Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка

Published: June 6, 2022 doi: 10.3791/63665
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 2,3, 1,3
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

Summary

Настоящий протокол описывает пробоподготовку и анализ данных для количественной оценки фосфорилирования белка с использованием улучшенного анализа вытягивания одной молекулы (SiMPull).

Abstract

Фосфорилирование является необходимой посттрансляционной модификацией, которая регулирует функцию белка и направляет результаты передачи сигналов клетками. Современные методы измерения фосфорилирования белка не могут сохранить гетерогенность фосфорилирования в отдельных белках. Анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был разработан для исследования состава макромолекулярных комплексов путем иммунопреципитации белков на стеклянном покровном листе с последующей одномолекулярной визуализацией. Современный метод представляет собой адаптацию SiMPull, которая обеспечивает надежную количественную оценку состояния фосфорилирования полноразмерных мембранных рецепторов на уровне одной молекулы. Визуализация тысяч отдельных рецепторов таким образом позволяет количественно оценить паттерны фосфорилирования белка. Настоящий протокол детализирует оптимизированную процедуру SiMPull, от подготовки образца до визуализации. Оптимизация препаратов стекла и протоколов фиксации антител еще больше повышает качество данных. Текущий протокол предоставляет код для анализа одномолекулярных данных, который вычисляет фракцию рецепторов, фосфорилированных в образце. Хотя эта работа фокусируется на фосфорилировании рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), протокол может быть обобщен на другие мембранные рецепторы и цитозольные сигнальные молекулы.

Introduction

Мембранно-ассоциированная сигнализация настраивается комбинацией активации мембранных рецепторов, индуцированной лигандами, и рекрутирования последующих вспомогательных белков, которые распространяют сигнал. Фосфорилирование ключевых тирозинов в рецепторных цитоплазматических хвостах имеет решающее значение для инициирования образования сигнальных комплексов, или сигналосом 1,2. Поэтому важным вопросом в биологии является то, как создаются и поддерживаются паттерны фосфорилирования для привлечения сигнальных партнеров и диктовки клеточных результатов. Это включает в себя понимание гетерогенности фосфорилирования рецепторов, как в изобилии, так и в специфических паттернах фосфотирозина, которые могут обеспечить средство манипулирования сигнальными выходами путем диктовки составасигналосомы 3,4,5,6,7. Тем не менее, существуют ограничения в современных методах опроса фосфорилирования белка. Западный блот-анализ отлично подходит для описания тенденций фосфорилирования белка, но является полуколичественным8 и не дает информации о неоднородности системы, потому что тысячи и миллионы рецепторов усредняются вместе. В то время как западные пятна позволяют исследовать образец с использованием фосфоспецифических антител к специфическим тирозинам, они не могут предоставить информацию о многосайтовых моделях фосфорилирования в пределах одного белка. Количественная фосфопротеомика сообщает об изобилии фосфотирозина, но существуют ограничения на обнаружение многосайтового фосфорилирования, поскольку интересующие остатки должны быть расположены в пределах того же пептида (обычно 7-35 аминокислот), который генерируется ферментативным сбраживанием 9,10,11.

Чтобы преодолеть ограничения, упомянутые выше, анализ одномолекулярного вытягивания (SiMPull) был адаптирован для количественной оценки состояний фосфорилирования интактных рецепторов на уровне одной молекулы. SiMPull был впервые продемонстрирован в качестве мощного инструмента для опроса макромолекулярных комплексов Jain et al.12,13. В SiMPull макромолекулярные комплексы были иммунопреципитированы (IP) на стеклянных покровах, функционализированных антителами, а затем проанализированы с помощью одномолекулярной микроскопии для определения числа субъединиц белка и co-IP со сложными компонентами12. Модификация Kim et al.14, получившая название SiMBlot, была первой, которая использовала вариацию SiMPull для анализа фосфорилирования денатурированных белков. Протокол SiMBlot основан на захвате биотинилированных белков клеточной поверхности с использованием покрытых NeutrAvidin покровных пластинок, которые затем исследуются на предмет фосфорилирования с маркировкой фосфоспецифических антител14. Несмотря на эти достижения, необходимы улучшения, чтобы сделать количественную оценку посттрансляционной модификации более надежной и применимой к более широкому спектру белков.

Настоящий протокол описывает оптимизированный подход SiMPull, который использовался для количественной оценки паттернов фосфорилирования интактного рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в ответ на ряд лигандных состояний и онкогенных мутаций15. Хотя эта работа сосредоточена на EGFR, этот подход может быть применен к любому мембранному рецептору и представляющим интерес цитозольным белкам (POI), для которых доступны качественные антитела. Протокол включает в себя шаги по снижению автофлуоресценции образца, конструкцию массива образцов, которая требует минимального объема образца с одновременной подготовкой до 20 образцов, а также оптимизацию условий маркировки и фиксации антител. Разработаны алгоритмы анализа данных для обнаружения одной молекулы и количественной оценки фосфорилированных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка чехла

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага необходимо надеть средства индивидуальной защиты (СИЗ), которые включают в себя двойной слой нитриловых перчаток, защитные очки или лицевой щиток, а также лабораторный халат.

