Summary
Protokollen præsenterer en metode til at udlede humane lungeorganoider fra primære lungevæv, udvide lungeorganoiderne og inducere proksimal differentiering for at generere 3D- og 2D-luftvejsorganoider, der trofast phenocopy det menneskelige luftvejsepitele.
Abstract
Manglen på en robust in vitro-model af det humane respiratoriske epitel hindrer forståelsen af åndedrætssystemets biologi og patologi. Vi beskriver en defineret protokol til at udlede humane lungeorganoider fra voksne stamceller i lungevævet og inducere proksimal differentiering for at generere modne luftvejsorganoider. Lungeorganoiderne udvides derefter fortløbende i over 1 år med høj stabilitet, mens de differentierede luftvejsorganoider bruges til morfologisk og funktionelt at simulere humant luftvejsepitel til et næsten fysiologisk niveau. Således etablerer vi en robust organoidmodel af det menneskelige luftvejsepitelet. Den langsigtede udvidelse af lungeorganoider og differentierede luftvejsorganoider genererer en stabil og vedvarende kilde, der gør det muligt for forskere at rekonstruere og udvide de menneskelige luftvejsepitelceller i kulturretter. Det humane lungeorganoidsystem giver en unik og fysiologisk aktiv in vitro-model til forskellige applikationer, herunder undersøgelse af virus-værtsinteraktion, lægemiddeltest og sygdomsmodellering.
Introduction
Organoider er blevet et robust og universelt værktøj til in vitro modellering af organudvikling og studere biologi og sygdom. Når de dyrkes i et vækstfaktordefineret kulturmedium, kan voksne stamceller (ASC) fra en række organer udvides i 3-dimension (3D) og selvsamles til organlignende cellulære klynger sammensat af flere celletyper, kaldet organoider. Clevers laboratorium rapporterede afledningen af den første ASC-afledte organoid, human intestinal organoid, i 2009 1,2. Derefter er ASC-afledte organoider blevet etableret for en række menneskelige organer og væv, herunder prostata 3,4, lever 5,6, mave 7,8,9, bugspytkirtel10, brystkirtel11 og lunge 12,13 . Disse ASC-afledte organoider bevarede det oprindelige organs kritiske cellulære, strukturelle og funktionelle egenskaber og opretholdt genetisk og fænotypisk stabilitet i langsigtet ekspansionskultur 14,15.
Organoider kan også stamme fra pluripotente stamceller (PSC), herunder embryonale stamceller (ES) celler og induceret pluripotent stamcelle (iPS)16. Mens PSC-afledte organoider udnytter mekanismerne for organudvikling til deres etablering, kan ASC'er tvinges til at danne organoider ved at genopbygge forhold, der efterligner stamcelleniche under fysiologisk vævs selvfornyelse eller vævsreparation. PSC-afledte organoider er gunstige modeller til at udforske udvikling og organogenese, omend de ikke er i stand til at nå det sammenlignelige modningsniveau for ASC-afledte organoider. Den fosterlignende modningsstatus for PSC-afledte organoider og kompleksiteten til etablering af disse organoider forhindrer i væsentlig grad deres brede anvendelser til at studere biologi og patologi i modne væv.
Det menneskelige luftveje, fra næse til terminal bronchiole, er foret med luftvejsepitelet, også kaldet det pseudostratificerede cilierede epitel, som består af fire hovedcelletyper, dvs. cilieret celle, bægercelle, basalcelle og klubcelle. Vi etablerede den ASC-afledte humane lungeorganoid fra humant lungevæv i samarbejde med Clevers' laboratorium12,13. Disse lungeorganoider udvides fortløbende i ekspansionsmediet i over et år; den nøjagtige varighed varierer mellem forskellige organoidlinjer opnået fra forskellige donorer. Sammenlignet med det indfødte luftvejsepitel er disse langsigtede udvidelige lungeorganoider imidlertid ikke modne nok, da cilierede celler, den største cellepopulation i de menneskelige luftveje, er underrepræsenteret i disse lungeorganoider. Således udviklede vi en proksimal differentieringsprotokol og genererede 3D- og 2D-luftvejsorganoider, der morfologisk og funktionelt phenokopierer luftvejsepitelet til et næsten fysiologisk niveau.
