Summary
Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane.
Abstract
La mancanza di un robusto modello in vitro dell'epitelio respiratorio umano ostacola la comprensione della biologia e della patologia dell'apparato respiratorio. Descriviamo un protocollo definito per derivare organoidi polmonari umani da cellule staminali adulte nel tessuto polmonare e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree. Gli organoidi polmonari vengono poi espansi consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree vengono utilizzati per simulare morfologicamente e funzionalmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Pertanto, stabiliamo un robusto modello organoide dell'epitelio delle vie aeree umane. L'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari e degli organoidi differenziati delle vie aeree genera una fonte stabile e rinnovabile, consentendo agli scienziati di ricostruire ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree umane nei piatti di coltura. Il sistema organoide polmonare umano fornisce un modello in vitro unico e fisiologicamente attivo per varie applicazioni, tra cui lo studio dell'interazione virus-ospite, test antidroga e modellazione della malattia.
Introduction
Gli organoidi sono diventati uno strumento robusto e universale per la modellazione in vitro dello sviluppo degli organi e lo studio della biologia e delle malattie. Quando coltivate in un terreno di coltura definito dal fattore di crescita, le cellule staminali adulte (ASC) da una varietà di organi possono essere espanse in 3 dimensioni (3D) e auto-assemblate in cluster cellulari simili a organi composti da più tipi di cellule, denominati organoidi. Il laboratorio di Clevers ha riportato la derivazione del primo organoide derivato dall'ASC, organoide intestinale umano, nel 2009 1,2. Successivamente, gli organoidi derivati dall'ASC sono stati stabiliti per una varietà di organi e tessuti umani, tra cui prostata 3,4, fegato 5,6, stomaco 7,8,9, pancreas10, ghiandola mammaria11 e polmone 12,13 . Questi organoidi derivati dall'ASC hanno mantenuto le proprietà cellulari, strutturali e funzionali critiche dell'organo nativo e hanno mantenuto la stabilità genetica e fenotipica nella coltura di espansione a lungo termine14,15.
Gli organoidi possono anche essere derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC), comprese le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)16. Mentre gli organoidi derivati dal PSC sfruttano i meccanismi di sviluppo degli organi per la loro istituzione, gli ASC possono essere costretti a formare organoidi ricostruendo condizioni che imitano la nicchia delle cellule staminali durante l'auto-rinnovamento fisiologico dei tessuti o la riparazione dei tessuti. Gli organoidi derivati da PSC sono modelli favorevoli per esplorare lo sviluppo e l'organogenesi, sebbene incapaci di raggiungere il livello di maturazione comparabile degli organoidi derivati da ASC. Lo stato di maturazione simile a quello fetale degli organoidi derivati dal PSC e la complessità per stabilire questi organoidi impediscono sostanzialmente le loro ampie applicazioni per lo studio della biologia e della patologia nei tessuti maturi.
Il tratto respiratorio umano, dal naso al bronchiolo terminale, è rivestito con l'epitelio delle vie aeree, chiamato anche epitelio ciliato pseudostratificato, che consiste di quattro tipi di cellule principali, cioè cellule ciliate, cellule calici, cellule basali e cellule club. Abbiamo stabilito l'organoide polmonare umano derivato dall'ASC da tessuti polmonari umani in collaborazione con il laboratorio 12,13 di Clevers. Questi organoidi polmonari vengono espansi consecutivamente nel mezzo di espansione per oltre un anno; la durata precisa varia tra diverse linee organoidi ottenute da diversi donatori. Tuttavia, rispetto all'epitelio nativo delle vie aeree, questi organoidi polmonari espandibili a lungo termine non sono abbastanza maturi poiché le cellule ciliate, la principale popolazione cellulare nelle vie aeree umane, sono sottorappresentate in questi organoidi polmonari. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione prossimale e generato organoidi delle vie aeree 3D e 2D che morfologicamente e funzionalmente fenocopio l'epitelio delle vie aeree a un livello quasi fisiologico.
Qui forniamo un protocollo video per derivare organoidi polmonari umani dai tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D.
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Protocol
Tutti i esperimenti che utilizzano tessuti umani qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 e UW21-695). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta dei tessuti.
1. Derivazione dell'organoide polmonare umano
- Preparazione di materiali sperimentali
- Preparare il mezzo basale integrando il mezzo DMEM / F12 avanzato con 2 mM di glutammina, 10 mM HEPES, 100 U / mL di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina.
