Summary
Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.
Abstract
Os dentes são de fundamental importância na vida não só para a mastigação alimentar e a fala, mas também para o bem-estar psicológico. O conhecimento sobre desenvolvimento dentário humano e biologia é escasso. Em particular, pouco se sabe sobre as células-tronco epiteliais do dente e sua função. Conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido dentário humano (ou seja, folículo dentário, isolado dos dentes do siso extraído). Os organoides são robustos e expansíveis a longo prazo e recapitulam o compartimento de células-tronco do dente humano proposto em termos de expressão de marcador, bem como atividade funcional. Em particular, os organoides são capazes de desdobrar um processo de diferenciação ameloblast como ocorre in vivo durante a amelogênese. Este modelo organoide único fornecerá uma ferramenta poderosa para estudar não apenas o desenvolvimento dentário humano, mas também a patologia dentária, e pode abrir caminho para a terapia regenerativa dentária. Substituir dentes perdidos por um dente biológico baseado neste novo modelo organoide pode ser uma alternativa atraente para a implantação padrão atual de materiais sintéticos.
Introduction
Os dentes têm papéis essenciais na mastigação alimentar, fala e bem-estar psicológico (autoimagem). O dente humano consiste em tecidos altamente mineralizados de densidade e durezavariadas 1. O esmalte dentário, o principal componente da coroa dentária, é o tecido mineralizado mais alto do corpo humano. Durante a formação do esmalte (amelogênese), quando os dentes se desenvolvem, as células-tronco epiteliais dentárias (DESCs) se diferenciam em células formadoras de esmalte (ameloblasts). Uma vez formado, o esmalte raramente é reparado ou renovado devido à perda apoptótica dos ameloblastas no início da erupção dentária1. A restauração do tecido esmalte danificado, causado por trauma ou doença bacteriana, é atualmente realizada com materiais sintéticos; no entanto, estes são incomodados com deficiências importantes como microleakage, osseointegração e ancoragem inferiores, vida útil finita e falta de reparo totalmente funcional2. Assim, uma cultura robusta e confiável de DESCs humanos com capacidade para gerar ameloblasts e potencial para produzir tecido mineralizado seria um grande avanço no campo regenerativo dental.
O conhecimento sobre fenótipo e função biológica do DESC humano são escassos 3,4,5. Curiosamente, foram propostos DESCs de dentes humanos para existir nos Repousos de Célula Epitelial de Malassez (ERM), aglomerados celulares presentes dentro do folículo dentário (DF), que circunda dentes não rompidos, e permanece presente no ligamento periodontal ao redor da raiz uma vez que o dente entra em erupção1. Células ERM co-cultivadas com polpa dentária foram encontradas para se diferenciar em células semelhantes ao ameloblast e gerar tecido semelhante ao esmalte6. No entanto, estudos profundos sobre o papel específico das células ERM na geração de esmalte (re-) foram limitados devido à falta de modelos de estudo confiáveis7. Os sistemas atuais de cultura in vitro ERM são dificultados pela vida útil limitada e perda rápida de fenótipo nas condições 2D usadas standardmente 8,9,10,11,12. Assim, é fortemente necessário um sistema in vitro tratável para expandir, estudar e diferenciar deSCs humanos.
Durante a última década, uma técnica poderosa para cultivar células-tronco epiteliais in vitro foi aplicada com sucesso a vários tipos de tecidos epiteliais (humanos) para estudar sua biologia, bem como a doença 13,14,15,16. Essa tecnologia permite que as células-tronco epiteliais do tecido se auto-desenvolvam em construções de células 3D (ou seja, organoides) quando semeadas em uma matriz extracelular (ECM) -imitando andaimes (tipicamente, Matrigel) e cultivadas em um meio definido replicando a sinalização do nicho de células-tronco do tecido e/ou embriogênese. Os fatores típicos de crescimento necessários para o desenvolvimento organoide incluem fator de crescimento epidérmico (EGF) e ativadores de integração MMTV do tipo wingless (WNT) 14,15,16. Os organoides resultantes são caracterizados pela fidelidade duradoura na imitação das células-tronco epiteliais originais do tecido, bem como alta expansão, mantendo seu fenótipo e propriedades funcionais, superando assim a disponibilidade de tecido humano primário muitas vezes limitada como adquirido da clínica. Para estabelecer organoides, o isolamento das células-tronco epitelial do tecido heterogêneo (ou seja, compreendendo outros tipos de células, como células mesenquimais) antes da cultivo não é necessário, pois as células mesenquimais não se ligam ou prosperam no ECM, eventualmente resultando em organoides puramente epiteliais 13,16,17,18,19 . Esta tecnologia promissora e versátil levou ao desenvolvimento de modelos organoides múltiplos de vários tecidos epiteliais humanos. No entanto, os organoides derivados do dente humano, valiosos para o estudo profundo do desenvolvimento dentário, regeneração e doenças, ainda não foram estabelecidos20,21. Recentemente conseguimos desenvolver um novo modelo organoide a partir do tecido DF a partir de terceiros molares (dentes do siso) extraídos de pacientes adolescentes19.
Aqui, descrevemos o protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano adulto (ou seja, do DF do terceiro molar) (Figura 1A). Os organoides resultantes expressam marcadores de haste associados ao ERM, sendo expansíveis a longo prazo. Curiosamente, ao contrário da maioria dos outros modelos organoides, o EGF tipicamente necessário é redundante para o desenvolvimento e crescimento organoide robusto. Curiosamente, os organoides de caule apresentam propriedades de diferenciação de ameloblast, imitando características e processos do ERM/DESC que ocorrem in vivo. O novo e único modelo organoide descrito aqui permite explorar a biologia, plasticidade e capacidade de diferenciação do DESC e abre as portas para dar os primeiros passos em direção a abordagens regenerativas dentárias.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa UZ/KU Leuven (13/0104U). Os terceiros molares extraídos (dentes do siso) foram obtidos após o consentimento informado dos pacientes.
1. Preparativos
- Pré-aquecimento uma placa de cultura de 48 poços para 15-20 h em uma incubadora de CO2 de 1,9% a 37 °C.
