Summary
O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.
Abstract
A falta de um modelo in vitro robusto do epitélio respiratório humano dificulta a compreensão da biologia e patologia do sistema respiratório. Descrevemos um protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos de células-tronco adultas no tecido pulmonar e induzir diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas. Os organoides pulmonares são então expandidos consecutivamente por mais de 1 ano com alta estabilidade, enquanto os organoides diferenciados das vias aéreas são usados para simular morfológica e funcionalmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Assim, estabelecemos um modelo organoide robusto do epitélio das vias aéreas humanas. A expansão a longo prazo de organoides pulmonares e organoides diferenciados das vias aéreas gera uma fonte estável e renovável, permitindo aos cientistas reconstruir e expandir as células epiteliais das vias aéreas humanas em pratos culturais. O sistema organoide pulmonar humano fornece um modelo in vitro único e fisiologicamente ativo para várias aplicações, incluindo o estudo da interação entre vírus e hospedeiros, testes medicamentosos e modelagem de doenças.
Introduction
Os organoides tornaram-se uma ferramenta robusta e universal para a modelagem in vitro do desenvolvimento de órgãos e estudo da biologia e da doença. Quando cultivadas em um meio de cultura definido por fatores de crescimento, as células-tronco adultas (ASC) de uma variedade de órgãos podem ser expandidas em 3 dimensões (3D) e auto-montadas em aglomerados celulares semelhantes a órgãos compostos por múltiplos tipos de células, denominados organoides. O laboratório de Clevers relatou a derivação do primeiro organoide derivado do ASC, organoide intestinal humano, em 2009 1,2. Posteriormente, organoides derivados do ASC foram estabelecidos para uma variedade de órgãos e tecidos humanos, incluindo próstata 3,4, fígado 5,6, estômago 7,8,9, pâncreas10, glândula mamária11 e pulmão 12,13 . Esses organoides derivados do ASC mantiveram as propriedades críticas celulares, estruturais e funcionais do órgão nativo e mantiveram a estabilidade genética e fenotípica na cultura de expansão de longo prazo14,15.
Organoides também podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), incluindo células de tronco embrionária (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS)16. Enquanto organoides derivados do PSC exploram os mecanismos de desenvolvimento de órgãos para seu estabelecimento, as ASCs podem ser coagidas a formar organoides por meio da reconstrução de condições que imitam o nicho de células-tronco durante a autoconexão do tecido fisiológico ou reparação de tecidos. Os organoides derivados do PSC são modelos favoráveis para explorar o desenvolvimento e a organogênese, embora incapazes de atingir o nível de maturação comparável dos organoides derivados do ASC. O estado de maturação fetal dos organoides derivados do PSC e a complexidade para o estabelecimento desses organoides impedem substancialmente suas amplas aplicações para estudar biologia e patologia em tecidos maduros.
O trato respiratório humano, do nariz ao brônquio terminal, é forrado com o epitélio das vias aéreas, também chamado de epitélio ciliado pseudostratificado, que consiste em quatro tipos principais de células, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula basal e célula do clube. Estabelecemos o organoide pulmonar humano derivado do ASC a partir de tecidos pulmonares humanos em colaboração com o laboratório 12,13 da Clevers. Esses organoides pulmonares são consecutivamente expandidos no meio de expansão por mais de um ano; a duração precisa varia entre diferentes linhas organoides obtidas de diferentes doadores. No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são maduros o suficiente, uma vez que as células ciliadas, a maior população celular nas vias aéreas humanas, são sub-representadas nesses organoides pulmonares. Assim, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal e geramos organoides das vias aéreas 3D e 2D que, morfologicamente e funcionalmente, fenóquico das vias aéreas, a um nível quase fisiológico.
Aqui fornecemos um protocolo de vídeo para derivar organoides pulmonares humanos dos tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides 3D e 2D das vias aéreas.
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Protocol
Toda a experimentação usando tecidos humanos descritos aqui foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). O consentimento informado foi obtido dos pacientes antes da coleta de tecidos.