- Preparare il mezzo di espansione organoide polmonare umano integrando il mezzo basale con il 10% di R-spondin 1 mezzo condizionato, il 10% di mezzo condizionato noggin, 1x integratore B27, 1,25 mM di N-acetilcisteina, 10 mM di nicotinamide, 5 μM di Y-27632, 500 nM di A-83-01, 1 μM di SB202190, 5 ng/ mL di fattore di crescita fibroblst (FGF)-7, 20 ng / mL di FGF-10 e 100 μg / mL di primocina (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: il mezzo condizionato R-spondin 1 e Noggin può essere sostituito con R-spondin 1 (500 ng/mL) e Noggin (100 ng/mL) commerciali. - Prewarm una piastra di coltura in sospensione a 24 pozzetti in un incubatore di colture cellulari. Utilizzare un incubatore di colture cellulari standard con il 5% di CO2 e atmosfera umidificata a 37 °C. Scongelare la matrice del seminterrato in un frigorifero a 4 °C. Mantenere la matrice del seminterrato e il terreno di coltura sul ghiaccio durante la sperimentazione.
- Isolamento cellulare da tessuti polmonari umani per la coltura di organoidi 3D
- Procurarsi tessuti polmonari umani appena resecati di circa 0,5 cm da pazienti sottoposti a resezione chirurgica a causa di varie malattie. Trasportare i tessuti polmonari in 30 ml di terreno basale a temperatura ambiente ed elaborare il più rapidamente possibile all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Tritare i tessuti polmonari in piccoli pezzi (0,5-1 mm) con un bisturi sterile in un piatto di coltura cellulare di 10 cm. Lavare i pezzi di tessuto con 10 mL di mezzo basale freddo in un tubo di centrifuga da 15 mL, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 8 mL di mezzo basale integrato con collagenasi ad una concentrazione finale di 2 mg/mL. Digerire i pezzi di tessuto agitando il tubo a 120 giri/min per 30-40 min a 37 °C.
- Pipettare su e giù per 20 volte per tagliare i pezzi di tessuto digerito usando una pipetta sierologica da 10 ml. Impilare un filtro da 100 μm su un tubo centrifugo da 50 ml e filtrare la sospensione.
- Recuperare i pezzi di tessuto sul colino con il mezzo basale e trasferirli in un tubo centrifugo da 15 ml, seguito da un secondo ciclo di taglio e filtraggio. Ulteriori cesoie-filtraggio possono essere eseguite 1x-2x per isolare più cellule, specialmente quando viene procurato un piccolo pezzo di tessuto (ad esempio, <0,5 cm).
- Aggiungere FBS al flusso con una concentrazione finale del 2% per terminare la digestione, seguita da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Risospesere il pellet cellulare in 10 mL di terreno basale, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
- (Facoltativo) Se molti eritrociti sono visti nel pellet (stimato dal colore del pellet), risospesso il pellet cellulare in 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi, aggiungere 10 ml di mezzo basale al tubo, seguito da centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Risospesciare il pellet in matrice fredda del seminterrato e tenerlo sul ghiaccio. Aggiungere 80-160 μL di matrice basale per cellule recuperate da un tessuto polmonare di dimensioni intorno a 0,5 cm; la quantità è sufficiente per seminare 2-4 goccioline.
- Erogare 40 μL di sospensione a ciascun pozzetto di una piastra di coltura di sospensione a 24 pozzetti preriscaldata. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi per formare una goccia.
- Aggiungere 500 μL di organoidi polmonari umani mezzo di espansione integrato con 5 nM di Heregulin beta-1 a ciascun pozzetto e incubare la piastra in un incubatore di colture cellulari.
- Aggiorna il mezzo ogni 3 giorni. Rimuovere il vecchio mezzo mantenendo intatta la goccia e aggiungere il mezzo fresco con cautela. Passare gli organoidi dopo l'incubazione per 10-14 giorni. Usa Heregulin beta-1 solo nella cultura iniziale prima del primo passaggio.
- Osservare gli organoidi al microscopio per assicurarsi che gli organoidi non siano incorporati con una densità cellulare molto elevata. Se una goccia si disintegra a causa di una densità cellulare eccessivamente elevata, recuperare e reincorporare gli organoidi e le cellule con un volume maggiore di matrice basale per produrre più goccioline con una densità cellulare inferiore e desiderabile.