  1. Выполните травление пираньи, чтобы удалить органический мусор из стекла.
    ВНИМАНИЕ: Раствор пираньи является сильным окислителем, который является коррозионным и высокореакционноспособным при контакте с органическими материалами. Реакция с органическим мусором является экзотермической и потенциально взрывоопасной. Таким образом, процедура должна выполняться в химическом вытяжном шкафу с опущенной створкой. Стеклянная посуда Pyrex необходима для обработки раствора пираньи.
    1. Подготовьте рабочее пространство внутри химического вытяжного шкафа. Расположите крышки без перекрытия в нижней части 4-литрового стеклянного стакана, «реакционного» стакана, и поместите реакционный стакан на конфорку с мягким нагревом. Дайте стеклянной посуде нагреться в течение 10 минут. Поместите «отработанный» стеклянный стакан объемом 1 л с 500 мл ddH2O проксимально к реакционному стакану.
    2. Медленно добавляйте 49 мл 12 N серной кислоты (H2SO4) в реакционный стакан со стеклянной серологической пипеткой. Промыть пипетку в стакане для отходов перед утилизацией.
    3. Добавьте 21 мл 30% перекиси водорода (H2O2) по каплям со стеклянной серологической пипеткой в реакционный стакан. Медленно распределите каплиH2O2 равномерно по дну реакционной колбы, чтобы предотвратить локализованное закаливание реакции травления пираний. Промыть пипетку в стакане для отходов перед утилизацией.
      ВНИМАНИЕ: Всегда добавляйте H2O2 в H2SO4, и никогда наоборот.
    4. Пираньи травят крышки в течение 30 минут. Осторожно перемешивайте содержимое реакционного стакана каждые 5 мин.
    5. Погасите раствор пираньи, вылив содержимое отработанного стакана в реакционный стакан. Медленно перенесите жидкость вниз по стенке реакционного стакана, чтобы свести к минимуму брызги. Снимите реакционный стакан с конфорки.
    6. Когда реакцию закалят и охладят, вылейте раствор пираньи обратно в стакан для отходов для нейтрализации, не снимая травленые крышки из реакционного стакана.
    7. Нейтрализуют раствор пираньи с постепенным добавлением слабого основания. Например, используют чрезмерную массу 20 г бикарбоната натрия (NaHCO3)/100 мл раствора пираньи.
      ВНИМАНИЕ: Не храните растворы пираньи в герметичных контейнерах для отходов. Раствор всегда должен быть нейтрализован перед утилизацией. Реакция нейтрализации производит энергичные пузырьки и может быть взрывоопасной, если не контролироваться постепенным добавлением слабого основания.
    8. Нейтрализованный раствор перемешайте стеклянным стержнем и дайте ему вступить в реакцию в течение 2 ч. Поднимите рН до >4 и утилизируйте раствор.
    9. Между добавлением слабого основания к раствору пираньи перекладывают травленые крышки из реакционного стакана в воронку Бюхнера со стеклянным стержнем перемешивания и промывают в течение 5 мин в процессе ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно переходите к следующему шагу или храните травленые крышки пираньи до 2 недель в ddH2Oв запечатанной стеклянной банке или чашке Петри (оберните герметизирующей пленкой, см. Таблицу материалов).
  2. Обтекайте крышки органическими растворителями ультразвуком, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Поместите крышки в стеклянную банку Коплина (см. Таблицу материалов) и накройте метанолом (CH3OH). Закройте крышку банки герметизирующей пленкой и на 10 мин. Осторожно вылейте метанол из банки Коплина в стеклянную бутылку для хранения.
    2. Наполните банку Коплина ацетоном (C3H6O), закройте крышку и втирайте ультразвуком в течение 10 минут. Осторожно вылейте ацетон из банки Коплина в стеклянную бутылку для хранения.
      ВНИМАНИЕ: Метанол легковоспламеняется и остро токсичен. Используйте в химическом вытяжном шкафу. Ацетон является легковоспламеняющимся и раздражителем. Поэтому обрабатывайте и храните его в стекле, а также используйте его в химическом вытяжном шкафу. Утилизировать как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол и ацетон могут быть повторно использованы до пяти раз каждый.
  3. Активируйте поверхность крышки для функционализации силана.
    1. Ванна-ультразвук с 1 М гидроксида калия (KOH) в течение 20 мин. Осторожно вылейте KOH из банки Coplin в коническую трубку объемом 50 мл для повторного использования.
      ВНИМАНИЕ: KOH является коррозионным и раздражающим фактором. Используйте в химическом вытяжном шкафу и не храните в стекле. Храните его в полипропиленовых тубах. Утилизировать как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: KOH можно повторно использовать до пяти раз.
    2. Дважды промойте ddH2O. Стейте ddH2O с облицовочных пластинок, а затем нагрейте каждый покров, размахивая пламенем горелки Бунзена, чтобы отогнать всю поверхностную влагу. Поместите крышки в сухую банку Coplin.
  4. Выполняют аминосиланизацию покрова.
    1. Готовят раствор аминосилана, смешивая 69,4 мл метанола с 3,6 мл уксусной кислоты (CH3COOH) в конической колбе. Добавьте 720 мкл N-(2-аминоэтил)-3-аминопропилтриметоксисилана (аминосилана) и хорошо перемешайте (см. Таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Уксусная кислота является легковоспламеняющейся и коррозионной. Обработайте стеклянными пипетками и храните в стекле. Работа с уксусной кислотой в химическом вытяжном шкафу. Аминосилан является остротоксичной опасностью для вдыхания, сенсибилизатором и раздражителем. Вреден для водной флоры и фауны. Используйте в химическом вытяжном шкафу. Утилизируйте химические вещества как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аминосилан является светочувствительным и быстро гидролизуется в воде. Все этапы с этим реагентом должны выполняться в условиях минимальной освещенности, чтобы сохранить активность. Продувите баллон газообразным азотом и нанесите уплотнительную пленку перед хранением в темном осушителе. Заменяйте каждые 6-9 месяцев.
    2. Немедленно добавьте раствор аминосилана в банку Коплина. Накройте крышкой и нанесите уплотнительную пленку, продолжая защищать от света.
    3. Инкубировать покровы в растворе аминосилана в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре (RT). Ванно-ультразвуком в течение 1 мин, а затем инкубировать еще 10 мин. Осторожно вылейте раствор аминосилана в контейнер для отходов, предназначенный для CH3OH со следами аминосилана и CH3COOH.
    4. Промойте крышки метанолом и вылейте раствор в контейнер для отходов, предназначенный для метанола.
    5. Промойте крышки три раза в течение 2 мин каждый с ddH2O. Слейте крышки, смойте лишнюю влагу и полностью высушите на воздухе в течение 10 минут.
  5. Выполните подготовку массива/функционализацию покрытий биотин-ПЭГ.
    1. Готовят 1 М NaHCO3 (рН 8,5) рабочего материала, растворяя 84,5 мг NaHCO3 в 1 мл ddH2O. Для получения конечной концентрации 10 мМ NaHCO3 разбавляют 1 М NaHCO3 в ddH2O(1:100).
    2. Нарисуйте массив сетки на сухих аминосиланизированных покровных листах гидрофобным барьерным пером (см. Таблицу материалов) и дождитесь высыхания чернил. Запишите идентификатор на обложке, чтобы отметить правильную ориентацию. Поместите крышки в увлажненную камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Массив должен состоять из 16-20 квадратов, размером примерно 4 мм х 4 мм.
    3. Чтобы получить раствор биотина-ПЭГ сукцинимидила валерата (биотин-ПЭГ)/mPEG сукцинимидил валерат (mPEG), сначала удалите mPEG и биотин-PEG (см. Таблицу материалов) из морозильной камеры и уравновесьте до RT. Добавьте 153 мг mPEG и 3,9 мг биотина-PEG (~1:39 биотин-PEG:mPEG) в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и повторно суспендируйте в 609 мкл 10 мМ NaHCO3 путем бережного пипетирования. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин при РТ для удаления пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Период полураспада сукцинимидила валерата в буфере рН 8,5 составляет ~30 мин. После добавления буфера в mPEG выполните следующие действия как можно быстрее. Этот шаг имеет решающее значение.
    4. Применяют раствор биотин-ПЭГ/мПЕГ, чтобы полностью покрыть каждый квадрат в покровных массивах, обычно 10-15 мкл на квадрат. Не позволяйте жидкости переполнять определенное пространство. Храните крышки в камере влажности в темноте в течение 3-4 ч при РТ.
    5. Промойте крышки обильным количеством воды, последовательно погружая их в стеклянные стаканы объемом 3x 250 мл, заполненные ddH2O на 10 с каждый.
    6. Отгоните всю влагу из обшивки газообразным азотом. Храните крышки спиной к спине в заполненной азотом конической трубке объемом 50 мл, обернутой уплотнительной пленкой при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно перейдите к шагу 2 или храните крышки при температуре -20 °C в течение 1 недели перед использованием.

2. Приготовление лизата SiMPull

ВНИМАНИЕ: Необходимыми СИЗ для остальных этапов протокола являются нитриловые перчатки, защитные очки и лабораторные халаты.

ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты получали из адгезивных CHO-клеток, экспрессирующих EGFR-GFP. Клетки покрывали в 60-миллиметровой чашке для культуры тканей (TC60) в течение12,13. Клетки CHO культивировали в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 500 нг/мл генетикина (см. Таблицу материалов). Также могут использоваться другие адгезивные клеточные линии или суспензионные ячейки.

  1. Разбейте ячейки, выполнив следующие действия.
    1. Посуду для культивирования (содержащую клетки) вымыть 1 мл 1x PBS. Добавьте 1 мл 1x трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C для отделения клеток. С помощью пипетки перенесите отсоединенные ячейки из чашки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    2. Взять 10 мкл трипана синего и смешать с 10 мкл клеточной суспензии в отдельной центрифужной трубке. Подсчитывайте ячейки с помощью 10 мкл клеточной смеси в автоматическом счетчике ячеек, согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
    3. Пластина 8 х 105 клеток на ночь в чашке Петри TC60. Накройте по одному блюду для каждого условия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования клетки либо не лечили, либо обрабатывали перванадатом и EGF, как описано на этапе 2.4.1.
  2. Подготовьте следующие растворы для приготовления клеточного лизата.
    1. Приготовьте ледяной 1x PBS (pH 7,4).
    2. Готовят лизисный буфер, раствор 1% неионного, недегенеративного детергента (см. Таблицу материалов) в 50 мМ Tris-HCl (рН 7,2) и 150 мМ NaCl с добавлением ингибитора протеазы/фосфатазы (PPI) (1:100 из запаса). Поместите пробирку на нутатор и дайте буферу перемешаться в течение 15 мин. Выдержать приготовленный раствор на льду.
    3. Подготовьте буфер тирода к конечной концентрации 135 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 0,4 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 10 мМ HEPES (рН 7,2), 20 мМ глюкозы и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (см. Таблицу материалов). Нагреть раствор до 37 °C.
  3. Подготовьте положительный контроль для фосфорилирования – 1 мМ перванадата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Первандат является перокисленной формой ванадата - ингибитора белка тирозинфосфатаз16. Предотвращение дефосфорилирования белка путем ингибирования активности фосфатазы приводит к получению высокофосфорилированного образца.
    1. Подготовьте 200 мМ активированного ортованадата натрия (Na3VO4).
      1. Для приготовления 100 мл раствора добавляют 3,89 г Na3VO4 (см. Таблицу материалов) до 90 мл ddH2Oи растворяют при перемешивании. Отрегулируйте pH до 10, добавив HCl или NaOH по каплям. Добавление HCl сделает раствор желтым.
      2. Доведите объем до 100 мл с ddH2O. Отварите раствор, нагрев его в микроволновой печи. После кипячения раствор будет бесцветным.
      3. Охладите раствор до RT и отрегулируйте рН до 10. Повторите кипячение, охлаждение и регулировку pH еще два-четыре раза, пока рН не стабилизируется на уровне 10. Аликвотировать и хранить при -20 °C.
    2. Готовят запас 30 мМ перванадата (ПВ) путем смешивания 20,4 мкл 3%H2O2 со 100 мкл 200 мМ Na3VO4 и 546,8 мкл ddH2O(эквимолярные концентрацииH2O2и активированныеNa3VO4). Инкубировать в темноте при RT в течение 15 мин.
    3. Подготовьте 1 мМ PV в буфере Tyrode. Для раствора 10 мл добавьте 0,33 мл фотоэлектрического материала 30 мМ к 9,67 мл буфера Tyrode 37 °C. Немедленно обработайте клетки.
    4. Промывайте ячейки один раз 3 мл буфера Tyrode. Добавьте 3 мл 1 мМ PV в буфер Тирода к клеткам и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
  4. Выполните стимуляцию лиганда.
    1. Стимулируйте клетки интересующим лигандом, используя соответствующую концентрацию, время и температуру. Для максимальной стимуляции EGFR инкубируют с 1 мл эпидермального фактора роста 50 нМ (EGF, см. Таблицу материалов) + 1 мМ PV в буфере Tyrode в течение 5 мин при 37 °C.
  5. Выполняют лизис клеток.
    1. После желаемой клеточной обработки поместите блюдо на лед и вымойте ледяным 1x PBS. Полностью удалите весь объем PBS с помощью пипетки.
    2. Добавьте на пластину 180 мкл лизисного буфера (этап 2.2.2). Используйте скребок для ячеек, чтобы потянуть буфер вокруг пластины, чтобы полностью покрыть ячейки. Нанесите твердое, постоянное давление с помощью клеточного скребка по всей культивируемой поверхности, чтобы полностью лизировать клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем лизисного буфера должен быть сведен к минимуму для обеспечения высокой концентрации белка.
    3. Пипетка лизированных клеток и перенос их в трубку объемом 1,5 мл. Держите трубку на льду в течение 30 минут. Вихрь лизатов каждые 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если POI состоит из нескольких субъединиц или чувствителен к диссоциации, не вихряйте лизаты.
    4. Центрифугируйте лизированные ячейки при 16 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую трубку объемом 1,5 мл с помощью пипетки. Он содержит общий белок лизат.
    5. Зарезервировать 10 мкл лизата и разбавить его в 90 мкл лизисного буфера для анализа бицинхониновой колориметрической пробы (БЦА)17. Хранить оставшийся общий лизат белка при -80 °C.
    6. Определение общей концентрации лизата белка с помощью анализа BCA (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие белковые лизаты могут быть приготовлены в день эксперимента и использованы в свежем виде или хранятся в виде одноразовых аликвот при -80 °C в течение 12 недель. Не замораживать/не оттаивать.

3. Функционализация массива биотинилированным антителом

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. T50 Buffer, раствор 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0) и 50 мМ NaCl. Раствор стабилен в течение 1 месяца при РТ.
    2. T50-BSA путем дополнения буфера T50 0,1 мг/мл BSA. Выдержать приготовленный раствор на льду.
    3. 10 мг/мл боргидрида натрия (NaBH4) в 1x PBS. Подготовьте его непосредственно перед использованием.
    4. 0,2 мг/мл НейтрАвидина (см. Таблицу материалов) в буфере Т50.
      ВНИМАНИЕ: NaBH4 является восстановителем и легковоспламеняющимся. Всегда продувайте контейнер газообразным азотом после использования и храните его в осушителе.
  2. Функционализируйте массив биотинилированным антителом.
    1. Извлеките функционализированные массивы ПЭГ-биотина из морозильной камеры и уравновешивайте коническую трубку до RT перед открытием. Поместите крышку с массивом, ориентированным вверх, на уплотнительную пленку, выстланную 100 мм тканевой культуры (TC100).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизируйте верхнее освещение. Все растворы должны «подниматься» на квадратах, определенных гидрофобным массивом. Добавьте соответствующий объем раствора, чтобы полностью покрыть каждый квадрат (обычно 10-15 мкл) и не позволяйте жидкости переполнять определенное пространство. Для быстрого удаления жидкостей используйте собственную вакуумную линию, прикрепленную к вакуумной колбе, для улавливания отходов. Дайте NaBH4 дегазировать в течение 1 ч перед утилизацией, оставив трубку открытой в химическом вытяжном шкафу. Лечение NaBH4 необходимо для снижения фоновой автофлуоресценции, тем самым уменьшая ложноположительные обнаружения одиночных молекул.
    2. Обработайте каждый квадрат массива 10 мг/мл NaBH4 в 1x PBS в течение 4 мин при RT. Промыть три раза PBS.
    3. Инкубировать каждый квадрат в течение 5 мин с 0,2 мг/мл НейтрАвидина в Т50. Промыть три раза с T50-BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: НейтрАвидин связывается с ПЭГ-биотином и обеспечивает сайт связывания биотинилированных антител 12,13,15.
    4. Инкубировать каждый квадрат в течение 10 мин с 2 мкг/мл биотинилированного POI-специфического антитела в T50-BSA; трижды промыть T50-BSA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол использует биотинилированный анти-EGFR IgG (см. Таблицу материалов) для захвата EGFR-GFP.