- Liquefazer uma alíquota de Matrigel (fator de crescimento reduzido; livre de fenol; ainda mais referida como matriz de membrana do porão; BMM) no gelo (4 °C) pela mínima de 2h antes da etapa 2.1.
NOTA: Evite ciclos de congelamento/degelo do BMM. Liquefafique o BMM por 15-20 h no gelo e aliquot a 1 mL em tubos de microcentrifusagem e armazene a -20 °C. - Esfrie a centrífuga a 4 °C.
- Prepare a mídia e filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm. Os volumes a seguir baseiam-se na coleta dos DFs de todos os quatro molares de três terços tipicamente extraídos simultaneamente.
- Prepare 20 mL de meio de coleta df (Tabela 1): águia média essencial mínima (αMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 0,5% Amphotericina B e 1% penicilina-estreptomicina. Transfira 4 mL de médio de coleta df para um tubo de 15 mL e transfira os tubos no gelo.
NOTA: Um tubo de 15 mL é suficiente por paciente para coleta de amostras (ou seja, para quatro molares de quatro terços). - Fazer 20 mL de meio organoide dentário (ainda chamado de TOM; Tabela 2) utilizando meio definido sem soro (SFDM; Tabela 3). Armazene TOM a 4 °C durante a máxima de 2 semanas.
- Prepare 8 mL de meio de dissociação (Tabela 4), ou seja, salina tamponada com fosfato (PBS) contendo colagenase VI (3 mg/mL ) e dispase II (4 mg/mL). Pré-aquecimento do meio de dissociação em um banho de água de 37 °C por pelo menos 10 minutos antes do uso e transfira-o para dois tubos de 15 mL (4 mL por tubo) para dissociar quatro tecidos DF.
- Prepare uma placa de lavagem (12-bem) contendo: três poços com 70% de EtOH, três poços com PBS e três poços com meio de coleta DF.
- Fazer 15 mL de média A por amostra (ou seja, 5 mL por dois DFs por paciente; Tabela 5).
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas em condições estéreis.
- Prepare 20 mL de meio de coleta df (Tabela 1): águia média essencial mínima (αMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), 0,5% Amphotericina B e 1% penicilina-estreptomicina. Transfira 4 mL de médio de coleta df para um tubo de 15 mL e transfira os tubos no gelo.
2. Dissociação do folículo dental
- Uma vez que os terceiros molares com DFs associados são coletados no meio de coleta (no gelo), transfira o conteúdo dos tubos para uma placa de Petri.
- Segure o dente com uma pinça e isole cuidadosamente o DF usando uma lâmina cirúrgica.
NOTA: Esta etapa requer prática; tenha cuidado com a lâmina. - Para lavar o sangue restante dos DFs, coloque os tecidos DF brevemente no primeiro poço de 70% EtOH (placa de lavagem) para 20 s, e depois transfira para o próximo EtOH bem para 20 s, e ainda mais para o terceiro Poço EtOH (máximo de 1 min em 70% EtOH no total; maior tempo de incubação resultará em viabilidade celular reduzida).
- Em seguida, continue enxaguando nos três poços pbs (máximo 2 min no total).
- Enxágüe os DFs nos três poços médios de coleta do DF restantes (até um máximo de 20 min no total).
- Transfira os DFs enxaguados para uma nova placa de Petri.
- Corte um pequeno pedaço de um dos DFs (~5 mm2) para fixação de paraformaldeído (PFA) (ver seção 7) e armazene-o no gelo (por um máximo de 6 h) em um tubo de microcentrifuuge contendo 500 μL de meio de coleta de DF até a fixação do PFA.
- Pique o resto dos DFs em pequenos pedaços (~1 mm2).
NOTA: É aconselhável processar imediatamente os tecidos DF recém-isolados para a formação organoide ideal e eficiência de crescimento, em vez de partir de tecido criopreservado, o que resulta em menor eficiência. No entanto, é possível criopreservar tecido DF primário nesta etapa (ver meio criopreservação e protocolo na seção 5). - Transfira os DFs picados para um tubo de 15 mL contendo 4 mL de meio de dissociação pré-armado e incubar em um banho de água de 37 °C por 2h.
NOTA: Adicione dois DFs por meio de dissociação pré-armado de 4 mL (um tubo) para garantir uma dissociação ideal. - A cada 15 minutos, pipet o meio de dissociação DF mistura para cima e para baixo usando um cano pasteur de vidro para acelerar a desintegração do tecido. Quando as peças df não forem mais observadas (geralmente após 1h), prossiga com a dissociação do DF usando uma tubulação pasteur polida com fogo estreita.
NOTA: Para a dissociação ótima do DF, mude para uma tubulação Pasteur estreitada pelo polimento de fogo no máximo 1h de isolamento df.- Enquanto isso, prepare 10 mL de médio A contendo 50 μL de DNase (0,2 mg/mL; Tabela 5).
- Adicione 5 mL de médio A (contendo o DNase) a cada tubo com DF dissociado, e incubar por 1 min a temperatura ambiente (RT).
- Filtre a suspensão celular (contendo células únicas e aglomerados de células pequenas) através de um coador de células de 40 μm para remover os fragmentos grandes restantes e (a maioria) do tecido fibroso.
- Combine os vários tubos com DF dissociado de um paciente nesta etapa.
- Enxágüe o filtro com 1 mL de média A. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 200 x g por 10 min a 4 °C.
- Remova o supernatante, resuspenja a pelota em 1 mL de SFDM (Tabela 3) e transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado. Negligencie as células que permanecem.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
3. Estabelecimento da cultura organoide dentária (Figura 1A e Figura 2A)
- Com base no número de celular obtido, calcule o número de poços que podem ser semeados. Uma gotícula de 20 μL deve conter 20.000 células. A mistura final é composta de suspensão celular e BMM em uma proporção de 30:70.
- Remova a quantidade apropriada de supernascer e resuspend em BMM gelado para obter uma proporção de 70:30 de BMM: suspensão celular para chapeamento. Por exemplo, quando 200.000 células são obtidas, placa 10 gotículas de 20 μL. Assim, remova o supernascer até que 60 μL da suspensão celular seja deixado, adicione 140 μL de BMM gelado e resuspend.
