Summary
Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.
Abstract
Come vertebrato, il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato negli studi biologici. Il pesce zebra e gli esseri umani condividono un'elevata omologia genetica, che ne consente l'uso come modello per le malattie umane. Lo studio della funzione genica si basa sulla rilevazione dei modelli di espressione genica. Sebbene l'immunoistochimica offra un modo potente per saggiare l'espressione proteica, il numero limitato di anticorpi disponibili in commercio nel pesce zebra limita l'applicazione del costaining. L'ibridazione in situ è ampiamente utilizzata negli embrioni di zebrafish per rilevare l'espressione di mRNA. Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando ibridazione in situ e immunoistochimica per sezioni di embrioni di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. L'immunoistochimica e l'imaging di una singola criosezione sono stati eseguiti dopo l'ibridazione in situ . Il protocollo è utile per svelare il modello di espressione di due geni, prima mediante il rilevamento di trascritti in situ e poi mediante immunoistochimica contro una proteina nella stessa sezione.
Introduction
Il pesce zebra è un potente modello di vertebrato per studi di sviluppo e genetica 1,2. Il pesce zebra e l'uomo condividono un'elevata omologia genetica (il 70% dei geni sono condivisi con il genoma umano), che ne consente l'uso come modello per le malattie umane3. Nel pesce zebra, è abbastanza comune rilevare i modelli di espressione di due geni e la loro relazione spaziale. L'immunoistochimica è stata utilizzata per la prima volta nel 1941 per rilevare agenti patogeni nei tessuti infetti applicando anticorpi marcati con FITC4. La proteina bersaglio nella sezione del tessuto viene prima marcata con un anticorpo primario e la sezione viene quindi etichettata con un anticorpo secondario contro l'immunoglobulina della specie ospite dell'anticorpo primario. La colorazione anticorpale è un approccio robusto per rilevare la localizzazione delle proteine, che offre un'elevata risoluzione ottica a livello intracellulare. Tuttavia, il numero di anticorpi disponibili è molto limitato nel pesce zebra. Uno studio recente mostra che circa 112.000 anticorpi sono disponibili in commercio per i topi; Tuttavia, pochissimi anticorpi si sono dimostrati affidabili nel pesce zebra5.
Invece, nel pesce zebra, l'ibridazione in situ è stata ampiamente applicata per l'analisi del pattern di espressione genica. Questo metodo è stato utilizzato per la prima volta per valutare l'espressione genica negli embrioni di Drosophila nel 19806,7, e da allora, questa tecnologia è stata continuamente sviluppata e migliorata. Inizialmente, sono state utilizzate sonde di DNA radiomarcate per rilevare trascritti di mRNA; Tuttavia, la risoluzione spaziale era relativamente bassa e c'erano potenziali rischi per la salute causati dalla radioattività. Successivamente, l'ibridazione in situ si basa sulle sonde di RNA marcate con digoxigenina (DIG) o fluoresceina (Fluo), che sono coniugate alla fosfatasi alcalina (AP) o rilevate mediante amplificazione del segnale fluorescente della tiramido (TSA)8,9. Sebbene la TSA sia stata utilizzata per rilevare due o tre geni, l'etichettatura DIG delle sonde di RNA e degli anticorpi antiDIG coniugati con AP sono ancora approcci altamente sensibili, stabili e ampiamente utilizzati per l'ibridazione in situ. Pertanto, gli anticorpi commercializzati combinati con sonde in situ marcate con DIG sono utili per fornire informazioni sulla localizzazione delle proteine e sull'espressione di un gene.
