Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Organoïden van menselijke tand vestigen als een krachtig hulpmiddel voor mechanistisch onderzoek en regeneratieve therapie
Chapters
Summary April 13th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We presenteren een protocol om epitheliale organoïde culturen te ontwikkelen, uitgaande van menselijke tand. De organoïden zijn robuust uitbreidbaar en recapituleren de epitheelstamcellen van de tand, inclusief hun ameloblastdifferentiatiecapaciteit. Het unieke organoïde model biedt een veelbelovend hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige (stamcel) biologie te bestuderen met perspectieven voor tandregeneratieve benaderingen.
Transcript
Dit nieuwe van menselijke tanden afgeleide organoïde model biedt het eerste krachtige hulpmiddel om de menselijke tandheelkundige stamcelbiologie te ontcijferen met perspectieven op tandregeneratieve toepassingen. Op dit moment is dit tandorganoïde model het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze menselijke tandepitheelstamcellen te laten groeien en uit te breiden. Dit organoïde protocol kan worden toegepast om onderzoeksmodellen vast te stellen, niet alleen van gezonde, maar ook zieke tanden zoals tandheelkundige tumoren en bacteriële impact.
Onderzoek van dergelijke ziektemodellen kan nieuwe therapeutische doelen aan het licht brengen. Dit organoïde model is zeer instrumenteel bij het ontcijferen van het glazuurvormingsproces in de menselijke tand en kan de constructie van tanddelen zoals glazuur voor generatieve doeleinden mogelijk maken. De procedure wordt gedemonstreerd door Lara Hemeryck, promovenda in mijn onderzoeksgroep.
Verzamel om te beginnen de derde kiezen met bijbehorende tandheelkundige follikels in het verzamelmedium dat op ijs is geplaatst en breng de inhoud van de buizen over naar een petrischaal. Houd de tand vast met een pincet en isoleer de tandheelkundige follikels zorgvuldig met behulp van een chirurgisch mes. Was het resterende bloed van de tandfollikels door de tandfollikelweefsels gedurende 20 seconden kort in het eerste putje van 70% ethanol te plaatsen, breng het vervolgens gedurende 20 seconden over naar de volgende doodsethanolplaat en verder naar de derde ethanolput.
Blijf het drie keer spoelen in fosfaat-gebufferde zoutputten, gevolgd door het spoelen van de tandheelkundige follikels in de drie resterende tandheelkundige follikels verzamelen medium putjes gedurende maximaal 20 minuten in totaal. Breng de gespoelde tandheelkundige follikels over in een nieuwe petrischaal. Snijd een klein stukje van een van de tandheelkundige follikels voor een paraformaldehydefixatie en bewaar het in een microcentrifugebuis met 500 microliter verzamelmedium gedurende maximaal zes uur.
Gehakt de rest van de tandheelkundige follikels in kleine stukjes en breng ze over in een buis van 15 milliliter met vier milliliter voorgewarmd dissociatiemedium en incubeer de buis vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende twee uur in het waterbad. Pipetteer elke 15 minuten het dissociatiemedium van de tandfollikels en meng op en neer met een glazen pipet om de weefseldesintegratie te versnellen. Wanneer stukjes tandheelkundige follikels niet langer worden waargenomen, gaat u verder met de dissociatie met behulp van een vernauwde, vuur gepolijste Pasteur-pipet.
Bereid ondertussen 10 milliliter medium A met 100 microliter DNase en voeg vijf milliliter van dit medium toe aan elke buis met gedissocieerde tandheelkundige follikels. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Spoel het filter met één milliliter medium A.Combineer de verschillende buisjes gedissocieerde tandfollikels van één patiënt in deze stap en centrifugeer de gefilterde celsuspensie op 200 maal g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.
Verwijder het supernatant. Resuspenseer de pellet in één milliliter serumvrij gedefinieerd medium en breng de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Bereken de celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller en bereken het aantal putten dat kan worden gezaaid.
De uiteindelijke mix bestaat uit celsuspensie en keldermembraanmatrix in een verhouding van 30 tot 70. Verwijder de juiste hoeveelheid supernatant en resuspendeer het langzaam om een 70-tot-30-verhouding van ijskoude keldermembraanmatrix tot celsuspensie voor beplating te verkrijgen. Eenmaal geresuspendeerd in de keldermembraanmatrix, houdt u de microcentrifugebuis op ijs om keldermembraanmatrixstolling te voorkomen.