- Resuspend lentamente para evitar a formação de bolhas de ar. Uma vez resuspendido em BMM, mantenha o tubo de microcentrífuga no gelo.
NOTA: Manter o tubo de microcentrífuga no gelo é crucial para evitar a solidificação do BMM.
- Resuspend lentamente para evitar a formação de bolhas de ar. Uma vez resuspendido em BMM, mantenha o tubo de microcentrífuga no gelo.
- Pipetar as gotículas BMM de 20 μL no centro dos poços da placa de cultura pré-aquecido de 48 poços.
- Vire a placa de cabeça para baixo, coloque-a em uma incubadora de CO2 de 1,9% (% CO2 de acordo com o buffer SFDM), e deixe-a solidificar por pelo menos 20 min a 37 °C.
- Adicione o inibidor rock (RI; 10 μM) e a anfotericina B (0,1%) ao TOM e pré-aquecimento do meio em um banho de água de 37 °C.
NOTA: A anfotericina B é sensível à luz. - Pegue a placa de 48 poços da incubadora, coloque na vertical e adicione 250 μL do meio pré-armado preparado para cada poço com gotícula/células BMM e devolva a placa para a incubadora de CO2 1,9%.
- Para refrescar o meio (de preferência a cada 2-3 dias), incline a placa de 48 poços em um ângulo de 45°, remova suavemente o meio anterior, evitando tocar na goteta BMM e adicione 250 μL de novo meio TOM pré-armado.
NOTA: Recomenda-se atualizar pelo menos três vezes por semana para evitar o esgotamento dos principais nutrientes e fatores de crescimento. A RI só precisa ser adicionada ao TOM na semeadura inicial e nos primeiros dias de cada passagem (ver seção 4) para prevenir a morte celular por anoikis e melhorar o crescimento organoide. A anfotericina B só é adicionada ao meio durante a passagem 0 (P0) para bloquear uma possível contaminação fúngica.
4. Amplificação e passagem da cultura organoide dentária (Figura 1B e Figura 2B)
- Passagem dos organoides entre 10 e 14 dias de cultura.
NOTA: Evite cultivar por um período mais longo, pois a cultura prolongada pode limitar o crescimento organoide e a passabilidade. Somente no desenvolvimento inicial (P0) os organoides podem ser cultivados por até 20 dias, dependendo de sua taxa de crescimento (até que o máximo ± 200 μm de diâmetro seja atingido). - Remova o meio dos poços com organoides que precisam ser passagemdos. Dentro de uma condição de cultura, acumule até quatro poços confluentes (ver Figura 2C).
- Para coletar os organoides, adicione 400 μL de SFDM gelado por poço diretamente na gotícula BMM e encolha repetidamente o meio para cima e para baixo até que toda a gotícula BMM seja desalojada.
- Caso os poços estejam sendo agrupados, transfira os 400 μL do primeiro poço para o próximo (e assim por diante) para desalojar as gotículas BMM contendo organoides de todos os poços que precisam ser agrupados.
- Transfira o conjunto BMM-organóide desalojado para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e repita o passo 4.3 novamente até que todas as estruturas organoides sejam coletadas dos poços.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Pré-aquecimento um aliquot de TrypLE Express (complementado com RI a 5 μM) em um banho de água de 37 °C. Por tubo de microcentrifuge de organoides, é necessário um volume de 400 μL TrypLE Express.
- Após a centrifugação, remova o supernasce e resuspense a pelota em 400 μL de TrypLE. Incubar a suspensão em um banho de água de 37 °C por 12 minutos.
- Adicione 400 μL de SFDM gelado para inativar a enzima e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante.
- Pré-revesse uma dica (para obter volume veja abaixo) com SFDM gelado e resuspenque a pelota organoide.
- Para evitar a perda organoide, reumuada a mesma ponta (pré-revestida) o máximo possível sem comprometer a esterilidade.
NOTA: O volume de SFDM necessário para o ressusufetador da pelota depende do número de estruturas organoides obtidas e do número de passagem atual. - Como regra geral, para passagens, P0 para P2-3 (geralmente ainda crescendo um número baixo de organoides) usam um volume de 200 μL SFDM. A partir de passagens, P3-4 ou superior (geralmente produzindo um número maior de organoides) usam um volume de 700 μL de SFDM.
NOTA: Ambos os procedimentos são chamados de métodos de "passagem baixa" e "passagem mais alta", respectivamente (ver as etapas 4.10 e 4.11). Aplicar corretamente os métodos distintos é crucial para uma passagem eficiente dos organoides. Com o método de passagem mais elevado, os organoides são mais facilmente perdidos e não devem ser aplicados a baixo número de organoides (ou seja, em P0 a P2-3). No entanto, o método de passagem mais elevado é necessário para dissociar eficientemente grandes quantidades de organoides.
- Para evitar a perda organoide, reumuada a mesma ponta (pré-revestida) o máximo possível sem comprometer a esterilidade.
- Método de passagem baixa: Resuspend a pelota em 200 μL de SFDM gelado. Empurre a ponta da tubulação completamente esvaziada contra a parte inferior do tubo de microcentrífuga para reduzir seu diâmetro. Verifique se o diâmetro é pequeno o suficiente (aspiração mais lenta, fluxo é distorcido, mas não bloqueado). Encolé-lo para cima e para baixo por 5 minutos para interromper mecanicamente os organoides.
- Método de passagem mais alto: Resuspend a pelota em 700 μL de SFDM gelado com uma ponta P1000. Adicione uma ponta P200 (sem filtro) em cima desta ponta P1000 e pré-casaco com SFDM gelado. Evite a formação de bolhas de ar ajustando a configuração de volume da tubulação, a fim de aspirar pelo menos 90% do volume médio (com organoides). Encolé-lo para cima e para baixo por 5 minutos para interromper mecanicamente os organoides.
- Verifique sob o microscópio de luz (a 4x de ampliação) se principalmente células únicas com (apenas) algumas estruturas não desoperadas são obtidas.