1. Derivação do organoide pulmonar humano
- Preparação de materiais experimentais
- Prepare o meio basal suplementando médio avançado DMEM/F12 com glutamina de 2 mM, HEPES de 10 mM, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
- Prepare o meio de expansão organoide pulmonar humano suplementando o meio basal com 10% R-spondin 1 meio condicionado, 10% noggin médio condicionado, 1x suplemento B27, 1,25 mM N-acetilcisteína, 10 mM nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de fator de crescimento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 e 100 μg/mL de primocina (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O meio condicionado R-spondin 1 e Noggin pode ser substituído por R-spondin 1 (500 ng/mL) e Noggin (100 ng/mL). - Pré-aquecimento uma placa de cultura de suspensão de 24 poços em uma incubadora de cultura celular. Use uma incubadora de cultura celular padrão com 5% de CO2 e atmosfera umidificada a 37 °C. Descongele a matriz do porão em uma geladeira de 4 °C. Mantenha a matriz do porão e a cultura média no gelo durante a experimentação.
- Isolamento celular dos tecidos pulmonares humanos para a cultura organoide 3D
- Procure tecidos pulmonares humanos recém-ressecados de cerca de 0,5 cm de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica devido a várias doenças. Transporte os tecidos pulmonares em 30 mL de meio basal à temperatura ambiente e processe o mais rápido possível dentro de uma capa de biossegurança.
- Moce tecidos pulmonares em pequenos pedaços (0,5-1 mm) com um bisturi estéril em um prato de cultura celular de 10 cm. Lave peças de tecido com 10 mL de meio basal frio em um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o supernaspetivo e resuspenque a pelota em 8 mL de meio basal suplementado com colagemnase em uma concentração final de 2 mg/mL. Digerir os pedaços de tecido sacudindo o tubo a 120 rpm por 30-40 min a 37 °C.
- Pipeto para cima e para baixo por 20x para tesourar os pedaços de tecido digerido usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Empilhe um coador de 100 μm em um tubo de centrífugas de 50 mL e filtre a suspensão.
- Recupere as peças de tecido no coador com o meio basal e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mL, seguida de uma segunda rodada de tesoura e filtragem. Podem ser realizadas filtragem adicional de tesoura 1x-2x para isolar mais células, especialmente quando um pequeno pedaço de tecido (por exemplo, <0,5 cm) é adquirido.
- Adicione FBS ao fluxo com uma concentração final de 2% para interromper a digestão, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Resuspend a pelota celular em 10 mL de meio basal, seguido de centrifugação a 400 x g para 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- (Opcional) Se muitos eritrócitos forem vistos na pelota (estimado pela cor da pelota), resuspende a pelota de célula em 2 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, adicione 10 mL de meio basal ao tubo, seguido de centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
- Resuspend a pelota em matriz fria do porão e mantenha no gelo. Adicionar 80-160 μL de matriz de porão para células recuperadas de um tecido pulmonar de tamanho em torno de 0,5 cm; a quantidade é suficiente para semear 2-4 gotículas.
- Dispense 40 μL de suspensão a cada poço de uma placa de cultura de suspensão pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar para formar uma gota.
- Adicione 500 μL de organoides pulmonares humanos meio de expansão complementado com 5 nM de Heregulin beta-1 para cada poço e incubar a placa em uma incubadora de cultura celular.
- Refrescar o meio a cada 3 dias. Remova o meio antigo mantendo a gota intacta e adicione o meio fresco com cautela. Passagem dos organoides após incubação por 10-14 dias. Use Heregulin beta-1 apenas na cultura inicial antes da primeira passagem.
- Observe os organoides sob um microscópio para garantir que os organoides não estejam incorporados com uma densidade celular muito alta. Se uma gotícula se desintegrar devido a uma densidade celular excessivamente alta, recupere e reindua os organoides e células com um maior volume de matriz de porão para fazer mais gotículas com uma densidade celular menor e desejável.