Her leverer vi en videoprotokol til at udlede humane lungeorganoider fra det primære lungevæv, udvide lungeorganoiderne og inducere proksimal differentiering for at generere 3D- og 2D-luftvejsorganoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ved hjælp af humant væv beskrevet heri blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Hong Kong / Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 og UW21-695). Informeret samtykke blev indhentet fra patienter før vævsindsamling.
1. Afledning af human lungeorganoid
- Forberedelse af eksperimentelle materialer
- Forbered basalt medium ved at supplere avanceret DMEM / F12-medium med 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin.
- Forbered humant lungeorganoid ekspansionsmedium ved at supplere basalt medium med 10% R-spondin 1 konditioneret medium, 10% Noggin konditioneret medium, 1x B27 supplement, 1,25 mM N-acetylcystein, 10 mM nicotinamid, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng / ml fibroblst vækstfaktor (FGF) -7, 20 ng / ml FGF-10 og 100 μg / ml primocin (se materialetabel).
BEMÆRK: Det R-spondin 1 og Noggin konditionerede medium kan erstattes med kommercielt rekombinant R-spondin 1 (500 ng / ml) og Noggin (100 ng / ml). - Forvarm en 24-brønd suspension kulturplade i en cellekultur inkubator. Brug en standard cellekulturinkubator med 5% CO2 og befugtet atmosfære ved 37 °C. Tø kældermatrix op i et køleskab med 4 °C. Hold kældermatrixen og kulturmediet på is under eksperimentering.
- Celleisolering fra humant lungevæv til 3D-organoidkultur
- Indkøb frisk resekteret humant lungevæv på omkring 0,5 cm fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion på grund af forskellige sygdomme. Transporter lungevævet i 30 ml basalmedium ved stuetemperatur og behandl så hurtigt som muligt inde i en biosikkerhedshætte.
- Hakket lungevæv i små stykker (0,5-1 mm) med en steril skalpel i en 10 cm cellekulturskål. Vævsstykker med 10 ml koldt basalmedium vaskes i et 15 ml centrifugerør efterfulgt af centrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pelleten genanvendes i 8 ml basalmedium suppleret med collagenase i en slutkoncentration på 2 mg/ml. Fordøje vævsstykkerne ved at ryste røret ved 120 o / min i 30-40 minutter ved 37 ° C.
- Rør op og ned i 20x for at forskyde de fordøjede vævsstykker ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Læg en 100 μm sil på et 50 ml centrifugerør, og filtrer suspensionen.
- Gendan vævsstykker på silen med basalmediet og overfør dem til et 15 ml centrifugerør efterfulgt af en anden runde af klipning og filtrering. Yderligere forskydningsfiltrering kan udføres 1x-2x for at isolere flere celler, især når der udtages et lille stykke væv (f.eks. <0,5 cm).
- Der tilsættes FBS til gennemstrømningen med en slutkoncentration på 2 % for at afslutte fordøjelsen efterfulgt af centrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Cellepillen resuspenderes i 10 ml basalsubstrat efterfulgt af centrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- (Valgfrit) Hvis der ses mange erythrocytter i pelleten (estimeret ved pelletens farve), skal cellepillen resuspenderes i 2 ml lysisbuffer til røde blodlegemer og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter. Derefter tilsættes 10 ml basalmedium til røret efterfulgt af centrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Resuspender pelleten i kold kældermatrix og hold på is. Tilsæt 80-160 μL kældermatrix til celler genvundet fra et lungevæv af størrelse omkring 0,5 cm; mængden er tilstrækkelig til at frø 2-4 dråber.
- Der hældes 40 μL suspension til hver brønd af en forvarmet 24-brønd suspensionskulturplade. Kulturpladen inkuberes ved 37 °C i 10-15 min. Lad kældermatrixen størkne for at danne en dråbe.
- Der tilsættes 500 μL humane lungeorganoider ekspansionsmedium suppleret med 5 nM Heregulin beta-1 til hver brønd og inkuberer pladen i en cellekulturinkubator.
- Opdater mediet hver 3. dag. Fjern det gamle medium, mens du holder dråben intakt, og tilsæt frisk medium med forsigtighed. Passage organoiderne efter inkubation i 10-14 dage. Brug kun Heregulin beta-1 i den oprindelige kultur før den første passage.