4. SiMPull POI из цельноклеточных лизатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите блюдо TC100 из функционализированных массивов SiMPull на лед на оставшуюся часть приготовления SiMPull. Этот шаг представляет собой извлечение POI из общего лизата белка. Лизат не должен использоваться повторно после размораживания.

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) / 0,1% глутаральдегида (GA) в 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: PFA и GA являются токсичными химическими фиксаторами и потенциальными канцерогенами. Носите СИЗ. Утилизируйте химические вещества как опасные отходы в соответствии с местными правилами и руководящими принципами.
    2. Готовят 10 мМ Tris-HCl, рН 7,4.
  2. Разморозьте и перемешайте лизат, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Держитесь на льду.
  3. Развести 1 мкл лизата в 100 мкл ледяного T50-BSA/PPI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости определите соответствующий коэффициент разбавления общего лизата белка, применив к массиву ряд разбавлений. Оптимальная плотность рецепторов SiMPull на площадь массива составляет 0,04-0,08/мкм2. Разбавления лизата могут быть оценены на этапе 6 (Анализ данных).
  4. Инкубировать лизат на массиве в течение 10 мин; затем четыре раза промыть ледяным T50-BSA/PPI.
  5. Разбавляют AF647-конъюгированное антифосфотирозиновое антитело (см. Таблицу материалов) в ледяном T50-BSA/PPI и инкубируют на массиве в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе пан-анти-pTyr (PY99)-AF647 IgG используется для идентификации фосфорилированной популяции EGFR-GFP. Использование непосредственно меченых антител устраняет необходимость во вторичных антителах, увеличивая варианты маркировки и улучшая согласованность результатов. Флуоресцентно меченые антитела могут быть получены из коммерческих источников. Если антитела не являются коммерчески доступными, они могут быть индивидуально маркированы с использованием стандартных методов биоконъюгации, и доступны коммерческие наборы биоконъюгации. Каждая партия флуоресцентно меченых антител должна быть проверена на оптимальные условия маркировки путем выполнения SiMPull для измерения кривой дозы и нахождения точки насыщения.
  6. Промыть шесть раз ледяным T50-BSA в общей сложности 6-8 мин.
  7. Дважды промыть ледяным 1x PBS.
  8. Инкубируйте массив с 4% раствором PFA/0,1% GA в течение 10 мин для предотвращения диссоциации антител.
  9. Промывайте дважды в течение 5 мин каждый с 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4 / PBS для инактивации фиксаторов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с использованием более чем одного антитела (например, обнаружение нескольких участков фосфотирозина) повторите шаги 4.5-4.9. Информацию об определении стерического препятствия между двумя антителами см. на этапе 6.2.9.

5. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Получение одномолекулярного изображения осуществляется с использованием объектива 150x TIRF и разветвителя изображения, который захватывает каждый спектральный канал в определенном квадранте камеры emCCD (см. Таблицу материалов). Калибровочные изображения сначала получаются для регистрации каналов и калибровки усиления камеры с помощью наноструктурированной сетки выравнивания каналов (наносетки), которая содержит 20 x 20 массивов по 200 ± 50 нм отверстий на внутриотрезном расстоянии 3 ± 1 мкм (общий размер ~ 60 мкм × 60 мкм).

  1. Выполните регистрацию канала, выполнив следующие действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точная регистрация каналов необходима для правильного расчета колокализации излучателей. Этот шаг имеет решающее значение.
    1. Очистите цель масла и нанесите каплю нефти на цель. Поместите наносеть на сцену для визуализации. Используя передаваемый белый свет, сосредоточьтесь на рисунке сетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения с наносетью получаются с использованием проходящего света, который проходит через наносетку и обнаруживается во всех спектральных каналах. В качестве альтернативы можно использовать мультифлуоресцентные шарики, которые излучают флуоресценцию, обнаруженную в каждом канале. Сбор изображений должен быть оптимизирован в соответствии с настройкой каждого микроскопа.
    2. Получите серию из 20 изображений сетки. Убедитесь, что пиксели не насыщены. Сохраните серию изображений как «Fiducial».
    3. Расфокусируйте наносеть, чтобы создать рисунокAiry 18. Получите серию из 20 изображений для калибровки усиления. Сохраните изображение как "Gain".
    4. Получите серию из 20 изображений для смещения камеры, блокируя весь свет от попадания на камеру. Сохраните изображение как «Фон».
  2. Получение изображений SiMPull.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед созданием изображения массива coverslip замените решение Tris на T50-BSA и уравновесьте массив до RT.
    1. Очистите цель масла и нанесите дополнительное масло на цель. Закрепите массив чехла на ступени микроскопа.
    2. Оптимизируйте мощность возбуждения каждого флуорофора, угол TIRF и время интеграции камеры. Цель состоит в том, чтобы достичь наивысшего уровня сигнал-шум при минимизации фотоотбеливания образца. Запишите мощность лазера для согласованности в будущих измерениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовалось время экспозиции 300 мс для дальнего красного канала и 1 с для зеленого канала. Лазер 642 нм использовался при мощности лазера примерно 500 мкВт, в то время как лазер 488 нм использовался при 860 мкВт, измеренной перед ламповой линзой.
    3. Получение изображений для каждого образца. Сначала изобразите дальний красный канал, а затем каждый флуорофор с более низкой длиной волны, чтобы уменьшить фотоотбеливание. Из-за небольшого объема, используемого для каждого образца, проверяйте уровень буфера каждые 30-45 минут и пополняйте по мере необходимости.

