Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.
Abstract
Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.
Introduction
Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien 1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht3. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt4. Das Zielprotein im Gewebeschnitt wird zunächst mit einem Primärantikörper markiert und der Schnitt wird dann mit einem Sekundärantikörper gegen die Wirtsspezies Immunglobulin des Primärantikörpers markiert. Die Antikörperfärbung ist ein robuster Ansatz zum Nachweis der Lokalisation von Proteinen, der eine hohe optische Auflösung auf intrazellulärer Ebene bietet. Allerdings ist die Anzahl der verfügbaren Antikörper im Zebrafisch sehr begrenzt. Eine aktuelle Studie zeigt, dass etwa 112.000 Antikörper für Mäuse kommerziell verfügbar sind. Allerdings haben sich nur sehr wenige Antikörper im Zebrafisch als zuverlässig erwiesen5.
Stattdessen wurde im Zebrafisch die In-situ-Hybridisierung häufig für die Analyse von Genexpressionsmustern eingesetzt. Diese Methode wurde erstmals in den 1980er Jahren zur Bestimmung der Genexpression in Drosophila-Embryonen verwendet6,7, und seitdem wurde diese Technologie kontinuierlich weiterentwickelt und verbessert. Zunächst wurden radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet, um mRNA-Transkripte nachzuweisen; Die räumliche Auflösung war jedoch relativ gering, und es gab potenzielle Gesundheitsrisiken, die durch die Radioaktivität verursacht wurden. Anschließend stützt sich die In-situ-Hybridisierung auf die mit Digoxigenin (DIG) oder Fluorescein (Fluo) markierten RNA-Sonden, die mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiert oder durch fluoreszierende Tyramid-Signalamplifikation (TSA) detektiert werden8,9. Obwohl TSA zum Nachweis von zwei oder drei Genen verwendet wurde, sind die DIG-Markierung von RNA-Sonden und antiDIG AP-konjugierten Antikörpern immer noch hochempfindliche, stabile und weit verbreitete Ansätze für die In-situ-Hybridisierung. Daher sind kommerzialisierte Antikörper in Kombination mit DIG-markierten in situ Sonden nützlich, um Einblicke in die Proteinlokalisierung und -expression eines Gens zu erhalten.
Whole-Mount-Embryonen können aufgrund der geringen optischen Auflösung die räumliche Beziehung zwischen den Genen nicht aufdecken, obwohl Zebrafischembryonen klein und durchsichtig sind10. Daher ist es notwendig, die Expressionsmuster von Genen auf intrazellulärer Ebene zu analysieren. Die Kryosektion ist bei Zebrafischen weit verbreitet, da sie einfach durchzuführen ist und das Antigen effektiv erhalten kann. Daher bietet die In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie in Zebrafisch-Kryoschnitten eine leistungsfähige Möglichkeit, die Expressionsmuster zweier Gene zu analysieren. Eine Kombination aus in situ Hybridisierung und Immunhistochemie wurde auf Zebrafischeangewendet 11. Die Proteinase-K-Behandlung wurde jedoch verwendet, um die Sondenpenetration auf Kosten der Antigenintegrität zu verbessern. Um diese Einschränkung zu überwinden, verwendet dieses Protokoll Erhitzung, um den Antigenabruf zu induzieren. Dieses Protokoll gilt nicht nur für Embryonen verschiedener Stadien und Gewebeabschnitte unterschiedlicher Dicke (14 μm Kopfabschnitte und 20 μm Rückenmarksabschnitte), sondern wurde auch anhand von Genen verifiziert, die in zwei Organen, einschließlich des Kopfes und des Rückenmarks, exprimiert werden.
In diesem Artikel wird beschrieben, wie In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung in Zebrafischembryonen in Kryoschnitten kombiniert werden können. Die Vielseitigkeit dieses Protokolls wird durch die Verwendung einer Reihe von in situ Hybridisierungs- und Immunhistochemie-Kombinationen demonstriert, einschließlich in situ Hybridisierungssonden für zwei verschiedene Neuronen. Diese Methode eignet sich zum Nachweis von mRNA und Proteinen in verschiedenen Regionen und Embryonen unterschiedlichen Alters sowie der Expressionsmuster zweier Gene.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Nantong genehmigt (Nr. S20191210-402).