2. Expansão de organoides pulmonares humanos
- Prepare uma pipeta Pasteur queimando a ponta de uma pipeta Pasteur em uma chama, como um queimador bunsen, para reduzir a abertura de 1,5 mm para cerca de 1,0 mm de diâmetro. Esfrie as pipetas, seguidas de autoclaving para esterilizar. Molhe as pipetas com o meio basal para evitar a fixação e perda da célula durante a tesoura mecânica.
- Passagem de organoides pulmonares com cisalhamento mecânico
- Use uma ponta de 1 mL e pipeta para cima e para baixo para quebrar as gotículas obtidas acima. Em seguida, transfira os organoides junto com o tubo médio para uma centrífuga de 15 mL e ajuste o volume para 10 mL com meio basal frio. Descarte o supernatante após centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 °C
- Lave os organoides com 10 mL de meio basal frio mais uma vez. Resuspenda os organoides em 2 mL de meio basal frio. Pipeta para cima e para baixo para esmatar os organoides em pequenos pedaços com uma pipeta Pasteur.
- Suplemento com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend os fragmentos organoides com matriz de porão frio suficiente para permitir uma expansão de 1:3 a 1:5. Mantenha-se no gelo.
- Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.
- Adicione 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar a cada poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Refrescar o meio a cada 3 dias. Passagem os organoides a cada 2 semanas com uma razão de 1:3 a 1:5.
- Passagem de organoides pulmonares com trippsinização
NOTA: A trippsinização é preferida quando é difícil cisar o organoide pulmonar em pequenos pedaços usando uma pipeta Pasteur, ou o tamanho dos organoides é altamente variável, ou as experimentações subsequentes requerem organoides de tamanho mais uniforme.- Colher os organoides pulmonares conforme mostrado na etapa 2.2.1. Resuspend o organoide em 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.
- Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Tesourar os organoides mecanicamente, pipetando os organoides para cima e para baixo em pequenos pedaços usando uma tubulação Pasteur. Verifique o tamanho das peças organoides sob um microscópio a 4x de ampliação. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão.
NOTA: Determine o tamanho dos fragmentos organoides sob o microscópio de acordo com o arranjo experimental. Se um experimento precisa de mais organoides ou organoides de tamanho mais uniforme, os organoides de tesoura em pedaços menores ou mesmo células únicas. Então, leva mais tempo, provavelmente 3 semanas, antes que os organoides estejam prontos para experimentação. - Cubra com meio basal a um volume final de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C. Resuspend as peças organoides em matriz de porão frio com um volume suficiente para passagem com uma razão de 1:5-1:10. Mantenha-se no gelo.
- Coloque 40 μL de suspensão organoide em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços. Incubar a placa de cultura a 37 °C por 10-15 min. Deixe a matriz do porão se solidificar.
- Suplementar com 500 μL de meio de expansão organoide pulmonar por poço e incubar em uma incubadora de cultura celular. Atualize o meio de expansão a cada 3 dias. Passagem os organoides após 2-3 semanas.
NOTA: Cerca de 100 organoides são montados dentro de uma gotícula de 40 μL da matriz do porão. Os organoides pulmonares normalmente crescem melhor com uma densidade celular relativamente alta. Reinscreva os organoides com uma densidade celular menor se as gotículas se desintegrarem ou os organoides em crescimento se unirem devido à densidade celular excessivamente alta.
3. Diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas
- Prepare o meio de diferenciação proximal (meio PD) complementando o meio basal da interface líquida ar com suplemento de interface líquida de ar 1x, suplemento de manutenção da interface líquida de ar 1x, 4 μg/mL de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 e 10 μM de DAPT (ver Tabela de Materiais).
- Organoides das vias aéreas 3D
- Incubar organoides pulmonares no meio de expansão por 7-10 dias após a passagem via cisalhamento mecânico. Substitua o meio de expansão pelo meio PD. Incubar os organoides no meio dp por 14 dias em uma incubadora de cultura celular.