- Adicione 500 μL de SFDM gelado ao tubo de microcentrifuuge e misture suavemente a mistura de células dissociadas com o SFDM fresco por pipetação.
- Deixe grandes estruturas não desoperadas sedimentares por 10 minutos colocando verticalmente o tubo de microcentrifuuge no gelo.
NOTA: É necessário remover as estruturas não desempísparadas porque elas influenciam negativamente a passibilidade organoide. Para a iniciação organoide (P0), essa etapa de sedimentação não é necessária. - Coletar o supernante (~500-1.000 μL dependendo do método de passagem) contendo células únicas e pequenos aglomerados celulares; transferir para um novo tubo de microcentrifuuge, e centrífuga a 190 x g por 10 min a 4 °C.
- Calcule a concentração celular usando um contador celular automatizado. Negligencie as células que permanecem.
- Conte quantos poços podem ser semeados e calcule a razão de suspensão celular/BMM apropriada conforme descrito acima (seção 3).
- Adicione 70% de BMM à pelota celular e mantenha o tubo de microcentrífuga no gelo.
NOTA: É crucial manter o tubo de microcentrifuuge no gelo para evitar a solidificação do BMM. - Prossiga com a etapa 3.3 até 3.7 e volte a passar entre o dia 10 e o dia 14 da cultura.
5. Criopreservação de organoides dentários
- Coletar e dissociar os organoides como mencionado acima para a passagem (passo 4). Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de criopreservação contendo SFDM (70%), FBS (20%) e DMSO (10%).
- Transfira a suspensão para um criovial e coloque-a no gelo. Coloque os criovias em uma caixa de criogenia e transfira para -80 °C (por pelo menos 4 h).
- Dentro de 1 mês, transfira as amostras congeladas para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo (> 12 meses).
6. Descongelamento de organoides dentários criopreservados
- Antes de iniciar o procedimento de descongelamento, coloque um tubo de 15 mL por criovial no gelo contendo 10 mL de SFDM com 20% de FBS.
- Remova o criovial do nitrogênio líquido e coloque-o no gelo.
NOTA: Realize as seguintes etapas o mais rápido possível e evite tempo de descongelamento muito longo (>5 min) bem como intervalos muito longos entre os passos (>5 min), pois tal prolongamento diminuirá a sobrevida celular. - Coloque o criovial em um banho de água morna (37 °C) até descongelar (~1-2 min).
- Transfira imediatamente o conteúdo do criovial para o tubo gelado de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova 9 mL do supernaspe e centrifule os 1 mL restantes a 200 x g por 5 min a 4 °C. Retire o supernatante e lave a pelota com SFDM gelado de 1 mL.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e conte as células usando um contador celular automatizado.
- Conte quantos poços podem ser semeados e calcule a razão de suspensão celular/BMM apropriada conforme descrito acima (seção 3).
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenque a pelota em uma proporção de 70:30 de BMM:TOM e mantenha no gelo.
- Prossiga com a etapa 3.3 até 3.7 e passagem entre o dia 10 e o dia 14 da cultura.
7. Fixação e incorporação de organoides dentários
NOTA: Este procedimento (incluindo as seções 8 e 9) também pode ser aplicado ao tecido df primário.
- Fixação de organoides dentários em PFA
- Remova o meio de cada um, bem como na etapa 4.2.
- Coletar os organoides desalojando a gotícula BMM (etapa 4.3). Transfira a mistura BMM-organoid para um tubo de microcentrífa de 1,5 mL.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernasal e adicione 500 μL de 4% pfa e incubar por um mínimo de 30 min (máximo 1 h) em RT com mistura suave em um agitador orbital.
ATENÇÃO: Use a coifa química ao trabalhar com PFA. - Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante e enxágue a pelota organoide com PBS por 10 minutos no RT com agitação suave.
- Lave a pelota organoide (passo 7.1.5) duas vezes adicionais. Gire os organoides fixos a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Resuspense a pelota em 500 μL de 70% EtOH (em água deionizada). Armazene os organoides por até 1 mês em 70% EtOH a 4 °C.
- Agarose e parafina-incorporação de organoides dentários
NOTA: Para incorporar eficientemente organoides em parafina, é necessário um passo adicional de incorporação em agarose.- Centrifugar os organoides fixos pfa em 70% EtOH a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante.
- Prepare uma solução de 2% de agarose em 30 mL de PBS em uma garrafa de vidro. Aqueça a mistura agarose-PBS em um micro-ondas até que uma estrutura semelhante a gel seja observada (aproximadamente 2,5 min a 600 W).
- Em paralelo, adicione 30 mL de PBS a outra garrafa de vidro e aqueça no micro-ondas (aproximadamente 2,5 min a 600 W). Deixe a solução agarose esfriar por 1 min.
- Corte a ponta de uma ponta P200 para permitir trabalhar com a solução agarose com precisão e para evitar bolhas de ar.
- Pré-aqueça a ponta P200 no PBS quente, pipetting para cima e para baixo algumas vezes.
- Adicione 150 μL de solução de agarose pré-armada à pelota organoide e encobre suavemente a mistura organóide-agarose (com resuspensão mínima) evitando bolhas de ar.
NOTA: A ressuspensão mínima permitirá melhor localizar os organoides no gel de agarose na seção de microtoma, uma vez que os organoides estão então mais próximos um do outro. - Transfira imediatamente a mistura organóide-agarose para a mesma tampa do tubo de microcentrifuuge, coloque o tubo horizontalmente e deixe a agarose solidificar (~20 min em RT). Enquanto isso, rotule as fitas.
- Uma vez solidificado, remova o gel de agarose da tampa de microcentrifuuge usando uma pinça e transfira-o para um rotulado.
- Transfira o contendo agarose para um béquer contendo 50% de EtOH em água desionizada. Cubra o béquer com parafilm para evitar a evaporação do EtOH.
NOTA: O volume do béquer depende do número de. - Processe as amostras em um processador de tecido durante a noite.
NOTA: À medida que a parafina se solidifica na RT, as seguintes etapas devem ser executadas rapidamente. - Pré-aqueça um bloco de aquecimento na estação de trabalho de incorporação por 15 minutos.