- Overhold organoiderne under et mikroskop for at sikre, at organoiderne ikke er indlejret med en meget høj celletæthed. Hvis en dråbe opløses på grund af en alt for høj celletæthed, skal du gendanne og genindvie organoiderne og cellerne med et højere volumen kældermatrix for at fremstille flere dråber med en lavere og ønskelig celletæthed.
2. Udvidelse af humane lungeorganoider
- Forbered en Pasteur-pipette ved at brænde spidsen af en Pasteur-pipette på en flamme, såsom en Bunsen-brænder, for at indsnævre åbningen fra 1,5 mm til ca. 1,0 mm i diameter. Pipetterne afkøles efterfulgt af autoklavering for at sterilisere. Våd pipetterne med basalmediet for at undgå cellefastgørelse og tab under mekanisk klipning.
- Lungeorganoider passage med mekanisk klipning
- Brug en 1 ml spids og pipette op og ned for at bryde dråberne opnået ovenfor. Overfør derefter organoiderne sammen med mediet til et 15 ml centrifugerør og juster volumenet til 10 ml med koldt basalmedium. Supernatanten kasseres efter centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C
- Vask organoiderne med 10 ml koldt basalmedium igen. Resuspend organoiderne i 2 ml koldt basalmedium. Rør op og ned for at forskyde organoiderne i små stykker med en Pasteur-pipette.
- Der suppleres med basalsubstrat til et samlet volumen på 10 ml efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend de organoide fragmenter med kold kældermatrix, der er tilstrækkelig til at muliggøre en 1: 3 til 1: 5 ekspansion. Opbevares på is.
- Anbring 40 μL organoid suspension i hver brønd af en forvarmet 24-brøndplade. Kulturpladen inkuberes ved 37 °C i 10-15 min. Lad kældermatrixen størkne.
- Tilsæt 500 μL lungeorganoid ekspansionsmedium til hver brønd og inkuber i en cellekulturinkubator. Opdater mediet hver 3. dag. Passerer organoiderne hver 2. uge med et forhold på 1: 3 til 1: 5.
- Lungeorganoider passage med trypsinisering
BEMÆRK: Trypsinisering foretrækkes, når det er vanskeligt at skære lungeorganoiden i små stykker ved hjælp af en Pasteur-pipet, eller størrelsen af organoiderne er meget variabel, eller de efterfølgende eksperimenter kræver organoider af mere ensartet størrelse.- Lungeorganoiderne høstes som vist i trin 2.2.1. Resuspender organoiden i 1 ml dissociationsenzym og inkuberes i et 37 ° C vandbad i 3-5 minutter.
- Tilsæt 1 ml basalt medium til røret. Forskyd organoiderne mekanisk ved at pipettere organoiderne op og ned i små stykker ved hjælp af en Pasteur-pipet. Kontroller størrelsen på organoidstykker under et mikroskop ved 4x forstørrelse. Tilsæt derefter 40 μL FBS for at afslutte fordøjelsen.
BEMÆRK: Bestem størrelsen af organoidfragmenter under mikroskopet i henhold til det eksperimentelle arrangement. Hvis et eksperiment har brug for flere organoider eller organoider af mere ensartet størrelse, skal du forskyde organoider i mindre stykker eller endda enkeltceller. Derefter tager det længere tid, sandsynligvis 3 uger, før organoiderne er klar til eksperimentering. - Der fyldes op med basalsubstrat til et slutvolumen på 10 ml efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend organoidstykkerne i kold kældermatrix med et volumen, der er tilstrækkeligt til passage med et forhold på 1: 5-1: 10. Opbevares på is.
- Anbring 40 μL organoid suspension i hver brønd af en forvarmet 24-brøndplade. Kulturpladen inkuberes ved 37 °C i 10-15 min. Lad kældermatrixen størkne.
- Suppler med 500 μL lungeorganoid ekspansionsmedium pr. brønd og inkuberes i en cellekulturinkubator. Opdater udvidelsesmediet hver 3. dag. Passage organoiderne efter 2-3 uger.