1. Entnahme von Zebrafisch-Embryonen
- In der Nacht vor der Entnahme der Eier ein Zebrafischpaar in Zuchtbecken aufstellen, einen transgenen Zebrafisch und einen AB-Wildtyp-Zebrafisch (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB Wildtyp oder Tg (hb9:egfp) X AB Wildtyp) (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine diagonale Trennwand aus Kunststoff, um den Mann und die Frau zu trennen, um einen physischen Zugang auszuschließen. Setzen Sie am nächsten Tag den oberen Teil des Zuchtbeckens in einen sauberen unteren Teil ein, der mit frischem Wasser gefüllt ist, und entfernen Sie die Trennwand des Zuchtbeckens. Lassen Sie die Fische 10-20 Minuten lang paaren und sammeln Sie die Eier ein, nachdem sie auf den Boden des Zuchtbeckens gesunken sind.
- Die Embryonen werden in E3-Embryonenmedium (siehe Materialtabelle) kultiviert, das Methylenblau (1 ml 0,05 % Methylenblau in 1 l E3-Embryonenmedium) bei 28,5 °C enthält.
- Behandeln Sie die Embryonen 24 h nach der Befruchtung (hpf) mit Phenylthioharnstoff (PTU, siehe Materialtabelle), um die Bildung von Pigmenten zu verhindern.
HINWEIS: Tiere beiderlei Geschlechts werden in Versuchen verwendet.
2. In-situ-Hybridisierung
Anmerkungen: Das für die Schritte 2.1-2.11 verwendete Wasser ist mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltes Wasser (siehe Materialtabelle).
- Fixieren Sie ~10 Embryonen mit 0,5-1 ml frischem 4%igem Paraformaldehyd (PFA, siehe Materialtabelle) in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen bei 4 °C über Nacht für 12-14 h.
ANMERKUNG: Das Protokoll für die In-situ-Hybridisierung wurde gegenüber der zuvor veröffentlichten Literaturleicht modifiziert 12. PFA muss innerhalb einer Woche nach der Anwendung frisch zubereitet und bei 4 °C oder einen Monat bei -20 °C gelagert werden. Alle folgenden Schritte der In-situ-Hybridisierung wurden mit 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen durchgeführt. - Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut nur von Embryonen zu entfernen, die älter als 48 hpf sind.
HINWEIS: Die Haut wird entfernt, um das Eindringen von RNA-Sonden in die Rumpfregion von Embryonen zu erleichtern, die älter als 48 hpf sind. - Die Embryonen werden nach und nach dehydriert, indem sie mit 25%, 50% und 75% Methanol in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 nacheinander (PBST, siehe Materialtabelle) für jeweils 5 min bei Raumtemperatur gewaschen werden. Waschen Sie die Embryonen dann 5 Minuten lang in 100% Methanol bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Embryonen in 100%igem Methanol bei -20 °C für mindestens 12-14 h über Nacht.
HINWEIS: Dehydrierte Embryonen können 6 Monate lang in 100% Methanol bei -20 °C gelagert werden. - Rehydrieren Sie die Embryonen nach und nach, indem Sie sie nacheinander 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 75 %, 50 % und 25 % Methanol in PBST waschen. Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Verdauen Sie die Embryonen mit 10 μg/ml Proteinase K (siehe Materialtabelle) in PBST bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 1).
- Waschen Sie die Embryonen 5 Minuten lang mit PBST. Führen Sie diesen Waschschritt dreimal durch.
- Fixieren Sie die gewaschenen Embryonen in 4% PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Dieser Schritt stoppt die Verdauung, da PFA die Proteinase K inaktiviert. Stellen Sie sicher, dass die Probe vorsichtig gemischt wird, um alle Embryonen PFA auszusetzen. Die Röhrchen können auf die Seite gelegt werden, um die Embryonen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Diese PFA muss nicht frisch sein (sie kann bis zu 2 Wochen gekühlt werden). - Waschen Sie den Embryo dreimal mit PBST und inkubieren Sie ihn bei jeder Wäsche 5 Minuten lang.
- Führen Sie eine Vorhybridisierung der Embryonen durch, indem Sie sie mit einer Prähybridisierungslösung (preHYB, siehe Materialtabelle) bei 65 °C für 5 min inkubieren. Ersetzen Sie preHYB durch eine Hybridisierungslösung (HYB, siehe Materialtabelle) und prähybridisieren Sie für mindestens 4 h in HYB.
Anmerkungen: Bevor Sie mit der Vorhybridisierung fortfahren, heizen Sie die Lösungen auf 65 °C vor. Formamid (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um die Form und Struktur des Gewebes zu erhalten. Formamid verhindert auch die Bindung von nicht-homologen Fragmenten bei niedrigen Temperaturen. - Erhitzen Sie die Sonde (Insm1a oder 5-HT2C) 5 Minuten lang in HYB bei 95 °C, bevor Sie sie zu den Embryonen hinzufügen. Verwenden Sie die Sonde bei 1 μg/ml HYB. Entfernen Sie so viel preHYB wie möglich, ohne dass die Embryonen mit der Luft in Berührung kommen, und geben Sie die vorgewärmte Sonde in HYB in das Röhrchen mit den Embryonen.
HINWEIS: Eine markierte RNA-Sonde kann verwendet werden, um mit einer mRNA-Zielsequenz in den Embryonen zu hybridisieren. Daher kann die Sonde verwendet werden, um die Expression eines Gens von Interesse und die Position der mRNA zu bestimmen. - Lassen Sie die Sonde über Nacht (12-14 h) bei 50-70 °C hybridisieren.
Anmerkungen: Die Hybridisierungstemperatur ist für verschiedene Sonden unterschiedlich. - Am nächsten Tag wird die Sondenlösung mit einer Pipette abgesaugt und in einem Röhrchen bei -20 °C aufbewahrt, damit sie viele Male wiederverwendet werden kann.
- Waschen Sie die Embryonen wie folgt:
- Waschen Sie die Embryonen 15 Minuten lang mit 100% HYB bei 65 °C.
- Waschen Sie die Embryonen nacheinander mit 75%, 50% und 25% HYB in 2x Standard-Kochsalzcitrat mit 0,1% Tween-20 (SSCT, siehe Materialtabelle) für jeweils 15 min bei 65 °C.
- Waschen Sie die Embryonen für 15 min in 2x SSCT bei 65 °C.
- Waschen Sie die Embryonen 15 min lang in 0,2x SSCT bei 65 °C.
- Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in Maleinsäurepuffer mit 0,02 % Tween-20 (MABT, siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur.
- Blockieren Sie die hybridisierten und gewaschenen Embryonen für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 2%iger Blocklösung-1 (siehe Materialtabelle).
- Ersetzen Sie die Blockierlösung-1 durch Antidigoxigenin AP (Verdünnung 1:4.000, siehe Materialtabelle) in einer frischen 2%igen Blocklösung-1 und schütteln Sie sie über Nacht 12-14 h bei 4 °C.
- Waschen Sie die Embryonen viermal für 30 Minuten in MABT bei Raumtemperatur.
Anmerkungen: Nehmen Sie den BM purple (siehe Materialtabelle) während des dritten Waschgangs aus dem Kühlschrank und schütteln Sie ihn gelegentlich während der folgenden Wäschen. - Waschen Sie die Embryonen zweimal für 10 Minuten in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie eine Pipette, um so viel NTMT wie möglich aus den Embryonen zu entfernen. Ersetzen Sie die Embryonen durch das violette AP-Substrat von BM und färben Sie die Embryonen bei Raumtemperatur im Dunkeln. Überwachen Sie die Farbwechsel alle 30 Minuten, um den Färbegrad zu kontrollieren.
Anmerkungen: Die spezifische Färbezeit ist unterschiedlich und muss je nach Sonde angepasst werden. Die Inkubation der Embryonen bei 37 °C kann die Reaktion beschleunigen. Die Inkubation der Embryonen bei 4 °C kann die Reaktionszeit verlängern und kann über Nacht erfolgen. - Sobald es sich im gewünschten Ausmaß entwickelt hat, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie es zweimal kurz mit NTMT spülen. Nach der In-situ-Hybridisierung werden die Embryonen 20 Minuten lang dreimal mit PBST gespült.
3. Einbetten
- Tauchen Sie die Embryonen in 5%ige Saccharose in 1x PBS (siehe Materialtabelle) über Nacht für 12-14 h bei 4 °C.
- Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 15%ige Saccharose und inkubieren Sie sie über Nacht für 12-16 h bei 4 °C.
- Wechseln Sie die Lösung, die die Embryonen bedeckt, in 1x PBS auf 30%ige Saccharose und inkubieren Sie sie 1-2 Tage bei 4 °C.
HINWEIS: Inkubieren Sie in dieser Lösung, bis die Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken. - Füllen Sie einen Kryomold mit einem Medium für die optimale Schneidtemperatur (OCT) (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die Embryonen in 30%iger Saccharose mit OCT-Medium in das Kryomold. Rühren Sie sie um, um die Saccharose aus den Embryonen zu entfernen.
- Übertragen Sie die Embryonen in ein neues Kryomold für Gewebe und füllen Sie es vorsichtig mit OCT-Medium, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
- Tauchen Sie jeden Embryo ein, schieben Sie ihn auf den Boden der Kryoform und platzieren Sie jeden Embryo in der gewünschten Ausrichtung (entweder dorsal-ventral oder lateral). Halten Sie die Embryonen in einer geraden Linie.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, nur einen Embryo in jeden Kryomold zu setzen (siehe Materialtabelle). - Legen Sie die eingebetteten Embryonen in Kryoformen in ein Trockeneis-Ethanolbad.
- Bei -80 °C mindestens über Nacht 12-14 h lagern.
HINWEIS: Die Kryoformen können mindestens einen Monat lang bei -80 °C aufbewahrt werden.
4. Kryosektion
- Stellen Sie die Kryoschnitte mit einem Kryostaten auf -20 °C ein.
- Entfernen Sie den Probenblock aus dem Kryomast und legen Sie ihn in den Kryostaten. Legen Sie das OCT-Medium auf den Boden des gekühlten Futters und legen Sie den Block darauf.
- Stellen Sie sicher, dass der Probenblock parallel zur Rasierklinge steht. Schneiden Sie überschüssiges OCT-Medium vorsichtig um die Probe herum ab.
- Mit einem Kryostaten in 12-20 μm dicke Abschnitte schneiden. Übertragen Sie die Abschnitte schnell auf Glasobjektträger, so dass jeder Objektträger 3-4 Abschnitte hat. Lassen Sie die Proben Raumtemperatur erreichen und lagern Sie die Abschnitte in einem verschlossenen Objektträgerkasten bei -80 °C für die spätere Verwendung.
5. Immunfärbung
HINWEIS: Die GFP-Färbung wird an den Schnitten durchgeführt.
- Waschen Sie die Objektträger, die die Abschnitte enthalten, 5 Minuten lang mit PBS.
- Citratpuffer in der Mikrowelle zum Kochen bringen.
- Legen Sie die Objektträger in den Puffer und erhitzen Sie sie weiter, um die Lösung etwa 20 Minuten lang nahe dem Sieden zu halten.
HINWEIS: Dieser Schritt hilft bei der Antigengewinnung. Das Gewebe bleibt auch bei hohen Temperaturen intakt, was die Färbequalität verbessert, indem es Faltungen, Beschädigungen oder Ablösungen des Gewebes verhindert. - Lassen Sie die Proben langsam auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt beginnen. Lassen Sie die überschüssige Lösung abtropfen, trocknen Sie den Bereich um jeden Abschnitt vorsichtig mit einem Stück Taschentuch ab und zeichnen Sie mit einem wasserabweisenden Stift (siehe Materialtabelle) einen Kreis um den Abschnitt, um eine hydrophobe Barriere zu bilden. Achten Sie darauf, die Gewebeabschnitte nicht auszutrocknen.
- Waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
- 2 h in Blocklösung-2 (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur blockieren.
- Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung (monoklonales α-GFP der Maus, 1:250, siehe Materialtabelle) pro Objektträger und inkubieren Sie die Objektträger in einer immunhistochemischen Nassbox bei 4 °C über Nacht.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
- Überschüssiges PBS ablassen. Inkubieren Sie die Objektträger mit dem entsprechenden Sekundärantikörper (1:400, siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur in PBS.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie bei jedem Waschgang 10 Minuten lang.
- Lassen Sie das überschüssige PBS ab, pipettieren Sie das Eindeckmedium auf den Objektträger und montieren Sie es mit einem Objektträger-Deckglas.
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Representative Results
Mit diesem Protokoll kann das Expressionsmuster einer mRNA und eines Proteins gleichzeitig untersucht werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf. Der 5-HT2C-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT-Rezeptors, der an den Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) gebunden ist. Es ist im zentralen Nervensystem (ZNS) weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Gehirnfunktionen wie Appetit, Stimmung, Angst und Fortpflanzungsverhalten erheblich regulieren13. Die Expression von 5-HT2C im ZNS wurde durch die transgene Linie Tg (foxp2:egfp-caax) nachgewiesen, in der foxP2-Neurone durch fluoresceingrün fluoreszierendes Protein (GFP) markiert sind. GFP wurde nicht im Wildtyp-Zebrafisch exprimiert, sondern nur in der transgenen Linie. Die gleichzeitige Detektion der Expression von RNA (5-HT2C, die Sonde für htr2c, Abbildung 2A) und Protein (GFP, antiGFP, Abbildung 2B) kann für die Protein- und mRNA-Kolokalisationsanalyse verwendet werden.
Insulinom-assoziiertes 1a (insm1a), ein Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, wurde erstmals aus der Tumorreduktionsbibliothek identifiziert und spielte mehrere Funktionen bei der Bildung und Differenzierung des zentralen und peripheren Nervensystems und des neuroendokrinen Systems von Wirbeltieren. Neuere Studien haben gezeigt, dass insm1a ein wichtiger Regulator der Entwicklung von Motoneuronen ist. Die Expression von insm1a im Rückenmark und in den Motoneuronen des Zebrafisches wurde durch die transgene Linie Tg (hb9:egfp) nachgewiesen, in der hb9-Neurone durch Fluorescein-GFP markiert sind. GFP wurde nicht im Wildtyp-Zebrafisch exprimiert, sondern nur in der transgenen Linie. Der gleichzeitige Nachweis der Expression von RNA (insm1a, die Sonde für insm1a, Abbildung 3A) und Protein (GFP, antiGFP, Abbildung 3B) kann für die Protein- und mRNA-Kolokalisationsanalyse verwendet werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um die Kolokalisation von Protein und RNA zu detektieren und ihre räumliche Beziehung zu verstehen.
Abbildung 1: Gliederung der Methode. Dieses Flussdiagramm zeigt einen experimentellen Arbeitsablauf. Der Workflow kann in mindestens 9 Tagen abgeschlossen werden (siehe die Anzahl der Tage in der oberen rechten Ecke jeder Phase im Workflow), obwohl einige Schritte in einem längeren Zeitraum abgeschlossen werden können, wie im Protokoll beschrieben. Abkürzungen: PFA = Paraformaldehyd; O/N = über Nacht; RT = Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Whole-Mount-Embryonen, gefärbt mit 5-HT2C-Sonde und GFP-Antikörper in Tg (foxP2:egfp-caax). Hellfeld- (A), Fluoreszenz- (B) und zusammengefügte Bilder (C) zeigen die Expression von 5-HT2C (die Sonde für htr2c, A) und GFP (antiGFP, B) in foxP2-Neuronen und Axonbahnen. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Whole-Mount-Embryonen, gefärbt mit insm1a-Sonde und GFP-Antikörper in Tg (hb9:egfp). Hellfeld- (A), Fluoreszenz- (B) und verschmolzene Bilder (C) zeigen die Expression von insm1a (die Sonde für insm1a, A) und GFP (anti-GFP, B) in hb9-Neuronen. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Embryonen | Zeit |
| 24 HPF | 2 Minuten |
| 30 hpf | 3 Minuten |
| 36 hpf | 5 Minuten |
| 48 PS | 10 Minuten |
| 72 hpf | 15 Minuten |
| 96 PS | 45 Minuten |
| 4-5 dpf | 60 Minuten |
Tabelle 1: Verdauungszeit der Proteinase K für Zebrafischembryonen. Abkürzungen: hpf = Stunden nach der Befruchtung; DPF = Tage nach der Befruchtung.
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Discussion
Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen14,15,16 wurden Immunfluoreszenz und Immunhistochemie verwendet, um die Proteinexpression zu untersuchen. Nur wenige zebrafischspezifische Antikörper wurden für die Verwendung in den Abschnitten17 angemessen validiert. Frühere Studien haben nur eine Technik verwendet: Immunfluoreszenz, Immunhistochemie oder In-situ-Hybridisierung. Die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zur Analyse von RNA und Protein überwindet die Grenzen einer einzelnen Technik. Der erste Schritt war die In-situ-Hybridisierung, die die mRNA stark vor dem Abbau schützt. Die Antigengewinnung wurde durch Erhitzen induziert, um eine Störung der Antikörperbindung während der immunhistochemischen Färbung durch die Proteinase K-Behandlung zu vermeiden. Ob dieser Ansatz für alle Antigene funktioniert, bedarf weiterer Tests. Bilder der Schnitte zeigten, dass der 5-HT2C-Rezeptor in foxP2-Neuronen und der insm1a-Rezeptor in hb9-Neuronen koexprimiert wurde.
Die Whole-Mount-In-situ-Hybridisierung bewahrt die Integrität der Proben erheblich. Eine In-situ-Hybridisierung mit anschließender Schnittierung kann die Inkubationszeit für die Antikörperfärbung verkürzen. Darüber hinaus kann die Antikörperfärbung nach In-situ-Hybridisierung dazu beitragen, Fluoreszenzlöschung zu vermeiden.
Die folgenden spezifischen Schritte sind für den Erfolg des Experiments unerlässlich. Der erste kritische Schritt besteht darin, den Embryo wieder in 4% PFA zu fixieren. Dieser Schritt stoppt die Proteinase-K-Reaktion, da PFA die Proteinase K inaktiviert. Die Proben sollten vorsichtig gemischt werden, um alle Embryonen PFA auszusetzen. Das Röhrchen kann auch auf die Seite gelegt werden, so dass die Embryonen gleichmäßig in der Lösung verteilt werden. Der zweite kritische Schritt ist die Behandlung des Embryos während der OCT-Implantation. Die Embryonen sollten in einer bestimmten Richtung angeordnet werden (entweder dorsal-ventral oder lateral), wobei sie gerade gehalten werden müssen, damit sie für alle Embryonen in Abschnitte aus ungefähr demselben Bereich geschnitten werden können. Eine kleine Nadel wird verwendet, um kleine, bewusste Bewegungen im viskosen OCT-Medium auszuführen, um den Embryo zu lokalisieren und Blasen zu entfernen.
Es gibt mehrere mögliche Änderungen, die auf das beschriebene Szenario angewendet werden können. Die Verdauungszeit der Proteinase K in situ Hybridisierung kann anhand der verschiedenen Entwicklungsstadien der Zebrafischembryonen bestimmt werden (Tabelle 1). Darüber hinaus ist die Dicke der Kryoschnitte sehr flexibel und kann nach experimentellen Anforderungen bestimmt werden. Es wird zwar prognostiziert, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von Experimenten geeignet sein wird, aber er hat einige potenzielle Einschränkungen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens hängt davon ab, dass eine vollständige Probe durch zwei aufeinanderfolgende Experimente erhalten bleibt. Es gibt mehrere mögliche Pausenpunkte in diesem Protokoll. Die dehydrierten Embryonen können in 30%iger Saccharoselösung bei -20 °C mehrere Monate gelagert werden14. Ebenso können die vorbereiteten Objektträger in einer Objektträgerbox bei -20 °C länger als 1 Jahr gelagert werden14. Die gefrorenen Blöcke können drei Monate bei -80 °C gelagert werden.
Dieses Protokoll für die In-situ-Hybridisierung in Kombination mit Immunhistochemie hat sich beim Nachweis der Expression von 5-HT2C und insm1a in Zebrafischembryonen als erfolgreich erwiesen und kann leicht auf eine Vielzahl von Geweben in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf Neuronen oder Gliazellen angewendet werden, was Neurowissenschaftlern einen robusten Forschungsansatz bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), der Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) und der Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
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