2. Espansione degli organoidi polmonari umani
- Preparare una pipetta Pasteur bruciando la punta di una pipetta Pasteur su una fiamma, come un bruciatore Bunsen, per restringere l'apertura da 1,5 mm a circa 1,0 mm di diametro. Raffreddare le pipette, seguito da autoclave per sterilizzare. Bagnare le pipette con il mezzo basale per evitare l'attaccamento e la perdita di cellule durante la cesoiatura meccanica.
- Passaggio organoidi polmonari con taglio meccanico
- Utilizzare una punta da 1 ml e un pipetto su e giù per rompere le goccioline ottenute sopra. Quindi, trasferire gli organoidi insieme al mezzo in un tubo centrifugo da 15 ml e regolare il volume a 10 ml con mezzo basale freddo. Scartare il surnatante dopo centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 °C
- Lavare nuovamente gli organoidi con 10 ml di mezzo basale freddo. Sospendere gli organoidi in 2 ml di terreno basale freddo. Pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in piccoli pezzi con una pipetta Pasteur.
- Integrare con mezzo basale ad un volume totale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospesso i frammenti organoidi con matrice basale fredda sufficiente a consentire un'espansione da 1:3 a 1:5. Continua sul ghiaccio.
- Posizionare 40 μL di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi.
- Aggiungere 500 μL di terreno di espansione organoide polmonare a ciascun pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Aggiorna il mezzo ogni 3 giorni. Passare gli organoidi ogni 2 settimane con un rapporto da 1:3 a 1:5.
- Passaggio degli organoidi polmonari con tripsinizzazione
NOTA: La tripsinizzazione è preferita quando è difficile tagliare l'organoide polmonare in piccoli pezzi usando un pipetto Pasteur, o la dimensione degli organoidi è altamente variabile, o le sperimentazioni successive richiedono organoidi di dimensioni più uniformi.- Raccogliere gli organoidi polmonari come indicato al punto 2.2.1. Sospendere l'organoide in 1 mL di enzima di dissociazione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 3-5 min.
- Aggiungere 1 mL di mezzo basale al tubo. Tagliare meccanicamente gli organoidi pipettando gli organoidi su e giù in piccoli pezzi usando un pipetto Pasteur. Controllare le dimensioni dei pezzi organoidi al microscopio con ingrandimento 4x. Quindi, aggiungere 40 μL di FBS per terminare la digestione.
NOTA: Determinare la dimensione dei frammenti organoidi al microscopio in base alla disposizione sperimentale. Se un esperimento ha bisogno di più organoidi o organoidi di dimensioni più uniformi, tagliare gli organoidi in pezzi più piccoli o anche in singole cellule. Quindi, ci vuole più tempo, probabilmente 3 settimane, prima che gli organoidi siano pronti per la sperimentazione. - Rabboccare con mezzo basale fino ad un volume finale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospesso i pezzi organoidi in matrice fredda di basamento con un volume sufficiente al passaggio con un rapporto di 1:5-1:10. Continua sul ghiaccio.
- Posizionare 40 μL di sospensione organoide in ogni pozzetto di una piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Incubare la piastra di coltura a 37 °C per 10-15 min. Lascia che la matrice del seminterrato si solidifichi.
- Integrare con 500 μL di terreno di espansione organoide polmonare per pozzetto e incubare in un incubatore di colture cellulari. Aggiorna il mezzo di espansione ogni 3 giorni. Passaggio degli organoidi dopo 2-3 settimane.
NOTA: Circa 100 organoidi sono montati all'interno di una goccia da 40 μL di matrice basale. Gli organoidi polmonari normalmente crescono meglio con una densità cellulare relativamente alta. Reincorporare gli organoidi con una densità cellulare inferiore se le goccioline si disintegrano o gli organoidi in crescita si attaccano insieme a causa della densità cellulare eccessivamente elevata.
3. Differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree
- Preparare il mezzo di differenziazione prossimale (mezzo PD) integrando il mezzo basale di interfaccia liquido aria con 1x integratore di interfaccia liquido aria, 1x integratore di interfaccia liquido aria, 4 μg/mL di eparina, 1 μM di idrocortisone, 10 μM di Y-27632 e 10 μM di DAPT (vedi Tabella dei materiali).