BEMÆRK: Omkring 100 organoider er monteret i en 40 μL dråbe kældermatrix. Lungeorganoiderne vokser normalt bedre med en relativt høj celletæthed. Genindsæt organoiderne med en lavere celletæthed, hvis dråber opløses, eller de voksende organoider binder sig sammen på grund af den alt for høje celletæthed.
3. Proximal differentiering for at generere modne luftvejsorganoider
- Forbered proximalt differentieringsmedium (PD-medium) ved at supplere luftvæskeinterfacebastarmen med 1x luftvæskeinterfacetilskud, 1x vedligeholdelsestilskud til luftvæskegrænseflade, 4 μg / ml heparin, 1 μM hydrocortison, 10 μM Y-27632 og 10 μM DAPT (se materialetabel).
- 3D luftvejsorganoider
- Inkuber lungeorganoider i ekspansionsmediet i 7-10 dage efter passaging via mekanisk klipning. Udskift ekspansionsmediet med PD-mediet. Inkuber organoiderne i PD-mediet i 14 dage i en cellekulturinkubator.
- Kassér PD-mediet i hver brønd. Tilsæt cellelysatbuffer for at høste den differentierede luftvejsorganoid til RNA-ekstraktion og påvisning af cellulær genekspression ved RT-qPCR-assay.
- Alternativt inkuberes organoiderne ved 37 ° C i 60 minutter efter tilsætning af 10 mM EDTA for at adskille organoiderne i enkeltceller efterfulgt af flowcytometrianalyse for at undersøge cellepopulationer. Organoiderne er klar til forskellige eksperimentelle manipulationer.
- 2D luftvejsorganoid
- Forbered tilstrækkelige 3D lungeorganoider til 2D differentieringskultur. Der kræves i alt 1,3 x 105 og 4,5 x 105 celler til henholdsvis en 24-brønds permeabel støtteindsats og en 12-brønds permeabel støtteindsats.
- Efter at 3D lungeorganoider vokser i ekspansionsmediet i 2 uger, fordøjes organoiderne i enkeltceller og frø i 24-brønd og 12-brøndindsatser for at generere 2D luftvejsorganoider.
- Pre-inkubere indsatserne med basalmediet natten over i en cellekulturinkubator. Tilsæt 250 μL og 500 μL basalmedium i henholdsvis øverste og nederste kammer på en 24-brøndplade. For en 12-brønds plade tilsættes 500 μL og 1.000 μL basalmedium i henholdsvis øverste og nederste kammer.
- Høst 3D lungeorganoider som beskrevet i trin 2.2.1. Resuspender organoiderne med 1 ml dissociationsenzym og inkuberes i et 37 ° C vandbad i 3-5 minutter.
- Tilsæt 1 ml basalt medium til røret. Rør op og ned for at skære organoiderne i enkeltceller med en Pasteur-pipette og kontrollere cellerne under et mikroskop. Tilsæt derefter 40 μL FBS for at afslutte fordøjelsen.
- Cellerne filtreres gennem en 40 μm sil i et 50 ml centrifugerør. Overfør den filtrerede cellesuspension til et 15 ml rør. Der fyldes op med basalsubstrat til et samlet volumen på 10 ml efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspend pelleten, opsamlet fra 24 dråber (40 μL), i 1-2,5 ml lungeorganoid ekspansionsmedium afhængigt af celletætheden i dråberne. Tæl antallet af celler med en celletæller under et mikroskop. Cellekoncentrationen justeres til 1,3 x 106/ml (for indsatser med 24 brønde) eller 9 x 105/ml (for indsatser med 12 brønde).
- Fjern basalmediet fra de øverste og nederste kamre. Der tilsættes 500 μL og 1.000 μL ekspansionsmedium i bundkammeret i henholdsvis 24-brøndindsatsen og 12-brøndindsatsen. Frø 100 μL og 500 μL cellesuspension fremstillet i trin 3.3.7 på det apikale kammer i henholdsvis 24-brøndindsatsen og 12-brøndindsatsen.
- Inkuber i en cellekultur inkubator i 2 dage. Udskift ekspansionsmediet med PD-mediet i både apikalt og nederste kammer på pladerne. Inkuber organoiderne i cellekulturinkubator i 14 dage og opdater PD-mediet hver 3. dag.