- Remova o gel de agarose contendo organoides no e coloque-o no bloco de aquecimento pré-enlatado. Retire a tampa do e coloque-a de lado para uso posterior.
- Encha o bloco de aquecimento restante com parafina.
NOTA: Verifique com uma pinça se o gel de agarose contendo organoides ainda está localizado na parte inferior do bloco de aquecimento. Devido ao seu leve, ele pode começar a flutuar, resultando em perda de amostra. - Coloque a tampa do em cima do bloco de aquecimento. Deixe-o solidificar por 30 minutos em uma placa fria. Retire o bloco de aquecimento e armazene os blocos de parafina a 4 °C.
8. Secção de microtoma e coloração de organoides dentários (Figura 2B e Figura 3A-C)
- Secção de microtoma de blocos de parafina contendo organoides
- Corte 5 μm seções dos organoides dentários nos blocos de parafina usando um microtome.
- Coloque as fatias de parafina em cima de um deslizamento de vidro microscópio. Coloque o deslizamento de vidro do microscópio em uma placa quente a 37 °C e cubra-o com água deionizada usando uma tubulação Pasteur.
- Deixe o vidro do microscópio deslizar durante a noite.
- Manchas de seções organoides dentárias
- Desparafinar as seções organoides (no deslizamento de vidro do microscópio) em um forno por 1h a 58 °C.
- Reidratar as seções organoides (no deslizamento de vidro do microscópio) na diminuição da série EtOH dentro da capa química na seguinte ordem:
Xileno 2x por 3 min cada
100% EtOH 2x por 3 min cada
95% EtOH 2x por 3 min cada
90% EtOH 2x por 3 min cada
70% EtOH 3x por 3 min cada
ATENÇÃO: Use a coifa química ao trabalhar com Xileno. - Enxágüe o deslizamento de vidro do microscópio na água da torneira por 5 minutos no RT. Em seguida, enxágüe-o em PBS por 5 min no RT.
- Realize a recuperação de antígenos colocando as seções organoides (no slide de vidro do microscópio) em tampão citrato pré-caçado (10 mM de ácido cítrico em água desionizada com pH 6; em um recipiente plástico; pré-armado por 10 minutos em um banho de água de 95 °C) por 30 minutos em um banho de água de 95 °C.
- Deixe o deslizamento de vidro do microscópio esfriar por 20 minutos na RT. Enxágue o deslizamento de vidro do microscópio em PBS por 5 minutos no RT e, em seguida, em PBS contendo 0,1% Triton-X (PBT) por 5 min na RT.
- Use uma caneta de marcação para criar uma barreira hidrofóbica nas fronteiras de cada slide.
- Bloqueie por um mínimo de 1 h no RT no buffer de bloqueio (contendo 1,5 mg/mL de glicina, 2 mg/mL de colmônio bovino (BSA) dissolvido em PBT) mais 10% de soro de burro.
NOTA: Normalmente, 300 μL de tampão de bloqueio mais 10% de soro de burro é necessário por slide de vidro microscópio. - Coloque o deslizamento de vidro do microscópio em uma câmara úmida. Use uma caixa hermética onde todos os slides se encaixam e molham alguns tecidos de papel com água para colocar na parte inferior da caixa. Isso evitará que os slides sequem durante as etapas subsequentes de coloração.
- Remova o tampão de bloqueio, adicione o anticorpo primário (Tabela 6) preparado no tampão de bloqueio mais 1% de soro de burro e incubar o slide coberto com solução de anticorpos durante a noite na câmara úmida a 4 °C. Refaça a borda da caneta de marcação, se necessário.
- Lave o deslizamento de vidro do microscópio três vezes em PBT na RT por 10 minutos com mistura suave em um agitador orbital (75-150 rpm).
- Adicione o anticorpo secundário (Tabela 6), preparado no tampão de bloqueio mais 1% de soro de burro, e incubar por 1h na câmara úmida da RT.
- Remova o tampão de bloqueio e lave o slide de vidro do microscópio três vezes em PBT em RT por 10 minutos com mistura suave em um agitador orbital.
- Adicione o meio de montagem antifado com DAPI (1 a 3 gotículas) em uma mancha de vidro e monte-o em cima das seções organoides (no slide de vidro do microscópio). Proceder com a imagem; armazenar slides para uma máxima de 1 semana a 4 °C.
9. Extração de RNA e RT-qPCR de organoides dentários (Figura 2B e Figura 3D)
- Extração de RNA de organoides dentários
- Retire o meio de cada poço (passo 4.2).
- Colete os organoides deslocando a gotícula BMM (etapa 4.3), transfira a mistura BMM-organóide para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernasciente, resuspende vigorosamente em 350 μL de 1% β-mercaptoetanol dissolvido em tampão de lise (Tabela de Materiais), e coloque no gelo.
ATENÇÃO: Realize todos os passos com β-mercaptoetanol em um capô químico.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas nesta etapa por até 1 mês a -80 °C. Descongele as amostras no gelo antes de prosseguir com a etapa 9.1.4. - Vórtice as amostras até que nenhuma estrutura organoide seja observada mais.
- Proceda com a extração de RNA utilizando o kit de extração de RNA (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- RT-qPCR de organoides dentários (Tabela 7)
- Transcrever inversa (RT) o RNA19 utilizando o kit de transcrição reversa (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Analise as amostras de CDNA resultantes com PCR quantitativo baseado em SYBR Green (qPCR)19 utilizando um sistema PCR em tempo real (Tabela de Materiais).
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Representative Results
Desenvolvimento organoide dentário
Fornecemos um protocolo detalhado para estabelecer culturas organoides a partir do tecido DF humano adquirido após a extração do dente do siso (Figura 1A). O DF isolado é enzimaticamente e mecanicamente dissociado. As células obtidas são cultivadas dentro da BMM em mídias que foram empiricamente definidas para o desenvolvimento e crescimento organoide ideal (meio organoide dentário; TOM)19.
