Summary
Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.
Abstract
Het ontbreken van een robuust in vitro model van het menselijke respiratoire epitheel belemmert het begrip van de biologie en pathologie van het ademhalingssysteem. We beschrijven een gedefinieerd protocol om menselijke longorganoïden af te leiden van volwassen stamcellen in het longweefsel en proximale differentiatie te induceren om volwassen luchtwegorganoïden te genereren. De longorganoïden worden vervolgens achtereenvolgens gedurende meer dan 1 jaar met hoge stabiliteit uitgebreid, terwijl de gedifferentieerde luchtwegorganoïden worden gebruikt om morfologisch en functioneel menselijk luchtwegepitheel te simuleren tot een bijna fysiologisch niveau. Zo stellen we een robuust organoïde model van het menselijke luchtwegepitheel vast. De langdurige expansie van longorganoïden en gedifferentieerde luchtwegorganoïden genereert een stabiele en hernieuwbare bron, waardoor wetenschappers de menselijke luchtwegepitheelcellen in kweekschotels kunnen reconstrueren en uitbreiden. Het menselijke longorganoïde systeem biedt een uniek en fysiologisch actief in vitro model voor verschillende toepassingen, waaronder het bestuderen van virus-gastheer interactie, medicijntesten en ziektemodellering.
Introduction
Organoïden zijn een robuust en universeel hulpmiddel geworden voor in vitro modellering van orgaanontwikkeling en het bestuderen van biologie en ziekte. Wanneer gekweekt in een groeifactor-gedefinieerd kweekmedium, kunnen volwassen stamcellen (ASC) uit een verscheidenheid aan organen worden uitgebreid in 3-dimensie (3D) en zelf worden geassembleerd tot orgaanachtige cellulaire clusters die zijn samengesteld uit meerdere celtypen, organoïden genoemd. Het laboratorium van Clevers rapporteerde de afleiding van de eerste asc-afgeleide organoïde, human intestinal organoid, in 2009 1,2. Daarna zijn asc-afgeleide organoïden vastgesteld voor een verscheidenheid aan menselijke organen en weefsels, waaronder prostaat 3,4, lever 5,6, maag 7,8,9, pancreas10, borstklier11 en long 12,13 . Deze van ASC afgeleide organoïden behielden de kritische cellulaire, structurele en functionele eigenschappen van het inheemse orgaan en behielden genetische en fenotypische stabiliteit in de expansiecultuur op lange termijn14,15.
Organoïden kunnen ook worden afgeleid van pluripotente stamcellen (PSC), waaronder embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel16. Terwijl PSC-afgeleide organoïden de mechanismen van orgaanontwikkeling voor hun oprichting exploiteren, kunnen ASC's worden gedwongen om organoïden te vormen door omstandigheden te herbouwen die de stamcelniche nabootsen tijdens fysiologische weefselzelfvernieuwing of weefselherstel. PSC-afgeleide organoïden zijn gunstige modellen om ontwikkeling en organogenese te onderzoeken, hoewel ze niet in staat zijn om het vergelijkbare rijpingsniveau van ASC-afgeleide organoïden te bereiken. De foetale rijpingsstatus van PSC-afgeleide organoïden en de complexiteit voor het vaststellen van deze organoïden verhinderen aanzienlijk hun brede toepassingen voor het bestuderen van biologie en pathologie in volwassen weefsels.
De menselijke luchtwegen, van neus tot terminale bronchiole, zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook wel het pseudostratified trilhaarepitheel genoemd, dat bestaat uit vier belangrijke celtypen, d.w.z. trilhaarcel, bokaalcel, basale cel en clubcel. We hebben de ASC-afgeleide menselijke longorganoïde uit menselijke longweefsels vastgesteld in samenwerking met Clevers ' lab12,13. Deze longorganoïden worden gedurende meer dan een jaar achtereenvolgens in het expansiemedium geëxpandeerd; de precieze duur varieert tussen de verschillende organoïde lijnen die van verschillende donoren zijn verkregen. In vergelijking met het inheemse luchtwegepitheel zijn deze langdurig uitbreidbare longorganoïden echter niet volwassen genoeg omdat trilhaarcellen, de belangrijkste celpopulatie in de menselijke luchtwegen, ondervertegenwoordigd zijn in deze longorganoïden. Zo ontwikkelden we een proximaal differentiatieprotocol en genereerden we 3D- en 2D-luchtwegorganoïden die morfologisch en functioneel fenoscopie van het luchtwegepitheel tot een bijna-fysiologisch niveau.