Gli embrioni interi non possono rivelare la relazione spaziale tra i geni a causa della bassa risoluzione ottica, anche se gli embrioni di zebrafish sono piccoli e trasparenti10. Quindi, il sezionamento è necessario per analizzare i modelli di espressione dei geni a livello intracellulare. La criosezione è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra in quanto è facile da eseguire e può preservare efficacemente l'antigene. Pertanto, l'ibridazione in situ combinata con l'immunoistochimica nelle criosezioni del pesce zebra offre un modo potente per analizzare i modelli di espressione di due geni. Una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica è stata applicata al pesce zebra11. Tuttavia, il trattamento con proteinasi K è stato utilizzato per migliorare la penetrazione della sonda a scapito dell'integrità dell'antigene. Per superare questa limitazione, questo protocollo utilizza il riscaldamento per indurre il recupero dell'antigene. Questo protocollo non è applicabile solo a embrioni di diversi stadi e sezioni di tessuto di vari spessori (sezioni della testa da 14 μm e sezioni del midollo spinale da 20 μm), ma è stato anche verificato utilizzando geni espressi in due organi, tra cui la testa e il midollo spinale.
Questo articolo descriverà come combinare l'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale negli embrioni di zebrafish nelle criosezioni. La versatilità di questo protocollo è dimostrata utilizzando una serie di combinazioni di ibridazione in situ-immunoistochimica, comprese le sonde di ibridazione in situ per due diversi neuroni. Questo metodo è adatto per rilevare mRNA e proteine in diverse regioni ed embrioni di età diverse, nonché i modelli di espressione di due geni.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nantong (n. S20191210-402).
1. Raccolta di embrioni di zebrafish
- Sistemare una coppia di zebrafish in vasche di riproduzione la sera prima della raccolta delle uova, uno un pesce zebra transgenico e l'altro un pesce zebra selvatico AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type o Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (vedi la tabella dei materiali). Utilizzare un divisorio diagonale di plastica per separare il maschio e la femmina per precludere l'accesso fisico. Il giorno seguente, montare la parte superiore della vasca di riproduzione in una parte inferiore pulita piena di acqua dolce e rimuovere il divisorio della vasca di allevamento. Lasciare che il pesce si accoppia per 10-20 minuti e raccogliere le uova dopo che sono affondate sul fondo della vasca di riproduzione.
- Coltura degli embrioni in terreno embrionale E3 (vedere la tabella dei materiali) contenente blu di metilene (1 mL di blu di metilene allo 0,05% in 1 L di terreno embrionale E3) a 28,5 °C.
- Trattare gli embrioni a 24 ore dopo la fecondazione (hpf) con feniltiourea (PTU, vedere la tabella dei materiali) per prevenire la formazione di pigmento.
NOTA: Gli animali di entrambi i sessi sono usati negli esperimenti.
2. Ibridazione in situ
NOTA: L'acqua utilizzata per le fasi 2.1-2.11 è acqua trattata con dietil pirocarbonato (DEPC) (vedere la tabella dei materiali).
- Fissare ~10 embrioni con 0,5-1 mL di paraformaldeide fresca al 4% (PFA, vedi la Tabella dei Materiali) in una provetta microfuge da 1,5 mL a 4 °C per una notte per 12-14 ore.
NOTA: Il protocollo per l'ibridazione in situ è leggermente modificato rispetto alla letteratura precedentemente pubblicata12. Il PFA deve essere preparato di fresco e conservato a 4 °C entro una settimana dall'uso o per un mese a -20 °C. Tutte le fasi successive dell'ibridazione in situ sono state eseguite utilizzando provette microfughe da 1,5 ml. - Utilizzare una pinzetta per rimuovere la pelle solo degli embrioni di età superiore a 48 hpf.
NOTA: La pelle viene rimossa per facilitare la penetrazione delle sonde di RNA nella regione del tronco degli embrioni di età superiore a 48 hpf. - Disidratare gradualmente gli embrioni lavando con il 25%, 50% e 75% di metanolo in 1x soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,1% di Tween-20 successivamente (PBST, vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni per 5 minuti in metanolo al 100% a temperatura ambiente. Incubare gli embrioni in metanolo al 100% a -20 °C per almeno una notte per 12-14 ore.
NOTA: Gli embrioni disidratati possono essere conservati al 100% in metanolo a -20 °C per 6 mesi. - Reidratare gradualmente gli embrioni lavando con metanolo al 75%, 50% e 25% in PBST successivamente per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Lavare l'embrione tre volte con PBST per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
- Digerire gli embrioni con 10 μg/mL di proteinasi K (vedere la Tabella dei Materiali) in PBST a temperatura ambiente (vedere Tabella 1).