- Descarte o meio DP em cada poço. Adicione tampão de lise celular para colher o organoide diferenciado das vias aéreas para extração de RNA e detecção de expressão genética celular pelo ensaio RT-qPCR.
- Alternativamente, incubar os organoides a 37 °C por 60 minutos após a adição de 10 mM EDTA para desassociar os organoides em células únicas, seguido de análise de citometria de fluxo para examinar populações celulares. Os organoides estão prontos para várias manipulações experimentais.
- Organoide das vias aéreas 2D
- Prepare organoides pulmonares 3D suficientes para a cultura de diferenciação 2D. São necessárias 1,3 x 105 e 4,5 x 105 células para uma inserção de suporte permeável de 24 poços e uma inserção de suporte permeável de 12 poços, respectivamente.
- Após os organoides pulmonares 3D crescerem no meio de expansão por 2 semanas, digerir os organoides em células únicas e sementes nas pastilhas de 24 poços e 12 poços para gerar organoides das vias aéreas 2D.
- Pré-incubar as pastilhas com o meio basal durante a noite em uma incubadora de cultura celular. Adicione 250 μL e 500 μL de meio basal na câmara superior e inferior de uma placa de 24 poços, respectivamente. Para uma placa de 12 poços, adicione 500 μL e 1.000 μL de meio basal na câmara superior e inferior, respectivamente.
- Colher organoides pulmonares 3D conforme descrito na etapa 2.2.1. Resuspend os organoides com 1 mL de enzima dissociação e incubar em um banho de água de 37 °C por 3-5 min.
- Adicione 1 mL de meio basal ao tubo. Encarreça para cima e para baixo para transformar os organoides em células únicas com uma tubulação Pasteur e verificar as células sob um microscópio. Em seguida, adicione 40 μL de FBS para interromper a digestão.
- Filtre as células através de um coador de 40 μm em um tubo centrífuga de 50 mL. Transfira a suspensão da célula filtrada para um tubo de 15 mL. Cubra com meio basal a um volume total de 10 mL, seguido de centrifugação a 300 x g para 5 min a 4 °C.
- Resuspende a pelota, coletada de 24 gotículas (40 μL), em 1-2,5 mL de meio de expansão organoide pulmonar, dependendo da densidade celular nas gotículas. Conte o número de células com um contador de células sob um microscópio. Ajuste a concentração celular para 1,3 x 106/mL (para inserções de 24 poços) ou 9 x 105/mL (para inserções de 12 poços).
- Remova o meio basal das câmaras superior e inferior. Adicione 500 μL e 1.000 μL de meio de expansão na câmara inferior da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente. Sementes 100 μL e 500 μL de suspensão celular preparada na etapa 3.3.7 na câmara apical da inserção de 24 poços e inserção de 12 poços, respectivamente.
- Incubar em uma incubadora de cultura celular por 2 dias. Substitua o meio de expansão pelo meio PD tanto na câmara apical quanto na parte inferior das placas. Incubar os organoides na incubadora de cultura celular por 14 dias e atualizar o meio DP a cada 3 dias.
NOTA: Cílios móveis são perceptíveis nos organoides 3D e 2D sob um microscópio a partir do dia 7 após a incubação no meio PD. Após 14 dias de cultura de diferenciação no meio dp, os organoides das vias aéreas são maduros para várias manipulações experimentais. - Meça a resistência elétrica trans-epitelial (TEER) a cada dois dias usando um sistema de medição de resistência elétrica de acordo com um protocolo padrão descrito em17.