Os organoides normalmente se desenvolvem dentro de 2 semanas após a semeadura celular DF (P0; Figura 2A). Os organoides são expansíveis a longo prazo (até 11 passagens até agora) (Figura 2B, mostrada em P4). A semeadura de cerca de 20.000 células por gotícula BMM (tanto em P0 quanto em outras passagens) produz uma densidade ótima de organoides (Figura 2C), enquanto a semeadura de números celulares mais altos leva ao crescimento organoide subótimal (ou seja, organoides menores em densidade muito alta) à medida que há espaço insuficiente para crescer (Figura 2D). As condições de cultura eventualmente otimizadas permitem o desenvolvimento de organoides a partir de amostras de DF a 100% de eficiência19.
Caracterização e validação organoide dentária
Os organoides desenvolvidos apresentam uma aparência densa e contêm células que apresentam uma alta razão nucleo-citoplasmática, como observada da mesma forma nas células ERM7 (Figura 3A). Além disso, e em outra analogia, os organoides expressam o marcador ERM citokeratin 14 (CK14)22, confirmando assim sua origem epitelial (Figura 3B), bem como outros marcadores ERM propostos (como P63, CD44 e ITGα6 12,22,23 (Figura 3B). Além disso, os organoides expressam SOX2, um conhecido marcador DESC em camundongos e também presente no epitélio do desenvolvimento de dentes humanos (Figura 3B)1. Curiosamente, a amelogenina (AMELX), principal componente da matriz esmalte, também encontrada expressa nos organoides, também é detectada no ERM24 (Figura 3C). A expressão de outros marcadores ERM/stemness é descrita em nosso estudo recente19 e pode ser usada para certificar ainda mais os organoides obtidos. Além disso, os organoides mantêm seu fenótipo ERM/stemness durante a passagem, entre outros mostrados pela expressão estável de marcadores de células-tronco ERM (Figura 3D). Por fim, os organoides derivados do dente mostram capacidade de diferenciação para células ameloblast (semelhantes), que também podem ser aplicadas para validar as culturas organoides obtidas, mostrando expressão de marcadores ameloblast maduros, como proteína associada ao odontogênico-ameloblast (ODAM) e amelotina (AMTN) após transferência para meio de diferenciação (ver19).
Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático do desenvolvimento organoide dentário, caracterização e aplicações. (A) Desenvolvimento organoide dentário a partir de tecido folículo dentário (DF) isolado de terceiros molares não rompidos. (B) Amplificação, caracterização e potencial de aplicação de organoides dentários. d, dia; P, passagem. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desenvolvimento organoide dentário. (A) Desenvolvimento organoide a partir do tecido DF. Imagens de brightfield representativas mostradas em diferentes dias (d) após a semeadura (P0; P, passagem; 2,5x). (B) Imagens de Brightfield mostrando passagem robusta de uma linha organoide dentária (2,5x). (C) Imagens de Brightfield mostrando uma linha organoide dentária imediatamente na passagem (d0; esquerda; 2,5x) semeadas a uma densidade de 20.000 células por poço, e a cultura organoide confluente resultante pronta para ser passagem (d14; direita; 2,5x). (D) Imagens de Brightfield mostrando uma linha organoide dentária, que havia sido semeada a uma densidade de >20.000 células, levando a organoides menores em densidade muito alta em d14 (2,5x). Barras de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização organoide dentária. (A) Imagens de Brightfield de culturas organoides derivadas do DF em diferentes ampliações mostrando estruturas densas desenvolvidas aos 14 dias em TOM (P4; 5-20x)). Hematoxilina e eosina de um organoide (P1, dia 11). A caixa é ampliada. Setas indicam células com alta relação nucleo-citoplasmica. (B) Coloração imunofluorescente para marcadores epiteliais/ERM/stemness em organoides cultivados em TOM (20x). (C) Coloração imunofluorescente para amelogenina (AMELX) em organoide cultivado em TOM (20x). DAPI (azul) foi usado para rotular núcleos. (D) Níveis de expressão genética (relativos ao GAPDH) de marcadores ERM/stemness em organoides cultivados em P1 e P5 TOM no dia 14 da cultura (± médios SEM; n = 3 réplicas biológicas). Barras de escala: 50 μm, a menos que indicado em contrário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de coleta do folículo dental (DF) | |
| Nome | Concentração |
| Águia média essencial mínima (αMEM) | |
| Soro bovino fetal (FBS) | 10% |
| Anfotericina B | 0.5% |
| Penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) | 1% |
Tabela 1: Folículo dental (DF) meio de coleta. A tabela lista os constituintes do meio de coleta do DF.
| Meio organoide dentário (TOM) | |
| Nome | Concentração |
| Meio definido sem soro (SFDM) | Ver Tabela 3 para composição |
| A83-01 | 0,5 μM |
| B27 (sem vitamina A) | 2% |
| Toxina da cólera | 100 ng/mL |
| FGF2 (= FGF básico) | 20 ng/mL |
| FGF8 | 200 ng/mL |
| FGF10 | 100 ng/mL |
| L-Glutamina | 2 mM |
| IGF-1 | 100 ng/mL |
| N2 | 1% |
| N-acetil L-cisteína | 1,25 mM |
| Nicotinamida | 10 mM |
| Cabeça | 100 ng/mL |
| RSPO1 | 200 ng/mL |
| SB202190 (p38i) | 10 μM |
| Psiu | 100 ng/mL |
| WNT3a | 200 ng/mL |
Tabela 2: Meio organoide dentário (TOM). A tabela lista os constituintes e suas respectivas concentrações necessárias para preparar o meio organoide dentário.
| Meio definido sem soro (SFDM) (pH 7.3) | |
| Nome | Concentração |
| Estéril H2O | |
| DMEM 1:1 F12 sem Fe | 16,8 g/L |
| Transferrin | 5 mg/L |
| Insulina do pâncreas bovino | 5 mg/L |
| Penicilina G sal de sódio | 35 mg/L |
| Sal sulfato de estreptomicina | 50 mg/L |
| Etanol absoluto, ≥99,8% (EtOH) | 600 μL/L |
| Catalase do fígado bovino | 50 μL/L |
| Carbonato de hidrogênio de sódio (NaHCO3) | 1 g/L |
| Albumina Bovina (grau de cultura celular) | 5 g/L |
Tabela 3: Meio definido sem soro (SFDM) (pH 7.3). A tabela lista a composição do meio definido sem soro.
| Meio de dissociação | |
| Nome | Concentração |
| Salina tamponada fosfato (PBS) | |
| Colagenase IV | 3 mg/mL |
| Dispase II | 4 mg/mL |
Tabela 4: Meio de dissociação. Lista de constituintes e suas concentrações necessárias para a preparação do meio de dissociação.
| Médio A (pH 7.3) | |
| Nome | Concentração |
| Estéril H2O | |
| DMEM em pó de alta glicose | 13,38 g/L |
| HEPES | 5.958 g/L |
| Piruvato de sódio (C3H3NaO3) | 110 mg/L |
| Penicilina G sal de sódio | 35 mg/L |
| Sal sulfato de estreptomicina | 50 mg/L |
| Cloreto de Sódio (NaCl) | 0,5 g/L |
| Carbonato de hidrogênio de sódio (NaHCO3) | 1 g/L |
| Albumina Bovina (grau de cultura celular) | 3 g/L |
| Dnase* | 0,2 mg/mL |
| *adicionar quando mencionado |
Tabela 5: Médio A (pH 7.3). A tabela lista a concentração dos constituintes usados para preparar o Medium A.
| Anticorpos Primários | ||
| Nome | Anfitrião | Concentração |
| AMELX | rato | 1:100 |
| CD44 | rato | 1:200 |
| CK14 | rato | 1:200 |
| ITGA6 | coelho | 1:200 |
| P63 | coelho | 1:1000 |
| SOX2 | coelho | 1:2000 |
| Anticorpos secundary | ||
| Nome | Anfitrião | Concentração |
| mouse IgG (Alexa 555) | burro | 1:1000 |
| coelho IgG (Alexa 488) | burro | 1:1000 |
Tabela 6: Lista de anticorpos e suas diluições. A tabela lista os anticorpos e suas respectivas diluições utilizadas neste estudo.
| Primers | ||
| Gene | Primer para a frente | Primer reverso |
| GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| ITGA6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| SOX2 | GCTGGGACATGAAGAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| PITX2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabela 7: Lista de primers. A tabela lista os primers de GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 e PITX2 utilizados neste estudo.
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Discussion
Este protocolo descreve a geração eficiente e reprodutível de organoides a partir do dente humano. Para nosso conhecimento, esta é a primeira metodologia para o estabelecimento de organoides de conceito atual (epitelial) a partir do tecido dentário humano. Os organoides são expansíveis a longo prazo e apresentam um fenótipo de caule epitelial dentário, duplicando DESCs previamente relatados no compartimento ERM do DF7. Além disso, os organoides replicam características funcionais de DESC/ERM, incluindo o desdobramento de um processo de diferenciação de ameloblast 7,25,26. Os achados são robustos, uma vez que resultados comparáveis foram encontrados com linhas organoides independentesdo paciente 19.
Ao executar este protocolo organoide dentário, vários pontos críticos precisam ser levados em conta. Primeiro, a adição do inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632 na semeadura inicial e imediatamente após cada passagem é essencial para evitar que as células únicas se submetam a anoikis27. Além disso, a anfotericina B é necessária em todos os refrescos de mídia durante p0 para evitar o crescimento fúngico (oral). Em segundo lugar, aconselha-se processar imediatamente os tecidos DF recém-isolados para a formação organoide ideal e eficiência de crescimento, em vez de partir de tecido criopreservado, o que resulta em menor eficiência. Em terceiro lugar, ao descongelar uma linha organoide criopreservada para cultivo, realize etapas o mais rápido possível e evite um tempo de descongelamento muito longo, bem como intervalos muito longos entre os passos à medida que a prolongação do tempo diminui a sobrevivência celular. Em quarto lugar, deve-se notar que o número de organoides na passagem precoce (P0-P3) pode permanecer limitado, também porque apenas um número limitado de células ERM (tronco) pode estar presente nas amostras específicas de tecidos df isolados. Assim, as culturas organoides na passagem precoce devem ser tratadas com cuidado e consideração. Portanto, recomenda-se (i) evitar a rápida expansão da cultura organoide (ou seja, só começar a se dividir em 1:3 ou mais a partir de P3-4, e antes em 1:0.5 ou 1:1); (ii) utilizar o método de divisão apropriado (passagem baixa - passagem mais alta) conforme descrito. Nesse contexto, aconselha-se coletar dentes do siso não esrupcionados de pacientes adolescentes jovens (15 a 19 anos) uma vez que as células ERM diminuem em número com desenvolvimento dentário e28 anos. Em quinto lugar, os fragmentos de tecido duro não ressupersados do tecido DF na suspensão celular (mesmo após a filtragem) fazem com que a queda do BMM seja menos estável e mais propensa a se desalojar durante a cultura. Recomenda-se uma maior porcentagem de BMM (como 80%) se forem observados múltiplos fragmentos de tecido duro não ressecidos na suspensão celular DF dissociada. Em sexto lugar, é fortemente aconselhável a passagem dos organoides entre o dia 10 e o 14º dia da cultura, uma vez que a cultura mais longa afetará negativamente a expansão organoide por causa da dissociação menos ideal. Se por uma ou outra razão, os organoides forem cultivados por mais de 14 dias, a quantidade e o tempo de incubação do TryplE Express para dissociação organoides podem ser estendidos para dissociação eficiente, embora 15 minutos de exposição enzimática não devem ser superados. Dentro do mesmo contexto, o meio de cultura deve ser atualizado a cada 2-3 dias para evitar a exaustão do nutriente e do fator de crescimento. Caso os organoides não se expandam adequadamente, independentemente dos pontos críticos mencionados acima, deve-se focar em manter todas as ferramentas (BMM, SFDM gelada para ponta pré-revestimento, tubos de microcentrifuuge) usados durante a passagem no gelo. Além disso, é crucial aplicar corretamente os métodos de passagem distintos (baixa passagem e método de passagem mais alto) para uma passagem eficiente dos organoides.
Antes, outros grupos relataram crescimento in vitro do tecido DESC/ERM humano primário 8,9,10,11,12,21. No entanto, as culturas eram principalmente 2D (monocamadas) e não 3D, como este modelo organoide, além de mostrar apenas crescimento de curto prazo e retenção de fenótipos. Alternativamente, muitas vezes (espontaneamente) foram utilizadas células imortalizadas, que, no entanto, não são fisiológicas e mostram apenas semelhança limitada com o tecido ou células de origem. Além disso, essas linhas celulares foram derivadas de tecido embrionário e/ou de animais. Além disso, a diferenciação de ameloblast não é descrita ou apenas documentada limitadamente. Assim, o modelo organoide aqui apresentado oferece diversas vantagens, sendo (i) a recapitulação fiel do tecido/células de origem, (ii) expansível a longo prazo, (iii) cultivada em 3D representando mais de perto a configuração in vivo, (iv) de origem humana e idade pós-natal, e (v) capaz de se diferenciar em células dentárias maduras (tipo célula ameloblast) (ver19).
Assim, geramos uma valiosa ferramenta de pesquisa, não relatada antes, segurando várias aplicações interessantes (Figura 1B). Os organoides podem ser aplicados para estudar a haste e plasticidade humanas DESC/ERM. Ele oferece a oportunidade de obter mais informações sobre a biologia da população celular ERM ainda enigmática por meio de análises transcriômicas imunofluorescentes, gênicas e (células únicas). Além disso, os organoides são particularmente adequados para a modelagem de doenças humanas para decifrar mecanismos patogênicos, identificar (novos) alvos terapêuticos e gerar ferramentas de descoberta e rastreamento de medicamentos29. Mais especificamente, este modelo pode ser aplicado a cistos odontogênicos (para os quais não há nenhum modelo de pesquisa confiável disponível), que podem ser comparados a organoides saudáveis derivados do dente. Além disso, essa abordagem organoide dentária pode ser aproveitada para modelar e estudar doenças dentárias que vão desde o impacto de bactérias até mutações genéticas associadas a anomalias dentárias (como mutações em P63, que poderiam ser introduzidas usando métodos de edição de genes de ponta, como o CRISPR-Cas)30, eventualmente levando a potenciais, e novos alvos terapêuticos e tratamentos. Outras aplicações do protocolo organoide dentário podem incluir o biobanco (atualmente já disponível para celulose dentária, como o Future Health Biobank)31 para coletar linhas organoides de pessoas e doenças múltiplas (por exemplo, para pesquisas básicas e translacionais, como o rastreamento de medicamentos). Além disso, vários relatórios sobre modelos organoides compostos contendo não apenas epiteliais, mas também outros tipos celulares do tecido de origem foram publicados recentemente32,33. Como a composição dentária é bastante complexa, acomodar células mesenquimais, imunes e endoteliais, aplicar este modelo organoide epitelial em combinação com esses tipos de células para mais detalhadamente representar sua contraparte in vivo é uma perspectiva atraente. Além disso, este sistema permite explorar a amelogênese no dente humano, atualmente apenas mal compreendido, mas certamente contando com interações epiteliais-mesenquimais. A decifração do desenvolvimento do ameloblast representa um importante avanço no mundo científico e clínico odontológico, uma vez que a produção de esmalte, o componente quintessencial de nossos dentes, é um objetivo altamente perseguido na reparação de tecidos dentários. Além disso, a modelagem organoide detalhada neste estudo pode significar o início para a formação de tecidos mineralizados in vitro e abrir caminho para o desenvolvimento de um dente bioengenheiro (ou pelo menos partes) para terapia de substituição.
Uma das limitações do modelo organoide é que ele representa apenas o componente epitelial do tecido. No entanto, conforme descrito em detalhes acima, essa deficiência poderia ser resolvida pela adição de outros tipos de células/tecidos, como o mesenquimedental 19. Outro aspecto que pode ser reconhecido como uma limitação é a origem do BMM utilizado aqui (Matrigel). Este BMM é derivado de um sarcoma (Engelbrecht-Holm-Swarm) de um rato e, portanto, deve ser substituído antes de traduzir a abordagem organoide para a clínica. Recentemente, vários esforços foram feitos para substituir Matrigel por hidrogéis sintéticos34,35. No entanto, mais pesquisas são necessárias para cultivar organoides com sucesso em tais géis não naturais. Embora a tecnologia organoide forneça uma abordagem interessante para a futura terapia regenerativa dentária - por exemplo, o desenvolvimento de um dente bioengenheiro - questões éticas devem ser levantadas sobre a privacidade dos doadores celulares, bem como a comercialização de organoides humanos e tecidos derivados dele. Até agora, nãoforam alcançadas conclusões sobre a comercialização organoide para fins regenerativos. Os biobancos de polpa dentária têm aumentado31, bem como biobancos organoides de vários tecidos cancerígenos, principalmente cancerosos, para fins de rastreamento de medicamentos. Dado que os organoides não podem ser categorizados como células, gametas, tecidos ou órgãos (que todos são regulados por lei), há uma necessidade urgente de retratar seu status jurídico para seu uso em ambientes clínicos, científicos ou comerciais. Embora os organoides tenham demonstrado depositar tecido mineralizado quando transplantados subcutâneamente in vivo19, novos estudos são necessários para analisar seu potencial de depósito de esmalte semelhante ao de um dente humano natural.
Ao todo, o novo modelo organoide desenvolvido apresenta uma ferramenta promissora e valiosa para estudar a biologia e a amelogênese do dente humano, ambos atualmente pouco explorados, com perspectivas futuras para modelagem de doenças dentárias e terapias regenerativas.
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Disclosures
O autor correspondente garante que todos os autores tenham divulgado todo e qualquer conflito de interesse.
Acknowledgments
Somos gratos a todos os membros da equipe da Cirurgia Oral e Maxilofacial (MKA) da UZ Leuven, bem como aos pacientes, por sua ajuda inestimável na coleta de terceiros molares recém-extraídos. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Reinhilde Jacobs e à Dra. Este trabalho foi apoiado por subvenções da KU Leuven (BOF) e FWO-Flanders (G061819N). L.H. é um Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
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