- Lavare gli embrioni con PBST per 5 minuti. Eseguire questa fase di lavaggio tre volte.
- Rifissare gli embrioni lavati in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Questo passaggio interrompe la digestione perché PFA inattiva la proteinasi K. Assicurarsi che il campione sia miscelato delicatamente per esporre tutti gli embrioni al PFA; I tubi possono essere posizionati sui loro lati per distribuire uniformemente gli embrioni nella soluzione. Questo PFA non deve essere fresco (può essere refrigerato per un massimo di 2 settimane). - Lavare l'embrione tre volte con PBST, incubando per 5 minuti durante ogni lavaggio.
- Eseguire la preibridazione degli embrioni mediante incubazione con soluzione di preibridazione (preHYB, vedere la tabella dei materiali) a 65 °C per 5 minuti. Sostituire preHYB con una soluzione di ibridazione (HYB, vedere la tabella dei materiali) e preibridare per almeno 4 ore in HYB.
NOTA: Prima di procedere con la preibridazione, preriscaldare le soluzioni a 65 °C. La formammide (vedi la tabella dei materiali) viene utilizzata per mantenere la forma e la struttura del tessuto. La formammide impedisce anche il legame di frammenti non omologhi a basse temperature. - Riscaldare la sonda (Insm1a o 5-HT2C) in HYB per 5 minuti a 95 °C prima di aggiungerla agli embrioni. Utilizzare la sonda a 1 μg/mL HYB. Rimuovere quanto più preHYB possibile senza lasciare che gli embrioni entrino in contatto con l'aria e aggiungere la sonda preriscaldata in HYB alla provetta contenente gli embrioni.
NOTA: Una sonda di RNA marcata può essere utilizzata per ibridarsi con una sequenza di mRNA bersaglio negli embrioni. Pertanto, la sonda può essere utilizzata per rilevare l'espressione di un gene di interesse e la posizione dell'mRNA. - Lasciare ibridare la sonda durante la notte (12-14 h) a 50-70 °C.
NOTA: la temperatura di ibridazione differisce per le diverse sonde. - Il giorno successivo, aspirare la soluzione della sonda con una pipetta e conservarla in un tubo a -20 °C in modo che possa essere riutilizzata più volte.
- Lavare gli embrioni come segue:
- Lavare gli embrioni per 15 minuti con 100% HYB a 65 °C.
- Lavare gli embrioni in sequenza con HYB al 75%, 50% e 25% in 2x citrato salino standard contenente 0,1% di Tween-20 (SSCT, vedere la tabella dei materiali) per 15 minuti ciascuno a 65 °C.
- Lavare gli embrioni per 15 minuti in 2x SSCT a 65 °C.
- Lavare gli embrioni per 15 minuti in 0,2x SSCT a 65 °C.
- Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in tampone di acido maleico contenente 0,02% Tween-20 (MABT, vedere la tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
- Bloccare gli embrioni ibridati e lavati per almeno 2 ore a temperatura ambiente con soluzione bloccante al 2% 1 (vedere la tabella dei materiali).
- Sostituire la soluzione bloccante-1 con antidigoxigenina AP (diluizione 1:4.000, vedere la tabella dei materiali) in una nuova soluzione bloccante al 2%-1 e agitare per una notte per 12-14 ore a 4 °C.
- Lavare gli embrioni quattro volte per 30 minuti in MABT a temperatura ambiente.
NOTA: Rimuovere il BM purple (vedere la tabella dei materiali) dal frigorifero durante il terzo lavaggio e agitarlo di tanto in tanto durante i lavaggi successivi. - Lavare gli embrioni due volte per 10 minuti in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, vedere la tabella dei materiali).
- Utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più NTMT possibile dagli embrioni. Sostituire con il substrato AP viola BM e colorare gli embrioni a temperatura ambiente al buio. Monitorare i cambiamenti di colore ogni 30 minuti per controllare il grado di tintura.