Hier bieden we een videoprotocol om menselijke longorganoïden af te leiden uit de primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met menselijke weefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 en UW21-695). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten vóór weefselverzameling.
1. Afleiding van menselijke longorganoïde
- Voorbereiding van experimenteel materiaal
- Bereid basaal medium door geavanceerd DMEM / F12-medium aan te vullen met 2 mM glutamine, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.
- Bereid humaan longorganoïde expansiemedium voor door basaal medium aan te vullen met 10% R-spondin 1 geconditioneerd medium, 10% Noggin geconditioneerd medium, 1x B27 supplement, 1,25 mM N-acetylcysteïne, 10 mM nicotinamide, 5 μM van Y-27632, 500 nM van A-83-01, 1 μM van SB202190, 5 ng / ml fibroblst groeifactor (FGF) -7, 20 ng / ml FGF-10 en 100 μg / ml primocine (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Het R-spondin 1 en Noggin geconditioneerde medium kan worden vervangen door commercieel recombinant R-spondin 1 (500 ng/ml) en Noggin (100 ng/ml). - Prewarm een 24-well suspensiecultuurplaat in een celkweekincubator. Gebruik een standaard celkweekincubator met 5% CO2 en bevochtigde atmosfeer bij 37 °C. Ontdooi keldermatrix in een koelkast van 4 °C. Houd de keldermatrix en het kweekmedium op ijs tijdens het experimenteren.
- Celisolatie uit menselijke longweefsels voor 3D organoïde cultuur
- Koop vers gereseceerde menselijke longweefsels van ongeveer 0,5 cm van patiënten die chirurgische resectie ondergaan als gevolg van verschillende ziekten. Transporteer de longweefsels in 30 ml basaal medium bij kamertemperatuur en verwerk zo snel mogelijk in een bioveiligheidskap.
- Gehakt longweefsels in kleine stukjes (0,5-1 mm) met een steriel scalpel in een celkweekschaal van 10 cm. Was tissuestukken met 10 ml koud basaal medium in een centrifugebuis van 15 ml, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 8 ml basaal medium aangevuld met collagenase in een eindconcentratie van 2 mg / ml. Verwerk de stukjes weefsel door de buis bij 120 rpm gedurende 30-40 min bij 37 °C te schudden.
- Pipetteer op en neer gedurende 20x om de verteerde weefselstukken te scheren met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Stapel een zeef van 100 μm op een centrifugebuis van 50 ml en filter de suspensie.
- Herstel weefselstukken op de zeef met het basale medium en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 ml, gevolgd door een tweede ronde van scheren en filteren. Extra shearing-filtering kan 1x-2x worden uitgevoerd om meer cellen te isoleren, vooral wanneer een klein stukje weefsel (bijvoorbeeld <0,5 cm) wordt verkregen.
- Voeg FBS toe aan de doorstroom met een eindconcentratie van 2% om de spijsvertering te beëindigen, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Resuspensie van de celpellet in 10 ml basaal medium, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- (Optioneel) Als er veel erytrocyten in de pellet worden gezien (geschat door de kleur van de pellet), resuspenseer de celpellet dan in 2 ml rode bloedcellysisbuffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 10 ml basaal medium toe aan de buis, gevolgd door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in koude keldermatrix en houd op ijs. Voeg 80-160 μL keldermatrix toe voor cellen die zijn teruggewonnen uit een longweefsel van ongeveer 0,5 cm; de hoeveelheid is voldoende om 2-4 druppels te zaaien.
- Doseer 40 μL suspensie aan elk putje van een voorverwarmde 24-wells ophangcultuurplaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen tot een druppel.
- Voeg 500 μL menselijk longorganoïden expansiemedium aangevuld met 5 nM Heregulin beta-1 toe aan elke put en incubeer de plaat in een celkweekincubator.
- Ververs het medium om de 3 dagen. Verwijder het oude medium terwijl u de druppel intact houdt en voeg met voorzichtigheid een vers medium toe. Passeer de organoïden na incubatie gedurende 10-14 dagen. Gebruik Heregulin beta-1 alleen in de begincultuur vóór de eerste passage.
