Summary
We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.
Abstract
Tanden zijn van cruciaal belang in het leven, niet alleen voor voedselmasticatie en spraak, maar ook voor psychologisch welzijn. Kennis over de ontwikkeling en biologie van menselijke tanden is schaars. In het bijzonder is er niet veel bekend over de epitheelstamcellen van de tand en hun functie. We zijn erin geslaagd om een nieuw organoïde model te ontwikkelen dat vertrekt van menselijk tandweefsel (d.w.z. tandheelkundige follikel, geïsoleerd uit geëxtraheerde verstandskiezen). De organoïden zijn robuust en langdurig uitbreidbaar en recapituleren het voorgestelde menselijke tandepitheelstamcelcompartiment in termen van markerexpressie en functionele activiteit. In het bijzonder zijn de organoïden in staat om een ameloblastdifferentiatieproces te ontvouwen zoals dat in vivo optreedt tijdens amelogenese. Dit unieke organoïde model biedt een krachtig hulpmiddel om niet alleen de ontwikkeling van menselijke tanden te bestuderen, maar ook tandheelkundige pathologie, en kan de weg vrijmaken voor tandregeneratieve therapie. Het vervangen van verloren tanden door een biologische tand op basis van dit nieuwe organoïde model zou een aantrekkelijk alternatief kunnen zijn voor de huidige standaard implantatie van synthetische materialen.
Introduction
Tanden hebben een essentiële rol bij voedselmasticatie, spraak en psychologisch welzijn (zelfbeeld). De menselijke tand bestaat uit sterk gemineraliseerde weefsels met verschillende dichtheid en hardheid1. Tandglazuur, het hoofdbestanddeel van de tandkroon, is het hoogste gemineraliseerde weefsel in het menselijk lichaam. Tijdens de vorming van glazuur (amelogenese), wanneer tanden zich ontwikkelen, differentiëren tandheelkundige epitheelstamcellen (DESC's) in glazuurvormende cellen (ameloblasten). Eenmaal gevormd, wordt het glazuur zelden gerepareerd of vernieuwd vanwege het apoptotische verlies van de ameloblasten bij het begin van tanduitbarsting1. Herstel van beschadigd glazuurweefsel, zoals veroorzaakt door trauma of bacteriële ziekte, wordt momenteel bereikt met behulp van synthetische materialen; deze hebben echter te kampen met belangrijke tekortkomingen zoals microlekage, inferieure osseo-integratie en verankering, eindige levensduur en gebrek aan volledig functionele reparatie2. Vandaar dat een robuuste en betrouwbare kweek van menselijke DESC's met de capaciteit om ameloblasten te genereren en het potentieel om gemineraliseerd weefsel te produceren een belangrijke stap voorwaarts zou zijn op het gebied van tandheelkundige regeneratieve aard.
Kennis over humaan DESC-fenotype en biologische functie is schaars 3,4,5. Interessant is dat DESC's van menselijke tanden zijn voorgesteld om te bestaan in de epitheelcelresten van Malassez (ERM), celclusters aanwezig in de tandheelkundige follikel (DF), die niet-gescheurde tanden omringt, en aanwezig blijft in het parodontale ligament rond de wortel zodra de tand uitbarst1. ERM-cellen die samen met tandpulp zijn gekweekt, blijken te differentiëren tot ameloblastachtige cellen en glazuurachtig weefsel te genereren6. Diepgaande studies naar de specifieke rol van ERM-cellen in glazuur (re-) generatie zijn echter beperkt vanwege het ontbreken van betrouwbare studiemodellen7. De huidige ERM in vitro kweeksystemen worden belemmerd door een beperkte levensduur en snel verlies van fenotype in de 2D-omstandigheden die standaard worden gebruikt 8,9,10,11,12. Daarom is een handelbaar in vitro systeem om menselijke DESC's getrouw uit te breiden, te bestuderen en te differentiëren sterk nodig.
In het afgelopen decennium is een krachtige techniek om epitheelstamcellen in vitro te laten groeien met succes toegepast op verschillende soorten (menselijke) epitheelweefsels om hun biologie en ziekte 13,14,15,16 te bestuderen. Deze technologie stelt de weefselepitheelstamcellen in staat om zichzelf te ontwikkelen tot 3D-celconstructies (d.w.z. organoïden) wanneer ze worden gezaaid in een extracellulaire matrix (ECM) -nabootsende steiger (meestal Matrigel) en gekweekt in een gedefinieerd medium dat de stamcelnichesignalering en / of embryogenese van het weefsel repliceert. Typische groeifactoren die nodig zijn voor organoïde ontwikkeling zijn epidermale groeifactor (EGF) en vleugelloze MMTV-integratieplaats (WNT) activators 14,15,16. De resulterende organoïden worden gekenmerkt door blijvende trouw bij het nabootsen van de oorspronkelijke epitheelstamcellen van het weefsel, evenals een hoge uitbreidbaarheid met behoud van hun fenotype en functionele eigenschappen, waardoor de vaak beperkte beschikbaarheid van primair menselijk weefsel zoals verkregen uit de kliniek wordt overwonnen. Om organoïden vast te stellen, is isolatie van de epitheelstamcellen uit het heterogene weefsel (d.w.z. bestaande uit andere celtypen zoals mesenchymale cellen) voorafgaand aan het kweken niet vereist, omdat mesenchymale cellen zich niet hechten aan of gedijen in de ECM, wat uiteindelijk resulteert in zuiver epitheliale organoïden 13,16,17,18,19 . Deze veelbelovende en veelzijdige technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van vele organoïde modellen uit verschillende menselijke epitheelweefsels. Menselijke tand-afgeleide organoïden, waardevol voor diepgaande studie van tandontwikkeling, regeneratie en ziekte, waren echter nog niet vastgesteld20,21. We zijn er onlangs in geslaagd om zo'n nieuw organoïde model te ontwikkelen op basis van DF-weefsel uit derde kiezen (verstandskiezen) die zijn geëxtraheerd bij adolescente patiënten19.
Hier beschrijven we het protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen uit de volwassen menselijke tand (d.w.z. uit de DF van derde kiezen) (figuur 1A). De resulterende organoïden drukken ERM-geassocieerde stengelheidsmarkers uit terwijl ze op lange termijn uitbreidbaar zijn. Intrigerend genoeg is, in tegenstelling tot de meeste andere organoïde modellen, het typisch benodigde EFG overbodig voor robuuste organoïde ontwikkeling en groei. Interessant is dat de stamheidsorganoïden ameloblastdifferentiatie-eigenschappen vertonen, waardoor ERM / DESC-kenmerken en -processen in vivo worden nagebootst. Het nieuwe en unieke organoïde model dat hier wordt beschreven, maakt het mogelijk om DESC-biologie, plasticiteit en differentiatiecapaciteit te verkennen en opent de deur voor het zetten van de eerste stappen in de richting van tandregeneratieve benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie Onderzoek UZ/KU Leuven (13/0104U). Geëxtraheerde derde kiezen (verstandskiezen) werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de patiënten.