NOTA: Il tempo di tintura specifico è diverso e deve essere regolato in base a ciascuna sonda. L'incubazione degli embrioni a 37 °C può accelerare la reazione. L'incubazione degli embrioni a 4 °C può aumentare il tempo di reazione e può essere effettuata durante la notte. - Una volta sviluppato nella misura desiderata, interrompere la reazione risciacquando brevemente con NTMT due volte. Dopo l'ibridazione in situ , sciacquare gli embrioni con PBST tre volte per 20 minuti.
3. Incorporamento
- Immergere gli embrioni in saccarosio al 5% in 1x PBS (vedi la tabella dei materiali) durante la notte per 12-14 ore a 4 °C.
- Cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 15% di saccarosio in 1x PBS e incubare per una notte per 12-16 ore a 4 °C.
- Cambiare la soluzione che copre gli embrioni al 30% di saccarosio in 1x PBS e incubare per 1-2 giorni a 4 °C.
NOTA: Incubare in questa soluzione fino a quando gli embrioni affondano sul fondo del tubo. - Riempire un criomold con un mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali). Trasferire gli embrioni in saccarosio al 30% al criomold con terreno OCT. Mescolarli per rimuovere il saccarosio dagli embrioni.
- Trasferire gli embrioni in un nuovo criomold per tessuto e riempirlo delicatamente con mezzo OCT, evitando la formazione di bolle.
- Immergere ogni embrione, spingendolo verso il fondo del criostampo, e posizionare ogni embrione nell'orientamento desiderato (dorsale-ventrale o laterale). Mantieni gli embrioni in linea retta.
NOTA: Si raccomanda vivamente di posizionare un solo embrione in ogni criomold (vedere la tabella dei materiali). - Posizionare gli embrioni incorporati in criostampi in un bagno di etanolo ghiacciato secco.
- Conservare a -80 °C almeno per una notte per 12-14 h.
NOTA: I criomuffi possono essere mantenuti a -80 °C per almeno un mese.
4. Criosezione
- Impostare le criosezioni con un criostato a -20 °C.
- Rimuovere il blocco del campione dal criomold e posizionarlo nel criostato. Posizionare il mezzo OCT sulla base del mandrino refrigerato e posizionare il blocco sopra.
- Assicurarsi che il blocco del campione sia parallelo alla lama del rasoio. Tagliare con cura il mezzo OCT in eccesso attorno al campione.
- Tagliare in sezioni spesse 12-20 μm usando un criostato. Trasferire rapidamente le sezioni su vetrini in modo che ogni diapositiva abbia 3-4 sezioni. Lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente e conservare le sezioni in una scatola di scorrimento sigillata a -80 °C per un uso successivo.
5. Immunocolorazione
NOTA: la colorazione GFP viene eseguita sulle sezioni.
- Lavare i vetrini contenenti le sezioni con PBS per 5 min.
- Riscaldare il tampone citrato a ebollizione in un forno a microonde.
- Posizionare i vetrini nel tampone e continuare a riscaldare per mantenere la soluzione vicino all'ebollizione per circa 20 minuti.
NOTA: questo passaggio aiuta nel recupero dell'antigene. Il tessuto rimane intatto anche ad alte temperature, il che migliora la qualità della colorazione prevenendo il piegamento, il danneggiamento o il distacco dei tessuti. - Lasciare raffreddare lentamente i campioni a temperatura ambiente prima della fase successiva. Scolare la soluzione in eccesso, asciugare accuratamente l'area intorno a ciascuna sezione con un pezzo di tessuto e disegnare un cerchio attorno alla sezione con una penna idrorepellente (vedere la tabella dei materiali) per formare una barriera idrofobica. Fare attenzione a non asciugare le sezioni di tessuto.
- Lavare i vetrini due volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
- Bloccare per 2 ore in soluzione bloccante-2 (vedere la tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
- Pipettare la soluzione di anticorpi primari (monoclonale di topo α-GFP, 1:250, vedere la tabella dei materiali) per vetrino e incubare i vetrini in una scatola umida immunoistochimica a 4 °C durante la notte.