- Observeer de organoïden onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de organoïden niet zijn ingebed met een zeer hoge celdichtheid. Als een druppel desintegreert als gevolg van een te hoge celdichtheid, herstel en herinfundeer de organoïden en cellen met een hoger volume keldermatrix om meer druppels te maken met een lagere en wenselijke celdichtheid.
2. Uitbreiding van menselijke longorganoïden
- Bereid een Pasteur-pipet door de punt van een Pasteur-pipet op een vlam te branden, zoals een Bunsen-brander, om de opening te verkleinen van 1,5 mm tot ongeveer 1,0 mm in diameter. Koel de pipetten af, gevolgd door autoclaveren om te steriliseren. Maak de pipetten nat met het basale medium om celaanhechting en verlies tijdens mechanisch scheren te voorkomen.
- Long organoïden passage met mechanische afschuiving
- Gebruik een tip van 1 ml en pipet op en neer om de druppels die hierboven zijn verkregen te breken. Breng vervolgens de organoïden samen met het medium over naar een centrifugebuis van 15 ml en pas het volume aan op 10 ml met koud basaal medium. Gooi het supernatant weg na centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C
- Was de organoïden nogmaals met 10 ml koud basaal medium. Resuspendeer de organoïden in 2 ml koud basaal medium. Pipetteer op en neer om de organoïden in kleine stukjes te scheren met een Pasteur pipet.
- Vul aan met basaal medium tot een totaal volume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de organoïde fragmenten met koude keldermatrix voldoende om een 1:3 tot 1:5 expansie mogelijk te maken. Blijf op ijs.
- Plaats 40 μL organoïde suspensie in elk putje van een voorverwarmde 24-wells plaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen.
- Voeg 500 μL longorganoïde expansiemedium toe aan elke put en incubeer in een celkweekincubator. Ververs het medium om de 3 dagen. Passeer de organoïden elke 2 weken met een verhouding van 1:3 tot 1:5.
- Long organoïden passage met trypsinisatie
OPMERKING: Trypsinisatie heeft de voorkeur wanneer het moeilijk is om de longorganoïde in kleine stukjes te scheren met behulp van een Pasteur-pipet, of de grootte van de organoïden zeer variabel is, of de daaropvolgende experimenten organoïden van meer uniforme grootte vereisen.- Oogst de longorganoïden zoals aangegeven in stap 2.2.1. Resuspendeer de organoïde in 1 ml dissociatie-enzym en incubeer in een waterbad van 37 °C gedurende 3-5 minuten.
- Voeg 1 ml basaal medium toe aan de buis. Schuif de organoïden mechanisch door de organoïden op en neer te pipetteren in kleine stukjes met behulp van een Pasteur-pipet. Controleer de grootte van organoïde stukken onder een microscoop bij 4x vergroting. Voeg vervolgens 40 μL FBS toe om de spijsvertering te beëindigen.
OPMERKING: Bepaal de grootte van organoïde fragmenten onder de microscoop volgens de experimentele opstelling. Als een experiment meer organoïden of organoïden van meer uniforme grootte nodig heeft, schuif dan organoïden in kleinere stukken of zelfs enkele cellen. Daarna duurt het langer, waarschijnlijk 3 weken, voordat de organoïden klaar zijn voor experimenten. - Vul aan met basaal medium tot een eindvolume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de organoïde stukken in koude keldermatrix met een volume dat voldoende is om door te gaan met een verhouding van 1:5-1:10. Blijf op ijs.
- Plaats 40 μL organoïde suspensie in elk putje van een voorverwarmde 24-wells plaat. Incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 10-15 min. Laat de keldermatrix stollen.
- Vul aan met 500 μL long organoïde expansiemedium per put en incubeer in een celkweekincubator. Ververs het uitbreidingsmedium om de 3 dagen. Passeer de organoïden na 2-3 weken.
OPMERKING: Ongeveer 100 organoïden zijn gemonteerd in een druppel van 40 μL van de keldermatrix. De longorganoïden groeien normaal gesproken beter met een relatief hoge celdichtheid. Herinfundeer de organoïden met een lagere celdichtheid als druppels desintegreren of de groeiende organoïden zich aan elkaar hechten vanwege de te hoge celdichtheid.
3. Proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren
- Bereid proximaal differentiatiemedium (PD-medium) voor door het basale medium luchtvloeistofinterface aan te vullen met 1x luchtvloeistofinterfacesupplement, 1x luchtvloeistofinterfaceonderhoudssupplement, 4 μg/ml heparine, 1 μM hydrocortison, 10 μM Y-27632 en 10 μM DAPT (zie materiaaltabel).