- Organoidi 3D delle vie aeree
- Incubare gli organoidi polmonari nel terreno di espansione per 7-10 giorni dopo il passaggio tramite taglio meccanico. Sostituire il mezzo di espansione con il supporto PD. Incubare gli organoidi nel mezzo PD per 14 giorni in un incubatore di colture cellulari.
- Scartare il supporto PD in ogni pozzetto. Aggiungere un tampone di lisato cellulare per raccogliere l'organoide differenziato delle vie aeree per l'estrazione dell'RNA e il rilevamento dell'espressione genica cellulare mediante il test RT-qPCR.
- In alternativa, incubare gli organoidi a 37 °C per 60 minuti dopo l'aggiunta di 10 mM edTA per dissociare gli organoidi in singole cellule, seguita da analisi citometrica a flusso per esaminare le popolazioni cellulari. Gli organoidi sono pronti per varie manipolazioni sperimentali.
- Organoide 2D delle vie aeree
- Preparare sufficienti organoidi polmonari 3D per la coltura di differenziazione 2D. Un totale di 1,3 x 105 e 4,5 x 105 celle sono necessari rispettivamente per un inserto di supporto permeabile a 24 pozzetti e un inserto di supporto permeabile a 12 pozzetti.
- Dopo che gli organoidi polmonari 3D crescono nel mezzo di espansione per 2 settimane, digerire gli organoidi in singole cellule e seminare negli inserti a 24 pozzetti e 12 pozzetti per generare organoidi 2D delle vie aeree.
- Pre-incubare gli inserti con il mezzo basale durante la notte in un incubatore di colture cellulari. Aggiungere 250 μL e 500 μL di mezzo basale nella camera superiore e inferiore di una piastra a 24 pozzetti, rispettivamente. Per una piastra a 12 pozzetti, aggiungere 500 μL e 1.000 μL di mezzo basale nella camera superiore e inferiore, rispettivamente.
- Raccogliere organoidi polmonari 3D come descritto nella fase 2.2.1. Risospesere gli organoidi con 1 mL di enzima di dissociazione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 3-5 min.
- Aggiungere 1 mL di mezzo basale al tubo. Pipettare su e giù per tagliare gli organoidi in singole cellule con un pipetto di Pasteur e controllare le cellule al microscopio. Quindi, aggiungere 40 μL di FBS per terminare la digestione.
- Filtrare le celle attraverso un filtro da 40 μm in un tubo centrifuga da 50 ml. Trasferire la sospensione cellulare filtrata in un tubo da 15 ml. Rabboccare con mezzo basale per un volume totale di 10 ml, seguito da centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Risospesso il pellet, raccolto da 24 goccioline (40 μL), in 1-2,5 mL di terreno di espansione organoide polmonare a seconda della densità cellulare nelle goccioline. Contare il numero di cellule con un contatore di cellule al microscopio. Regolare la concentrazione cellulare a 1,3 x 106/mL (per inserti a 24 pozzetti) o 9 x 105/mL (per inserti a 12 pozzetti).
- Rimuovere il mezzo basale dalle camere superiore e inferiore. Aggiungere 500 μL e 1.000 μL di terreno di espansione nella camera inferiore dell'inserto a 24 pozzetti e dell'inserto a 12 pozzetti, rispettivamente. Seminare 100 μL e 500 μL di sospensione cellulare preparati nella fase 3.3.7 sulla camera apicale dell'inserto a 24 pozzetti e dell'inserto a 12 pozzetti, rispettivamente.
- Incubare in un incubatore di colture cellulari per 2 giorni. Sostituire il mezzo di espansione con il mezzo PD sia nella camera apicale che in quella inferiore delle piastre. Incubare gli organoidi nell'incubatore di colture cellulari per 14 giorni e rinfrescare il mezzo PD ogni 3 giorni.
NOTA: Le ciglia mobili sono distinguibili negli organoidi 3D e 2D al microscopio dal giorno 7 dopo l'incubazione nel mezzo PD. Dopo 14 giorni di coltura di differenziazione nel mezzo PD, gli organoidi delle vie aeree sono maturi per varie manipolazioni sperimentali. - Misurare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) a giorni alterni utilizzando un sistema di misurazione della resistenza elettrica secondo un protocollo standard descritto alpunto 17.