- Lavare i vetrini tre volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
- Drenare il PBS in eccesso. Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario appropriato (1:400, vedere la Tabella dei Materiali) per 1 ora a temperatura ambiente in PBS.
- Lavare i vetrini tre volte con PBS, incubando per 10 minuti durante ogni lavaggio.
- Scaricare il PBS in eccesso, pipettare il mezzo di montaggio sul vetrino e montare con una slitta di copertura della slitta.
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Representative Results
Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare simultaneamente il modello di espressione di un mRNA e di una proteina. Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro sperimentale. Il recettore 5-HT2C è un sottotipo del recettore 5-HT legato dal neurotrasmettitore serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT). È ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale (SNC) e può regolare significativamente una varietà di funzioni cerebrali, tra cui appetito, umore, ansia e comportamento riproduttivo13. L'espressione di 5-HT2C nel SNC è stata rilevata dalla linea transgenica Tg (foxp2:egfp-caax), in cui i neuroni foxP2 sono marcati dalla proteina fluorescente verde fluoresceina (GFP). La GFP non è stata espressa nel pesce zebra wild-type ma solo nella linea transgenica. La rilevazione simultanea dell'espressione di RNA (5-HT2C, la sonda per htr2c, Figura 2A) e proteina (GFP, antiGFP, Figura 2B) può essere utilizzata per l'analisi di colocalizzazione di proteine e mRNA.
L'insulinoma-associated 1a (insm1a), un fattore di trascrizione zinco-finger, è stato identificato per la prima volta dalla libreria di riduzione del tumore e ha svolto diverse funzioni nella formazione e differenziazione del sistema nervoso centrale e periferico dei vertebrati e del sistema neuroendocrino. Studi recenti hanno dimostrato che insm1a è un importante regolatore dello sviluppo del motoneurone. L'espressione di insm1a nel midollo spinale e nei motoneuroni del pesce zebra è stata rilevata dalla linea transgenica Tg (hb9:egfp), in cui i neuroni hb9 sono marcati mediante fluoresceina GFP. La GFP non è stata espressa nel pesce zebra wild-type ma solo nella linea transgenica. La rilevazione simultanea dell'espressione di RNA (insm1a, la sonda per insm1a, Figura 3A) e proteina (GFP, antiGFP, Figura 3B) può essere utilizzata per l'analisi di colocalizzazione di proteine e mRNA. Questo protocollo è stato applicato con successo per rilevare la colocalizzazione di proteine e RNA per comprendere la loro relazione spaziale.
Figura 1: Schema del metodo. Questo diagramma di flusso mostra un flusso di lavoro sperimentale. Il flusso di lavoro può essere completato in un minimo di 9 giorni (vedere il numero di giorni nell'angolo in alto a destra di ogni fase del flusso di lavoro), anche se alcuni passaggi possono essere completati in un periodo più lungo, come descritto nel protocollo. Abbreviazioni: PFA = paraformaldeide; O/N = pernottamento; RT = temperatura ambiente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Embrioni interi colorati con sonda 5-HT2C e anticorpo GFP in Tg (foxP2:egfp-caax). Le immagini in campo chiaro (A), fluorescenti (B) e unite (C) mostrano l'espressione di 5-HT2C (la sonda per htr2c, A) e GFP (antiGFP, B) nei neuroni foxP2 e nei tratti assonici. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Embrioni interi colorati con sonda insm1a e anticorpo GFP in Tg (hb9:egfp). Le immagini in campo chiaro (A), fluorescenti (B) e unite (C) mostrano l'espressione di insm1a (la sonda per insm1a, A) e GFP (anti-GFP, B) nei neuroni hb9. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Embrioni | Ore |
| 24 CV | 2 minuti |
| 30 CVF | 3 minuti |
| 36 CV | 5 minuti |
| 48 CV | 10 minuti |
| 72 CV | 15 minuti |
| 96 CV | 45 minuti |
| 4-5 dpf | 60 minuti |
Tabella 1: Tempo di digestione della proteinasi K per embrioni di zebrafish. Abbreviazioni: hpf = ore dopo la fecondazione; DPF = giorni dopo la fecondazione.
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Discussion
Questo protocollo propone una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica, un passo importante negli esperimenti di colocalizzazione su embrioni di zebrafish. Questo metodo serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. L'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale sono state eseguite su embrioni di zebrafish. In contrasto con diversi protocolli pubblicati in precedenza14,15,16, l'immunofluorescenza e l'immunoistochimica sono state utilizzate per esplorare l'espressione proteica. Pochi anticorpi specifici del pesce zebra sono stati opportunamente convalidati per l'uso nei paragrafi17. Studi precedenti hanno utilizzato una sola tecnica: immunofluorescenza, immunoistochimica o ibridazione in situ. La combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica per analizzare RNA e proteine supera i limiti di qualsiasi tecnica. Il primo passo è stata l'ibridazione in situ, che protegge notevolmente l'mRNA dalla degradazione. Il recupero dell'antigene è stato indotto mediante riscaldamento per evitare l'interruzione da parte del trattamento con proteinasi K del legame anticorpale durante la colorazione immunoistochimica. Se questo approccio funziona per tutti gli antigeni richiederà ulteriori test. Le immagini delle sezioni hanno mostrato che il recettore 5-HT2C era coespresso nei neuroni foxP2 e che il recettore insm1a era coespresso nei neuroni hb9.
L'ibridazione in situ a montaggio intero preserva notevolmente l'integrità dei campioni. L'ibridazione in situ seguita dal sezionamento può ridurre il tempo di incubazione per la colorazione degli anticorpi. Inoltre, la colorazione anticorpale dopo l'ibridazione in situ può aiutare a evitare la tempra a fluorescenza.
I seguenti passaggi specifici sono essenziali per il successo dell'esperimento. Il primo passo critico è quello di rifissare l'embrione in PFA al 4%. Questo passaggio interrompe la reazione della proteinasi K perché la PFA inattiva la proteinasi K. I campioni devono essere miscelati delicatamente per esporre tutti gli embrioni alla PFA; Il tubo può anche essere posizionato su un lato in modo che gli embrioni siano distribuiti uniformemente nella soluzione. Il secondo passo critico è il trattamento dell'embrione durante l'impianto di OCT. Gli embrioni dovrebbero essere disposti in una direzione specifica (dorsale-ventrale o laterale), mantenendoli dritti in modo che possano essere tagliati in sezioni all'incirca dalla stessa area per tutti gli embrioni. Un piccolo ago viene utilizzato per fare piccoli movimenti coscienti nel mezzo viscoso OCT per localizzare l'embrione e rimuovere le bolle.
Esistono diverse potenziali modifiche che possono essere applicate allo scenario descritto. Il tempo di digestione della proteinasi K nell'ibridazione in situ può essere determinato in base ai diversi stadi di sviluppo degli embrioni di zebrafish (Tabella 1). Inoltre, lo spessore delle criosezioni è molto flessibile e può essere determinato in base alle esigenze sperimentali. Mentre si prevede che questo approccio sarà adatto per una vasta gamma di esperimenti, ha alcune potenziali limitazioni. Il successo dell'esecuzione di questa procedura dipende dal mantenimento di un campione completo attraverso due esperimenti successivi. Ci sono più possibili punti di pausa in questo protocollo. Gli embrioni disidratati possono essere conservati in una soluzione di saccarosio al 30% a -20 °C per diversi mesi14. Allo stesso modo, i vetrini preparati possono essere conservati in una scatola di scorrimento a -20 °C per più di 1 anno14. I blocchi congelati possono essere conservati a -80 °C per tre mesi.
Questo protocollo per l'ibridazione in situ combinato con l'immunoistochimica ha dimostrato di avere successo nel rilevare l'espressione di 5-HT2C e insm1a negli embrioni di zebrafish e può essere facilmente applicato a una varietà di tessuti in diversi stadi di sviluppo. Inoltre, questo protocollo può essere applicato ai neuroni o alle cellule gliali, fornendo un solido approccio sperimentale per i neuroscienziati.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e dalla Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
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