- 3D luchtweg organoïden
- Incubeer longorganoïden in het expansiemedium gedurende 7-10 dagen na het passeren via mechanisch scheren. Vervang het expansiemedium door het PD-medium. Incubeer de organoïden in het PD-medium gedurende 14 dagen in een celkweekincubator.
- Gooi het PD-medium in elk putje weg. Voeg cellysaatbuffer toe om de gedifferentieerde luchtwegorganoïde te oogsten voor RNA-extractie en detectie van cellulaire genexpressie door RT-qPCR-assay.
- U kunt de organoïden ook incuberen bij 37 °C gedurende 60 minuten na toevoeging van 10 mM EDTA om de organoïden in afzonderlijke cellen te disassociateren, gevolgd door flowcytometrieanalyse om celpopulaties te onderzoeken. De organoïden zijn klaar voor verschillende experimentele manipulaties.
- 2D luchtweg organoïde
- Bereid voldoende 3D-longorganoïden voor 2D-differentiatiecultuur voor. Een totaal van 1,3 x 105 en 4,5 x 105 cellen zijn vereist voor respectievelijk een 24-well permeable support insert en een 12-well permeable support insert.
- Nadat 3D-longorganoïden gedurende 2 weken in het expansiemedium zijn gegroeid, verteren de organoïden in enkele cellen en zaad in de 24-well en 12-well inserts om 2D-luchtwegorganoïden te genereren.
- Incubeer de inserts 's nachts met het basale medium in een celkweekincubator. Voeg respectievelijk 250 μL en 500 μL basaal medium toe in de bovenste en onderste kamer van een 24-well plaat. Voeg voor een 12-wellsplaat respectievelijk 500 μL en 1.000 μL basaal medium toe in de bovenste en onderste kamer.
- Oogst 3D-longorganoïden zoals beschreven in stap 2.2.1. Resuspendeer de organoïden met 1 ml dissociatie-enzym en incubeer gedurende 3-5 minuten in een waterbad van 37 °C.
- Voeg 1 ml basaal medium toe aan de buis. Pipetteer op en neer om de organoïden in enkele cellen te scheren met een Pasteur-pipet en controleer de cellen onder een microscoop. Voeg vervolgens 40 μL FBS toe om de spijsvertering te beëindigen.
- Filter de cellen door een zeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 ml. Breng de gefilterde celsuspensie over in een buis van 15 ml. Vul aan met basaal medium tot een totaal volume van 10 ml, gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Resuspendeer de pellet, verzameld uit 24 druppels (40 μL), in 1-2,5 ml longorganoïde expansiemedium, afhankelijk van de celdichtheid in de druppels. Tel het aantal cellen met een celteller onder een microscoop. Stel de celconcentratie in op 1,3 x 106/ml (voor inzetstukken met 24 putten) of 9 x 105/ml (voor inzetstukken met 12 putten).
- Verwijder het basale medium uit de bovenste en onderste kamers. Voeg 500 μL en 1.000 μL expansiemedium toe in de onderste kamer van respectievelijk de insert met 24 putten en de insert met 12 putten. Zaad 100 μL en 500 μL celsuspensie bereid in stap 3.3.7 op de apicale kamer van respectievelijk de 24-well insert en 12-well insert.
- Incubeer gedurende 2 dagen in een celkweekincubator. Vervang het expansiemedium door het PD-medium in zowel de apicale als de onderste kamer van de platen. Incubeer de organoïden in celkweek incubator gedurende 14 dagen en ververs het PD-medium elke 3 dagen.