6. Анализ данных

  1. Загрузите демо-коды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный демонстрационный код и примеры наборов данных демонстрируют полный рабочий процесс анализа данных (Дополнительные файлы кодирования 1-4). Системные требования, перечисленные в SiMPullMain.m, приведены в файле дополнительного кодирования 1.
    1. Распакуйте и сохраните в личный каталог Документы/MATLAB (MacOS/Linux) или Документы\MATLAB (Windows).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это создает четыре новые папки: SiMPull_class, smite, Образцы данных, Выходные данные анализа образцов.
    2. Откройте файл "ReadMe_Setup.txt", найденный в папке SiMPull_class.
    3. Установите наборы инструментов MATLAB и MATLAB: набор инструментов для подгонки кривых, набор инструментов для параллельных вычислений и набор инструментов для статистики и машинного обучения.
    4. Установите DipImage19 в соответствии с инструкциями по загрузке.
    5. Установите пакет анализа одной молекулы "smite", как описано в ReadMe_setup.txt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "smite" доступен в репозитории GitHub (см. Таблицу материалов).
    6. Откройте файл SiMPullMain.m, найденный в SiMPull_class папке, перетащив файл в окно MATLAB.
    7. Измените каталог на ...\MATLAB\Sample Data\, щелкнув значок Обзор папки и выбрав папку.
  2. Обзор этапов обработки данных
    1. Запустите SiMPullMain.m - следуя инструкциям для каждого раздела. Выполните каждый раздел по отдельности, поместив курсор в этот раздел и щелкнув значок Выполнить раздел.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие шаги по анализу данных описаны в этом разделе. Подробные инструкции приведены в сопроводительном коде SiMPullMain.m.
    2. Запустите раздел «Инициализация», чтобы задать путь для определения спектральных каналов и размера изображения.
    3. Запустите раздел «Найти усиление и смещение камеры», чтобы преобразовать усиление камеры в фотоны с помощью наборов данных «Усиление» и «Фон».
    4. Запустите раздел «Регистрация каналов», чтобы рассчитать локально взвешенное среднее преобразование, используемое для регистрации изображений.
    5. Форматирование и курирование данных. Запустите раздел «Объединение последовательных каналов в четырехобразное изображение». Запустите "Удалить плохие кадры".
    6. Запустите раздел «Подгонка отдельных молекул и поиск перекрывающихся молекул».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел выполняет несколько функций для локализации отдельных молекул в каждом канале и определения событий колокализации между спектральными каналами.
    7. Чтобы определить минимальное количество фотонов на истинное соответствие GFP, выполните команду «Оптимизировать минимальное пороговое значение фотона». Это итеративный процесс.
      1. Во-первых, установите smf. Thresholding_MinPhotons = [0, 0, 0] и запустите раздел. Выберите «Пустые файлы данных» при появлении запроса. Повторите с файлами "CHO-EGFR-GFP".
      2. Выберите соответствующее минимальное пороговое значение, сравнив две гистограммы. Установить smf. Thresholding_MinPhotons = [475, 0, 0] и снова запустите раздел.
    8. Запустите раздел «Рассчитать процент GFP, подходящего для положительного значения для сигнала FR», чтобы исправить фоновые локализации и вычислить конечные значения.
    9. Выполните вариант 1 (шаг 6.2.10) или вариант 2 (шаг 6.2.11) в соответствии с экспериментальной необходимостью.
    10. Вариант 1: Правильно для количества рецепторов, доступных в плазматической мембране для связывания лигандов, как описано в ссылке15.
      1. Во-первых, маркируют поверхностные рецепторы насыщенными уровнями флуоресцентного красителя NHS Ester (NHS-AF647, см. Таблицу материалов). Затем выполните эксперимент SiMPull, чтобы определить процент локализации GFP, который колокализуется с AF647.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает оценку доли рецепторов, доступных для маркировки NHS, и соотношения рецепторов на поверхности (SR).
      2. Примените поправку SR в конечном расчете: NGFP = (NLOC - NBG)*SR, где NGFP - скорректированное число локализаций GFP, NBG - номер фоновой локализации, а NLOC - общие локализации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем примере эта коррекция не применяется, поскольку перванадат является мембранопроницаемым16 и, следовательно, действие ингибирования фосфатазы не ограничивается поверхностными рецепторами.
    11. Вариант 2: Для многосайтовых измерений фосфорилирования рассмотрите возможность стерического препятствия при использовании двух антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерическое препятствие может вызвать снижение наблюдаемого процента фосфорилированных рецепторов для антитела 1 в присутствии антитела 2 (P12) по сравнению с одним только антителом 1 (P1).
      1. Используйте SiMPull для определения P1 и P12 и расчета поправочного коэффициента для стерического препятствия в соответствии с ранее опубликованной ссылкой15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Карикатура, изображающая процесс SiMPull, показана на рисунке 1A. Покровные листы функционализируются с использованием NeutrAvidin в качестве якоря для биотинилированных антител против EGFR для захвата EGFR-GFP из общих белковых лизатов. После вымывания несвязанного белка фосфорилированные рецепторы мечутся антифосфотирозиновым (анти-PY) антителом15. На рисунке 1В показано изображение гидрофобной решетки, где несколько образцов могут быть подготовлены и изображены на одном и том же крышке. Одним из преимуществ этого держателя образца является то, что требуются минимальные объемы образца ~ 10 мкл. Крышку можно отобразить, поместив ее непосредственно на ступень микроскопа. Тем не менее, полезно стабилизировать крышку с помощью держателя крышки. Держатель крышки, показанный на рисунке 1B , был создан с помощью 3D-принтера, а чертеж представлен в дополнительном кодовом файле 5. Автофлуоресценция гидрофобных чернил является полезным руководством по поиску фокальной плоскости образца (рисунок 1С). Пример многоканального необработанного изображения показан на рисунке 1D. Наложение необработанных зеленых и темно-красных каналов показано на рисунке 1E.

На рисунке 2 показан рабочий процесс анализа и представлены репрезентативные данные. Сбор данных сначала начинается с получения фидуциалов для регистрации каналов, которые используются для наложения данных отдельных спектральных каналов (рисунок 2A). Изображения яркого поля делаются с использованием наносетчатого паттерна, который пропускает белый свет и обнаруживается в каждом спектральном канале сплиттера изображения (не показан). Зеленый канал действует как опорный канал, а дальний красный канал является смещенным каналом. Локально взвешенное среднее преобразование вычисляется с помощью функции fitgeotrans20 в MATLAB и используется для смещения дальнекрасных координат в координатную рамку зеленого канала. Это преобразование использует полиномиальную модель второго порядка в каждой контрольной точке. Затем собираются многоканальные данные массива SiMPull. Этот рабочий процесс состоял из полуавтоматического сбора, где для конкретного квадрата выборки была выбрана начальная рентабельность инвестиций, и были изображены три области вокруг этой области, так что каждый набор данных содержит полное изображение с четырьмя видами из трех независимых ROI (рисунок 1D). В каждом спектральном канале местоположения-кандидаты излучателя находятся путем применения разностного гауссовского фильтра к изображениям и определения локальных максимумов. Субрегионы (квадраты, рисунок 2В) рисуются вокруг локальных максимумов, а количество фотонов излучателей оценивается исходя из предположения, что каждый субрегион содержит только один излучатель. Субрегионы, в которых содержатся кандидаты на выбросы с количеством фотонов выше минимального значения, сохраняются для подгонки. Функция гауссовского точечного разброса (PSF) подходит для каждого кандидата на эмиттер в небольших субрегионах, примерно центрированных вокруг каждого излучателя. Результирующие локализации оцениваются на основе их количества фотонов, фона, нижней границы координат соответствия Крамера-Рао, дисперсии PSF (т. е. ширины PSF) и значения p, описывающего пригодность модели PSF. Для каждого спектрального канала создается гауссовское изображение с равномерной интенсивностью гауссовских пятен, размещенных в координатах для каждого хорошего соответствия (рисунок 2C). Колокализация визуализируется путем наложения гауссовских изображений из каждого спектрального канала с использованием преобразования, рассчитанного из фидуциального образца (рисунок 2D). Важно флуоресцентно маркировать рецептор для идентификации, поскольку все еще существует неспецифическое связывание антифосфотирозиновых антител с поверхностью, когда присутствует клеточный лизат. EGFR-GFP (зеленый канал) используется для генерации маски расположения рецепторов, и подсчитывается только сигнал AF647-anti-PY (дальний красный канал) внутри этой маски (рисунок 2D). Пары в пределах 1 пикселя (размер пикселя 106,7 нм) считаются колокализованными и сохраняются в списке, содержащем координаты эталонного канала. Процент AF647, колокализованного с GFP, рассчитывается для определения фракции фосфорилированных рецепторов (рисунок 2E).