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Representative Results
Questo protocollo consente la derivazione di organoidi polmonari umani con un alto tasso di successo. Il tessuto polmonare umano fresco viene tritato in piccoli pezzi e quindi decomposto con collagenasi. Le singole cellule risultanti sono incorporate nella matrice basale e incubate nel mezzo di espansione organoide polmonare integrato con un cocktail di fattori di nicchia per la crescita delle cellule staminali epiteliali (fase 1.1.2). La Figura 1 mostra la microfotografia di cellule polmonari appena isolate incorporate nella matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto di tipo 2 (BME; Figura 1A, a sinistra). Gli organoidi cistici compaiono e si ingrandiscono nel tempo (Figura 1A, a destra). Nel frattempo, le cellule non correlate subiscono gradualmente la morte cellulare. I fibroblasti sono presenti nella coltura durante il primo o il secondo passaggio. Successivamente, la coltura contiene esclusivamente organoidi epiteliali, che sono organoidi polmonari derivati da cellule staminali epiteliali presenti nei tessuti polmonari primari. Questi organoidi polmonari vengono passati ogni 2-3 settimane mediante taglio meccanico in un rapporto da 1:3 a 1:5 o per tripsinizzazione con un rapporto da 1:5 a 1:10 (passi 2.2-2.3). Le microfotografie rappresentative degli organoidi polmonari dopo il quarto passaggio sono mostrate nella Figura 1B. Dopo la cesoiatura meccanica, i frammenti organoidi incorporati nel BME formano domini cistici entro un paio d'ore (Figura 1B, a sinistra). Una microfotografia dello stesso campo il giorno 5 (Figura 1B, a destra) mostra gli organoidi che crescono nel tempo. Questi organoidi polmonari umani in espansione ospitano tutti e quattro i principali tipi di cellule epiteliali delle vie aeree, tra cui la cellula ciliata ACCTUB + o FOXJ1 +, la cellula basale P63 +, la cellula club CC10 + e la cellula calice MUC5AC +18 (Figura 1C), in uno stato prematuro. In particolare, questi organoidi polmonari umani possono essere passati consecutivamente e stabilmente per oltre 1 anno. Se mantenuti all'interno della matrice basale, gli organoidi polmonari hanno maggiori probabilità di mostrare una polarità apicale-in, meno del 2%-3% degli organoidi polmonari mostrano una polarità apicale-out13. Di conseguenza, gli apici cellulari non sono facilmente accessibili a meno che gli organoidi 3D non vengano tranciati aperti.
Tuttavia, rispetto all'epitelio nativo delle vie aeree umane, questi organoidi polmonari espandibili a lungo termine non sono sufficientemente maturi poiché la popolazione cellulare dominante nell'epitelio nativo delle vie aeree umane, la cellula ciliata, è sottorappresentata nell'organoide polmonare. Abbiamo quindi definito un mezzo di differenziazione prossimale (PD) per migliorare lo stato di maturazione degli organoidi polmonari umani. Gli organoidi incubati nel mezzo di espansione e nel mezzo PD hanno sviluppato una morfologia distinta nel tempo (Figura 2A). Le ciglia mobili erano più abbondanti negli organoidi nel mezzo PD rispetto a quelli nel mezzo di espansione. Dopo 2 settimane di coltura di differenziazione nel mezzo PD, le ciglia mobili sono distinguibili in ogni singolo organoide (Figura 2B e Video Supplementare 1). È interessante notare che le ciglia battenti spingono i detriti cellulari e la mucina escreta all'interno del lume organoide a turbinare in modo unidirezionale, il che ricapitola adeguatamente la scala mobile mucociliare per rimuovere le particelle inalate (Video supplementare 1), un importante meccanismo di auto-pulizia delle vie aeree umane. Dimostriamo che le cellule ciliate sono aumentate drammaticamente a circa il 50% negli organoidi differenziati rispetto agli organoidi polmonari originali. Per valutare le percentuali di quattro tipi di cellule epiteliali, gli organoidi delle vie aeree 2D sono stati analizzati mediante citometria a flusso. In breve, gli organoidi sono stati dissociati con 10 mM di EDTA per 60 minuti a 37 °C, fissati con il 4% di PFA e permeabilizzati con tensioattivo allo 0,1%. Successivamente, le cellule sono state incubate con anticorpi primari (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora a 4 °C seguita da colorazione con anticorpi secondari. Un sistema FACS è stato utilizzato per analizzare i campioni. L'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che gli organoidi differenziati ospitano quattro tipi di cellule epiteliali delle vie aeree (Figura 2C). Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree in grado di simulare fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico.