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Representative Results
Este protocolo permite a derivação de organoides pulmonares humanos com uma alta taxa de sucesso. Tecido pulmonar humano fresco é picado em pequenos pedaços, e depois decomposto com colagemnase. As células únicas resultantes estão embutidas na matriz do porão e incubadas no meio de expansão organoide pulmonar complementada com um coquetel de fatores de nicho para o crescimento das células-tronco epiteliais (passo 1.1.2). A Figura 1 mostra a microfotografia de células pulmonares recém-isoladas embutidas na matriz de membrana de porão do fator de crescimento reduzido Tipo 2 (BME; Figura 1A, esquerda). Organoides císticos aparecem e aumentam ao longo do tempo (Figura 1A, à direita). Enquanto isso, as células não relacionadas sofrem morte celular gradualmente. Os fibroblastos estão presentes na cultura durante a primeira ou segunda passagens. Posteriormente, a cultura contém organoides epiteliais exclusivamente, que são organoides pulmonares derivados de células-tronco epiteliais presentes nos tecidos pulmonares primários. Estes organoides pulmonares são passagens a cada 2-3 semanas por cisalhamento mecânico em uma razão de 1:3 a 1:5 ou por trippsinização a uma razão de 1:5 a 1:10 (passos 2.2-2.3). As microfotografias representativas dos organoides pulmonares após a quarta passagem são mostradas na Figura 1B. Após a cisalhamento mecânico, os fragmentos organoides incorporados no BME formam domínios císticos dentro de algumas horas (Figura 1B, à esquerda). Uma microfotografia do mesmo campo no dia 5 (Figura 1B, à direita) mostra organoides crescendo ao longo do tempo. Esses organoides pulmonares humanos em expansão abrigam todos os quatro principais tipos de células epiteliais das vias aéreas, incluindo célula ciliada ACCTUB+ ou FOXJ1+, célula basal P63+, célula do clube CC10+ e célula de cálice MUC5AC+18 (Figura 1C), em estado prematuro. Notavelmente, esses organoides pulmonares humanos podem ser consecutivos e stably passagens por mais de 1 ano. Quando mantidos dentro da matriz do porão, os organoides pulmonares são mais propensos a mostrar uma polaridade apical-in, menos de 2%-3% dos organoides pulmonares mostram uma polaridade apical-out13. Como resultado, os ápices celulares não são facilmente acessíveis a menos que os organoides 3D estejam abertos.
No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas humanas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são suficientemente maduros, uma vez que a população celular dominante no epitélio das vias aéreas nativas, célula ciliada, é sub-representada no organoide pulmonar. Em seguida, definimos um meio de diferenciação proximal (DP) para melhorar o estado de maturação dos organoides pulmonares humanos. Os organoides incubados no meio de expansão e o meio DP desenvolveram morfologia distinta ao longo do tempo (Figura 2A). Motile cilia foram mais abundantes nos organoides no meio DP do que aqueles no meio de expansão. Após 2 semanas de cultura de diferenciação no meio PD, cílios motile são perceptíveis em cada organoide (Figura 2B e Vídeo Suplementar 1). Curiosamente, a cilia pulsante leva os detritos celulares e a mucina excretada dentro do lúmen organoide para redemoinho unidirecionalmente, o que recapitula adequadamente a escada rolante mucociliária para remover as partículas inaladas (Vídeo Suplementar 1), um importante mecanismo de auto-compensação das vias aéreas humanas. Demonstramos que as células ciliadas aumentaram dramaticamente para cerca de 50% nos organoides diferenciados em comparação com os organoides pulmonares originais. Para avaliar os percentuais de quatro tipos de células epiteliais, os organoides das vias aéreas 2D foram analisados por citometria de fluxo. Resumidamente, os organoides foram dissociados com 10 mM EDTA para 60 min a 37 °C, fixados com 4% de PFA, e permeabilizados com 0,1% surfactante. Posteriormente, as células foram incubadas com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) por 1h a 4 °C seguido de coloração com anticorpos secundários. Foi utilizado um sistema FACS para analisar as amostras. A análise da citometria de fluxo demonstrou organoides diferenciados que acomodam quatro tipos de células epiteliais das vias aéreas (Figura 2C). Por isso, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas que podem simular fielmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico.