Существует несколько важных шагов для обеспечения хорошего качества данных. Одним из таких усилий является инкубация массива крышки с NaBH4 , как описано в протоколе для гашения автофлуоресценции в зеленом канале. Эта автофлуоресценция относится к неспецифическому сигналу из-за возможных примесей на стекле, содержащих одиночные или сопряженные π связи21. Такие примеси потенциально происходят из аминосилановых и ПЭГ-реагентов, используемых в процессе функционализации, или пыли из воздуха и имеют тенденцию флуоресцировать в зеленом спектральном канале. Несмотря на усилия по хранению стекла под азотом, эти молекулы также могут генерироваться путем окисления, которое происходит при хранении. NaBH4 также используется для уменьшения флуоресценции от примесей на слайдах и микрочипах, в том числе с силановым покрытием16. На рисунке 3А показано уменьшение числа фоновых обнаружений, возникающих при обработке травленого стекла пираньей NaBH4. В то время как NaBH4 резко снижает фоновую флуоресценцию, некоторые излучатели все еще обнаруживаются в зеленом канале. Это можно исправить, получив фоновые изображения из образцов без лизата (рисунок 3D) и вычитая среднее количество фоновых локализаций из образцов, содержащих GFP. Флуоресценция от примесей не была обнаружена в дальне-красном канале. Если плотность рецепторов слишком высока, несколько излучателей GFP могут быть найдены в одном дифракционном ограниченном месте (данные не показаны). Используя ступенчатое фотоотбеливание для определения количества GFP на пятно, мы обнаружили, что плотность рецептора между 0,04-0,08 белка / мкм2 обеспечивает достаточное расстояние между одиночными излучателями, чтобы устранить потенциал нахождения нескольких излучателей на точку12. Плотность рецептора может быть оптимизирована путем изменения количества IP-антител, связанных со стеклянной поверхностью, или количества добавленного лизата. Крайне важно убедиться, что антитело, нацеленное на POI, используется на насыщенных уровнях. Рекомендуется получить кривую концентрации антител на фосфорилированных образцах для определения соответствующих условий маркировки (рисунок 3B). Кроме того, фосфоспецифичность антитела должна быть подтверждена с помощью образцов покоя и/или лечения ингибиторами протеинспецифической киназы (рисунок 3B). Антитела будут диссоциировать от рецептора во время временного окна визуализации. Обработка образца комбинацией PFA и GA предотвратила потерю сигнала (рисунок 3C).