BEMÆRK: Mobile cilier kan ses i 3D- og 2D-organoiderne under et mikroskop fra dag 7 efter inkubation i PD-mediet. Efter 14 dages differentieringskultur i PD-mediet er luftvejsorganoiderne modne til forskellige eksperimentelle manipulationer. - Mål transepitelial elektrisk modstand (TEER) hver anden dag ved hjælp af et elektrisk modstandsmålingssystem i overensstemmelse med en standardprotokol beskrevet i17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol muliggør afledning af humane lungeorganoider med en høj succesrate. Frisk humant lungevæv hakkes i små stykker og nedbrydes derefter med collagenase. De resulterende enkeltceller indlejres i kældermatrixen og inkuberes i lungeorganoidekspansionsmediet suppleret med en cocktail af nichefaktorer til udvækst af epitelstamceller (trin 1.1.2). Figur 1 viser mikrofotografiet af frisk isolerede lungeceller indlejret i reduceret vækstfaktor kældermembranmatrix Type 2 (BME; Figur 1A, til venstre). Cystiske organoider vises og forstørres over tid (figur 1A, højre). I mellemtiden gennemgår de ikke-relaterede celler celledød gradvist. Fibroblaster er til stede i kulturen under den første eller anden passage. Derefter indeholder kulturen udelukkende epitelorganoider, som er lungeorganoider afledt af epitelstamceller, der er til stede i det primære lungevæv. Disse lungeorganoider passeres hver 2-3 uge ved mekanisk klipning i et forhold på 1: 3 til 1: 5 eller ved trypsinisering i et forhold på 1: 5 til 1: 10 (trin 2.2-2.3). De repræsentative mikrofotografier af lungeorganoider efter den fjerde passage er vist i figur 1B. Efter mekanisk klipning danner de organoidfragmenter, der er indlejret i BME, cystiske domæner inden for et par timer (figur 1B, venstre). Et mikrofotografi af samme felt på dag 5 (figur 1B, til højre) viser organoider, der vokser over tid. Disse ekspanderende humane lungeorganoider har alle de fire store luftvejsepitelcelletyper, herunder ACCTUB + eller FOXJ1 + ciliated celle, P63 + basalcelle, CC10 + klubcelle og MUC5AC + bægercelle18 (figur 1C) i en for tidlig tilstand. Især kan disse humane lungeorganoider være fortløbende og stabilt passage i over 1 år. Når de opretholdes inden for kældermatrixen, viser lungeorganoider mest sandsynligt en apikal polaritet, mindre end 2% -3% af lungeorganoiderne viser en apikal polaritet13. Som et resultat er cellespidser ikke let tilgængelige, medmindre 3D-organoiderne skæres op.
Sammenlignet med det indfødte humane luftvejsepitelatel er disse langsigtede udvidelige lungeorganoider imidlertid ikke tilstrækkeligt modne, da den dominerende cellepopulation i det indfødte humane luftvejsepitel, cilieret celle, er underrepræsenteret i lungeorganoiden. Vi definerede derefter et proximal differentieringsmedium (PD) for at forbedre modningsstatus for humane lungeorganoider. Organoiderne inkuberet i ekspansionsmediet og PD-mediet udviklede særskilt morfologi over tid (figur 2A). Motile cilia var mere rigelige i organoiderne i PD-mediet end dem i ekspansionsmediet. Efter 2 ugers differentieringskultur i PD-mediet kan bevægelige cilier ses i hver enkelt organoid (figur 2B og supplerende video 1). Interessant nok driver de bankende cilier celleaffaldet og udskilles mucin inde i organoid lumen til at hvirvle ensrettet, hvilket tilstrækkeligt rekapitulerer den mucociliære rulletrappe for at fjerne de indåndede partikler (Supplerende video 1), en vigtig selvrensningsmekanisme i de menneskelige luftveje. Vi viser, at de cilierede celler steg dramatisk til omkring 50% i de differentierede organoider sammenlignet med de oprindelige lungeorganoider. For at vurdere procentdelene af fire typer epitelceller blev 2D-luftvejsorganoiderne analyseret ved flowcytometri. Kort fortalt blev organoiderne dissocieret med 10 mM EDTA i 60 minutter ved 37 ° C, fastgjort med 4% PFA og permeabiliseret med 0,1% overfladeaktivt stof. Derefter blev cellerne inkuberet med primære antistoffer (se materialetabel) i 1 time ved 4 °C efterfulgt af farvning med sekundære antistoffer. Et FACS-system blev brugt til at analysere prøverne. Flowcytometrianalysen viste differentierede organoider rummer fire luftvejsepitelcelletyper (figur 2C). Derfor udviklede vi en proksimal differentieringsprotokol til at generere luftvejsorganoider, der trofast kan simulere det menneskelige luftvejsepitelatel til et næsten fysiologisk niveau.
For at gøre det muligt for den organoide apikale overflade at være let tilgængelig og bedre modellere den menneskelige luftvejsepitels eksponering for respiratoriske patogener, genererede vi 2D-monolag af luftvejsorganoider. Efter 2 ugers differentieringskultur udviklede 2D-luftvejsorganoider en intakt epitelbarriere (figur 3A, B). Vi udførte også et dextran blokeringsassay for at vurdere integriteten af epitelbarriere dannet i 2D luftvejsorganoider. På dag 10 efter dyrkning i transwellindsatser blev fluoresceinisothiocyanat-dextran (MW 10.000) tilsat i mediet af det øverste kammer og inkuberet ved 37 °C i 4 timer. Medierne i de øverste og nederste kamre blev høstet til et fluorescensassay. Dextran blokeringsindeks refererer til fluorescensintensiteten af mediet i det øverste kammer versus det i det nederste kammer (figur 3B). Disse 2D luftvejsorganoider indeholder også rigelige cilierede celler (figur 3C). Cilierede celler blev mærket af anti-β-Tubulin IV antistof (ACCTUB) og ged anti-mus 488 sekundært antistof. Konfokale billeder blev erhvervet ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Flerkanalsbilleder blev erhvervet ved hjælp af laserne 405 nm for DAPI, 488 nm for ACCTUB og 633/640 nm for Phalloidin. Billeddannelsesparametre blev justeret i henhold til brugervejledningen til konfokalmikroskopet. Kort fortalt blev pinhole-størrelsen indstillet til 1 AU, masterforstærkningen blev indstillet til 650 V til 750 V med digital forstærkning på 1,0, og lasereffekten blev justeret for hver kanal inden for området 0,2% til 5%. Billedbehandling blev udført ved hjælp af den leverede analysesoftware.
Det menneskelige luftveje er foret med to forskellige typer epiteler, dvs. luftvejsepitelet og alveolær epitel. Førstnævnte linjer luftvejene fra næsehulen til den terminale bronchiole og består af fire hovedtyper af epitelceller, dvs. cilieret celle, bægercelle, klubcelle og basalcelle. Derudover viser luftvejsepitelet, der forer de proksimale og distale luftveje, en variabel cellulær sammensætning langs den proksimale-distale akse. Det proksimale luftvejsepitelet er pseudostratificeret, bestående af rigelige cilierede celler og slimudskillende bægerceller; der henviser til, at det distale luftvejsepitele er et enkelt lag af kuboidale cilierede og klubceller med mindre basale og bægerceller19. Humant lungevæv, der anvendes til udledning af lungeorganoider, er blevet indkøbt fra patienter, der gennemgik kirurgiske resektionsektioner på grund af forskellige sygdomme. Vi bruger normalt lungevæv ved siden af det syge væv til organoidkultur. Disse lungevæv indeholder typisk bronchioler af variabel størrelse omgivet af alveolære sække. Under den indledende kultur overlever luftvejsepitelstamceller eller luftvejsprogenitorceller i lungevævene og spredes på grund af nichefaktorerne i ekspansionsmediet. Ekspansionsmediet muliggør indledende afledning og langsigtet ekspansion af lungeorganoider ved at lede organoiderne mod en umoden tilstand, mens luftvejsdifferentieringsprotokollen genererer luftvejsorganoider, der fænokopierer det oprindelige luftvejsepitelement morfologisk og funktionelt. Modelsystemet, herunder afledning, ekspansion og differentiering af lungeorganoider, er skitseret i figur 4. Den cellulære sammensætning i det proksimale og distale luftvejsepitel er også illustreret i figur 4.
Figur 1: Afledning, ekspansion og karakterisering af humane lungeorganoider. (A) En repræsentativ mikrofotografi viser enkeltceller indlejret i kældermatrixen efter isolering fra lungevæv på dag 0 (venstre). På dag 5 vokser cystiske organoider (højre). Skala bar er 0,5 mm. (B) Et repræsentativt mikrofotografi af lungeorganoider på dagen for den fjerde passage og dag 5 efter passage. Vægtstang er 0,5 mm. P1 og P4 repræsenterer første og fjerde passage. Billederne blev taget med 10x forstørrelse. (C) Konfokale billeder af fire luftvejsepitelcelletyper i humane lungeorganoider. Fire afstamninger af luftvejsepitelceller er til stede i lungeorganoiderne, herunder ACCUB + og FOXJ1 + cilierede celler, P63 + basalceller, CC10 + klubceller og MUC5AC + bægerceller. Kerner og cellulære actinfilamenter er modmonteret med henholdsvis DAPI (blå) og Phalloidin-647 (lilla). Skala bar er 10 μm. Dette tal er vedtaget fra13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Proximal differentiering af humane lungeorganoider. (A) Humane lungeorganoider blev dyrket i PD-mediet eller ekspansionsmediet (Exp) parallelt i 16 dage. Bright-field mikrofotografier af organoider på de angivne dage er vist. Skalabjælke er 0,4 mm. (B) Cilia i de differentierede luftvejsorganoider vises (sort pil). Skalalinjen er 20 μm. (C) Procentdelene af individuelle celletyper i organoider inkuberet i PD-medium (øverst) og ekspansionsmedium (bund) som detekteret ved FACS-analyse. De repræsentative histogrammer af en organoid linje er vist. Eksperimentet blev udført i tre forskellige organoidlinjer. Dette tal er vedtaget fra13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Generering af 2D differentierede luftvejsorganoider. (A) Transepitel elektronisk resistens (TEER) blev målt på den angivne dag efter inkubation i PD-substratet. Data viser gennemsnitlige ± standardafvigelse (SD) for 2D-monolag i 10 indsatser. (B) På dag 10 efter dyrkning i permeable støtteplader blev fluoresceinisothiocyanat-dextran tilsat, og medierne i de øverste og nederste kamre blev høstet til et fluorescensassay efter 4 timer. Dextran blokeringsindeks refererer til fluorescensintensiteten af mediet i det øverste kammer versus det i det nederste kammer. Diameteren af permeable støtteindsatser, der anvendes i vores eksperiment, er 0,4 μm. Uden såning af celler kan dextran frit trænge ind i de normale 2D-indsatser. Således skal dextranblokeringsindekset for en normal 2D (linjen mærket med Blank) være 1. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SD på 10 indsatser podet med 2D luftvejsorganoider (2D organoid) og dem i to tomme indsatser (blank). (C) Konfokale billeder af rigelige ACCTUB + cilierede celler (grøn) i 2D luftvejsorganoider. Cellular actin filamenter er modmonteret med Phalloidin-647 (lilla). Skala bar er 20 μm. Dette tal er vedtaget fra13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk illustration af afledning, ekspansion og differentiering af humane lungeorganoider. Enkeltceller isoleret fra humant lungevæv er direkte indlejret i kældermatrixen og inkuberet i lungeorganoidudvidelsesmediet. De afledte humane lungeorganoider kan udvides på lang sigt med høj stabilitet og let genvindes fra kryopreserverede bestande. Ved differentiering kan de genererede luftvejsorganoider trofast simulere humant luftvejsepitelet. 2D og 3D luftvejsorganoider er blevet udviklet til forskellige eksperimentelle manipulationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1. De synkront slående cilier driver celleaffaldet til at hvirvle ensrettet i de differentierede luftvejsorganoider13. Denne video er blevet vedtaget fra13. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De menneskelige luftveje er foret med luftvejsepitelet, også kendt som det pseudostratificerede cilierede epitel. De vigtigste celletyper i det øvre luftvejsepitel er cilierede celler, der muliggør koordineret bevægelse af deres apikale cilier for at udvise slim og indåndede partikler fra luftvejene, bægerceller, der producerer og udskiller slim, og basalceller, der linjer kældermembranen og er impliceret i regenerering. I de små luftveje, såsom bronchioler, indeholder kuboidale luftvejsepitelet sekretoriske klubceller og færre cilierede celler end i de øvre luftvejsområder. Vi beskriver en robust protokol til at udlede humane lungeorganoider fra epitelstamcellerne i humant lungevæv. Disse humane lungeorganoider opretholdes i ekspansionsmediet og fortløbende passerer i over 1 år med høj stabilitet. Nøglevækstfaktorer i ekspansionsmediet inkluderer R-spondin, en Wnt-agonist20; og Noggin, som er en hæmmer af BMP-signalering21, samt FGF7 og FGF10. Tidligere undersøgelser har afsløret en afgørende rolle af Wnt, FGF og BMP signalering i homeostase af respiratorisk epitel 22,23,24. Ekspansionsmediet muliggør indledende afledning og langsigtet ekspansion af lungeorganoider ved at lede organoiderne mod en umoden tilstand. Vi videreudvikler en proksimal differentieringsmetode til at generere 3D- og 2D-luftvejsorganoider, der rummer fire store luftvejscelletyper og simulerer det menneskelige luftvejsepitel til et næsten fysiologisk niveau. Under hele proceduren, herunder indledende afledning, langsigtet ekspansion og proximal differentiering, kræves hverken kedelig cellerensning eller feeder og stromale celler. Således etablerer vi en organoid model af det menneskelige luftvejsepitelatel. De to faser af kultur, ekspansionskultur og differentieringskultur, udelukker hinanden. Lungeorganoiderne giver en stabil kilde til langsigtet ekspansion, mens differentierede luftvejsorganoider trofast phenocopy det menneskelige luftvejsepitelet. Disse organoider er modtagelige for forskellige eksperimentelle manipulationer, herunder billeddannelse, RNA-sekventering, flowcytometrianalyse, genetisk redigering osv.13,14,25,26,27.
For at sikre høj effektivitet til at udlede lungeorganoider skal ekspansionsmediet rekonstitueres nøjagtigt og omhyggeligt, hvilket er afgørende for den høje etableringshastighed, der er aktiveret af protokollen. En væsentlig begrænsning af denne organoidmodel er den rene epitelsammensætning, mangel på stromale celler og immunceller, der er til stede i den menneskelige luftvejsslimhinde, hvilket kan få luftvejsorganoiderne til at afvige fra det oprindelige luftvejsepitel til en vis grad. Således stræber vi efter at generere den næste generation af respiratoriske organoider ved at inkorporere immunceller og andre biologisk relevante komponenter i vores nuværende organoidmodel.
De luftvejsorganoider, vi etablerede, simulerer trofast den multicellulære sammensætning og funktionalitet af det indfødte humane respiratoriske epitel til et næsten fysiologisk niveau, hvilket er umuligt i homogene cellelinjer. Vores organoidmodeller gør det muligt for forskere at rekonstruere og stabilt udvide det indfødte menneskelige luftvejsepitele i kulturplader. Disse luftvejsorganoider er et universelt værktøj til at studere biologi og patologi i de menneskelige luftveje. Primære luftvejsepitelceller, der anvendes i forskningslaboratorier, kan ikke udvides på grund af den begrænsede replikative kapacitet og fungerer næppe som et reproducerbart og let tilgængeligt forskningsværktøj.
Organoider, herunder humane respiratoriske organoider, har afsløret deres unikke karakter og styrke til at studere humane patogener, herunder SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Som et universelt og fysiologisk aktivt værktøj kan humane lungeorganoider i vid udstrækning anvendes til at udforske biologi og patologi i det menneskelige luftveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J. Z., C.L. og M.C.C. er opført som opfindere på patentet på luftvejsorganoider (publikationsnr.: US-2021-0207081-A1). De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Center for PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Det Medicinske Fakultet, University of Hong Kong, for hjælp til konfokal billeddannelse og flowcytometri. Dette arbejde blev delvist støttet af midler fra Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) fra Food and Health Bureau; Forskningsrådets Generelle Forskningsfond (GRF, 17105420) og Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, regeringen i Hong Kong Special Administrative Region.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
References
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M.
- Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H.
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