Para permitir que a superfície apical organoide seja facilmente acessível e modele melhor a exposição ao epitélio das vias aéreas humanas a patógenos respiratórios, geramos monocamadas 2D de organoides das vias aéreas. Após 2 semanas de cultura de diferenciação, organoides das vias aéreas 2D desenvolveram uma barreira epitelial intacta (Figura 3A,B). Também foi realizado um ensaio de bloqueio do Dextran para avaliar a integridade da barreira epitelial formada em organoides das vias aéreas 2D. No dia 10, após a cultura em pastilhas transwell, fluoresceína isothiocyanate-dextran (MW 10.000) foi adicionado no meio da câmara superior e incubado a 37 °C por 4h. A mídia nas câmaras superior e inferior foram colhidas para um ensaio de fluorescência. O índice de bloqueio do Dextran refere-se à intensidade de fluorescência do meio na câmara superior versus na câmara inferior (Figura 3B). Estes organoides das vias aéreas 2D também contêm células ciliadas abundantes (Figura 3C). As células ciliadas foram rotuladas por anticorpos anti-β-Tubulin IV (ACCTUB) e anticorpos secundários anti-rato 488. Imagens confocal foram adquiridas usando um microscópio confocal. Imagens multicanais foram adquiridas utilizando os lasers 405 nm para DAPI, 488 nm para ACCTUB e 633/640 nm para Phalloidin. Os parâmetros de imagem foram ajustados de acordo com o manual do usuário do microscópio confocal. Resumidamente, o tamanho do pinhole foi definido para 1 UA, o ganho mestre foi definido para 650 V a 750 V com ganho digital de 1.0, e a potência laser foi ajustada para cada canal dentro da faixa de 0,2% a 5%. O processamento de imagens foi realizado por meio do software de análise fornecido.
O trato respiratório humano é revestido com dois tipos distintos de epitélios, ou seja, epitélio das vias aéreas e epitélio alveolar. A primeira linhas as vias aéreas da cavidade nasal para o brônquio terminal e consiste em quatro tipos principais de célula epitelial, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula do clube e célula basal. Além disso, o epitélio das vias aéreas que reveste as vias aéreas proximal e distal mostra uma composição celular variável ao longo do eixo proximal-distal. O epitélio das vias aéreas proximais é pseudoestratificado, consistindo de células ciliadas abundantes e células de cálice que secretam muco; enquanto o epitélio das vias aéreas distal é uma única camada de células cuboidais ciliadas e club com células menos basais e cálices19. Os tecidos pulmonares humanos usados para a deriva de organoides pulmonares foram adquiridos de pacientes submetidos a ressecções cirúrgicas devido a várias doenças. Usamos tecidos pulmonares normais adjacentes aos tecidos doentes para cultura organoide. Estes tecidos pulmonares normalmente contêm bronquiolos de tamanho variável cercados por sacos alveolares. Durante a cultura inicial, as células-tronco epiteliais das vias aéreas ou as células progenitoras das vias aéreas nos tecidos pulmonares sobrevivem e proliferam devido aos fatores de nicho no meio de expansão. O meio de expansão permite a derivação inicial e a expansão a longo prazo dos organoides pulmonares direcionando os organoides para um estado imaturo, enquanto o protocolo de diferenciação das vias aéreas gera organoides das vias aéreas fenocopying as vias aéreas nativas epitélio morfológica e funcionalmente. O sistema modelo, incluindo derivação, expansão e diferenciação de organoides pulmonares, está descrito na Figura 4. A composição celular no epitélio das vias aéreas proximal e distal também é ilustrada na Figura 4.