Наконец, важно оптимизировать параметры подгонки одной молекулы. Первый шаг «поиска коробки», который идентифицирует потенциальных кандидатов на эмиттер (рисунок 2B), должен быть щедрым, чтобы позволить многим кандидатам пройти гауссовскую примерку. Таким образом, минимальный порог фотонов для обнаружения коробки может быть относительно низким, чтобы захватить все реальные излучатели и некоторые фоновые пятна. Также важно не устанавливать размер коробки и припуск перекрытия слишком маленьким. Сохранение размера коробки в пределах 5-7 пикселей и возможность двухпиксельного перекрытия идеально подходит для излучателей при рекомендуемой плотности. После обнаружения коробки необходимо оптимизировать минимальный порог фотонов на этапе установки. Минимальный параметр фотонов способствует определению того, какие гауссовские подогнанные излучатели проходят как истинное соответствие. Чтобы определить правильный минимальный порог фотонов для истинных размеров GFP, код включает функцию построения гистограммы для изучения фотонов / локализации как в фоновых (без лизата клеток), так и в GFP-содержащих (плюс лизат клеток) образцах (рисунок 3D). Этот шаг важен, потому что, хотя NaBH4 уменьшает количество флуоресценции от примесей, он не удаляет все фоновые локализации. Рисунок 3D демонстрирует необходимость установки минимального порога фотонов для уменьшения количества обнаружений от примесей. Чтобы определить этот порог, гистограмма интенсивности фонового излучателя рассчитывается на основе визуализации образца, который не подвергается воздействию лизата клеток (рисунок 3D, вверху слева). Было обнаружено, что большинство фоновых излучателей имеют значения менее 475 фотонов. Для сравнения, образец, содержащий истинные излучатели GFP, показал значительную долю распределения выше 475 (рисунок 3D, вверху справа). Порог выбирается путем проверки, чтобы удалить как можно больше фоновых счетчиков, минимизируя при этом количество потерь сигнала из образца лизата (рисунок 3D, нижний ряд). Оставшаяся плотность фонового подсчета при этом пороге учитывается в количественном анализе.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор подготовки образцов. (A) Карикатура, изображающая подход SiMPull. Покровные листы функционализируются антителом, которое распознает POI для захвата этого POI из целоклеточных лизатов. Стекло сначала покрывается ПЭГ и биотин-ПЭГ. НейтрАвидин затем связывается с биотин-ПЭГ и действует как якорь для биотинилированного антитела против POI. Фосфорилированные белки затем обнаруживаются с флуоресцентно меченым антителом против PY. (B) Фотография держателя крышки (красный) с массивом чехла на месте и установленным на сцене микроскопа. Массивы с несколькими образцами генерируются с использованием гидрофобных чернил для создания до 20 отдельных квадратов образцов на одном стеклянном крышке. Размер крышки составляет 60 мм x 24 мм. (C) Пример изображений гидрофобной автофлуоресценции чернил (пурпурный) и флуоресцентных шариков (зеленый). Автофлуоресценция гидрофобных чернил является полезным руководством для поиска фокальной плоскости на поверхности покрова. (D) Пример изображения необработанных данных со спектральными каналами, разделенными на чипе камеры сплиттером изображения Quad-view. В комплект фильтров Quad-view входят следующие эмиссионные фильтры: синий (445/45 нм), зеленый (525/45 нм), красный (600/37 нм), дальний красный (685/40 нм). (E) Необработанное наложение зеленого и дальнего красного каналов. Белое поле указывает на область, дополнительно исследованную на рисунке 2B-D. Шкала (C-E) = 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс анализа данных. (A) Регистрация канала сначала выполняется на изображениях, полученных из наносети. После обрезки двух интересующих спектральных каналов (здесь зеленый и дальний красный) накладываются фидуциальные изображения для каждого канала (слева). Увеличение поля в левом изображении (Вставка) показывает, что изображения еще не зарегистрированы по-настоящему. Излучатели в каждом канале соответствуют модели Гаусса и локализованы (регистрация). Локализация излучателей показана в виде кругов для дальнего красного канала и крестов для зеленого канала. Заключительным шагом является применение локально взвешенного среднего преобразования для смещения координат локализации дальнего красного канала в систему отсчета зеленого канала (Aligned). Вычисляемое локально взвешенное среднее преобразование затем используется для регистрации последующих данных SiMPull. (B) Репрезентативные изображения зеленого/EGFR-GFP канала и дальнего красного/AF647-анти-PY канала. Одиночные излучатели над фоновым количеством фотонов идентифицируются и маркируются коробками. (C) Профиль выбросов в каждой выбранной коробке соответствует модели Гаусса, и излучатели, которые соответствуют модели одного флуорофора PSF, сохраняются. (D) Из излучателей GFP создается маска для определения местоположения EGFR-GFP (зеленый). Колокализация EGFR-GFP и AF647-anti-PY идентифицирует фосфорилированные рецепторы (белый). (E) Фракция фосфорилированных рецепторов рассчитывается из колокализованных EGFR-GFP и AF647-anti-PY. Гистограмма сравнивает обработку PV + EGF с покоящимися клетками, усредненными для нескольких измерений. Полосы ошибок представляют стандартную ошибку, вычисляемую при условии биномиального распределения. Шкала = 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Критические шаги для обеспечения качества данных. (A) Слева направо первые три панели представляют собой репрезентативные изображения автофлуоресценции на стекле в соответствующих условиях: после травления пираньи, с ПЭГ, и ПЭГ плюс Обработка NaBH4 (указывается с +). Кроме того, функционализация поверхности сохраняется после обработки NaBH4 , о чем свидетельствует минимальное неспецифическое связывание PY99-AF647 при сохранении надежного связывания EGFR-GFP с лизатом. (B) Кривая насыщения должна быть получена для каждой партии антител, используемых для обеспечения оптимальной маркировки антител. На этом рисунке показана кривая концентрации для маркировки EGFR сайт-специфическим фосфотирозиновым антителом, анти-EGFR-pY1173. Минимальное фосфорилирование обнаруживается в необработанных клетках (покоящийся, серый алмаз). В качестве контроля за неспецифическим связыванием клетки также обрабатывали ингибитором EGFR-киназы, Лапатинибом, перед добавлением 100 нМ EGF (пурпурного треугольника), что показывает ожидаемую профилактику фосфорилирования EGFR. Полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку, предполагающую биномиальное распределение. (C) Фиксация образца комбинацией PFA и GA предотвращает диссоциацию антител с течением времени. Полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку, предполагающую биномиальное распределение. (D) Ложные срабатывания исключаются путем выбора соответствующего порога для гауссовской подгонки. Сравнение гистограммы интенсивности прилегания при низком пороге (Threshold = 0; вверху) между фоновыми (без лизата) и реальными данными (плюс лизат клеток) позволяет выбрать соответствующее значение (Threshold = 475; внизу) для удаления припадков из автофлуоресцентных пятен в зеленом канале. Вертикальная пурпурная линия указывает на порог в 475 фотонов. Гистограммы рассчитываются из одинакового количества ROI для каждого типа выборки (n = 3). Шкала = 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл кодирования 1: zip-файл, содержащий скрипты и утилиты для выполнения анализа SiMPull. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодирующий файл 2: zip-файл, содержащий пакет анализа одной молекулы smite . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 3: zip-файл, содержащий образцы данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 4: zip-файл, содержащий репрезентативный образец результатов анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодовый файл 5: Схема держателя крышки для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для проведения количественных измерений фосфорилирования рецепторов на уровне одного белка. Было разработано несколько простых, но важных модификаций протокола SiMPull, которые повысили надежность измерения для обнаружения фосфо-тирозина, включая снижение аутофлуоресценции при обработке NaBH4 и постфиксацию образца для предотвращения диссоциации антител. Использование зеленой маски канала для идентификации расположения рецепторов для расчета колокализации с антителом против PY также повышает точность измерения за счет удаления потенциальных артефактов из неспецифического связывания антитела с клеточным лизатом. Двухцветная визуализация использовалась для обнаружения фракции фосфорилированных рецепторов. В этом сценарии рецептор был генетически помечен GFP, а антитело было непосредственно помечено дальним красным красителем. Подход SiMPull применим к другим белковым мишеням, для которых доступны специфические антитела, включая внутриклеточные белки. Кроме того, поскольку условия денатурации не требуются, мультисубунитные рецепторы / комплексы также могут быть захвачены. Однако денатурация может быть включена, если интересующие ПТМ расположены в структурированных областях белка14. В конечном счете, SiMPull может быть легко расширен, чтобы включить одновременную маркировку различных фосфотирозинов на отдельных рецепторах для количественной оценки многосайтовых моделей фосфорилирования15. Опрос полноразмерных, интактных рецепторов таким образом не может быть достигнут другими стандартными методами, включая вестерн-блоттинг и фосфомасси-спектрометрию.

Наряду с преимуществами SiMPull, необходимо учитывать некоторые ограничения. Как и в случае с любым методом, основанным на антителах, сродство и специфичность используемых антител имеют решающее значение для успеха измерения. Поэтому важно оптимизировать условия маркировки антител и в идеале избегать вторичных антител, используя непосредственно меченые первичные антитела. Кроме того, поверхностно связанные антитела будут осаждать белки, локализованные на плазматической мембране и в цитозольных компартментах. Это может недооценивать фосфорилирование, поскольку локализованные цитозоль белки недоступны для экзогенно добавленного лиганда. Необходимо принять дополнительные меры для корректировки поверхностных уровней рецепторов (этап 6.2.10). Антифосфотирозиновые антитела проявляли некоторое неспецифическое связывание после присутствия лизата. Чтобы избежать этого артефакта, EGFR был генетически помечен GFP для определения местоположения рецепторов, что позволило нам исключить сигнал анти-PY от рецептора. Если эндогенные белки должны быть опрошены, то контрокрашивание общим белковым антителом может обеспечить изображение маски с соответствующей коррекцией для любого неспецифического связывания. Наконец, в то время как SiMPull предоставляет информацию о гетерогенности на уровне белка, лизат, генерируемый в этом протоколе, поступает из тысяч клеток, и вариабельность от клетки к клетке теряется. Однако успехи в направлении одноэлементного SiMPull были достигнуты с использованием проточной камеры, состоящей из крышки и стороны микроскопа с зазором 10 мкм; бактерии были слабо покрыты на крышке, в то время как слайд был функционализирован антителом для захвата желаемых белков. После лизиса бактерий белки из каждой клетки были захвачены в ограниченной области на слайде22, покрытом антителами. Подобный одноклеточный SiMPull анализ клеток млекопитающих и фосфорилирование белка могут быть возможны в будущем.