OPMERKING: Mobiele trilharen zijn waarneembaar in de 3D- en 2D-organoïden onder een microscoop vanaf dag 7 na incubatie in het PD-medium. Na 14 dagen differentiatiecultuur in het PD-medium zijn de luchtwegorganoïden rijp voor verschillende experimentele manipulaties. - Meet om de dag de transepitheel elektrische weerstand (TEER) met behulp van een meetsysteem voor elektrische weerstand volgens een standaardprotocol zoals beschreven in17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol maakt de afleiding van menselijke longorganoïden met een hoog slagingspercentage mogelijk. Vers menselijk longweefsel wordt in kleine stukjes gehakt en vervolgens afgebroken met collagenase. De resulterende enkele cellen zijn ingebed in de keldermatrix en geïncubeerd in het longorganoïde expansiemedium aangevuld met een cocktail van nichefactoren voor de uitgroei van epitheelstamcellen (stap 1.1.2). Figuur 1 toont de microfoto van vers geïsoleerde longcellen ingebed in gereduceerde groeifactor keldermembraanmatrix Type 2 (BME; Figuur 1A, links). Cystische organoïden verschijnen en vergroten in de loop van de tijd (figuur 1A, rechts). Ondertussen ondergaan de niet-verwante cellen geleidelijk celdood. Fibroblasten zijn aanwezig in de cultuur tijdens de eerste of tweede passages. Daarna bevat de kweek uitsluitend epitheliale organoïden, die longorganoïden zijn die zijn afgeleid van epitheelstamcellen die aanwezig zijn in de primaire longweefsels. Deze longorganoïden worden elke 2-3 weken gepasseerd door mechanisch scheren in een verhouding van 1:3 tot 1:5 of door trypsinisatie in een verhouding van 1:5 tot 1:10 (stappen 2.2-2.3). De representatieve microfoto's van longorganoïden na de vierde passage zijn weergegeven in figuur 1B. Na mechanisch scheren vormen de organoïde fragmenten ingebed in BME binnen een paar uur cystische domeinen (figuur 1B, links). Een microfoto van hetzelfde veld op dag 5 (figuur 1B, rechts) toont organoïden die in de loop van de tijd groeien. Deze uitdijende menselijke longorganoïden herbergen alle vier de belangrijkste typen luchtwegepitheelcellen, waaronder ACCTUB + of FOXJ1 + trilhaarcel, P63 + basale cel, CC10 + clubcel en MUC5AC + bokaalcel18 (figuur 1C), in een voortijdige toestand. Met name deze menselijke longorganoïden kunnen gedurende meer dan 1 jaar opeenvolgend en stabiel worden gepasseerd. Wanneer ze in de keldermatrix worden gehouden, vertonen longorganoïden hoogstwaarschijnlijk een apicale polariteit, minder dan 2% -3% van de longorganoïden vertonen een apicale polariteit13. Als gevolg hiervan zijn celapexen niet gemakkelijk toegankelijk, tenzij de 3D-organoïden worden opengeschoren.
In vergelijking met het inheemse menselijke luchtwegepitheel zijn deze langdurig uitbreidbare longorganoïden echter niet voldoende volwassen, omdat de dominante celpopulatie in het inheemse menselijke luchtwegepitheel, trilhaarcel, ondervertegenwoordigd is in de longorganoïde. Vervolgens definieerden we een proximale differentiatie (PD) medium om de rijpingsstatus van menselijke longorganoïden te verbeteren. De organoïden geïncubeerd in het expansiemedium en het PD-medium ontwikkelden in de loop van de tijd een duidelijke morfologie (figuur 2A). Beweeglijke trilharen kwamen vaker voor in de organoïden in het PD-medium dan die in het expansiemedium. Na 2 weken differentiatiecultuur in het PD-medium zijn beweeglijke trilharen waarneembaar in elke afzonderlijke organoïde (figuur 2B en aanvullende video 1). Interessant is dat de kloppende trilharen het celpuin en de uitgescheiden mucine in het organoïde lumen aandrijven om unidirectioneel te wervelen, wat de mucociliaire roltrap adequaat samenvat om de ingeademde deeltjes te verwijderen (Aanvullende video 1), een belangrijk zelfzuiverend mechanisme van de menselijke luchtwegen. We tonen aan dat de trilhaarcellen dramatisch toenamen tot ongeveer 50% in de gedifferentieerde organoïden in vergelijking met de oorspronkelijke longorganoïden. Om de percentages van vier soorten epitheelcellen te beoordelen, werden de 2D-luchtwegorganoïden geanalyseerd met flowcytometrie. In het kort werden de organoïden gedissocieerd met 10 mM EDTA gedurende 60 minuten bij 37 °C, gefixeerd met 4% PFA en gepermeabiliseerd met 0,1% oppervlakteactieve stof. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met primaire antilichamen (zie tabel met materialen) gedurende 1 uur bij 4 °C, gevolgd door kleuring met secundaire antilichamen. Een FACS-systeem werd gebruikt om de monsters te analyseren. De flowcytometrieanalyse toonde aan dat gedifferentieerde organoïden plaats bieden aan vier typen luchtwegepitheelcellen (figuur 2C). Daarom hebben we een proximaal differentiatieprotocol ontwikkeld om luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw kunnen simuleren tot een bijna-fysiologisch niveau.
Om het organoïde apicale oppervlak gemakkelijk toegankelijk te maken en de blootstelling van het menselijk luchtwegepitheel aan respiratoire pathogenen beter te modelleren, hebben we 2D-monolagen van luchtwegorganoïden gegenereerd. Na 2 weken differentiatiecultuur ontwikkelden 2D-luchtwegorganoïden een intacte epitheliale barrière (figuur 3A,B). We hebben ook een dextran-blokkadetest uitgevoerd om de integriteit van de epitheliale barrière gevormd in 2D-luchtwegorganoïden te beoordelen. Op dag 10 na kweek in transwell inserts werd fluoresceïne isothiocyanaat-dextran (MW 10.000) toegevoegd in het medium van de bovenste kamer en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 4 uur. De media in de bovenste en onderste kamers werden geoogst voor een fluorescentietest. Dextran-verstoppingsindex verwijst naar de fluorescentie-intensiteit van het medium in de bovenste kamer versus die in de onderste kamer (figuur 3B). Deze 2D-luchtwegorganoïden bevatten ook overvloedige trilhaarcellen (figuur 3C). Trilhaarcellen werden gelabeld door anti-β-Tubulin IV-antilichaam (ACCTUB) en geiten-antimuis 488 secundair antilichaam. Confocale beelden werden verkregen met behulp van een confocale microscoop. Meerkanaalsbeelden werden verkregen met behulp van de lasers 405 nm voor DAPI, 488 nm voor ACCTUB en 633/640 nm voor falloidin. Beeldvormingsparameters werden aangepast volgens de gebruikershandleiding van de confocale microscoop. Kortom, de pinhole-grootte was ingesteld op 1 AU, de master gain werd ingesteld op 650 V tot 750 V met digitale versterking van 1,0, en het laservermogen werd aangepast voor elk kanaal binnen het bereik van 0,2% tot 5%. Beeldverwerking werd uitgevoerd met behulp van de meegeleverde analysesoftware.
De menselijke luchtwegen zijn bekleed met twee verschillende soorten epitheel, d.w.z. luchtwegepitheel en alveolair epitheel. De eerste lijnt de luchtwegen van de neusholte naar de terminale bronchiole en bestaat uit vier belangrijke soorten epitheelcellen, d.w.z. trilhaarcel, bokaalcel, clubcel en basale cel. Bovendien vertoont het luchtwegepitheel langs de proximale en distale luchtwegen een variabele cellulaire samenstelling langs de proximale-distale as. Het proximale luchtwegepitheel is pseudostratified, bestaande uit overvloedige trilhaarcellen en slijmafscheidende bokaalcellen; terwijl het distale luchtwegepitheel een enkele laag kubusvormige en clubcellen is met minder basale en bokaalcellen19. Menselijke longweefsels die worden gebruikt voor het afleiden van longorganoïden zijn verkregen van patiënten die chirurgische resecties hebben ondergaan als gevolg van verschillende ziekten. We gebruiken normale longweefsels grenzend aan de zieke weefsels voor organoïde cultuur. Deze longweefsels bevatten meestal bronchiolen van variabele grootte omgeven door alveolaire zakjes. Tijdens de initiële kweek overleven en vermenigvuldigen luchtwegepitheelstamcellen of luchtwegvoorlopercellen in de longweefsels zich en vermenigvuldigen ze zich vanwege de nichefactoren in het expansiemedium. Het expansiemedium maakt initiële afleiding en langdurige expansie van longorganoïden mogelijk door de organoïden naar een onrijpe toestand te leiden, terwijl het luchtwegdifferentiatieprotocol luchtwegorganoïden genereert die het inheemse luchtwegepitheel morfologisch en functioneel fenokopie van het inheemse luchtwegepitheel genereren. Het modelsysteem, inclusief afleiding, expansie en differentiatie van longorganoïden, wordt beschreven in figuur 4. De cellulaire samenstelling in het proximale en distale luchtwegepitheel wordt ook geïllustreerd in figuur 4.
Figuur 1: Afleiding, expansie en karakterisering van menselijke longorganoïden. (A) Een representatieve microfotografie toont enkele cellen ingebed in de keldermatrix na isolatie uit longweefsels op dag 0 (links). Op dag 5 groeien cystische organoïden (rechts). Schaalbalk is 0,5 mm. (B) Een representatieve microfoto van longorganoïden op de dag van de vierde passage en dag 5 na passage. Schaalbalk is 0,5 mm. P1 en P4 vertegenwoordigen de eerste en vierde passage. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 10x. (C) Confocale beelden van vier luchtwegepitheelceltypen in menselijke longorganoïden. Vier afstammingslijnen van luchtwegepitheelcellen zijn aanwezig in de longorganoïden, waaronder ACCUB + en FOXJ1 + trilhaarcellen, P63 + basale cellen, CC10 + clubcellen en MUC5AC + bokaalcellen. Kernen en cellulaire actinefilamenten zijn bevlekt met respectievelijk DAPI (blauw) en Phalloidine-647 (paars). De schaalbalk is 10 μm. Dit cijfer is overgenomen van13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Proximale differentiatie van menselijke longorganoïden. (A) Menselijke longorganoïden werden gedurende 16 dagen parallel gekweekt in het PD-medium of het expansiemedium (Exp). Bright-field microfoto's van organoïden op de aangegeven dagen worden getoond. Schaalbalk is 0,4 mm. (B) Trilharen in de gedifferentieerde luchtwegorganoïden worden weergegeven (zwarte pijl). De schaalbalk is 20 μm. (C) De percentages van individuele celtypen in organoïden geïncubeerd in PD-medium (boven) en expansiemedium (onder) zoals gedetecteerd door FACS-analyse. De representatieve histogrammen van één organoïde lijn worden getoond. Het experiment werd uitgevoerd in drie verschillende organoïde lijnen. Dit cijfer is overgenomen van13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Generatie van 2D gedifferentieerde luchtwegorganoïden. (A) Trans-epitheliale elektronische weerstand (TEER) werd gemeten op de aangegeven dag na incubatie in het PD-medium. Gegevens tonen gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van 2D-monolagen in 10 inserts. (B) Op dag 10 na kweek in doorlatende steunplaten werd fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran toegevoegd en werden de media in de bovenste en onderste kamers geoogst voor een fluorescentietest na 4 uur. Dextran-verstoppingsindex verwijst naar de fluorescentie-intensiteit van het medium in de bovenste kamer versus die in de onderste kamer. De diameter van de doorlatende steuninzetstukken die in ons experiment worden gebruikt, is 0,4 μm. Zonder cellen te zaaien, kan de dextran vrijelijk de normale 2D-inserts binnendringen. De dextran-verstoppingsindex van een normale 2D (de balk gelabeld met Blank) moet dus 1 zijn. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van 10 inserts bezaaid met 2D-luchtwegorganoïden (2D organoid) en die in twee lege inserts (blanco). (C) Confocale beelden van overvloedige ACCTUB+ trilhaarcellen (groen) in 2D-luchtwegorganoïden. Cellulaire actinefilamenten worden tegengekleurd met Phalloidin-647 (paars). De schaalbalk is 20 μm. Dit cijfer is overgenomen van13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische illustratie van afleiding, expansie en differentiatie van menselijke longorganoïden. Enkele cellen geïsoleerd uit menselijke longweefsels zijn direct ingebed in de keldermatrix en geïncubeerd in het longorganoïde expansiemedium. De afgeleide menselijke longorganoïden kunnen op lange termijn worden uitgebreid met een hoge stabiliteit en gemakkelijk worden hersteld uit gecryopreserveerde voorraden. Bij differentiatie kunnen de gegenereerde luchtwegorganoïden getrouw het menselijke luchtwegepitheel simuleren. 2D- en 3D-luchtwegorganoïden zijn ontwikkeld voor verschillende experimentele manipulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1. De synchroon kloppende trilharen drijven het celpuin aan om unidirectioneel te wervelen in de gedifferentieerde luchtwegorganoïden13. Deze video is overgenomen van13. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De menselijke luchtwegen zijn bekleed met het luchtwegepitheel, ook bekend als het pseudostratified ciliated epithelium. De belangrijkste celtypen van het bovenste luchtwegepitheel zijn trilhaarcellen die de gecoördineerde beweging van hun apicale trilharen mogelijk maken om slijm en ingeademde deeltjes uit de luchtwegen te verdrijven, bokaalcellen die slijm produceren en afscheiden, en basale cellen die het keldermembraan bekleden en betrokken zijn bij regeneratie. In de kleine luchtweg zoals bronchiolen bevat het kubusvormige luchtwegepitheel secretoire clubcellen en minder trilhaarcellen dan in de bovenste luchtwegregio's. We beschrijven een robuust protocol om menselijke longorganoïden af te leiden uit de epitheelstamcellen in menselijke longweefsels. Deze menselijke longorganoïden worden in het expansiemedium gehouden en achtereenvolgens gedurende meer dan 1 jaar met hoge stabiliteit gepasseerd. Belangrijke groeifactoren in het expansiemedium zijn R-spondin, een Wnt-agonist20; en Noggin, een remmer van BMP-signalering21, evenals FGF7 en FGF10. Eerdere studies hebben een cruciale rol van Wnt-, FGF- en BMP-signalering in de homeostase van respiratoir epitheel 22,23,24 aangetoond. Het expansiemedium maakt initiële afleiding en langdurige expansie van longorganoïden mogelijk door de organoïden naar een onrijpe toestand te leiden. We ontwikkelen verder een proximale differentiatiemethode om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren, die vier belangrijke luchtwegceltypen huisvesten en het menselijke luchtwegepitheel simuleren tot een bijna-fysiologisch niveau. Tijdens de hele procedure, inclusief initiële afleiding, langdurige expansie en proximale differentiatie, zijn geen vervelende celzuivering of feeder- en stromale cellen vereist. Zo stellen we een organoïde model van het menselijke luchtwegepitheel vast. De twee fasen van cultuur, expansiecultuur en differentiatiecultuur, sluiten elkaar uit. De longorganoïden bieden een stabiele bron voor langdurige expansie, terwijl gedifferentieerde luchtwegorganoïden het menselijke luchtwegepitheel trouw fenokopie. Deze organoïden zijn vatbaar voor verschillende experimentele manipulaties, waaronder beeldvorming, RNA-sequencing, flowcytometrie-analyse, genetische bewerking, enz.13,14,25,26,27.
Om een hoge efficiëntie te garanderen om longorganoïden af te leiden, moet het expansiemedium nauwkeurig en zorgvuldig worden gereconstitueerd, wat essentieel is voor de hoge vestigingssnelheid die door het protocol mogelijk wordt gemaakt. Een belangrijke beperking van dit organoïde model is de zuivere epitheliale samenstelling, het ontbreken van stromale cellen en immuuncellen die aanwezig zijn in het menselijke ademhalingsslijmvlies, waardoor de luchtwegorganoïden tot op zekere hoogte kunnen afwijken van het inheemse luchtwegepitheel. Daarom streven we ernaar om de volgende generatie respiratoire organoïden te genereren door immuuncellen en andere biologisch relevante componenten op te nemen in ons huidige organoïde model.
De luchtwegorganoïden die we hebben vastgesteld, simuleren getrouw de multicellulaire samenstelling en functionaliteit van het inheemse menselijke ademhalingsepitheel tot een bijna fysiologisch niveau, wat onmogelijk is in homogene cellijnen. Onze organoïde modellen stellen wetenschappers in staat om het inheemse menselijke luchtwegepitheel in kweekplaten te reconstrueren en stabiel uit te breiden. Deze luchtwegorganoïden zijn een universeel hulpmiddel om de biologie en pathologie van de menselijke luchtwegen te bestuderen. Primaire luchtwegepitheelcellen die in onderzoekslaboratoria worden gebruikt, zijn niet uitbreidbaar vanwege de beperkte replicerende capaciteit en dienen nauwelijks als een reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijk onderzoeksinstrument.
Organoïden, waaronder menselijke respiratoire organoïden, hebben hun uniekheid en kracht onthuld voor het bestuderen van menselijke pathogenen, waaronder SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Als een universeel en fysiologisch actief hulpmiddel kunnen menselijke longorganoïden op grote schaal worden gebruikt om de biologie en pathologie van de menselijke luchtwegen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L. en M.C.C. staan vermeld als uitvinders op het patent van luchtwegorganoïden (publicatienummer: US-2021-0207081-A1). De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken het Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, voor hulp bij confocale beeldvorming en flowcytometrie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van het Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) van het Food and Health Bureau; Algemeen Fonds voor Onderzoek (GRF, 17105420) van de Raad voor Onderzoeksbeurzen; en Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, de regering van de speciale administratieve regio Hongkong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