Figura 1: Derivação, expansão e caracterização de organoides pulmonares humanos. (A) Uma microfotografia representativa mostra células únicas embutidas na matriz do porão após o isolamento dos tecidos pulmonares no dia 0 (à esquerda). No dia 5, organoides císticos estão crescendo (à direita). Barra de escala é de 0,5 mm. (B) Uma microfotografia representativa de organoides pulmonares no dia da quarta passagem e dia 5 após a passagem. A barra de escala é de 0,5 mm. P1 e P4 representam a primeira e quarta passagens. As imagens foram tiradas em 10x de ampliação. (C) Imagens confocal de quatro tipos de células epiteliais das vias aéreas em organoides pulmonares humanos. Quatro linhagens de células epiteliais das vias aéreas estão presentes nos organoides pulmonares, incluindo células ciliadas ACCUB+ e FOXJ1+, células basais P63+, células do clube CC10+ e células de cálice MUC5AC+. Os filamentos de actina nuclei e celular são neutralizados com DAPI (azul) e Phalloidin-647 (roxo), respectivamente. A barra de escala é de 10 μm. Esse número foi adotado a partir de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação proximal dos organoides pulmonares humanos. (A) Os organoides pulmonares humanos foram cultivados no meio dp ou no meio de expansão (Exp) em paralelo por 16 dias. Microfotografias de campo brilhante de organoides nos dias indicados são mostradas. A barra de escala é de 0,4 mm. (B) Cilia nos organoides diferenciados das vias aéreas são mostrados (seta preta). Barra de escala é de 20 μm. (C) Os percentuais de tipos de células individuais em organoides incubados em PD médio (superior) e meio de expansão (inferior) detectados pela análise FACS. Os histogramas representativos de uma linha organoide são mostrados. O experimento foi realizado em três diferentes linhas organoides. Esse número foi adotado a partir de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Geração de organoides diferenciados das vias aéreas 2D. (A) A resistência eletrônica trans epitelial (TEER) foi medida no dia indicado após a incubação no meio PD. Os dados mostram ± desvio padrão (SD) de monocamadas 2D em 10 pastilhas. (B) No dia 10 após a cultura em placas de apoio permeáveis, fluorescenato isothiocyanato-dextran foi adicionado e a mídia nas câmaras superior e inferior foi colhida para um ensaio de fluorescência após 4h. O índice de bloqueio do Dextran refere-se à intensidade de fluorescência do meio na câmara superior versus a da câmara inferior. O diâmetro das pastilhas de suporte permeáveis utilizadas em nosso experimento é de 0,4 μm. Sem semeadura de células, o dextran pode penetrar livremente as pastilhas 2D normais. Assim, o índice de bloqueio do dextran de um 2D normal (a barra rotulada com Blank) deve ser 1. Os dados representam a média ± SD de 10 inserções semeadas com organoides de vias aéreas 2D (organoide 2D) e aquelas em duas pastilhas em branco (em branco). (C) Imagens confocal de células ciliadas ACCTUB+ abundantes (verde) em organoides de vias aéreas 2D. Filamentos de actina celular são contra-manchados com Phalloidin-647 (roxo). A barra de escala é de 20 μm. Esse número foi adotado a partir de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração esquemática de derivação, expansão e diferenciação de organoides pulmonares humanos. Células únicas isoladas dos tecidos pulmonares humanos estão diretamente embutidas na matriz do porão e incubadas no meio de expansão organoide pulmonar. Os organoides pulmonares humanos derivados podem ser expandidos a longo prazo com alta estabilidade e prontamente recuperados de estoques criopreservados. Após a diferenciação, os organoides das vias aéreas geradas podem simular fielmente o epitélio das vias aéreas humanas. Organoides das vias aéreas 2D e 3D foram desenvolvidos para várias manipulações experimentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1. A cilia sincronizadamente batendo leva os detritos celulares a girar unidirecionalmente nos organoides diferenciados das vias aéreas13. Este vídeo foi adotado a partir de13. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
As vias aéreas humanas são forradas com o epitélio das vias aéreas, também conhecido como epitélio ciliado pseudostratificado. Os principais tipos celulares do epitélio das vias aéreas superiores são células ciliadas que permitem o movimento coordenado de seus cílios apical para expelir muco e partículas inaladas das vias aéreas, células de cálice que produzem e secretam muco, e células basais que revestem a membrana do porão e estão implicadas na regeneração. Nas pequenas vias aéreas, como os brônquios, o epitélio das vias aéreas cuboidal contém células secretas do clube e menos células ciliadas do que nas regiões das vias aéreas superiores. Descrevemos um protocolo robusto para derivar organoides pulmonares humanos das células-tronco epiteliais nos tecidos pulmonares humanos. Esses organoides pulmonares humanos são mantidos no meio de expansão e consecutivamente passagens por mais de 1 ano com alta estabilidade. Os principais fatores de crescimento no meio de expansão incluem R-spondin, um AgonistWNT 20; e Noggin, que é um inibidor da sinalização BMP21, bem como FGF7 e FGF10. Estudos anteriores revelaram um papel crucial da sinalização WNT, FGF e BMP na homeostase do epitélio respiratório 22,23,24. O meio de expansão permite a derivação inicial e a expansão a longo prazo dos organoides pulmonares direcionando os organoides para um estado imaturo. Desenvolvemos ainda um método de diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D, que acomodam quatro tipos principais de células das vias aéreas e simulam o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Durante todo o procedimento, incluindo derivação inicial, expansão a longo prazo e diferenciação proximal, nem purificação celular tediosa nem alimentador e células estromicas são necessárias. Assim, estabelecemos um modelo organoide do epitélio das vias aéreas humanas. As duas fases da cultura, cultura de expansão e cultura de diferenciação, são mutuamente exclusivas. Os organoides pulmonares fornecem uma fonte estável para expansão a longo prazo, enquanto organoides diferenciados das vias aéreas fielmente fenócópia do epitélio das vias aéreas humanas. Esses organoides são favoráveis a várias manipulações experimentais, incluindo imagem, sequenciamento de RNA, análise de citometria de fluxo, edição genética, etc.13,14,25,26,27.
Para garantir alta eficiência para derivar organoides pulmonares, o meio de expansão deve ser reconstituído com precisão e meticulosamente, o que é essencial para a alta taxa de estabelecimento habilitada pelo protocolo. Uma grande limitação deste modelo organoide é a composição epitelial pura, falta de células estrômicas e células imunes presentes na mucosa respiratória humana, o que pode fazer com que os organoides das vias aéreas se desviem do epitélio das vias aéreas nativas até certo ponto. Assim, nos esforçamos para gerar a próxima geração de organoides respiratórios incorporando células imunes e outros componentes biologicamente relevantes em nosso modelo organoide atual.
Os organoides das vias aéreas que estabelecemos simulam fielmente a composição e funcionalidade multicelular do epitélio respiratório humano nativo a um nível quase fisiológico, o que é impossível em qualquer linha celular homogênea. Nossos modelos organoides permitem que os cientistas reconstruam e expandam o epitélio das vias aéreas humanas nativas em placas de cultura. Esses organoides das vias aéreas são uma ferramenta universal para estudar a biologia e a patologia das vias aéreas humanas. As células epiteliais das vias aéreas primárias usadas em laboratórios de pesquisa não são expansíveis devido à capacidade replicativa limitada e dificilmente servem como uma ferramenta de pesquisa reprodutível e facilmente acessível.
Organoides, incluindo organoides respiratórios humanos, revelaram sua singularidade e força para estudar patógenos humanos, incluindo SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Como ferramenta universal e fisiológica-ativa, os organoides pulmonares humanos podem ser amplamente utilizados para explorar a biologia e a patologia do trato respiratório humano.
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Disclosures
J. Z., C.L., e M.C.C. estão listados como inventores na patente de organoides das vias aéreas (publicação Nº: US-2021-0207081-A1). Os outros autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Centro de Ciências Panorômicas e Unidade de Microscópio Eletrônico, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Universidade de Hong Kong, pela assistência em imagens confocal e citometria de fluxo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde (HMRF, 17161272 e 19180392) da Secretaria de Alimentação e Saúde; Fundo Geral de Pesquisa (GRF, 17105420) do Conselho de Bolsas de Pesquisa; e Health@InnoHK, Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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