Протокол SiMPull содержит несколько критических шагов, необходимых для обеспечения высокого качества данных. Например, протокол включает в себя сложную подготовку покровного стекла. Травление пираньей тщательно очищает стекло и увеличивает гидроксильные группы и гидрофильность, которые необходимы для оптимизации поверхности покрова. После нескольких промывок органическими растворителями обработка KOH обеспечивает дополнительные гидроксильные группы для аминосиланизации13,23, которая покрывает стекло аминными группами для связывания ПЭГ и биотин-ПЭГ. Неправильная очистка или функционализация на любом из этих этапов будет мешать вытягиванию белка. Контроль молярного соотношения ПЭГ:биотин-ПЭГ, наряду с концентрацией лизата, являются ключевыми факторами в получении соответствующей плотности белка IP на субстрате SiMPull. Как и в случае с любым биологическим анализом, существует вариабельность между препаратами клеточного лизата, и между репликациями образцов могут наблюдаться небольшие различия между процентами фосфорилирования. Поэтому важно измерить уровни фосфорилирования различных участков тирозина в одном образце. Камера образцов, описанная в этом протоколе, обеспечивает систему для сбора множества точек данных за один сеанс визуализации и позволяет усреднять несколько экспериментов SiMPull.

Со стороны получения изображения важно получить фидуциальный образец, чтобы обеспечить точное наложение канала; в противном случае колокализация не будет точной. Также важно оптимизировать мощность лазера и настройки камеры, чтобы максимизировать сигнал-шум и в то же время свести к минимуму фотоотбеливание. Наконец, в то время как массив образцов требует небольшого количества образца и реагентов, малые объемы подвержены испарению во время сеанса визуализации. Важно периодически проверять массив образцов (~30-45 мин) и добавлять буфер по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание образцов.

Настоящий протокол продемонстрировал использование SiMPull для количественной оценки состояний фосфорилирования мембранных рецепторов. Будучи сосредоточенным на EGFR, этот подход может быть применен к другим рецепторам клеточной поверхности и внутриклеточным белкам и белковым комплексам, если доступны соответствующие антитела. Другим потенциальным применением SiMPull является опрос содержимого и состояния фосфорилирования фазовых конденсатов. Кроме того, SiMPull можно использовать для измерения других PTM, таких как убиквитинация. Таким образом, SiMPull предоставляет уникальный инструмент для клеточных биологов для опроса PTM на интактных белках и корреляции паттернов PTM с клеточным результатом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения R35GM126934, R01AI153617 и R01CA248166 для DSL. EMB поддерживался в рамках программы ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) и JAR в рамках программы UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Мы с благодарностью отмечаем использование общего ресурса флуоресцентной микроскопии Комплексного онкологического центра Университета Нью-Мексико, поддерживаемого NIH P30CA118100. Мы хотим отметить докторов Анкура Джайна и Тхэкиджипа Ха, чья оригинальная разработка SiMPull вдохновила эту работу.
ES-C нынешний адрес: Группа иммунодинамики, Лаборатория интегративной иммунологии рака, Центр исследований рака, Национальный институт рака, Bethesda

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes MTC Bio C2000
10 mM Tris-HCl pH 7.4
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl T50 Buffer
100 mm Tissue Culture dish CELLTREAT 229620 Storage of piranha etched glass/arrays
15 mL conical tube
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 Hazardous
50 mL conical tube Functionalized Glass storage/ KOH reuse
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl Lysis Buffer Component
60 mm Tissue Culture dish Corning 430166
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16020 Hazardous
Acetone (C3H6O) Millipore Sigma 270725 Hazardous
Alexa Fluor 647 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A-20006
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin Leinco Technologies, Inc E101
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-7020 AF647
Bath-sonicator Branson 1200
BCA Protein Assay Kit Pierce 23227
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA, MW 5,000
Bovine serum albumin Gold Biotechnology A-420-1 Tyrode's Buffer Component
Buchner funnel
Bunsen burner
Calcium Chloride (CaCl2) Millipore Sigma C4901 Tyrode's Buffer Component
Cell Scraper Bioworld 30900017-1
Conical Filtering Flask Fisher Scientific S15464
Coplin Jar WHEATON 900470
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Coverslips 24 x 60 #1.5 Electron Microscopy Sciences 63793
DipImage https://diplib.org/
DMEM Caisson Labs DML19-500
emCCD camera Andor iXon
Fetal Bovine Serum, Optima Bio-Techne S12450H Heat Inactivated
Fusion 360 software Autodesk
Geneticin G418 Disulfate Caisson Labs G030-5GM
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) JT Baker JTB-9526-01 Hazardous
Glass serological pipettes
Glass Stir Rod
Glucose (D-(+)-Glucose) Millipore Sigma D9434 Tyrode's Buffer Component
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78446 Lysis Buffer Component
HEPES Millipore Sigma H3375 Tyrode's Buffer Component
Hydrochloric Acid (HCl) VWR BDH7204-1 Hazardous
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) HX0645
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) EMD Millipore HX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 (NP-40) Sigma Aldrich I8896 Lysis Buffer Component
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000
Immersol 518F immersion oil Zeiss 444960-0000-000
in-house vacuum line
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-164
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) MPBio 2191421 Tyrode's Buffer Component
Matlab Mathworks Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox
Methanol (CH3OH) IBIS Scientific MX0486-1 Hazardous
Milli-Q water
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits Biotium 92245 Suggested conjugation kit
mPEG Laysan Bio mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane UCT United Chemical A0700 Hazardous
Nanogrid Miraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding Protein Thermo Fisher Scientific 31000
Nitrogen (compressed gas)
NVIDIA GPU with CUDA Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 Microscope Olympus
Parafilm M Sealing Film The Lab Depot HS234526C
PBS pH 7.4 Caisson Labs PBL06
PC-200 Analog Hot Plate Corning 6795-200
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-163
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb Cell Signaling Technology 2236BF
Potassium Chloride (KCl) Millipore Sigma 529552 Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH) Millipore Sigma 1050330500 Hazardous
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter Raise 3D PMS:2035U/RAL:3028 Printing temperature range: 205-235 °C
Pro2 3D printer Raise 3D
Pyrex 1 L beaker
PYREX 100 mL storage bottles Corning 1395-100 CH3OH/C3H6O reuse
Pyrex 250 mL beakers
Pyrex 4 L beaker
Quad-view Image Splitter Photometrics Model QV2
Refrigerated centrifuge Eppendorf EP-5415R
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides VWR 10027-446
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) Semrock LF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serological pipette controller
Serological Pipettes
smite single molecule analysis package https://github.com/LidkeLab/smite.git
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich S6014 Hazardous
Sodium Borohydride (NaBH4) Millipore Sigma 452874 Tyrode's Buffer Component
Sodium Chloride (NaCl) Millipore Sigma S9625 Activate by successive heat and pH cycling
Sodium Hydroxide VWR BDH3247-1
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Millipore Sigma S6508 Hazardous
Sulfuric Acid (H2SO4) Millipore Sigma 258105 Hazardous
TetraSpeck Microspheres Thermo Fisher Scientific T7279 multi-fluorescent beads
Tris (Trizma) base Millipore Sigma T1503
Trypan blue stain, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
  3. Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
  4. Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).
  5. Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
  6. Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
  7. Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
  8. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  9. Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
  10. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  11. Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
  12. Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
  13. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  14. Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
  15. Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
  16. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
  19. Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
  20. fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013).
  21. Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
  22. Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
  23. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 184
Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E.,… More

Bailey, E. M., Salazar-Cavazos, E., Grattan, R. M., Wester, M. J., Schodt, D. J., Rojo, J. A., Lidke, K. A., Lidke, D. S. An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation. J. Vis. Exp. (184), e63665, doi:10.3791/63665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter