Summary
Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.
Abstract
Das Fehlen eines robusten In-vitro-Modells des menschlichen respiratorischen Epithels behindert das Verständnis der Biologie und Pathologie des Atmungssystems. Wir beschreiben ein definiertes Protokoll, um menschliche Lungenorganoide aus adulten Stammzellen im Lungengewebe abzuleiten und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um reife Atemwegsorganoide zu erzeugen. Die Lungenorganoide werden dann nacheinander für über 1 Jahr mit hoher Stabilität expandiert, während die differenzierten Atemwegsorganoide verwendet werden, um das menschliche Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau zu simulieren. Damit etablieren wir ein robustes Organoidmodell des menschlichen Atemwegsepithels. Die langfristige Expansion von Lungenorganoiden und differenzierten Atemwegsorganoiden erzeugt eine stabile und erneuerbare Quelle, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die menschlichen Atemwegsepithelzellen in Kulturschalen zu rekonstruieren und zu erweitern. Das Organoidsystem der menschlichen Lunge bietet ein einzigartiges und physiologisch aktives In-vitro-Modell für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Virus-Wirt-Interaktion, der Arzneimitteltests und der Krankheitsmodellierung.
Introduction
Organoide sind zu einem robusten und universellen Werkzeug für die In-vitro-Modellierung der Organentwicklung und das Studium von Biologie und Krankheit geworden. Bei der Kultivierung in einem wachstumsfaktordefinierten Kulturmedium können adulte Stammzellen (ASC) aus einer Vielzahl von Organen in 3-dimensionalen (3D) erweitert und selbst zu organähnlichen Zellclustern zusammengesetzt werden, die aus mehreren Zelltypen, sogenannten Organoiden, bestehen. Das Labor von Clevers berichtete 2009 über die Ableitung des ersten von ASC abgeleiteten Organoids, des menschlichen Darmorganoids, 1,2. Danach wurden ASC-abgeleitete Organoide für eine Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben etabliert, darunter Prostata 3,4, Leber5,6, Magen 7,8,9, Bauchspeicheldrüse 10, Brustdrüse 11 und Lunge 12,13 . Diese ASC-abgeleiteten Organoide behielten die kritischen zellulären, strukturellen und funktionellen Eigenschaften des nativen Organs bei und bewahrten die genetische und phänotypische Stabilität in der Langzeitexpansionskultur14,15.
Organoide können auch aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS)16. Während PSC-abgeleitete Organoide die Mechanismen der Organentwicklung für ihre Etablierung ausnutzen, können ASCs gezwungen werden, Organoide zu bilden, indem Bedingungen wieder aufgebaut werden, die die Stammzellnische während der physiologischen Gewebeselbsterneuerung oder Gewebereparatur nachahmen. PSC-abgeleitete Organoide sind günstige Modelle, um die Entwicklung und Organogenese zu erforschen, obwohl sie nicht in der Lage sind, den vergleichbaren Reifegrad von ASC-abgeleiteten Organoiden zu erreichen. Der fetale Reifungsstatus von PSC-abgeleiteten Organoiden und die Komplexität bei der Etablierung dieser Organoide verhindern im Wesentlichen ihre breiten Anwendungen für das Studium der Biologie und Pathologie in reifen Geweben.
Die menschlichen Atemwege, von der Nase bis zur terminalen Bronchiole, sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, auch pseudostratifiziertes Flimmerepithel genannt, das aus vier Hauptzelltypen besteht, d.h. Flimmerzelle, Kelchzelle, Basalzelle und Keulenzelle. Wir haben das von ASC abgeleitete humane Lungenorganoid aus menschlichem Lungengewebe in Zusammenarbeit mit dem Labor12,13 von Clevers etabliert. Diese Lungenorganoide werden im Expansionsmedium über ein Jahr lang nacheinander expandiert; Die genaue Dauer variiert zwischen verschiedenen Organoidlinien, die von verschiedenen Spendern erhalten wurden. Im Vergleich zum nativen Atemwegsepithel sind diese langfristig expandierbaren Lungenorganoide jedoch nicht reif genug, da Flimmerzellen, die Hauptzellpopulation in den menschlichen Atemwegen, in diesen Lungenorganoiden unterrepräsentiert sind. Daher entwickelten wir ein proximales Differenzierungsprotokoll und erzeugten 3D- und 2D-Atemwegsorganoide, die das Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau phänokopieren.
Hier stellen wir ein Videoprotokoll zur Verfügung, um menschliche Lungenorganoide aus dem primären Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Experimente mit menschlichem Gewebe wurden vom Institutional Review Board der University of Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 und UW21-695) genehmigt. Vor der Gewebeentnahme wurde von den Patienten eine Einwilligung nach Aufklärung eingeholt.
1. Ableitung des menschlichen Lungenorganoids
- Aufbereitung von Versuchsmaterialien
- Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie das fortgeschrittene DMEM/F12-Medium mit 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzen.
- Herstellung des humanen Lungenorganoid-Expansionsmediums durch Ergänzung des basalen Mediums mit 10% R-Spondin 1 konditioniertem Medium, 10% Noggin-konditioniertem Medium, 1x B27-Ergänzung, 1,25 mM N-Acetylcystein, 10 mM Nicotinamid, 5 μM Y-27632, 500 nM A-83-01, 1 μM SB202190, 5 ng/ml Fibroblstwachstumsfaktor (FGF)-7, 20 ng/ml FGF-10 und 100 μg/ml Primocin (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das konditionierte Medium R-Spondin 1 und Noggin kann durch kommerzielles rekombinantes R-Spondin 1 (500 ng/ml) und Noggin (100 ng/ml) ersetzt werden. - Vorwärmen Sie eine 24-Well-Suspensionskulturplatte in einem Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie einen Standard-Zellkultur-Inkubator mit 5% CO2 und befeuchteter Atmosphäre bei 37 °C. Kellermatrix in einem 4 °C Kühlschrank auftauen. Halten Sie die Kellermatrix und das Kulturmedium während des Experimentierens auf Eis.
- Zellisolierung aus menschlichem Lungengewebe für 3D-Organoidkultur
- Beschaffen Sie frisch reseziertes menschliches Lungengewebe mit einer Größe von etwa 0,5 cm von Patienten, die sich aufgrund verschiedener Krankheiten einer chirurgischen Resektion unterziehen. Transportieren Sie das Lungengewebe in 30 ml Basalmedium bei Raumtemperatur und verarbeiten Sie es so schnell wie möglich in einer Biosicherheitshaube.
- Lungengewebe in kleine Stücke (0,5-1 mm) mit einem sterilen Skalpell in einer 10 cm Zellkulturschale zerkleinern. Waschen Sie Gewebestücke mit 10 ml kaltem Basalmedium in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 8 ml basalem Medium, ergänzt mit Kollagenase in einer Endkonzentration von 2 mg/ml. Verdauen Sie die Gewebestücke, indem Sie das Rohr bei 120 U / min für 30-40 min bei 37 ° C schütteln.
- Pipette 20x auf und ab, um die verdauten Gewebestücke mit einer serologischen 10-ml-Pipette zu scheren. Stapeln Sie ein 100-μm-Sieb auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und filtern Sie die Suspension.
- Gewebestücke auf dem Sieb mit dem Basalmedium bergen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen, gefolgt von einer zweiten Runde Scheren und Filtern. Eine zusätzliche Scherfilterung kann 1x-2x durchgeführt werden, um mehr Zellen zu isolieren, insbesondere wenn ein kleines Stück Gewebe (z. B. <0,5 cm) beschafft wird.
- Fügen Sie dem Durchfluss FBS mit einer Endkonzentration von 2% hinzu, um die Verdauung zu beenden, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
- Resuspendiert das Zellpellet in 10 ml Basalmedium, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
- (Optional) Wenn viele Erythrozyten im Pellet zu sehen sind (geschätzt durch die Farbe des Pellets), suspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min. Dann 10 ml Basalmedium in das Röhrchen geben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
- Schwebe das Pellet in kalter Kellermatrix und halte es auf Eis. Fügen Sie 80-160 μL Kellermatrix für Zellen hinzu, die aus einem Lungengewebe von einer Größe von etwa 0,5 cm gewonnen werden; Die Menge reicht aus, um 2-4 Tröpfchen zu säen.
- Geben Sie 40 μL Suspension auf jede Vertiefung einer vorerwärmten 24-Well-Suspensionskulturplatte ab. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren, um ein Tröpfchen zu bilden.
- Fügen Sie 500 μL humanes Lungenorganoid-Expansionsmedium, ergänzt mit 5 nM Heregulin beta-1, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator.
- Aktualisieren Sie das Medium alle 3 Tage. Entfernen Sie das alte Medium, während Sie das Tröpfchen intakt halten, und fügen Sie mit Vorsicht frisches Medium hinzu. Passage der Organoide nach der Inkubation für 10-14 Tage. Verwenden Sie Heregulin beta-1 nur in der Anfangskultur vor der ersten Passage.
- Beobachten Sie die Organoide unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Organoide nicht mit einer sehr hohen Zelldichte eingebettet sind. Wenn ein Tröpfchen aufgrund einer zu hohen Zelldichte zerfällt, erholen Sie sich und betten Sie die Organoide und Zellen mit einem höheren Volumen der Kellermatrix wieder ein, um mehr Tröpfchen mit einer niedrigeren und wünschenswerten Zelldichte herzustellen.
2. Expansion menschlicher Lungenorganoide
- Bereiten Sie eine Pasteur-Pipette vor, indem Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette auf eine Flamme, z. B. einen Bunsenbrenner, brennen, um die Öffnung von 1,5 mm auf etwa 1,0 mm Durchmesser zu verengen. Kühlen Sie die Pipetten ab, gefolgt von Autoklavieren zum Sterilisieren. Befeuchten Sie die Pipetten mit dem basalen Medium, um Zellanlagerungen und -verluste beim mechanischen Scheren zu vermeiden.
- Passage von Lungenorganoiden mit mechanischer Scherung
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spitze und eine Pipette auf und ab, um die oben erhaltenen Tröpfchen zu brechen. Übertragen Sie dann die Organoide zusammen mit dem Medium auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen mit kaltem Basalmedium auf 10 ml ein. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C
- Waschen Sie die Organoide noch einmal mit 10 ml kaltem Basalmedium. Resuspendieren Sie die Organoide in 2 ml kaltem Basalmedium. Pipette auf und ab, um die Organoide mit einer Pasteur-Pipette in kleine Stücke zu scheren.
- Ergänzung mit basalem Medium auf ein Gesamtvolumen von 10 ml, gefolgt von Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Suspendieren Sie die Organoidfragmente mit einer kalten Basalmatrix, die ausreicht, um eine 1:3- bis 1:5-Expansion zu ermöglichen. Bleiben Sie auf Eis.
- Legen Sie 40 μL Organoidsuspension in jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren.
- Fügen Sie 500 μL Lungenorganoid-Expansionsmedium zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Aktualisieren Sie das Medium alle 3 Tage. Passage der Organoide alle 2 Wochen mit einem Verhältnis von 1:3 bis 1:5.
- Passage von Lungenorganoiden mit Trypsinisierung
HINWEIS: Die Trypsinisierung wird bevorzugt, wenn es schwierig ist, das Lungenorganoid mit einem Pasteur-Pipett in kleine Stücke zu scheren, oder wenn die Größe der Organoide sehr variabel ist oder die nachfolgenden Experimente Organoide von gleichmäßigerer Größe erfordern.- Die Lungenorganoide werden wie in Schritt 2.2.1 gezeigt geerntet. Resuspendieren Sie das Organoid in 1 ml Dissoziationsenzym und inkubieren Sie es in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 3-5 min.
- Fügen Sie 1 ml Basalmedium in die Röhre hinzu. Scheren Sie die Organoide mechanisch, indem Sie die Organoide mit einem Pasteur-Pipett in kleine Stücke auf und ab pipettieren. Überprüfen Sie die Größe der Organoidstücke unter einem Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung. Fügen Sie dann 40 μL FBS hinzu, um die Verdauung zu beenden.
HINWEIS: Bestimmen Sie die Größe der Organoidfragmente unter dem Mikroskop entsprechend der Versuchsanordnung. Wenn ein Experiment mehr Organoide oder Organoide von gleichmäßigerer Größe benötigt, scheren Sie Organoide in kleinere Stücke oder sogar einzelne Zellen. Dann dauert es länger, wahrscheinlich 3 Wochen, bis die Organoide zum Experimentieren bereit sind. - Mit basalem Medium auf ein Endvolumen von 10 ml auffüllen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Suspendieren Sie die Organoidstücke in kalter Kellermatrix mit einem Volumen, das ausreicht, um mit einem Verhältnis von 1: 5-1: 10 zu passieren. Bleiben Sie auf Eis.
- Legen Sie 40 μL Organoidsuspension in jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Platte. Die Kulturplatte bei 37 °C für 10-15 min inkubieren. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren.
- Ergänzen Sie mit 500 μL Lungenorganoid-Expansionsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Aktualisieren Sie das Erweiterungsmedium alle 3 Tage. Passage der Organoide nach 2-3 Wochen.
HINWEIS: Etwa 100 Organoide sind in einem 40-μL-Tropfen der Kellermatrix montiert. Die Lungenorganoide wachsen normalerweise besser mit einer relativ hohen Zelldichte. Betten Sie die Organoide mit einer geringeren Zelldichte wieder ein, wenn Tröpfchen zerfallen oder die wachsenden Organoide aufgrund der zu hohen Zelldichte aneinander anhaften.
3. Proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide
- Bereiten Sie das proximale Differenzierungsmedium (TE-Medium) vor, indem Sie das basale Medium der Luft-Flüssigkeitsschnittstelle mit 1x Luftflüssigkeitsschnittstellenergänzung, 1x Luftflüssigkeitsschnittstellen-Erhaltungsergänzung, 4 μg / ml Heparin, 1 μM Hydrocortison, 10 μM Y-27632 und 10 μM DAPT (siehe Materialtabelle) ergänzen.
- 3D-Atemwegsorganoide
- Inkubieren Sie Lungenorganoide im Expansionsmedium für 7-10 Tage nach dem Passieren durch mechanische Scherung. Ersetzen Sie das Expansionsmedium durch das PD-Medium. Inkubieren Sie die Organoide im PD-Medium für 14 Tage in einem Zellkultur-Inkubator.
- Verwerfen Sie das PD-Medium in jedem Bohrloch. Fügen Sie Zelllysatpuffer hinzu, um das differenzierte Atemwegsorganoid für die RNA-Extraktion und den Nachweis der zellulären Genexpression durch RT-qPCR-Assay zu ernten.
- Alternativ können die Organoide bei 37 °C für 60 min nach Zugabe von 10 mM EDTA inkubiert werden, um die Organoide in einzelne Zellen zu zerlegen, gefolgt von einer Durchflusszytometrie-Analyse, um die Zellpopulationen zu untersuchen. Die Organoide sind bereit für verschiedene experimentelle Manipulationen.
- 2D-Atemwegsorganoid
- Bereiten Sie ausreichend 3D-Lungenorganoide für die 2D-Differenzierungskultur vor. Insgesamt werden 1,3 x 10 5 und 4,5 x 105 Zellen für einen 24-Well-Permeable-Stützeinsatz bzw. einen 12-Well-Permeable-Stützeinsatz benötigt.
- Nachdem 3D-Lungenorganoide 2 Wochen lang im Expansionsmedium gewachsen sind, verdauen Sie die Organoide in einzelne Zellen und kernen Sie sie in die 24-Well- und 12-Well-Einsätze, um 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.
- Die Einsätze mit dem basalen Medium über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator vorbrüten. Fügen Sie 250 μL bzw. 500 μL Basalmedium in die obere und untere Kammer einer 24-Well-Platte hinzu. Für eine 12-Well-Platte fügen Sie 500 μL bzw. 1.000 μL Basalmedium in der oberen bzw. unteren Kammer hinzu.
- 3D-Lungenorganoide wie in Schritt 2.2.1 beschrieben ernten. Resuspendieren Sie die Organoide mit 1 ml Dissoziationsenzym und inkubieren Sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 3-5 min.
- Fügen Sie 1 ml Basalmedium in die Röhre hinzu. Pipettieren Sie nach oben und unten, um die Organoide mit einer Pasteur-Pipette in einzelne Zellen zu scheren, und überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Fügen Sie dann 40 μL FBS hinzu, um die Verdauung zu beenden.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 40 μm Sieb in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die gefilterte Zellsuspension in eine 15-ml-Röhre. Nachfüllen mit basalem Medium auf ein Gesamtvolumen von 10 ml, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
- Resuspendiert das Pellet, das aus 24 Tröpfchen (40 μL) gesammelt wird, in 1-2,5 ml Lungenorganoid-Expansionsmedium, abhängig von der Zelldichte in den Tröpfchen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler unter einem Mikroskop. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1,3 x 106/ml (für 24-Well-Einsätze) oder 9 x 105/mL (für 12-Well-Einsätze) ein.
- Entfernen Sie das Basalmedium aus der oberen und unteren Kammer. Fügen Sie 500 μL bzw. 1.000 μL Expansionsmedium in der unteren Kammer des 24-Well-Einsatzes bzw. des 12-Well-Einsatzes hinzu. Seed 100 μL und 500 μL Zellsuspension in Schritt 3.3.7 auf die apikale Kammer des 24-Well-Inserts bzw. des 12-Well-Inserts.
- Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator für 2 Tage. Ersetzen Sie das Expansionsmedium durch das PD-Medium sowohl in der apikalen als auch in der unteren Kammer der Platten. Inkubieren Sie die Organoide im Zellkultur-Inkubator für 14 Tage und erfrischen Sie das PD-Medium alle 3 Tage.
HINWEIS: Mobile Zilien sind in den 3D- und 2D-Organoiden unter dem Mikroskop ab Tag 7 nach der Inkubation im PD-Medium erkennbar. Nach 14 Tagen Differenzierungskultur im PD-Medium sind die Atemwegsorganoide reif für verschiedene experimentelle Manipulationen. - Messen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) jeden zweiten Tag mit einem elektrischen Widerstandsmesssystem gemäß einem in17 beschriebenen Standardprotokoll.
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Representative Results
Dieses Protokoll ermöglicht die Ableitung menschlicher Lungenorganoide mit hoher Erfolgsquote. Frisches menschliches Lungengewebe wird in kleine Stücke zerkleinert und dann mit Kollagenase zersetzt. Die resultierenden Einzelzellen werden in die Basalmatrix eingebettet und im Lungenorganoid-Expansionsmedium inkubiert, ergänzt durch einen Cocktail von Nischenfaktoren für das Auswachsen von epithelialen Stammzellen (Schritt 1.1.2). Abbildung 1 zeigt die Mikrofotografie von frisch isolierten Lungenzellen, eingebettet in die Basalmembranmatrix Typ 2 (BME; Abbildung 1A, links). Zystische Organoide treten auf und vergrößern sich im Laufe der Zeit (Abbildung 1A, rechts). Währenddessen erleiden die nicht verwandten Zellen allmählich den Zelltod. Fibroblasten sind während der ersten oder zweiten Passage in der Kultur vorhanden. Danach enthält die Kultur ausschließlich epitheliale Organoide, bei denen es sich um Lungenorganoide handelt, die aus epithelialen Stammzellen gewonnen werden, die in den primären Lungengeweben vorhanden sind. Diese Lungenorganoide werden alle 2-3 Wochen durch mechanische Scherung im Verhältnis 1:3 bis 1:5 oder durch Trypsinisierung im Verhältnis 1:5 bis 1:10 (Schritte 2.2-2.3) durchgelassen. Die repräsentativen Mikroaufnahmen von Lungenorganoiden nach der vierten Passage sind in Abbildung 1B dargestellt. Nach der mechanischen Scherung bilden die in BME eingebetteten Organoidfragmente innerhalb weniger Stunden zystische Domänen (Abbildung 1B, links). Eine Mikrofotografie desselben Feldes am Tag 5 (Abbildung 1B, rechts) zeigt Organoide, die im Laufe der Zeit wachsen. Diese expandierenden menschlichen Lungenorganoide beherbergen alle vier wichtigsten Epithelzelltypen der Atemwege, einschließlich ACCTUB+ oder FOXJ1+ Flimmerzelle, P63+ Basalzelle, CC10+ Clubzelle und MUC5AC+Becherzelle 18 (Abbildung 1C), in einem vorzeitigen Zustand. Insbesondere können diese menschlichen Lungenorganoide über 1 Jahr lang nacheinander und stabil durchgangen werden. Wenn sie innerhalb der Basalmatrix gehalten werden, zeigen Lungenorganoide am ehesten eine apikal-in-Polarität, weniger als 2%-3% der Lungenorganoide zeigen eine apikal-austretende Polarität13. Infolgedessen sind Zellspitzen nicht leicht zugänglich, es sei denn, die 3D-Organoide werden aufgeschoren.
Im Vergleich zum einheimischen menschlichen Atemwegsepithel sind diese langfristig expandierbaren Lungenorganoide jedoch nicht ausreichend ausgereift, da die dominante Zellpopulation im einheimischen menschlichen Atemwegsepithel, die Flimmerzelle, im Lungenorganoid unterrepräsentiert ist. Wir definierten dann ein proximales Differenzierungsmedium (PD), um den Reifungsstatus menschlicher Lungenorganoide zu verbessern. Die im Expansionsmedium inkubierten Organoide und das PD-Medium entwickelten im Laufe der Zeit eine ausgeprägte Morphologie (Abbildung 2A). Bewegliche Zilien waren in den Organoiden im PD-Medium häufiger als in denen im Expansionsmedium. Nach 2 Wochen Differenzierungskultur im PD-Medium sind in jedem einzelnen Organoid bewegliche Zilien erkennbar (Abbildung 2B und ergänzendes Video 1). Interessanterweise treiben die schlagenden Zilien die Zelltrümmer und den ausgeschiedenen Mucin im Organoidlumen dazu, unidirektional zu wirbeln, was die mukoziliäre Rolltreppe angemessen rekapituliert, um die eingeatmeten Partikel zu entfernen (Ergänzendes Video 1), ein wichtiger Selbstreinigungsmechanismus der menschlichen Atemwege. Wir zeigen, dass die Flimmerzellen in den differenzierten Organoiden im Vergleich zu den ursprünglichen Lungenorganoiden dramatisch auf etwa 50% angestiegen sind. Um die Prozentsätze von vier Arten von Epithelzellen zu beurteilen, wurden die 2D-Atemwegsorganoide mittels Durchflusszytometrie analysiert. Kurz gesagt, die Organoide wurden mit 10 mM EDTA für 60 min bei 37 °C dissoziiert, mit 4% PFA fixiert und mit 0,1% Tensid permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen mit primären Antikörpern (siehe Materialtabelle) für 1 h bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Färbung mit sekundären Antikörpern. Zur Analyse der Proben wurde ein FACS-System eingesetzt. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass differenzierte Organoide vier Epithelzelltypen der Atemwege aufnehmen (Abbildung 2C). Daher haben wir ein proximales Differenzierungsprotokoll entwickelt, um Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel bis zu einem nahezu physiologischen Niveau originalgetreu simulieren können.
Damit die apikale Oberfläche des Organoids leicht zugänglich ist und die Exposition des menschlichen Atemwegsepithels gegenüber respiratorischen Krankheitserregern besser modelliert werden kann, haben wir 2D-Monoschichten von Atemwegsorganoiden erzeugt. Nach 2 Wochen Differenzierungskultur entwickelten 2D-Atemwegsorganoide eine intakte Epithelbarriere (Abbildung 3A,B). Wir führten auch einen Dextran-Blockade-Assay durch, um die Integrität der Epithelbarriere zu beurteilen, die in 2D-Atemwegsorganoiden gebildet wird. Am Tag 10 nach der Kultur in Transwell-Einsätzen wurde Fluorescein Isothiocyanat-Dextran (MW 10.000) in das Medium der oberen Kammer gegeben und bei 37 °C für 4 h inkubiert. Die Medien in der oberen und unteren Kammer wurden für einen Fluoreszenztest geerntet. Der Dextran-Blockadeindex bezieht sich auf die Fluoreszenzintensität des Mediums in der oberen Kammer im Vergleich zu der in der unteren Kammer (Abbildung 3B). Diese 2D-Atemwegsorganoide enthalten auch reichlich Cilienzellen (Abbildung 3C). Ciliated Zellen wurden durch Anti-β-Tubulin-IV-Antikörper (ACCTUB) und Ziegen-Anti-Maus-488-Sekundärantikörper markiert. Konfokale Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Mehrkanalbilder wurden mit den Lasern 405 nm für DAPI, 488 nm für ACCCTUB und 633/640 nm für Phalloidin aufgenommen. Die Bildgebungsparameter wurden gemäß der Bedienungsanleitung des konfokalen Mikroskops angepasst. Kurz gesagt, die Lochgröße wurde auf 1 AU eingestellt, die Masterverstärkung auf 650 V bis 750 V mit einer digitalen Verstärkung von 1,0 eingestellt und die Laserleistung wurde für jeden Kanal im Bereich von 0,2% bis 5% eingestellt. Die Bildverarbeitung erfolgte unter Verwendung der mitgelieferten Analysesoftware.
Die menschlichen Atemwege sind mit zwei verschiedenen Arten von Epithelen ausgekleidet, nämlich Atemwegsepithel und Alveolarepithel. Ersteres säumt die Atemwege von der Nasenhöhle zur terminalen Bronchiole und besteht aus vier Haupttypen von Epithelzellen, d.h. Flimmerzelle, Kelchzelle, Keulenzelle und Basalzelle. Darüber hinaus zeigt das Atemwegsepithel, das die proximalen und distalen Atemwege auskleidet, eine variable zelluläre Zusammensetzung entlang der proximal-distalen Achse. Das proximale Atemwegsepithel ist pseudostratifiziert und besteht aus reichlich vorhandenen Flimmerzellen und schleimsezernierenden Kelchzellen; während das distale Atemwegsepithel eine einzelne Schicht von quaderförmigen Flimmer- und Keulenzellen mit weniger Basal- und Kelchzellenist 19. Menschliches Lungengewebe, das zur Ableitung von Lungenorganoiden verwendet wird, wurde von Patienten bezogen, die sich aufgrund verschiedener Krankheiten chirurgischen Resektionen unterzogen haben. Wir verwenden normales Lungengewebe neben dem erkrankten Gewebe für die Organoidkultur. Diese Lungengewebe enthalten typischerweise Bronchiolen unterschiedlicher Größe, die von Alveolarsäcken umgeben sind. Während der Anfangskultur überleben und vermehren sich Epithelstammzellen der Atemwege oder Vorläuferzellen der Atemwege im Lungengewebe aufgrund der Nischenfaktoren im Expansionsmedium. Das Expansionsmedium ermöglicht die anfängliche Ableitung und langfristige Expansion von Lungenorganoiden, indem es die Organoide in einen unreifen Zustand lenkt, während das Atemwegsdifferenzierungsprotokoll Atemwegsorganoide erzeugt, die das native Atemwegsepithel morphologisch und funktionell phänokopieren. Das Modellsystem, einschließlich der Ableitung, Expansion und Differenzierung von Lungenorganoiden, ist in Abbildung 4 dargestellt. Die zelluläre Zusammensetzung im proximalen und distalen Atemwegsepithel ist ebenfalls in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 1: Ableitung, Expansion und Charakterisierung menschlicher Lungenorganoide . (A) Eine repräsentative Mikrofotografie zeigt einzelne Zellen, die nach der Isolierung aus Lungengewebe am 0. Tag in die Basalmatrix eingebettet sind (links). An Tag 5 wachsen zystische Organoide (rechts). Der Maßstabsbalken beträgt 0,5 mm. (B) Eine repräsentative Mikrofotografie von Lungenorganoiden am Tag der vierten Passage und am Tag 5 nach der Passage. Die Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. P1 und P4 stellen die erste und vierte Passage dar. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. (C) Konfokale Bilder von vier Epithelzelltypen der Atemwege in menschlichen Lungenorganoiden. Vier Linien von Atemwegsepithelzellen sind in den Lungenorganoiden vorhanden, darunter ACCUB+ und FOXJ1+ Flimmerzellen, P63+ Basalzellen, CC10+ Clubzellen und MUC5AC+ Becherzellen. Kerne und zelluläre Aktinfilamente werden mit DAPI (blau) bzw. Phalloidin-647 (violett) konterkariert. Der Skalenbalken beträgt 10 μm. Diese Zahl wurde von13 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Proximale Differenzierung menschlicher Lungenorganoide. (A) Menschliche Lungenorganoide wurden 16 Tage lang parallel im PD-Medium oder im Expansionsmedium (Exp) kultiviert. Hellfeld-Mikrofotografien von Organoiden an den angegebenen Tagen werden gezeigt. Der Maßstabsbalken beträgt 0,4 mm. (B) Zilien in den differenzierten Atemwegsorganoiden sind dargestellt (schwarzer Pfeil). Der Skalenbalken beträgt 20 μm. (C) Die Prozentsätze der einzelnen Zelltypen in Organoiden, die in PD-Medium (oben) und Expansionsmedium (unten) inkubiert wurden, wie durch FACS-Analyse nachgewiesen. Es werden die repräsentativen Histogramme einer Organoidlinie gezeigt. Das Experiment wurde in drei verschiedenen Organoidlinien durchgeführt. Diese Zahl wurde von13 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Erzeugung von 2D-differenzierten Atemwegsorganoiden. (A) Der transepitheliale elektronische Widerstand (TEER) wurde am angegebenen Tag nach der Inkubation im PD-Medium gemessen. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von 2D-Monolayern in 10 Einsätzen. (B) Am Tag 10 nach der Kultur in durchlässigen Stützplatten wurde Fluorescein Isothiocyanat-Dextran zugegeben und die Medien in der oberen und unteren Kammer wurden für einen Fluoreszenztest nach 4 h geerntet. Der Dextran-Blockadeindex bezieht sich auf die Fluoreszenzintensität des Mediums in der oberen Kammer im Vergleich zu der in der unteren Kammer. Der Durchmesser der in unserem Experiment verwendeten durchlässigen Stützeinsätze beträgt 0,4 μm. Ohne Zellen auszusäen, kann das Dextran die normalen 2D-Einsätze frei durchdringen. Daher sollte der Dextran-Blockierungsindex eines normalen 2D (der mit Blank beschriftete Balken) 1 sein. Die Daten stellen den mittleren ± SD von 10 Einsätzen dar, die mit 2D-Atemwegsorganoiden (2D-Organoid) und solchen in zwei leeren Einsätzen (leer) gesät sind. (C) Konfokale Bilder von reichlich ACCTUB+ befeuerten Zellen (grün) in 2D-Atemwegsorganoiden. Zelluläre Aktinfilamente werden mit Phalloidin-647 (violett) konterkariert. Der Skalenbalken beträgt 20 μm. Diese Zahl wurde von13 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Ableitung, Expansion und Differenzierung menschlicher Lungenorganoide. Einzelzellen, die aus menschlichem Lungengewebe isoliert wurden, werden direkt in die Basalmatrix eingebettet und im Lungenorganoid-Expansionsmedium inkubiert. Die abgeleiteten menschlichen Lungenorganoide können langfristig mit hoher Stabilität expandiert und leicht aus kryokonservierten Beständen gewonnen werden. Bei der Differenzierung können die erzeugten Atemwegsorganoide das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu simulieren. 2D- und 3D-Atemwegsorganoide wurden für verschiedene experimentelle Manipulationen entwickelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzendes Video 1. Die synchron schlagenden Zilien treiben die Zelltrümmer dazu, in den differenzierten Atemwegsorganoiden13 unidirektional zu wirbeln. Dieses Video wurde von13 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die menschlichen Atemwege sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, das auch als pseudostratifiziertes Flimmerepithel bekannt ist. Die Hauptzelltypen des Epithels der oberen Atemwege sind Flimmerzellen, die die koordinierte Bewegung ihrer apikalen Zilien ermöglichen, um Schleim und eingeatmete Partikel aus den Atemwegen auszustoßen, Becherzellen, die Schleim produzieren und absondern, und Basalzellen, die die Basalmembran auskleiden und an der Regeneration beteiligt sind. In den kleinen Atemwegen wie den Bronchiolen enthält das quaderförmige Atemwegsepithel sekretorische Clubzellen und weniger Flimmerzellen als in den oberen Atemwegsregionen. Wir beschreiben ein robustes Protokoll zur Ableitung menschlicher Lungenorganoide aus den epithelialen Stammzellen im menschlichen Lungengewebe. Diese menschlichen Lungenorganoide werden im Expansionsmedium erhalten und über 1 Jahr lang mit hoher Stabilität nacheinander durchgelassen. Zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren im Expansionsmedium gehören R-Spondin, ein Wnt-Agonist20; und Noggin, ein Inhibitor der BMP-Signalgebung21, sowie FGF7 und FGF10. Frühere Studien haben eine entscheidende Rolle der Wnt-, FGF- und BMP-Signalgebung bei der Homöostase des respiratorischen Epithels 22,23,24 gezeigt. Das Expansionsmedium ermöglicht die anfängliche Ableitung und langfristige Expansion von Lungenorganoiden, indem es die Organoide in einen unreifen Zustand lenkt. Wir entwickeln eine proximale Differenzierungsmethode weiter, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die vier Hauptzelltypen der Atemwege aufnehmen und das menschliche Atemwegsepithel auf einer nahezu physiologischen Ebene simulieren. Während des gesamten Verfahrens, einschließlich der anfänglichen Ableitung, der Langzeitexpansion und der proximalen Differenzierung, sind weder eine langwierige Zellreinigung noch Feeder- und Stromazellen erforderlich. So etablieren wir ein organoides Modell des menschlichen Atemwegsepithels. Die beiden Phasen der Kultur, Expansionskultur und Differenzierungskultur, schließen sich gegenseitig aus. Die Lungenorganoide bieten eine stabile Quelle für eine langfristige Ausdehnung, während differenzierte Atemwegsorganoide das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren. Diese Organoide sind für verschiedene experimentelle Manipulationen zugänglich, einschließlich Bildgebung, RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse, genetische Bearbeitung usw. 13,14,25,26,27.
Um eine hohe Effizienz bei der Ableitung von Lungenorganoiden zu gewährleisten, muss das Expansionsmedium genau und akribisch rekonstituiert werden, was für die durch das Protokoll ermöglichte hohe Etablierungsrate unerlässlich ist. Eine wesentliche Einschränkung dieses Organoidmodells ist die reine Epithelzusammensetzung, das Fehlen von Stromazellen und Immunzellen, die in der menschlichen Atemwegsschleimhaut vorhanden sind, was dazu führen kann, dass die Atemwegsorganoide bis zu einem gewissen Grad vom nativen Atemwegsepithel abweichen. Daher streben wir danach, die nächste Generation von Atemwegsorganoiden zu erzeugen, indem wir Immunzellen und andere biologisch relevante Komponenten in unser aktuelles Organoidmodell integrieren.
Die von uns etablierten Atemwegsorganoide simulieren originalgetreu die multizelluläre Zusammensetzung und Funktionalität des einheimischen menschlichen Atemwegsepithels auf einem nahezu physiologischen Niveau, was in homogenen Zelllinien unmöglich ist. Unsere Organoid-Modelle ermöglichen es Wissenschaftlern, das native menschliche Atemwegsepithel in Kulturplatten zu rekonstruieren und stabil zu erweitern. Diese Atemwegsorganoide sind ein universelles Werkzeug, um die Biologie und Pathologie der menschlichen Atemwege zu untersuchen. Primäre Atemwegsepithelzellen, die in Forschungslabors verwendet werden, sind aufgrund der begrenzten Replikationskapazität nicht erweiterbar und dienen kaum als reproduzierbares und leicht zugängliches Forschungswerkzeug.
Organoide, einschließlich humaner Atemwegsorganoide, haben ihre Einzigartigkeit und Stärke für die Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, einschließlich SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34, offenbart. Als universelles und physiologisch-aktives Werkzeug können menschliche Lungenorganoide umfassend genutzt werden, um die Biologie und Pathologie der menschlichen Atemwege zu erforschen.
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Disclosures
J. Z., C.L. und M.C.C. sind als Erfinder des Patents der Atemwegsorganoide aufgeführt (Publikationsnummer: US-2021-0207081-A1). Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Wir danken dem Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus dem Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) des Food and Health Bureau unterstützt; General Research Fund (GRF, 17105420) des Research Grants Council; und Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, die Regierung der Sonderverwaltungszone Hongkong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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