1. Voorbereidingen
- Prewarm een 48-well kweekplaat gedurende 15-20 uur in een 1,9% CO2-incubator bij 37 °C.
- Vloeibaar maken van een Matrigel aliquot (groeifactor-gereduceerd; fenol roodvrij; verder aangeduid als keldermembraanmatrix; BMM) op ijs (4 °C) gedurende ten minste 2 uur voorafgaand aan stap 2.1.
OPMERKING: Vermijd vries-/dooicycli van de BMM. Maak de BMM vloeibaar gedurende 15-20 uur op ijs en aliquot bij 1 ml in microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 °C. - Koel de centrifuge af tot 4 °C.
- Bereid media voor en filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm. De volgende delen zijn gebaseerd op de verzameling van de DF's van alle vier de derde kiezen die doorgaans gelijktijdig worden geëxtraheerd.
- Bereid 20 ml DF-verzamelmedium (tabel 1): minimaal essentieel medium eagle (αMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,5% amfotericine B en 1% penicilline-streptomycine. Breng 4 ml DF-opvangmedium over op een buis van 15 ml en breng de buizen over op ijs.
OPMERKING: Eén buis van 15 ml is voldoende per patiënt voor monsterverzameling (d.w.z. voor vier derde kiezen). - Maak 20 ml tandorganoïde medium (verder aangeduid als TOM; Tabel 2) met behulp van serumvrij gedefinieerd medium (SFDM; Tabel 3). Bewaar TOM bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Bereid 8 ml dissociatiemedium (tabel 4), d.w.z. fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met collagenase VI (3 mg/ml) en dispase II (4 mg/ml). Laat het dissociatiemedium voor gebruik minstens 10 minuten voor in een waterbad van 37 °C voorwarmen en breng het over in twee buizen van 15 ml (4 ml per buis) om vier DF-weefsels te dissociëren.
- Bereid een wasplaat (12-putjes) met daarin: drie putten met 70% EtOH, drie putten met PBS en drie putten met DF-opvangmedium.
- Maak 15 ml medium A per monster (d.w.z. 5 ml per twee DFs per patiënt; Tabel 5).
OPMERKING: De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
- Bereid 20 ml DF-verzamelmedium (tabel 1): minimaal essentieel medium eagle (αMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,5% amfotericine B en 1% penicilline-streptomycine. Breng 4 ml DF-opvangmedium over op een buis van 15 ml en breng de buizen over op ijs.
2. Dissociatie van de tandheelkundige follikel
- Zodra de derde kiezen met bijbehorende DFs zijn verzameld in het verzamelmedium (op ijs), brengt u de inhoud van de buisjes over naar een petrischaaltje.
- Houd de tand vast met een pincet en isoleer de DF zorgvuldig met behulp van een chirurgisch mes.
OPMERKING: Deze stap vereist oefening; wees voorzichtig met het mes. - Om het resterende bloed van de DFs te wassen, plaatst u de DF-weefsels kort in de eerste put van 70% EtOH (wasplaat) gedurende 20 s en vervolgens over te brengen naar de volgende EtOH-put gedurende 20 s, en verder naar de derde EtOH-put (maximaal 1 min in 70% EtOH in totaal; langere incubatietijd zal resulteren in verminderde levensvatbaarheid van de cel).
- Ga vervolgens verder met spoelen in de drie PBS-putten (maximaal 2 minuten in totaal).
- Spoel de DFs in de drie resterende DF-verzamelmediumputten (tot een maximum van 20 minuten in totaal).
- Breng de gespoelde DFs over in een nieuwe petrischaal.
- Snijd een klein stukje van een van de DFs (~5 mm2) voor paraformaldehyde (PFA) fixatie (zie rubriek 7) en bewaar het op ijs (maximaal 6 uur) in een microcentrifugebuis met 500 μL DF-opvangmedium tot PFA-fixatie.
- Gehakt de rest van de DFs in kleine stukjes (~1 mm2).
OPMERKING: Het wordt geadviseerd om de vers geïsoleerde DF-weefsels onmiddellijk te verwerken voor de optimale organoïde vorming en groei-efficiëntie, in plaats van te beginnen met gecryopreserveerd weefsel, wat resulteert in een lagere efficiëntie. Niettemin is het mogelijk om primair DF-weefsel in deze stap te cryopreserveren (zie cryopreservatiemedium en protocol in rubriek 5). - Breng de gehakte DFs over in een buis van 15 ml met 4 ml voorgewarmd dissociatiemedium en incubeer gedurende 2 uur in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Voeg twee DFs toe per 4 ml voorgewarmd dissociatiemedium (één buis) om optimale dissociatie te garanderen. - Pipetteer elke 15 minuten het DF-dissociatiemediummengsel op en neer met behulp van een glazen Pasteur-pipet om de weefseldesintegratie te versnellen. Wanneer DF-stukken niet langer worden waargenomen (meestal na 1 uur), ga dan verder met DF-dissociatie met behulp van een vernauwde vuurgepolijste Pasteur-pipet.
OPMERKING: Voor optimale DF-dissociatie schakelt u over op een Pasteur-pipet die is versmald door vuurpolijsten uiterlijk 1 uur DF-isolatie.- Bereid in de tussentijd 10 ml medium A met 50 μL DNase (0,2 mg/ml; Tabel 5).
- Voeg 5 ml medium A (met de DNase) toe aan elke buis met gedissocieerd DF en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
- Filter de celsuspensie (met enkele cellen en kleine celklonten) door een celzeef van 40 μm om de resterende grote fragmenten en (het grootste deel van) het vezelige weefsel te verwijderen.
- Combineer de verschillende buizen met gedissocieerde DF van één patiënt in deze stap.
- Spoel het filter af met 1 ml medium A. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml SFDM (tabel 3) en breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Bereken de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verwaarloos de celklonten die overblijven.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
3. Vaststelling van tandorganoïde cultuur (figuur 1A en figuur 2A)
- Bereken op basis van het verkregen celnummer het aantal putten dat kan worden gezaaid. Eén druppeltje van 20 μL moet 20.000 cellen bevatten. De uiteindelijke mix bestaat uit celsuspensie en BMM in een verhouding van 30:70.
- Verwijder de juiste hoeveelheid supernatant en resuspendeer in ijskoude BMM om een 70:30-verhouding van BMM te verkrijgen: celsuspensie voor plating. Wanneer bijvoorbeeld 200.000 cellen worden verkregen, plaat 10 druppels van 20 μL. Verwijder dus het supernatant totdat 60 μL van de celsuspensie overblijft, voeg 140 μL ijskoude BMM toe en resuspensie.
- Resuspendeer langzaam om luchtbelvorming te voorkomen. Eenmaal geresuspendeerd in BMM, houdt u de microcentrifugebuis op ijs.
OPMERKING: Het is cruciaal om de microcentrifugebuis op ijs te houden om BMM-stolling te voorkomen.
- Resuspendeer langzaam om luchtbelvorming te voorkomen. Eenmaal geresuspendeerd in BMM, houdt u de microcentrifugebuis op ijs.
- Pipetteer de 20 μL BMM druppels in het midden van de putten van de voorverwarmde 48-well kweekplaat.
- Draai de plaat ondersteboven, doe hem in een 1,9% CO2-incubator (% CO2 volgens SFDM-buffer) en laat hem minstens 20 minuten stollen bij 37 °C.
- Voeg ROCK-remmer (RI; 10 μM) en amfotericine B (0,1%) toe aan TOM en laat het medium voorwarmen in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Amfotericine B is lichtgevoelig. - Neem de 48-well plaat uit de incubator, plaats rechtop en voeg 250 μL van het voorbereide voorgewarmde medium toe aan elke put met BMM-druppel / cellen en breng de plaat terug naar de 1,9% CO2-incubator .
- Om het medium te verversen (bij voorkeur om de 2-3 dagen), kantelt u de 48-well plaat in een hoek van 45°, verwijdert u voorzichtig het vorige medium terwijl u de BMM-druppel niet aanraakt en voegt u 250 μL nieuw voorgewarmd TOM-medium toe.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om minstens drie keer per week te verversen om uitputting van belangrijke voedingsstoffen en groeifactoren te voorkomen. RI hoeft alleen aan TOM te worden toegevoegd bij de eerste zaaiing en de eerste dagen van elke passaging (zie rubriek 4) om celdood door anoikis te voorkomen en de uitgroei van organoïden te verbeteren. Amfotericine B wordt alleen tijdens passage 0 (P0) aan het medium toegevoegd om mogelijke schimmelbesmetting te blokkeren.
4. Amplificatie en passaging van tandorganoïde cultuur (figuur 1B en figuur 2B)
- Passeer de organoïden tussen 10 en 14 dagen cultuur.
OPMERKING: Vermijd kweken voor een langere periode, omdat langdurige kweek de hergroei en doorgang van organoïden kan beperken. Alleen bij de initiële ontwikkeling (P0) kunnen organoïden gedurende maximaal 20 dagen worden gekweekt, afhankelijk van hun groeisnelheid (totdat een maximale diameter van ± 200 μm is bereikt). - Verwijder het medium uit de putten met organoïden die moeten worden doorgelaten. Binnen één kweekconditie kunt u maximaal vier samenvloeiputten verzamelen (zie figuur 2C).
- Om de organoïden te verzamelen, voegt u 400 μL ijskoude SFDM per put rechtstreeks toe aan de BMM-druppel en pipetteert u het medium herhaaldelijk op en neer totdat de hele BMM-druppel is losgemaakt.
- In het geval dat putten worden gepoold, breng dan de 400 μL over van de eerste put naar de volgende (enzovoort) om de organoïde-bevattende BMM-druppels van alle putten die moeten worden gepoold los te maken.
- Breng het losgeraakte BMM-organoïde samenstel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en herhaal stap 4.3 opnieuw totdat alle organoïde structuren uit de putten zijn verzameld.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Prewarm een aliquot tryple express (aangevuld met RI bij 5 μM) in een waterbad van 37 °C. Per microcentrifugebuis organoïden is een volume van 400 μL TrypLE Express nodig.
- Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspenseer de pellet in 400 μL TrypLE. Incubeer de suspensie in een waterbad van 37 °C gedurende 12 minuten.
- Voeg 400 μL ijskoude SFDM toe om het enzym te inactiveren en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
- Bedek een punt (voor volume zie hieronder) met ijskoude SFDM en resuspendeer de organoïde pellet.
- Om organoïdverlies te voorkomen, hergebruikt u dezelfde (voorgecoate) tip zoveel mogelijk zonder de steriliteit in gevaar te brengen.
OPMERKING: Het volume SFDM dat nodig is voor het resuspenderen van de pellet is afhankelijk van het aantal organoïde structuren dat wordt verkregen en het huidige passagenummer. - Als vuistregel geldt dat voor passages P0 tot P2-3 (over het algemeen nog steeds een laag aantal organoïden groeien) een volume van 200 μL SFDM gebruiken. Uit passages gebruikt P3-4 of hoger (die over het algemeen een groter aantal organoïden opleveren) een volume van 700 μL SFDM.
OPMERKING: Beide procedures worden respectievelijk 'lage doorgang' als 'hogere passage'-methoden genoemd (zie stappen 4.10 en 4.11). Het correct toepassen van de verschillende methoden is cruciaal voor een efficiënte passaging van de organoïden. Met de hogere passagemethode gaan organoïden gemakkelijker verloren en mogen ze niet worden toegepast op lage aantallen organoïden (d.w.z. bij P0 tot P2-3). De hogere passagemethode is echter nodig om grotere hoeveelheden organoïden efficiënt te dissociëren.
- Om organoïdverlies te voorkomen, hergebruikt u dezelfde (voorgecoate) tip zoveel mogelijk zonder de steriliteit in gevaar te brengen.
- Lage doorgangsmethode: Resuspendeer de pellet in 200 μL ijskoude SFDM. Duw de volledig geleegde pipetpunt tegen de onderkant van de microcentrifugebuis om de diameter te verkleinen. Controleer of de diameter klein genoeg is (langzamere aspiratie, de stroming is scheef maar niet geblokkeerd). Pipetteer op en neer gedurende 5 minuten om de organoïden mechanisch te verstoren.
- Hogere doorgangsmethode: Resuspendeer de pellet in 700 μL ijskoude SFDM met een P1000-tip. Voeg een P200-tip (geen filter) toe aan deze P1000-tip en pre-coat met ijskoude SFDM. Voorkom luchtbelvorming door de volume-instelling van de pipet aan te passen om ten minste 90% van het gemiddelde volume (met organoïden) te bereiken. Pipetteer op en neer gedurende 5 minuten om de organoïden mechanisch te verstoren.
- Controleer onder de lichtmicroscoop (bij 4x vergroting) of er voornamelijk losse cellen met (slechts) enkele ongedisperseerde structuren worden verkregen.