Per consentire alla superficie apicale organoide di essere facilmente accessibile e modellare meglio l'esposizione dell'epitelio delle vie aeree umane ai patogeni respiratori, abbiamo generato monostrati 2D di organoidi delle vie aeree. Dopo 2 settimane di coltura di differenziazione, gli organoidi delle vie aeree 2D hanno sviluppato una barriera epiteliale intatta (Figura 3A,B). Abbiamo anche eseguito un test di blocco del destrano per valutare l'integrità della barriera epiteliale formata negli organoidi 2D delle vie aeree. Il giorno 10 dopo la coltura in inserti transwell, la fluoresceina isotiocianato-destrano (MW 10.000) è stata aggiunta nel mezzo della camera superiore e incubata a 37 °C per 4 ore. I supporti nelle camere superiore e inferiore sono stati raccolti per un test di fluorescenza. L'indice di blocco del destrano si riferisce all'intensità di fluorescenza del mezzo nella camera superiore rispetto a quella nella camera inferiore (Figura 3B). Questi organoidi delle vie aeree 2D contengono anche abbondanti cellule ciliate (Figura 3C). Le cellule ciliate sono state marcate con l'anticorpo anti-β-Tubulin IV (ACCTUB) e l'anticorpo secondario anti-topo di capra 488. Le immagini confocali sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale. Le immagini multicanale sono state acquisite utilizzando i laser 405 nm per DAPI, 488 nm per ACCTUB e 633/640 nm per Phalloidin. I parametri di imaging sono stati regolati in base al manuale utente del microscopio confocale. In breve, la dimensione del foro stenopeico è stata impostata su 1 UA, il guadagno principale è stato impostato su 650 V a 750 V con guadagno digitale di 1,0 e la potenza del laser è stata regolata per ciascun canale nell'intervallo dallo 0,2% al 5%. L'elaborazione delle immagini è stata eseguita utilizzando il software di analisi fornito.
Il tratto respiratorio umano è rivestito con due tipi distinti di epiteli, cioè l'epitelio delle vie aeree e l'epitelio alveolare. Il primo allinea le vie aeree dalla cavità nasale al bronchiolo terminale e consiste di quattro tipi principali di cellule epiteliali, cioè cellule ciliate, cellule calici, cellule club e cellule basali. Inoltre, l'epitelio delle vie aeree che riveste le vie aeree prossimali e distali mostra una composizione cellulare variabile lungo l'asse prossimale-distale. L'epitelio prossimale delle vie aeree è pseudostratificato, costituito da abbondanti cellule ciliate e cellule calici secernenti muco; mentre l'epitelio distale delle vie aeree è un singolo strato di cellule cuboidali ciliate e club con meno cellule basali e calici19. I tessuti polmonari umani utilizzati per derivare organoidi polmonari sono stati procurati da pazienti sottoposti a resezioni chirurgiche a causa di varie malattie. Usiamo tessuti polmonari normali adiacenti ai tessuti malati per la coltura di organoidi. Questi tessuti polmonari contengono tipicamente bronchioli di dimensioni variabili circondati da sacche alveolari. Durante la coltura iniziale, le cellule staminali epiteliali delle vie aeree o le cellule progenitrici delle vie aeree nei tessuti polmonari sopravvivono e proliferano a causa dei fattori di nicchia nel mezzo di espansione. Il mezzo di espansione consente la derivazione iniziale e l'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari dirigendo gli organoidi verso uno stato immaturo, mentre il protocollo di differenziazione delle vie aeree genera organoidi delle vie aeree fenocopiando l'epitelio delle vie aeree native morfologicamente e funzionalmente. Il sistema modello, che include la derivazione, l'espansione e la differenziazione degli organoidi polmonari, è delineato nella Figura 4. La composizione cellulare nell'epitelio prossimale e distale delle vie aeree è illustrata anche nella Figura 4.
Figura 1: Derivazione, espansione e caratterizzazione di organoidi polmonari umani. (A) Una microfotografia rappresentativa mostra singole cellule incorporate nella matrice basale dopo l'isolamento dai tessuti polmonari il giorno 0 (a sinistra). Il giorno 5, gli organoidi cistici stanno crescendo (a destra). La barra della scala è di 0,5 mm. (B) Una microfotografia rappresentativa di organoidi polmonari il giorno del quarto passaggio e il giorno 5 dopo il passaggio. La barra della scala è di 0,5 mm. P1 e P4 rappresentano il primo e il quarto passaggio. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 10x. (C) Immagini confocali di quattro tipi di cellule epiteliali delle vie aeree in organoidi polmonari umani. Quattro linee di cellule epiteliali delle vie aeree sono presenti negli organoidi polmonari, tra cui le cellule ciliate ACCUB+ e FOXJ1+, le cellule basali P63+, le cellule club CC10+ e le cellule calice MUC5AC+. I nuclei e i filamenti di actina cellulare sono controcolorati rispettivamente con DAPI (blu) e Phalloidin-647 (viola). La barra della scala è di 10 μm. Questa cifra è stata adottata da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Differenziazione prossimale di organoidi polmonari umani. (A) Gli organoidi polmonari umani sono stati coltivati nel mezzo PD o nel mezzo di espansione (Exp) in parallelo per 16 giorni. Vengono mostrate microfotografie a campo luminoso di organoidi nei giorni indicati. La barra della scala è di 0,4 mm. (B) Ciglia negli organoidi differenziati delle vie aeree sono mostrati (freccia nera). La barra di scala è di 20 μm. (C) Le percentuali dei singoli tipi di cellule negli organoidi incubati in mezzo PD (in alto) e in mezzo di espansione (in basso) come rilevato dall'analisi FACS. Vengono mostrati gli istogrammi rappresentativi di una linea organoide. L'esperimento è stato eseguito in tre diverse linee organoidiche. Questa cifra è stata adottata da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Generazione di organoidi differenziati 2D delle vie aeree. (A) La resistenza elettronica transepiteliale (TEER) è stata misurata al giorno indicato dopo l'incubazione nel mezzo PD. I dati mostrano ± deviazione standard media (SD) dei monostrati 2D in 10 inserti. (B) Il giorno 10 dopo la coltura in piastre di supporto permeabili, è stata aggiunta fluoresceina isotiocianato-destrano e i mezzi nelle camere superiore e inferiore sono stati raccolti per un saggio di fluorescenza dopo 4 ore. L'indice di blocco del destrano si riferisce all'intensità di fluorescenza del mezzo nella camera superiore rispetto a quella nella camera inferiore. Il diametro degli inserti di supporto permeabili utilizzati nel nostro esperimento è di 0,4 μm. Senza seminare alcuna cellula, il destrano può penetrare liberamente i normali inserti 2D. Pertanto, l'indice di blocco destrano di un normale 2D (la barra etichettata con Blank) dovrebbe essere 1. I dati rappresentano la SD media ± di 10 inserti seminati con organoidi 2D delle vie aeree (organoide 2D) e quelli in due inserti vuoti (vuoto). (C) Immagini confocali di abbondanti cellule ciliate ACCTUB+ (verde) in organoidi 2D delle vie aeree. I filamenti di actina cellulare sono controcolorati con falloidina-647 (viola). La barra della scala è di 20 μm. Questa cifra è stata adottata da13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Illustrazione schematica di derivazione, espansione e differenziazione di organoidi polmonari umani. Le singole cellule isolate dai tessuti polmonari umani sono direttamente incorporate nella matrice basale e incubate nel mezzo di espansione organoide polmonare. Gli organoidi polmonari umani derivati possono essere espansi a lungo termine con elevata stabilità e prontamente recuperati da stock crioconservati. Dopo la differenziazione, gli organoidi delle vie aeree generati possono simulare fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane. Gli organoidi delle vie aeree 2D e 3D sono stati sviluppati per varie manipolazioni sperimentali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1. Le ciglia che battono in modo sincrono spingono i detriti cellulari a turbinare unidirezionalmente negli organoidi differenziati delle vie aeree13. Questo video è stato adottato dal13. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Le vie aeree umane sono rivestite con l'epitelio delle vie aeree, noto anche come epitelio ciliato pseudostratificato. I principali tipi di cellule dell'epitelio delle vie aeree superiori sono le cellule ciliate che consentono il movimento coordinato delle loro ciglia apicali per espellere il muco e le particelle inalate dalle vie aeree, le cellule calici che producono e secernono muco e le cellule basali che rivestono la membrana basale e sono implicate nella rigenerazione. Nelle piccole vie aeree come i bronchioli, l'epitelio delle vie aeree cuboidali contiene cellule secretorie e meno cellule ciliate rispetto alle regioni superiori delle vie aeree. Descriviamo un protocollo robusto per derivare organoidi polmonari umani dalle cellule staminali epiteliali nei tessuti polmonari umani. Questi organoidi polmonari umani sono mantenuti nel mezzo di espansione e passati consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità. I principali fattori di crescita nel mezzo di espansione includono R-spondin, un agonista Wnt20; e Noggin, che è un inibitore della segnalazione BMP21, così come FGF7 e FGF10. Studi precedenti hanno rivelato un ruolo cruciale della segnalazione Wnt, FGF e BMP nell'omeostasi dell'epitelio respiratorio 22,23,24. Il mezzo di espansione consente la derivazione iniziale e l'espansione a lungo termine degli organoidi polmonari dirigendo gli organoidi verso uno stato immaturo. Sviluppiamo ulteriormente un metodo di differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D, che ospitano quattro principali tipi di cellule delle vie aeree e simulano l'epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Durante l'intera procedura, compresa la derivazione iniziale, l'espansione a lungo termine e la differenziazione prossimale, non sono necessarie né noiose purificazioni cellulari né cellule di alimentazione e stromali. Pertanto, stabiliamo un modello organoide dell'epitelio delle vie aeree umane. Le due fasi della cultura, la cultura dell'espansione e la cultura della differenziazione, si escludono a vicenda. Gli organoidi polmonari forniscono una fonte stabile per l'espansione a lungo termine, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree fenocopiano fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane. Questi organoidi sono suscettibili di varie manipolazioni sperimentali, tra cui imaging, sequenziamento dell'RNA, analisi della citometria a flusso, editing genetico, ecc.13,14,25,26,27.
Per garantire un'elevata efficienza per ricavare organoidi polmonari, il mezzo di espansione deve essere ricostituito in modo accurato e meticoloso, il che è essenziale per l'alto tasso di stabilimento consentito dal protocollo. Una delle principali limitazioni di questo modello organoide è la composizione epiteliale pura, la mancanza di cellule stromali e le cellule immunitarie presenti nella mucosa respiratoria umana, che possono causare in una certa misura la deviazione degli organoidi delle vie aeree dall'epitelio delle vie aeree nativo. Pertanto, ci sforziamo di generare la prossima generazione di organoidi respiratori incorporando cellule immunitarie e altri componenti biologicamente rilevanti nel nostro attuale modello organoide.
Gli organoidi delle vie aeree che abbiamo stabilito simulano fedelmente la composizione e la funzionalità multicellulare dell'epitelio respiratorio umano nativo a un livello quasi fisiologico, il che è impossibile in qualsiasi linea cellulare omogenea. I nostri modelli organoidi consentono agli scienziati di ricostruire ed espandere stabilmente l'epitelio nativo delle vie aeree umane nelle piastre di coltura. Questi organoidi delle vie aeree sono uno strumento universale per studiare la biologia e la patologia delle vie aeree umane. Le cellule epiteliali primarie delle vie aeree utilizzate nei laboratori di ricerca non sono espandibili a causa della limitata capacità replicativa e difficilmente fungono da strumento di ricerca riproducibile e facilmente accessibile.
Gli organoidi, compresi gli organoidi respiratori umani, hanno rivelato la loro unicità e forza per lo studio dei patogeni umani, tra cui SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. Come strumento universale e fisiologico-attivo, gli organoidi polmonari umani possono essere ampiamente utilizzati per esplorare la biologia e la patologia del tratto respiratorio umano.
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Disclosures
J. Z., C.L. e M.C.C. sono elencati come inventori sul brevetto degli organoidi delle vie aeree (pubblicazione n.: US-2021-0207081-A1). Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, per l'assistenza nell'imaging confocale e nella citometria a flusso. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai finanziamenti del Fondo per la salute e la ricerca medica (HMRF, 17161272 e 19180392) dell'Ufficio per la salute e la salute; Fondo generale di ricerca (GRF, 17105420) del Consiglio per le sovvenzioni alla ricerca; e Health@InnoHK Commissione per l'innovazione e la tecnologia, il governo della Regione amministrativa speciale di Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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