pixel er ideel til emittere med den anbefalede tæthed. Efter boksfinding skal minimumsfotontærsklen i monteringstrinnet optimeres. Parameteren med minimumfotoner bidrager til at bestemme, hvilke gaussiske monterede emittere der passer som en ægte pasform. For at bestemme den korrekte minimumsfotontærskel for ægte GFP-passer inkluderer koden en histogramplotningsfunktion til at undersøge fotonerne / lokaliseringen i både baggrund (ingen cellelysat) og GFP-holdige (plus cellelysat) prøver (figur 3D). Dette trin er vigtigt, fordi det, mens NaBH4 reducerer mængden af fluorescens fra urenheder, fjerner det ikke alle baggrundslokaliseringer. Figur 3D viser behovet for at fastsætte en minimumsfotontærskel for at reducere antallet af detektioner fra urenheder. For at bestemme denne tærskel beregnes et histogram af baggrundsemitterintensiteter ud fra billeddannelse af en prøve, der ikke udsættes for cellelysat (figur 3D, øverst til venstre). Størstedelen af baggrundsemittere viste sig at have værdier mindre end 475 fotoner. Til sammenligning viste stikprøven, der indeholdt ægte GFP-emittere, en signifikant brøkdel af fordelingen over 475 (figur 3D, øverst til højre). Tærsklen vælges ved inspektion for at fjerne så mange baggrundstællinger som muligt, samtidig med at mængden af signaltab fra lysatprøven minimeres (figur 3D, nederste række). Den resterende baggrundstællingstæthed ved denne tærskel tages i betragtning i den kvantitative analyse.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over prøveforberedelse. (A) Tegneserie, der viser SiMPull-tilgangen. Coverslips funktionaliseres med et antistof, der genkender POI for at fange den POI fra hele cellelysater. Glasset er først belagt med PEG og biotin-PEG. NeutrAvidin er derefter bundet til biotin-PEG og fungerer som et anker for det biotinylerede anti-POI-antistof. Fosforylerede proteiner detekteres derefter med et fluorescerende mærket anti-PY-antistof. (B) Fotografi af dækslipholderen (rød) med dækslip array på plads og monteret på mikroskopstadiet. Multisample arrays genereres ved hjælp af hydrofob blæk for at skabe op til 20 individuelle prøvefirkanter på en enkelt glasdæksler. Dækslippen er 60 mm x 24 mm. (C) Eksempelbilleder af hydrofob blæk autofluorescens (magenta) og fluorescerende perler (grøn). Autofluorescensen af det hydrofobe blæk er en nyttig vejledning til at finde brændplanet ved dækslipoverfladen. (D) Eksempel på et rådatabillede med spektrale kanaler adskilt på kamerachippen af Quad-view-billedsplitteren. Quad-view-filtersættet indeholder følgende emissionsfiltre: blå (445/45 nm), grøn (525/45 nm), rød (600/37 nm), langt rød (685/40 nm). (E) Rå overlejring af grønne og langt røde kanaler. Den hvide boks angiver det område, der undersøges nærmere i figur 2B-D. Skalabjælke (C-E) = 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for dataanalyse. (A) Kanalregistrering udføres først på billeder erhvervet fra nanonettet. Efter beskæring af de to spektrale kanaler af interesse (her grøn og fjernrød), overlejres de fiduciale billeder for hver kanal (til venstre). Forstørrelse af boksen i venstre billede (Indsat) viser, at billederne endnu ikke er registreret rigtigt. Emitterne i hver kanal passer til en gaussisk model og er lokaliseret (registrering). Lokalisering af emittere vises som cirkler for den langt røde kanal og kryds for den grønne kanal. Det sidste trin er at anvende en lokal vægtet middeltransformation for at flytte de langt røde kanallokaliseringskoordinater til den grønne kanalreferenceramme (justeret). Den beregnede lokalt vægtede middeltransformation bruges derefter til at registrere de efterfølgende SiMPull-data. (B) Repræsentative billeder af den grønne/EGFR-GFP-kanal og den fjernrøde/AF647-anti-PY-kanal. Enkeltemittere over baggrundsfotontællingen identificeres og markeres med kasser. (C) Emissionsprofilen i hver valgt boks er tilpasset en gaussisk model, og de emittere, der passer til modellen af en enkelt fluorofor PSF, opbevares. (D) Der oprettes en maske fra GFP-emitterne for at identificere placeringen af EGFR-GFP (grøn). Koloralisering af EGFR-GFP og AF647-anti-PY identificerer phosphorylerede receptorer (hvid). (E) Fraktionen af phosphorylerede receptorer beregnes ud fra de colokaliserede EGFR-GFP og AF647-anti-PY passer. Søjlediagrammet sammenligner PV + EGF-behandling med hvileceller, beregnet som gennemsnit for flere målinger. Fejllinjer repræsenterer standardfejl beregnet under forudsætning af en binomialfordeling. Skalabjælke = 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kritiske trin for at sikre datakvaliteten. (A) Fra venstre mod højre er de første tre paneler repræsentative billeder af autofluorescensen på glas under de respektive betingelser: efter piranha-ætsning med PEG og PEG plus NaBH4-behandling (angivet med +). Derudover bevares overfladefunktionalisering efter NaBH4-behandling som demonstreret ved minimal ikke-specifik PY99-AF647-binding, samtidig med at robust binding af EGFR-GFP fra lysatet bevares. (B) Der skal opnås en mætningskurve for hvert parti antistoffer, der anvendes for at sikre optimal antistofmærkning. Denne figur viser koncentrationskurven for mærkning af EGFR med det stedsspecifikke phosphotyrosinantistof, anti-EGFR-pY1173. Minimal phosphorylering detekteres i ubehandlede celler (Hvilende, grå diamant). Som en kontrol for ikke-specifik binding blev celler også behandlet med EGFR-kinasehæmmeren Lapatinib, før de tilføjede 100 nM EGF (magentatrekant), hvilket viser den forventede forebyggelse af EGFR-phosphorylering. Fejllinjer repræsenterer standardfejl under forudsætning af en binomialfordeling. (C) Fiksering af prøven med en kombination af PFA og GA forhindrer antistofdissociation over tid. Fejllinjer repræsenterer standardfejl under forudsætning af en binomialfordeling. (D) Falske positiver udelukkes ved at vælge den passende tærskel for gaussisk tilpasning. Sammenligning af histogrammet for tilpasningsintensiteter ved en lav tærskel (Tærskel = 0; top) mellem baggrund (intet lysat) og reelle data (plus cellelysat) giver mulighed for valg af passende værdi (Tærskel = 475; bund) for at fjerne passer fra autofluorescerende pletter i den grønne kanal. Den lodrette magentalinje angiver en 475 foton tærskel. Histogrammer beregnes ud fra det samme antal RIE'er for hver prøvetype (n = 3). Skalabjælke = 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende kodningsfil 1: zip-fil, der indeholder scripts og hjælpeprogrammer til kørsel af SiMPull-analyse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2: zip-fil, der indeholder smite-enkeltmolekyleanalysepakken. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3: zip-fil, der indeholder eksempeldataene. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 4: zip-fil, der indeholder repræsentative prøvedataanalyseoutput. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 5: Coverslip holder blueprint til 3D-udskrivning. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her blev optimeret til at muliggøre kvantitative målinger af receptorfosforylering på enkeltproteinniveau. Flere enkle, men vigtige ændringer af SiMPull-protokollen blev udviklet, der forbedrede pålideligheden af målingen til phospho-tyrosindetektion, herunder reduktion af autofluorescens med NaBH4-behandling og efterfiksering af prøven for at forhindre antistofdissociation. Brug af den grønne kanalmaske til at identificere receptorplaceringer til beregning af kolonisering med anti-PY-antistoffet forbedrer også målenøjagtigheden ved at fjerne potentielle artefakter fra den ikke-specifikke binding af antistoffet til cellelyset. Den tofarvede billeddannelse blev brugt til at detektere fraktionen af receptorer phosphoryleret. I dette scenario blev receptoren genetisk mærket med GFP, og antistoffet blev direkte mærket med et langt rødt farvestof. SiMPull-tilgangen gælder for andre proteinmål, for hvilke specifikke antistoffer er tilgængelige, herunder intracellulære proteiner. Da denatureringsbetingelser ikke er påkrævet, kan multisubunitreceptorer/-komplekser desuden også indfanges. Denaturering kan dog indarbejdes, hvis ptm'erne af interesse er placeret i strukturerede regioner af proteinet14. I sidste ende kan SiMPull let udvides til at omfatte samtidig mærkning af forskellige phospho-tyrosiner på individuelle receptorer for at kvantificere multisite phosphoryleringsmønstre15. Undersøgelsen af intakte receptorer i fuld længde på en sådan måde kan ikke opnås ved andre standardmetoder, herunder western blotting og phospho-massespektrometri.

Sammen med fordelene ved SiMPull skal nogle begrænsninger overvejes. Som med enhver antistofbaseret teknik er affiniteten og specificiteten af de anvendte antistoffer afgørende for målingens succes. Derfor er det vigtigt at optimere antistofmærkningsbetingelser og ideelt set undgå sekundære antistoffer ved at bruge direkte mærkede primære antistoffer. Desuden vil de overfladebundne antistoffer udfælde proteiner lokaliseret til plasmamembranen og inden for cytosoliske rum. Dette kan undervurdere phosphorylering, da cytosollokaliserede proteiner ikke er tilgængelige for den eksogent tilsatte ligand. Der skal tages yderligere skridt til at korrigere receptoroverfladeniveauerne (trin 6.2.10). Antiphosphotyrosinantistofferne udviste en vis ikke-specifik binding, når lysat var til stede. For at undgå denne artefakt blev EGFR genetisk mærket med GFP for at identificere placeringen af receptorer, hvilket gjorde det muligt for os at udelukke anti-PY-signalet fra receptoren. Hvis endogene proteiner skal forhøres, kan modbelægning med et totalt proteinantistof give maskebilledet med passende korrektion for enhver ikke-specifik binding. Endelig, mens SiMPull giver information om heterogenitet på proteinniveau, er lysatet genereret i denne protokol fra tusindvis af celler, og celle-til-celle-variabilitet går tabt. Imidlertid er fremskridt i retning af encellet SiMPull blevet foretaget ved hjælp af et flowkammer bestående af en dækslip og en mikroskopside med et hul på 10 μm; bakterier blev sparsomt belagt på dækslen, mens diaset blev funktionaliseret med antistof for at fange de ønskede proteiner. Ved lysis af bakterierne blev proteinerne fra hver celle fanget i et begrænset område på det antistofbelagte dias22. Lignende enkeltcellet SiMPull-analyse af pattedyrceller og proteinfosforylering kan være mulig i fremtiden.