Pipetteer de 20 microliter keldermembraanmatrixdruppels in het midden van de voorverwarmde 48-well kweekplaat. Draai de plaat ondersteboven en plaats deze om te stollen in een 1,9% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg rho-geassocieerde kinaseremmer en amfotericine B toe aan tandorganoïde medium en prewarm het medium in een waterbad van 37 graden Celsius.
Neem de 48-well plaat uit de incubator. Plaats het rechtop en voeg 250 microliter van het voorbereide voorgewarmde medium toe aan elke put met een keldermembraanmatrixdruppel met de cellen en breng de plaat terug naar de kooldioxide-incubator. Als u het medium wilt verversen, kantelt u de plaat in een hoek van 45 graden.
Verwijder voorzichtig het vorige medium, terwijl u vermijdt dat u de matrixdruppel van het keldermembraan aanraakt en voeg elke twee tot drie dagen 250 microliter nieuw voorgewarmd tandorganoïde medium toe. Om de passage van de organoïden uit te voeren, verwijdert u het medium uit de putten met organoïden en poolt u maximaal vier confluente putten. Om de organoïden te verzamelen, voegt u 400 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium per put rechtstreeks toe aan de membraanmatrixdruppel en pipetteert u het medium herhaaldelijk op en neer totdat de hele druppel is losgemaakt.
Als putten worden samengevoegd, breng dan de 400 microliter over van de eerste put naar de volgende om de organoïde bevattende druppels los te maken. Breng de losgeraakte organoïde assemblage over in een microcentrifugebuis van 1,5 microliter en herhaal de toevoeging van serumvrij gedefinieerd medium totdat alle organoïde structuren uit de putten zijn verzameld. Centrifugeer het op 200 maal g gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius.
Verwijder het supernatant uit de centrifugebuis en resuspenseer de pellet in een voorgewarmd aliquot trypLE Express. Voeg 400 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium toe om het enzym te inactiveren en centrifugeer het bij 200 keer g gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius. Verwijder het supernatant.
Bedek een punt met een ijskoud serumvrij gedefinieerd medium en suspensie de organoïde pellet opnieuw in steriele toestand. Suspensie de pellet opnieuw in 200 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium voor de lage passagemethode. Duw de volledig geleegde pipetpunt tegen de onderkant van de microcentrifugebuis om de diameter te verkleinen.
Pipetteer vijf minuten op en neer om de organoïden mechanisch te verstoren. Voor de hogere passagemethode resuspenseert u de pellet in 700 microliter ijskoud serumvrij gedefinieerd medium met een P1000-tip. Voeg een P200-tip toe aan deze P1000-tip en bekleed deze voor met ijskoud serumvrij gedefinieerd medium.
Voorkom luchtbelvorming door de volume-instelling van de pipet aan te passen. Streef ernaar om ten minste 90% van het gemiddelde volume met organoïden en pipet gedurende vijf minuten op en neer te zetten om de organoïden mechanisch te verstoren. De organoïden ontwikkelen zich meestal twee weken na het zaaien van tandheelkundige follikelcellen.
De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar tot 11 passages. Het zaaien van ongeveer 20.000 cellen per keldermembraanmatrixdruppel levert een optimale dichtheid van organoïden op, terwijl het zaaien van hogere celaantallen leidt tot suboptimale organoïde-uitgroei met vergelijkbare organoïden met een te hoge dichtheid vanwege onvoldoende ruimte om te groeien. De ontwikkelde organoïden vertonen een dicht uiterlijk en bevatten cellen met een hoge nucleocytoplasmatische verhouding.
Bovendien drukken de organoïden de ERM-marker cytokeratine 14 uit die hun epitheliale oorsprong en andere voorgestelde ERM-markers, zoals P63, CD44 en integrine alfa-6, bevestigen. Organoïden drukken SOX2 uit, een bekende DESC-marker bij muizen. Interessant is dat het hoofdbestanddeel van de glazuurmatrix, amelogenine, ook tot expressie komt in de organoïden.
De organoïden behouden hun ERMM-stengelheidsfenotype tijdens het passeren, zoals blijkt uit de stabiele expressie van markers. Voor een optimale groei van organoïden op lange termijn is het essentieel om de aanbevolen passagemethoden te gebruiken, wat betekent dat de lage passage of de hogere passagemethoden. Eenmaal gevormd, kunnen de organoïden worden gebruikt om het amelogeneseproces verder te onderzoeken en de afzetting van de glazuurmatrix die momenteel niet wordt bereikt in tandheelkundig onderzoek.
Deze techniek maakt de verkenning van tandheelkundige epitheliale stamcelbiologie, het proces van glazuurvorming en de interactie met het tandmenthenchym mogelijk, een samenspel dat essentieel is voor een correcte tandvorming.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