- Voeg 500 μL ijskoude SFDM toe aan de microcentrifugebuis en meng voorzichtig het gedissocieerde celmengsel met het verse SFDM door te pipetteren.
- Laat grote ongedisperseerde structuren gedurende 10 minuten bezinken door de microcentrifugebuis verticaal op ijs te plaatsen.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om de niet-verstoorde structuren te verwijderen omdat ze de organoïde doorgang negatief beïnvloeden. Voor organoïde initiatie (P0) is deze sedimentatiestap niet nodig. - Verzamel het supernatant (~ 500-1.000 μL afhankelijk van de passagingmethode) met enkele cellen en kleine celclusters; overbrengen in een nieuwe microcentrifugebuis en centrifugeren bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Bereken de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verwaarloos de celklonten die overblijven.
- Tel hoeveel putten kunnen worden gezaaid en bereken de juiste celsuspensie/BMM-verhouding zoals hierboven beschreven (rubriek 3).
- Voeg 70% BMM toe aan de celpellet en houd de microcentrifugebuis op ijs.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de microcentrifugebuis op ijs te houden om BMM-stolling te voorkomen. - Ga verder met stap 3.3 tot 3.7 en ga opnieuw door tussen dag 10 en dag 14 van cultuur.
5. Cryopreservatie van tandorganoïden
- Verzamel en dissociëer de organoïden zoals hierboven vermeld voor passaging (stap 4). Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml cryopreservatiemedium dat SFDM (70%), FBS (20%) en DMSO (10%) bevat.
- Breng de suspensie over in een cryoviaal en zet het in de ijskast. Plaats de cryovialen in een cryobox en breng over op -80 °C (gedurende ten minste 4 uur).
- Breng binnen 1 maand de bevroren monsters over naar vloeibare stikstof voor langdurige (>12 maanden) opslag.
6. Ontdooien van gecryopreserveerde tandorganoïden
- Voordat u met de ontdooiprocedure begint, plaatst u één buis van 15 ml per cryoviaal op ijs met 10 ml SFDM met 20% FBS.
- Haal het cryoviaal uit de vloeibare stikstof en zet het in de ijskast.
OPMERKING: Voer de volgende stappen zo snel mogelijk uit en vermijd een te lange dooitijd (>5 min) en te lange intervallen tussen de stappen (>5 min), omdat een dergelijke verlenging de celoverleving zal verminderen. - Plaats het cryoviaal in een warmwaterbad (37 °C) tot het ontdooid is (~1-2 min).
- Breng de inhoud van het cryoviaal onmiddellijk over in de ijskoude buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder 9 ml van het supernatant en centrifugeer de resterende 1 ml bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml ijskoude SFDM.
- Breng celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.
- Tel hoeveel putten kunnen worden gezaaid en bereken de juiste celsuspensie/BMM-verhouding zoals hierboven beschreven (rubriek 3).
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in een 70:30 verhouding van BMM:TOM en houd op ijs.
- Ga verder met stap 3.3 tot 3.7 en passage tussen dag 10 en dag 14 van cultuur.
7. Fixatie en paraffine-inbedding van tandorganoïden
OPMERKING: Deze procedure (inclusief secties 8 en 9) kan ook worden toegepast op het primaire DF-weefsel.
- Fixatie van tandorganoïden in PFA
- Verwijder het medium uit elke put en in stap 4.2.
- Verzamel de organoïden door de BMM-druppel te ontwrichten (stap 4.3). Breng het BMM-organoïde mengsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en voeg 500 μL 4% PFA toe en incubeer gedurende minimaal 30 minuten (maximaal 1 uur) op RT met voorzichtig mengen op een orbitale shaker.
LET OP: Gebruik de chemische kap bij het werken met PFA. - Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en spoel de organoïde pellet met PBS gedurende 10 minuten op RT met zacht schudden.
- Was de organoïde pellet (stap 7.1.5) nog eens twee keer. Draai de vaste organoïden bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Resuspendeer de pellet in 500 μL van 70% EtOH (in gedeïoniseerd water). Bewaar de organoïden tot 1 maand in 70% EtOH bij 4 °C.
- Agarose- en paraffine-inbedding van tandorganoïden
OPMERKING: Om organoïden efficiënt in paraffine in te bedden, is een extra stap van inbedding in agarose nodig.- Centrifugeer de PFA-vaste organoïden in 70% EtOH bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
- Bereid een 2% agarose-oplossing in 30 ml PBS in een glazen fles. Warm het agarose-PBS-mengsel op in een magnetron totdat een gelachtige structuur wordt waargenomen (ongeveer 2,5 min bij 600 W).
- Voeg tegelijkertijd 30 ml PBS toe aan een andere glazen fles en warm op in de magnetron (ongeveer 2,5 min bij 600 W). Laat de agarose oplossing 1 min afkoelen.
- Snijd het uiteinde van een P200-tip om precies met de agarose-oplossing te kunnen werken en luchtbellen te voorkomen.
- Prewarm de P200 tip in de warme PBS door een paar keer op en neer te pipetteren.
- Voeg 150 μL voorgewarmde agarose-oplossing toe aan de organoïde pellet en pipetteer voorzichtig het organoïde-agarosemengsel (met minimale resuspensie) terwijl luchtbellen worden vermeden.
OPMERKING: De minimale resuspensie zal het mogelijk maken om de organoïden in de agarose-gel beter te lokaliseren bij microtome-sectie, omdat de organoïden dan dichter bij elkaar liggen. - Breng het organoïde-agarosemengsel onmiddellijk over naar dezelfde microcentrifugebuisdop, plaats de buis horizontaal en laat de agarose stollen (~ 20 min bij RT). Label in de tussentijd de cassettes.
- Eenmaal gestold, verwijdert u de agarose-gel uit de microcentrifugedop met behulp van een pincet en brengt u deze over op een gelabelde cassette.
- Breng de agarose-bevattende cassette over op een bekerglas met 50% EtOH in gedeïoniseerd water. Bedek het bekerglas met parafilm om verdamping van de EtOH te voorkomen.
OPMERKING: Het volume van het bekerglas is afhankelijk van het aantal cassettes. - Verwerk de monsters 's nachts in een weefselverwerker.
OPMERKING: Aangezien paraffine stolt bij RT, moeten de volgende stappen snel worden uitgevoerd. - Prewarm een verwarmingsblok gedurende 15 minuten in de inbouwwerkplek.
- Verwijder de organoïde-bevattende agarosegel in de cassette en plaats deze in het voorbewarmde verwarmingsblok. Verwijder de dop van de cassette en leg deze opzij voor later gebruik.
- Vul het resterende verwarmingsblok met paraffine.
OPMERKING: Controleer met een pincet of de organoïde-bevattende agarosegel zich nog steeds aan de onderkant van het verwarmingsblok bevindt. Vanwege het lichte gewicht kan het gaan drijven, wat resulteert in monsterverlies. - Plaats de cassettedop bovenop het verwarmingsblok. Laat het 30 min stollen op een koude plaat. Verwijder het verwarmingsblok en bewaar de paraffineblokken bij 4 °C.
8. Microtoomsectie en kleuring van tandorganoïden (figuur 2B en figuur 3A-C)
- Microtoomsectie van organoïde-bevattende paraffineblokken
- Snijd 5 μm secties van de tandorganoïden in de paraffineblokken met behulp van een microtoom.
- Leg de plakjes paraffine op een microscoopglasglaasje. Plaats de microscoopglasglaas op een warme plaat bij 37 °C en bedek deze met gedeïoniseerd water met een Pasteur-pipet.
- Laat het microscoopglas een nacht drogen.
- Kleuring van tand organoïde secties
- Deparaffiniseer de organoïde secties (op de microscoopglasglaasje) in een oven gedurende 1 uur bij 58 °C.
- Hydrateer de organoïde secties (op de microscoopglasglaas) in afnemende EtOH-serie in de chemische kap in de volgende volgorde:
Xyleen 2x gedurende 3 min elk
100% EtOH 2x voor 3 min elk
95% EtOH 2x voor 3 min elk
90% EtOH 2x voor 3 min elk
70% EtOH 3x voor 3 min elk
LET OP: Gebruik de chemische kap bij het werken met Xyleen. - Spoel de microscoopglasglaas in kraanwater gedurende 5 minuten af bij RT. Spoel het vervolgens in PBS gedurende 5 minuten op RT.
- Voer het ophalen van antigeen uit door de organoïde secties (op de microscoopglasglaas) in voorbewarmde citraatbuffer (10 mM citroenzuur in gedeïoniseerd water met pH 6; in een plastic container; voorbewarmd gedurende 10 minuten in een waterbad van 95 °C) gedurende 30 minuten in een waterbad van 95 °C.
- Laat het microscoopglas 20 minuten afkoelen bij RT. Spoel de microscoopglasglaasjes 5 minuten in PBS bij RT en vervolgens in PBS met 0,1% Triton-X (PBT) gedurende 5 minuten bij RT.
- Gebruik een markeerpen om een hydrofobe barrière te maken aan de randen van elke dia.
- Blok gedurende minimaal 1 uur bij RT in blokkerende buffer (met 1,5 mg/ml glycine, 2 mg/ml albumine runderserum (BSA) opgelost in PBT) plus 10% ezelserum.
OPMERKING: Normaal gesproken is 300 μL blokkerende buffer plus 10% ezelserum nodig per microscoopglasglaasje. - Plaats de microscoopglasglaas in een vochtige kamer. Gebruik een luchtdichte doos waar alle dia's in passen en maak een paar papieren zakdoekjes nat met water om op de bodem van de doos te plaatsen. Dit voorkomt dat de dia's uitdrogen tijdens de volgende kleuringsstappen.
- Verwijder de blokkerende buffer, voeg het primaire antilichaam (tabel 6) toe, bereid in blokkerende buffer plus 1% ezelserum en incubeer de dia bedekt met antilichaamoplossing een nacht in de vochtige kamer bij 4 °C. Voer indien nodig de rand van de markeringspen opnieuw uit.
- Was de microscoopglasglaas drie keer in PBT op RT gedurende 10 minuten met voorzichtig mengen op een orbitale shaker (75-150 rpm).
- Voeg het secundaire antilichaam (tabel 6), bereid in blokkerende buffer plus 1% ezelserum, toe en incubeer gedurende 1 uur in de vochtige kamer bij RT.
- Verwijder de blokkerende buffer en was de microscoopglasglaas drie keer in PBT op RT gedurende 10 minuten met voorzichtig mengen op een orbitale shaker.
- Voeg antifade montagemedium met DAPI (1 tot 3 druppels) toe op een glazen afdekplaat en monteer dit bovenop de organoïde secties (op de microscoopglasglaasje). Ga verder met beeldvorming; bewaar dia's maximaal 1 week bij 4 °C.
9. RNA-extractie en RT-qPCR van tandorganoïden (figuur 2B en figuur 3D)
- RNA-extractie van tandorganoïden
- Verwijder het medium uit elk putje (stap 4.2).
- Verzamel de organoïden door de BMM-druppel te ontwrichten (stap 4.3), breng het BMM-organoïdemengsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant, resuspenseer krachtig in 350 μL van 1% β-mercaptoethanol opgelost in lysisbuffer (Tabel van Materialen) en zet op ijs.
LET OP: Voer alle stappen uit met β-mercaptoethanol in een chemische kap.
OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap maximaal 1 maand bij -80 °C worden bewaard. Ontdooi de monsters op ijs voordat u verdergaat met stap 9.1.4. - Vortex de monsters totdat er geen organoïde structuren meer worden waargenomen.
- Ga verder met RNA-extractie met behulp van de RNA-extractiekit (Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
- RT-qPCR van tandorganoïden (tabel 7)
- Reverse-transcribe (RT) het RNA19 met behulp van de reverse transcriptie kit (Table of Materials) volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseer de resulterende cDNA-monsters met SYBR Green-gebaseerde kwantitatieve PCR (qPCR)19 met behulp van een Real-Time PCR-systeem (Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ontwikkeling van tandorganoïden
We bieden een gedetailleerd protocol om organoïde culturen vast te stellen uit menselijk DF-weefsel dat is verkregen na extractie van verstandskiezen (figuur 1A). Geïsoleerde DF wordt enzymatisch en mechanisch gedissocieerd. De verkregen cellen worden gekweekt binnen BMM in media die empirisch zijn gedefinieerd voor optimale organoïde ontwikkeling en groei (tandorganoïde medium; TOM)19.
De organoïden ontwikkelen zich meestal binnen 2 weken na het zaaien van DF-cellen (P0; Figuur 2A). De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar (tot 11 passages tot nu toe) (figuur 2B, weergegeven op P4). Het zaaien van ongeveer 20.000 cellen per BMM-druppel (bij zowel P0 als verdere passages) levert een optimale dichtheid van organoïden op (figuur 2C), terwijl het zaaien van hogere celaantallen leidt tot suboptimale organoïde-uitgroei (d.w.z. kleinere organoïden met een te hoge dichtheid) omdat er onvoldoende ruimte is om te groeien (figuur 2D). De uiteindelijk geoptimaliseerde kweekomstandigheden maken de ontwikkeling van organoïden uit DF-monsters met 100% efficiëntiemogelijk 19.
Tand organoïde karakterisering en validatie
De ontwikkelde organoïden vertonen een dicht uiterlijk en bevatten cellen met een hoge nucleo-cytoplasmatische verhouding, zoals ook waargenomen in ERM-cellen7 (figuur 3A). Bovendien, en in verdere analogie, drukken de organoïden de ERM-marker cytokeratine 14 (CK14)22 uit, waardoor hun epitheliale oorsprong wordt bevestigd (figuur 3B), evenals andere voorgestelde ERM-markers (zoals P63, CD44 en ITGα6 12,22,23 (figuur 3B). Bovendien drukken organoïden SOX2 uit, een bekende DESC-marker bij muizen en ook aanwezig in het epitheel van zich ontwikkelende menselijke tanden (figuur 3B)1. Interessant is dat amelogenine (AMELX), het hoofdbestanddeel van de glazuurmatrix, ook tot expressie gebracht in de organoïden, ook wordt gedetecteerd in het ERM24 (figuur 3C). Expressie van nog andere ERM/stamheidsmarkers wordt beschreven in onze recente studie19 en kan worden gebruikt om de verkregen organoïden verder te certificeren. Bovendien behouden de organoïden hun ERM/stamheid fenotype tijdens het passeren, onder andere door stabiele expressie van ERM/stamcelmarkers (figuur 3D). Ten slotte vertonen de van tand afgeleide organoïden differentiatiecapaciteit voor ameloblast(-achtige) cellen, die ook kunnen worden toegepast om de verkregen organoïde culturen te valideren, met expressie van volwassen ameloblastmarkers zoals odontogeen-ameloblast geassocieerd eiwit (ODAM) en amelotine (AMTN) na overdracht naar differentiatiemedium (zie19).
Figuur 1: Schematische workflow van de ontwikkeling, karakterisering en toepassingen van tandorganoïden. (A) Tandorganoïde ontwikkeling van tandheelkundig follikelweefsel (DF) geïsoleerd uit niet-gescheurde derde kiezen. (B) Versterking, karakterisering en toepassingspotentieel van tandorganoïden. d, dag; P, passage. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Ontwikkeling van tandorganoïden. (A) Organoïde ontwikkeling uit DF-weefsel. Representatieve brightfield-beelden getoond op verschillende dagen (d) na het zaaien (P0; P, passage; 2,5x). (B) Brightfield-beelden met robuuste doorgang van een tandorganoïde lijn (2,5x). (C) Brightfield-afbeeldingen die een tandorganoïde lijn onmiddellijk bij passaging laten zien (d0; links; 2,5x) gezaaid met een dichtheid van 20.000 cellen per put, en de resulterende confluente organoïde cultuur klaar om te worden gepasseerd (d14; rechts; 2,5x). (D) Brightfield-afbeeldingen met een tandorganoïde lijn, die was gezaaid met een dichtheid van > 20.000 cellen, wat leidde tot kleinere organoïden met een te hoge dichtheid bij d14 (2,5x). Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Tandorganoïde karakterisering. (A) Brightfield-afbeeldingen van DF-afgeleide organoïde culturen bij verschillende vergrotingen met dichte structuren ontwikkeld na 14 dagen in TOM (P4; 5-20x)). Hematoxyline en eosinekleuring van een organoïde (P1, dag 11). Doos is vergroot. Pijlen geven cellen aan met een hoge nucleo-cytoplasmatische verhouding. (B) Immunofluorescente kleuring voor epitheliale/ERM/stengelheidsmarkers in TOM-gekweekte organoïden (20x). (C) Immunofluorescente kleuring voor amelogenine (AMELX) in TOM-gekweekt organoïde (20x). DAPI (blauw) werd gebruikt om kernen te labelen. (D) Genexpressieniveaus (ten opzichte van GAPDH) van ERM/stamheidsmarkers in P1- en P5 TOM-gekweekte organoïden op dag 14 van de kweek (gemiddelde ± SEM; n = 3 biologische replicaties). Schaalbalken: 50 μm, tenzij anders aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dental follicle (DF) verzamelmedium | |
| Naam | Concentratie |
| Minimaal essentieel medium adelaar (αMEM) | |
| Foetaal runderserum (FBS) | 10% |
| Amfotericine B | 0.5% |
| Penicilline-streptomycine (Pen / Strep) | 1% |
Tabel 1: Verzamelmedium voor tandheelkundige follikels (DF). De tabel bevat de bestanddelen van het DF-verzamelmedium.
| Tand organoïde medium (TOM) | |
| Naam | Concentratie |
| Serumvrij gedefinieerd medium (SFDM) | Zie tabel 3 voor de samenstelling |
| A83-01 | 0,5 μM |
| B27 (zonder vitamine A) | 2% |
| Cholera Toxine | 100 ng/ml |
| FGF2 (= basis FGF) | 20 ng/ml |
| FGF8 | 200 ng/ml |
| FGF10 | 100 ng/ml |
| L-Glutamine | 2mM |
| IGF-1 | 100 ng/ml |
| N2 | 1% |
| N-acetyl L-cysteïne | 1,25 mM |
| Nicotinamide | 10m |
| Noggin | 100 ng/ml |
| Rspo1 | 200 ng/ml |
| SB202190 (p38i) | 10 μM |
| Shh | 100 ng/ml |
| WNT3a | 200 ng/ml |
Tabel 2: Tandorganoïde medium (TOM). De tabel geeft een overzicht van de bestanddelen en hun respectieve concentraties die nodig zijn om het tandorganoïde medium te bereiden.
| Serumvrij gedefinieerd medium (SFDM) (pH 7,3) | |
| Naam | Concentratie |
| Steriel H2O | |
| DMEM 1:1 F12 zonder Fe | 16,8 g/l |
| Transferrine | 5mg/l |
| Insuline uit de alvleesklier van runderen | 5mg/l |
| Penicilline G natriumzout | 35mg/l |
| Streptomycinesulfaatzout | 50mg/l |
| Ethanol absoluut, ≥99,8% (EtOH) | 600 μL/L |
| Catalase van runderlever | 50 μL/L |
| Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumine Bovine (celkweekkwaliteit) | 5 g/l |
Tabel 3: Serumvrij gedefinieerd medium (SFDM) (pH 7,3). De tabel geeft een overzicht van de samenstelling van het serumvrije gedefinieerde medium.
| Dissociatiemedium | |
| Naam | Concentratie |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | |
| Collagenase IV | 3 mg/ml |
| Onpase II | 4 mg/ml |
Tabel 4: Dissociatiemedium. Lijst van bestanddelen en de vereiste concentraties voor de bereiding van het dissociatiemedium.
| Gemiddeld A (pH 7,3) | |
| Naam | Concentratie |
| Steriel H2O | |
| DMEM poeder hoge glucose | 13,38 g/l |
| Hepes | 5.958 g/l |
| Natriumpyruvaat (C3H3NaO3) | 110mg/l |
| Penicilline G natriumzout | 35mg/l |
| Streptomycinesulfaatzout | 50mg/l |
| Natriumchloride (NaCl) | 0,5 g/l |
| Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) | 1 g/l |
| Albumine Bovine (celkweekkwaliteit) | 3 g/l |
| Dnase* | 0,2 mg/ml |
| *toevoegen wanneer vermeld |
Tabel 5: Gemiddeld A (pH 7,3). De tabel geeft een overzicht van de concentratie van de bestanddelen die worden gebruikt voor de bereiding van medium A.
| Primaire antilichamen | ||
| Naam | Gastheer | Concentratie |
| AMELX | muis | 1:100 |
| cd44 | muis | 1:200 |
| CK14 | muis | 1:200 |
| Itga6 | konijn | 1:200 |
| P63 | konijn | 1:1000 |
| Sox2 | konijn | 1:2000 |
| Secundaire antilichamen | ||
| Naam | Gastheer | Concentratie |
| muis IgG (Alexa 555) | ezel | 1:1000 |
| konijn IgG (Alexa 488) | ezel | 1:1000 |
Tabel 6: Lijst van antilichamen en hun verdunningen. De tabel geeft een overzicht van de antilichamen en hun respectieve verdunningen die in deze studie zijn gebruikt.
| Inleidingen | ||
| Gen | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| Gapdh | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
| P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
| Itga6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
| Sox2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
| Pitx2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabel 7: Lijst van primers. De tabel bevat de primers van GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 en PITX2 die in deze studie worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de efficiënte en reproduceerbare generatie van organoïden vanaf de menselijke tand. Voor zover wij weten, is dit de eerste methodologie voor het vaststellen van de huidige (epitheliale) organoïden, uitgaande van menselijk tandweefsel. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar en vertonen een tandepitheelstamfenotype, waarbij DESC's worden gedupliceerd die eerder in het ERM-compartiment van de DF7 zijn gemeld. Bovendien repliceren de organoïden functionele DESC/ERM-kenmerken, waaronder het ontvouwen van een ameloblastdifferentiatieproces 7,25,26. De bevindingen zijn robuust, aangezien vergelijkbare resultaten werden gevonden met onafhankelijke organoïde lijnen19 van de patiënt.
Bij het uitvoeren van dit tandorganoïde protocol moet rekening worden gehouden met verschillende kritieke punten. Ten eerste is de toevoeging van Rho-associated kinase (ROCK) -remmer Y-27632 bij de eerste zaaiing en onmiddellijk na elke passaging essentieel om te voorkomen dat de afzonderlijke cellen anoikis27 ondergaan. Daarnaast is Amfotericine B nodig in alle media-versnaperingen tijdens P0 om (orale) schimmeluitgroei te voorkomen. Ten tweede wordt geadviseerd om de vers geïsoleerde DF-weefsels onmiddellijk te verwerken voor de optimale organoïde vorming en groei-efficiëntie, in plaats van te beginnen met gecryopreserveerd weefsel, wat resulteert in een lagere efficiëntie. Ten derde, bij het ontdooien van een gecryopreserveerde organoïde lijn voor het kweken, voer stappen zo snel mogelijk uit en vermijd te lange dooitijd en te lange intervallen tussen de stappen, omdat tijdsverlenging de celoverleving vermindert. Ten vierde moet worden opgemerkt dat het aantal organoïden bij vroege passage (P0-P3) beperkt kan blijven, ook omdat slechts een beperkt aantal ERM (stamcellen) aanwezig kan zijn in de specifieke geïsoleerde DF-weefselmonsters. Daarom moeten de organoïde culturen bij vroege passage met zorg en aandacht worden behandeld. Daarom wordt aanbevolen om (i) snelle uitbreiding van de organoïde cultuur te voorkomen (d.w.z. pas beginnen te splitsen bij 1: 3 of meer vanaf P3-4 en eerder bij 1: 0,5 of 1: 1); ii) gebruik de juiste splitsingsmethode (lage doorgang - hogere doorgang) zoals beschreven. In deze context wordt geadviseerd om ongestoorde verstandskiezen van jonge adolescente patiënten (15 tot 19 jaar oud) te verzamelen, aangezien ERM-cellen in aantal afnemen met de ontwikkeling van tanden ende leeftijd van 28 jaar. Ten vijfde zorgen resterende niet-gedisperseerde harde weefselfragmenten van het DF-weefsel in de celsuspensie (zelfs na filtering) ervoor dat de BMM-druppel minder stabiel is en meer kans heeft om los te komen tijdens de kweek. Een hoger percentage BMM (zoals 80%) wordt aanbevolen als meerdere niet-gedisperseerde harde weefselfragmenten worden waargenomen in de gedissocieerde DF-celsuspensie. Ten zesde wordt sterk aangeraden om de organoïden tussen dag 10 en dag 14 van de cultuur door te laten gaan, omdat langere kweek de uitbreidbaarheid van organoïden negatief zal beïnvloeden vanwege minder optimale dissociatie. Als organoïden om de een of andere reden langer dan 14 dagen worden gekweekt, kunnen de hoeveelheid TryplE Express en incubatietijd voor organoïde dissociatie worden verlengd voor efficiënte dissociatie, hoewel 15 minuten enzymatische blootstelling niet mag worden overschreden. Binnen dezelfde context moet het kweekmedium elke 2-3 dagen worden ververst om uitputting van voedingsstoffen en groeifactoren te voorkomen. In het geval dat organoïden niet goed uitzetten, ongeacht de hierboven genoemde kritieke punten, moet men zich concentreren op het behouden van alle gereedschappen (BMM, ijskoude SFDM voor pre-coating tip, microcentrifugebuizen) gebruikt tijdens het passeren op ijs. Daarnaast is het cruciaal om de verschillende passaging-methoden (lage passage en hogere passagemethode) correct toe te passen voor een efficiënte passaging van de organoïden.
Eerder hebben andere groepen in vitro groei van primair humaan DESC/ERM-weefsel 8,9,10,11,12,21 gemeld. Culturen waren echter voornamelijk 2D (monolagen) en niet 3D, zoals dit organoïde model, en vertoonden bovendien alleen groei op korte termijn en fenotyperetentie. Als alternatief werden vaak (spontaan) vereeuwigde cellen gebruikt, die echter niet fysiologisch zijn en slechts beperkte gelijkenis vertonen met het weefsel of de cellen van herkomst. Bovendien zijn deze cellijnen afgeleid van embryonaal weefsel en/of van dieren. Bovendien wordt ameloblastdifferentiatie niet of slechts beperkt gedocumenteerd. Het hier gepresenteerde organoïde model biedt dus verschillende voordelen, namelijk (i) getrouwe recapitulatie van het weefsel /de cellen van oorsprong, (ii) langdurig uitbreidbaar, (iii) gekweekt in 3D die de in vivo configuratie beter vertegenwoordigt, (iv) van menselijke oorsprong en postnatale leeftijd, en (v) in staat om te differentiëren in volwassen tandheelkundige cellen (ameloblastceltype) (zie19).
Zo genereerden we een waardevolle onderzoekstool, die nog niet eerder was gerapporteerd, met verschillende interessante toepassingen (figuur 1B). De organoïden kunnen worden toegepast om de menselijke DESC / ERM-stamheid en plasticiteit te bestuderen. Het biedt de mogelijkheid om meer inzicht te krijgen in de biologie van de nog raadselachtige ERM-celpopulatie door middel van immunofluorescentie, genexpressie en (eencellige) transcriptomische analyses. Daarnaast zijn organoïden bijzonder geschikt voor humane ziektemodellering om pathogenetische mechanismen te ontcijferen, (nieuwe) therapeutische doelen te identificeren en hulpmiddelen voor het ontdekken en screenen van geneesmiddelen te genereren29. Meer specifiek kan dit model worden toegepast op odontogene cysten (waarvoor geen betrouwbaar onderzoeksmodel beschikbaar is), die kunnen worden vergeleken met gezonde van tanden afgeleide organoïden. Bovendien kan deze tandorganoïde benadering worden gebruikt om tandziekten te modelleren en te bestuderen, variërend van de impact van bacteriën tot genetische mutaties geassocieerd met tandafwijkingen (zoals mutaties in P63, die kunnen worden geïntroduceerd met behulp van geavanceerde genbewerkingsmethoden zoals CRISPR-Cas)30, wat uiteindelijk leidt tot potentiële en nieuwe, therapeutische doelen en behandelingen. Andere toepassingen van het tandorganoïde protocol kunnen biobanking omvatten (momenteel al beschikbaar voor tandpulp, zoals de Future Health Biobank)31 om organoïde lijnen te verzamelen van verschillende personen en ziekten (bijvoorbeeld voor fundamenteel en translationeel onderzoek zoals geneesmiddelenscreening). Bovendien zijn er onlangs verschillende rapporten gepubliceerd over samengestelde organoïde modellen die niet alleen epitheliale maar ook andere celtypen van het weefsel van oorsprong bevatten32,33. Omdat de tandsamenstelling vrij complex is en mesenchymale, immuun- en endotheelcellen accommoderen, is het toepassen van dit epitheliale organoïde model in combinatie met deze celtypen om hun in vivo tegenhanger meer in detail te vertegenwoordigen een aantrekkelijk perspectief. Ook maakt dit systeem het mogelijk om amelogenese in de menselijke tand te onderzoeken, op dit moment alleen slecht begrepen, maar zeker afhankelijk van epitheliaal-mesenchymale interacties. Het ontcijferen van de ontwikkeling van ameloblasten zal naar verwachting een belangrijke sprong voorwaarts betekenen in de tandheelkundige wetenschappelijke en klinische wereld, aangezien de productie van glazuur, de typische component van onze tanden, een zeer nagestreefd doel is bij het herstellen van tandweefsel. Bovendien kan de organoïde modellering die in deze studie wordt beschreven, het begin betekenen voor de vorming van gemineraliseerde weefsels in vitro en de weg vrijmaken voor het ontwikkelen van een bio-technische tand (of op zijn minst delen) voor vervangingstherapie.
Een van de beperkingen van het organoïde model is dat het alleen de epitheliale component van weefsel vertegenwoordigt. Zoals hierboven in detail beschreven, kan deze tekortkoming echter worden opgelost door de toevoeging van andere cel- / weefseltypen, zoals het tandheelkundige mesenchym19. Een ander aspect dat als beperking kan worden erkend, is de oorsprong van de hier gebruikte BMM (Matrigel). Deze BMM is afgeleid van een sarcoom (Engelbrecht-Holm-Swarm) van een muis en moet daarom worden vervangen voordat de organoïde benadering naar de kliniek wordt vertaald. Onlangs zijn er verschillende inspanningen geleverd om Matrigel te vervangen door synthetische hydrogels 34,35. Er is echter meer onderzoek nodig om organoïden met succes in dergelijke niet-natuurlijke gels te laten groeien. Hoewel de organoïde technologie een interessante benadering biedt voor toekomstige tandheelkundige regeneratieve therapie - bijvoorbeeld de ontwikkeling van een bio-technische tand - moeten ethische vragen worden gesteld met betrekking tot de privacy van celdonoren en de commercialisering van menselijke organoïden en weefsels die daarvan zijn afgeleid. Tot nu toe zijn er geen conclusies getrokken met betrekking tot organoïde commercialisering voor regeneratieve doeleinden36. Tandpulpbiobanken zijn in opkomst31, evenals organoïde biobanken uit verschillende, voornamelijk kankerweefsels, voor geneesmiddelenscreeningsdoeleinden. Aangezien organoïden niet kunnen worden gecategoriseerd als cellen, gameten, weefsels of organen (die allemaal wettelijk worden gereguleerd), is er een dringende behoefte aan het weergeven van de juridische status voor het gebruik ervan in klinische, wetenschappelijke of commerciële omgevingen. Hoewel de organoïden hebben aangetoond gemineraliseerd weefsel af te zetten wanneer ze subcutaan in vivo worden getransplanteerd 19, zijn verdere studies nodig om hun potentieel om glazuur af te zetten te analyseren dat vergelijkbaar is met dat van een natuurlijke menselijke tand.
Al met al biedt het nieuwe organoïde model dat is ontwikkeld een veelbelovend, waardevol hulpmiddel om de biologie van menselijke tanden (stamcellen) en amelogenese te bestuderen, beide momenteel slechts slecht onderzocht, met toekomstperspectieven voor tandziektemodellering en regeneratieve therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De corresponderende auteur zorgt ervoor dat alle auteurs alle belangenconflicten openbaar hebben gemaakt.
Acknowledgments
We zijn alle medewerkers van de Orale en Maxillofaciale Chirurgie (MKA) van UZ Leuven, alsook de patiënten, dankbaar voor hun onschatbare hulp bij het verzamelen van vers geëxtraheerde derde kiezen. We willen ook Dr. Reinhilde Jacobs en Dr. Elisabeth Tijskens bedanken voor hun hulp bij de monsterverzameling. Dit werk werd ondersteund door subsidies van KU Leuven (BOF) en FWO-Vlaanderen (G061819N). L.H. is een FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