SiMPull-protokollen indeholder flere kritiske trin, der kræves for at sikre data af høj kvalitet. For eksempel indeholder protokollen en udførlig forberedelse af dækslipglasset. Piranha ætsning dækker glider grundigt renser glasset og øger hydroxylgrupper og hydrofilicitet, som er nødvendige for at optimere dækslipoverfladen. Efter flere vaske med organiske opløsningsmidler tilvejebringer KOH-behandling yderligere hydroxylgrupper til aminosilanisering13,23, som belægger glasset med amingrupper til PEG- og biotin-PEG-binding. Forkert rengøring eller funktionalisering ved et af disse trin vil forstyrre proteinnedtrapning. Kontrol af molforholdet mellem PEG: biotin-PEG sammen med lysatkoncentration er nøglefaktorer for at opnå passende protein-IP-densitet på SiMPull-substratet. Som med ethvert biologisk assay er der variabilitet mellem cellelysatpræparater, og små forskelle mellem phosphoryleringsprocenter kan ses mellem prøvereplikater. Derfor er det vigtigt at måle phosphoryleringsniveauerne for forskellige tyrosinsteder inden for samme prøve. Prøvekammeret beskrevet i denne protokol giver et system til at indsamle mange datapunkter i en billedbehandlingssession og giver mulighed for gennemsnit over flere SiMPull-eksperimenter.

På billedoptagelsessiden er det vigtigt at opnå den fiduciale prøve for at sikre en nøjagtig kanaloverlejring; Ellers vil kolonisering ikke være nøjagtig. Det er også vigtigt at optimere laserkraft og kameraindstillinger for at maksimere signal-støj og samtidig minimere fotobleaching. Endelig, mens prøvearrayet kræver en lille mængde prøve og reagenser, er de lave volumener modtagelige for fordampning under billeddannelsessessionen. Det er vigtigt med jævne mellemrum at kontrollere prøvearrayet (~ 30-45 min) og tilføje buffer efter behov for at forhindre prøver i at tørre.

Den nuværende protokol demonstrerede brugen af SiMPull til at kvantificere membranreceptorfosforyleringstilstande. Mens den fokuserer på EGFR, kan tilgangen anvendes på andre celleoverfladereceptorer og intracellulære proteiner og proteinkomplekser, så længe der er passende antistoffer til rådighed. En anden potentiel anvendelse for SiMPull er at undersøge indholdet og phosphoryleringsstatus for faseseparerede kondensater. Derudover kan SiMPull bruges til at måle andre PTM'er, såsom ubiquitination. Derfor giver SiMPull et unikt værktøj til cellebiologer til at forhøre PTM'er på intakte proteiner og korrelere PTM-mønstre med cellulært resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 og R01CA248166 til DSL. EMB blev støttet gennem ASERT-IRACDA-programmet (NIH K12GM088021) og JAR af UNM MARC-programmet (NIH 2T34GM008751-20). Vi anerkender taknemmeligt at bruge University of New Mexico Comprehensive Cancer Center fluorescensmikroskopi delt ressource, støttet af NIH P30CA118100. Vi vil gerne anerkende Dr. Ankur Jain og Taekijip Ha, hvis oprindelige udvikling af SiMPull inspirerede dette arbejde.
ES-C nuværende adresse: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Tags

Biokemi udgave 184
Et optimeret enkeltmolekyle pull-down assay til kvantificering af proteinfosforylering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter