Summary
Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.
Abstract
En tant que vertébré, le poisson zèbre a été largement utilisé dans les études biologiques. Le poisson zèbre et les humains partagent une homologie génétique élevée, ce qui permet son utilisation comme modèle pour les maladies humaines. L’étude de la fonction génique est basée sur la détection des profils d’expression génique. Bien que l’immunohistochimie offre un moyen puissant de tester l’expression des protéines, le nombre limité d’anticorps disponibles dans le commerce chez le poisson zèbre limite l’application de costaining. L’hybridation in situ est largement utilisée dans les embryons de poisson zèbre pour détecter l’expression de l’ARNm. Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les coupes d’embryons de poisson zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. L’immunohistochimie et l’imagerie d’une seule cryosection ont été réalisées après hybridation in situ . Le protocole est utile pour démêler le schéma d’expression de deux gènes, d’abord par détection de transcrits in situ , puis par immunohistochimie contre une protéine dans la même section.
Introduction
Le poisson-zèbre est un puissant modèle vertébré pour les études de développement et de génétique 1,2. Le poisson-zèbre et l’homme partagent une homologie génétique élevée (70% des gènes sont partagés avec le génome humain), ce qui permet son utilisation comme modèle pour les maladies humaines3. Chez le poisson zèbre, il est assez courant de détecter les schémas d’expression de deux gènes et leur relation spatiale. L’immunohistochimie a été utilisée pour la première fois en 1941 pour détecter les agents pathogènes dans les tissus infectés en appliquant des anticorps marqués FITC4. La protéine cible dans la section tissulaire est d’abord marquée avec un anticorps primaire, puis la section est marquée avec un anticorps secondaire contre l’immunoglobuline de l’espèce hôte de l’anticorps primaire. La coloration par anticorps est une approche robuste pour détecter la localisation des protéines, qui offre une résolution optique élevée au niveau intracellulaire. Cependant, le nombre d’anticorps disponibles est très limité chez le poisson zèbre. Une étude récente montre qu’environ 112 000 anticorps sont disponibles dans le commerce pour les souris; Cependant, très peu d’anticorps se sont révélés fiables chez le poisson zèbre5.
Au lieu de cela, chez le poisson zèbre, l’hybridation in situ a été largement appliquée pour l’analyse du modèle d’expression génique. Cette méthode a été utilisée pour la première fois pour évaluer l’expression génique dans les embryons de drosophile dans les années 19806,7, et depuis lors, cette technologie a été continuellement développée et améliorée. Initialement, des sondes ADN radiomarquées ont été utilisées pour détecter les transcrits d’ARNm; Cependant, la résolution spatiale était relativement faible et la radioactivité présentait des risques potentiels pour la santé. Par la suite, l’hybridation in situ repose sur les sondes à ARN marquées à la digoxigénine (DIG) ou à la fluorescéine (Fluo), qui sont conjuguées à la phosphatase alcaline (AP) ou détectées par amplification fluorescente du signal tyramide (TSA)8,9. Bien que la TSA ait été utilisée pour détecter deux ou trois gènes, le marquage DIG des sondes à ARN et des anticorps conjugués antiDIG AP sont encore des approches très sensibles, stables et largement utilisées pour l’hybridation in situ. Par conséquent, les anticorps commercialisés combinés à des sondes in situ marquées par DIG sont utiles pour fournir un aperçu de la localisation et de l’expression des protéines d’un gène.
Les embryons entiers ne peuvent pas révéler la relation spatiale entre les gènes en raison de la faible résolution optique, même si les embryons de poisson zèbre sont petits et transparents10. Par conséquent, la sectionnement est nécessaire pour analyser les modèles d’expression des gènes au niveau intracellulaire. La cryosectionnement a été largement utilisée chez le poisson zèbre car elle est facile à réaliser et peut préserver efficacement l’antigène. Par conséquent, l’hybridation in situ combinée à l’immunohistochimie dans les cryosections de poisson zèbre offre un moyen puissant d’analyser les schémas d’expression de deux gènes. Une combinaison d’hybridation in situ et d’immunohistochimie a été appliquée au poisson zèbre11. Cependant, le traitement par protéinase K a été utilisé pour améliorer la pénétration de la sonde au détriment de l’intégrité de l’antigène. Pour surmonter cette limitation, ce protocole utilise le chauffage pour induire la récupération de l’antigène. Ce protocole est non seulement applicable aux embryons de différents stades et aux coupes tissulaires de différentes épaisseurs (coupes de tête de 14 μm et coupes de moelle épinière de 20 μm), mais il a également été vérifié en utilisant des gènes exprimés dans deux organes, dont la tête et la moelle épinière.
Cet article décrira comment combiner l’hybridation in situ et la coloration d’anticorps dans des embryons de poisson zèbre dans des cryosections. La polyvalence de ce protocole est démontrée par l’utilisation d’un certain nombre de combinaisons hybridation-immunohistochimie in situ, y compris des sondes d’hybridation in situ pour deux neurones différents. Cette méthode convient à la détection de l’ARNm et des protéines dans différentes régions et embryons d’âges différents, ainsi que des schémas d’expression de deux gènes.
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Protocol
Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Nantong (n ° S20191210-402).
1. Collecte d’embryons de poisson zèbre
- Installez une paire de poissons-zèbres dans des bassins d’élevage la veille de la collecte des œufs, l’un étant un poisson zèbre transgénique et l’autre un poisson zèbre de type sauvage AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB de type sauvage ou Tg (hb9:egfp) X AB de type sauvage) (voir le tableau des matières). Utilisez un séparateur en plastique diagonal pour séparer le mâle et la femelle afin d’empêcher l’accès physique. Le lendemain, placez la partie supérieure du réservoir d’élevage dans une partie inférieure propre remplie d’eau douce et retirez le séparateur du réservoir d’élevage. Laissez le poisson s’accoupler pendant 10-20 minutes et ramassez les œufs après qu’ils aient coulé au fond de l’aquarium de reproduction.
- Culture des embryons dans un milieu embryonnaire E3 (voir le tableau des matières) contenant du bleu de méthylène (1 mL de bleu de méthylène à 0,05 % dans 1 L de milieu embryonnaire E3) à 28,5 °C.
- Traiter les embryons 24 h après la fécondation (HPF) avec la phénylthiourée (PTU, voir le tableau des matériaux) pour prévenir la formation de pigments.
NOTE: Les animaux des deux sexes sont utilisés dans des expériences.
2. Hybridation in situ
REMARQUE : L’eau utilisée pour les étapes 2.1 à 2.11 est de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) (voir le tableau des matières).
- Fixer ~10 embryons avec 0,5-1 mL de paraformaldéhyde frais à 4% (PFA, voir le tableau des matières) dans un tube à microfuge de 1,5 mL à 4 °C pendant une nuit pendant 12-14 h.
NOTE : Le protocole d’hybridation in situ est légèrement modifié par rapport à la littérature publiée précédemment12. Le PFA doit être fraîchement préparé et conservé à 4 °C dans la semaine suivant son utilisation ou pendant un mois à -20 °C. Toutes les étapes suivantes de l’hybridation in situ ont été réalisées à l’aide de tubes microfuges de 1,5 mL. - Utilisez une pince à épiler pour enlever la peau des embryons âgés de plus de 48 hpf.
REMARQUE: La peau est enlevée pour faciliter la pénétration des sondes d’ARN dans la région du tronc des embryons âgés de plus de 48 hpf. - Déshydrater progressivement les embryons en les lavant avec 25 %, 50 % et 75 % de méthanol dans 1x solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1 % de Tween-20 successivement (PBST, voir le tableau des matières) pendant 5 min chacun à température ambiante. Ensuite, lavez les embryons pendant 5 min dans du méthanol à 100% à température ambiante. Incuber les embryons dans du méthanol à 100% à -20 °C pendant au moins une nuit pendant 12-14 h.
REMARQUE: Les embryons déshydratés peuvent être conservés dans du méthanol à 100% à -20 ° C pendant 6 mois. - Réhydrater progressivement les embryons en les lavant avec 75%, 50% et 25% de méthanol dans du PBST successivement pendant 5 min chacun à température ambiante. Laver l’embryon trois fois avec PBST pendant 5 minutes chacun à température ambiante.
- Digérer les embryons avec 10 μg/mL de protéinase K (voir le tableau des matières) dans du PBST à température ambiante (voir le tableau 1).
- Laver les embryons avec PBST pendant 5 min. Effectuez cette étape de lavage trois fois.
- Refixer les embryons lavés dans du PFA à 4% pendant 15 min à température ambiante.
REMARQUE: Cette étape arrête la digestion car le PFA inactive la protéinase K. Assurez-vous que l’échantillon est mélangé doucement pour exposer tous les embryons au PFA; Les tubes peuvent être placés sur leurs côtés pour répartir uniformément les embryons dans la solution. Ce PFA n’a pas besoin d’être frais (il peut être réfrigéré jusqu’à 2 semaines). - Lavez l’embryon trois fois avec PBST, en couvant pendant 5 minutes lors de chaque lavage.
- Effectuer la préhybridation des embryons en incubant avec une solution de préhybridation (préHYB, voir le tableau des matériaux) à 65 °C pendant 5 min. Remplacer le préHYB par une solution d’hybridation (HYB, voir le tableau des matières) et préhybrider pendant au moins 4 h dans HYB.
NOTE: Avant de procéder à la préhybridation, préchauffer les solutions à 65 °C. Le formamide (voir le tableau des matériaux) est utilisé pour maintenir la forme et la structure du tissu. Le formamide empêche également la liaison de fragments non homologues à basse température. - Chauffer la sonde (Insm1a ou 5-HT2C) dans HYB pendant 5 min à 95 °C avant de l’ajouter aux embryons. Utilisez la sonde à 1 μg/mL HYB. Retirer autant de préHYB que possible sans laisser les embryons entrer en contact avec l’air, et ajouter une sonde préchauffée dans HYB au tube contenant les embryons.
REMARQUE: Une sonde à ARN marquée peut être utilisée pour s’hybrider avec une séquence d’ARNm cible dans les embryons. Par conséquent, la sonde peut être utilisée pour détecter l’expression d’un gène d’intérêt et l’emplacement de l’ARNm. - Laisser la sonde s’hybrider pendant la nuit (12-14 h) à 50-70 °C.
REMARQUE: La température d’hybridation diffère selon les sondes. - Le lendemain, aspirez la solution de sonde avec une pipette et conservez-la dans un tube à -20 °C afin qu’elle puisse être réutilisée plusieurs fois.
- Lavez les embryons comme suit:
- Laver les embryons pendant 15 min avec 100% HYB à 65 °C.
- Laver les embryons séquentiellement avec 75%, 50% et 25% HYB dans 2x citrate de solution saline standard contenant 0,1% Tween-20 (SSCT, voir le tableau des matériaux) pendant 15 minutes chacun à 65 °C.
- Laver les embryons pendant 15 min dans 2x SSCT à 65 °C.
- Laver les embryons pendant 15 min dans 0,2x SSCT à 65 °C.
- Laver les embryons deux fois pendant 10 min dans un tampon d’acide maléique contenant 0,02 % de Tween-20 (MABT, voir le tableau des matières) à température ambiante.
- Bloquer les embryons hybrides et lavés pendant au moins 2 h à température ambiante avec la solution de blocage à 2 % 1 (voir le tableau des matières).
- Remplacer la solution bloquante-1 par l’antidigoxigénine AP (dilution 1:4 000, voir le tableau des matières) dans une nouvelle solution bloquante-1 à 2 % et agiter pendant une nuit pendant 12-14 h à 4 °C.
- Laver les embryons quatre fois pendant 30 min dans MABT à température ambiante.
REMARQUE : Retirez le BM violet (voir le tableau des matières) du réfrigérateur pendant le troisième lavage et secouez-le de temps en temps pendant les lavages suivants. - Laver les embryons deux fois pendant 10 min dans NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, voir le tableau des matériaux).
- Utilisez une pipette pour retirer autant de NTMT que possible des embryons. Remplacer par du substrat AP violet BM et colorer les embryons à température ambiante dans l’obscurité. Surveillez les changements de couleur toutes les 30 minutes pour contrôler le degré de teinture.
REMARQUE: Le temps de teinture spécifique est différent et doit être ajusté en fonction de chaque sonde. L’incubation des embryons à 37 °C peut accélérer la réaction. L’incubation des embryons à 4 °C peut augmenter le temps de réaction et peut être effectuée pendant la nuit. - Une fois qu’il est développé dans la mesure souhaitée, arrêter la réaction en rinçant brièvement avec NTMT deux fois. Après hybridation in situ , rincer les embryons avec du PBST trois fois pendant 20 min.
3. Intégration
- Immerger les embryons dans 5% de saccharose dans 1x PBS (voir le tableau des matériaux) pendant une nuit pendant 12-14 h à 4 °C.
- Changer la solution recouvrant les embryons à 15% de saccharose dans 1x PBS et incuber pendant une nuit pendant 12-16 h à 4 °C.
- Changer la solution recouvrant les embryons à 30% de saccharose dans 1x PBS et incuber pendant 1-2 jours à 4 °C.
REMARQUE: Incuber dans cette solution jusqu’à ce que les embryons coulent au fond du tube. - Remplir un cryomoule avec un milieu à température de coupe optimale (OCT) (voir le tableau des matériaux). Transférer les embryons dans 30% de saccharose dans le cryomoule avec milieu OCT. Remuez-les pour retirer le saccharose des embryons.
- Transférer les embryons dans un nouveau cryomoule pour tissu et le remplir doucement avec un milieu OCT, en évitant la formation de bulles.
- Immergez chaque embryon, en le poussant au fond du cryomoule, et placez chaque embryon dans l’orientation souhaitée (dorso-ventrale ou latérale). Gardez les embryons en ligne droite.
NOTE: Il est fortement recommandé de placer un seul embryon dans chaque cryomoule (voir le tableau des matériaux). - Placez les embryons incrustés dans des cryomoules dans un bain d’éthanol de glace carbonique.
- Conserver à -80 °C au moins pendant une nuit pendant 12-14 h.
REMARQUE: Les cryomoules peuvent être conservés à -80 ° C pendant au moins un mois.
4. Cryosectionnement
- Réglez les cryosections à l’aide d’un cryostat à -20 °C.
- Retirez le bloc d’échantillon du cryomoule et placez-le dans le cryostat. Placer le support OCT sur la base du mandrin réfrigéré et placer le bloc sur le dessus.
- Assurez-vous que le bloc d’échantillon est parallèle à la lame du rasoir. Couper soigneusement l’excès de milieu OCT autour de l’échantillon.
- Couper en sections de 12 à 20 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Transférez rapidement les sections sur des lames de verre afin que chaque diapositive comporte 3-4 sections. Laisser les échantillons atteindre la température ambiante et conserver les sections dans une boîte à lames scellée à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
5. Immunomarquage
REMARQUE: La coloration GFP est effectuée sur les sections.
- Lavez les lames contenant les sections avec du PBS pendant 5 min.
- Chauffer le tampon de citrate à ébullition au micro-ondes.
- Placez les lames dans le tampon et continuez à chauffer pour garder la solution près de l’ébullition pendant environ 20 minutes.
REMARQUE: Cette étape aide à la récupération de l’antigène. Le tissu reste intact même à des températures élevées, ce qui améliore la qualité des taches en empêchant le pliage, l’endommagement ou le détachement des tissus. - Laissez les échantillons refroidir lentement à température ambiante avant l’étape suivante. Égoutter l’excès de solution, sécher soigneusement la zone autour de chaque section avec un morceau de tissu et dessiner un cercle autour de la section avec un stylo hydrofuge (voir le tableau des matériaux) pour former une barrière hydrophobe. Veillez à ne pas sécher les coupes de tissu.
- Lavez les lames deux fois avec du PBS, en incubant pendant 10 minutes à chaque lavage.
- Bloquer pendant 2 h dans la solution de blocage-2 (voir le tableau des matières) à température ambiante.
- Pipeter la solution d’anticorps primaires (monoclonale de souris α-GFP, 1:250, voir le tableau des matériaux) par lame et incuber les lames dans une boîte humide immunohistochimique à 4 °C pendant la nuit.
- Lavez les lames trois fois avec du PBS, en incubant pendant 10 minutes à chaque lavage.
- Égoutter l’excès de PBS. Incuber les lames avec l’anticorps secondaire approprié (1:400, voir le tableau des matériaux) pendant 1 h à température ambiante dans PBS.
- Lavez les lames trois fois avec du PBS, en incubant pendant 10 minutes à chaque lavage.
- Vidangez l’excès de PBS, pipette le support de montage sur la glissière et montez à l’aide d’un couvercle de glissière.
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Representative Results
Ce protocole peut être utilisé pour examiner simultanément le modèle d’expression d’un ARNm et d’une protéine. La figure 1 illustre le flux de travail expérimental. Le récepteur 5-HT2C est un sous-type du récepteur 5-HT lié par le neurotransmetteur sérotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT). Il est largement distribué dans le système nerveux central (SNC) et peut réguler de manière significative une variété de fonctions cérébrales, y compris l’appétit, l’humeur, l’anxiété et le comportement reproductif13. L’expression de 5-HT2C dans le SNC a été détectée par la lignée transgénique Tg (foxp2:egfp-caax), dans laquelle les neurones foxP2 sont marqués par la protéine fluorescente verte fluorescéine (GFP). La GFP n’a pas été exprimée chez le poisson-zèbre de type sauvage, mais seulement dans la lignée transgénique. La détection simultanée de l’expression de l’ARN (5-HT2C, la sonde pour htr2c, Figure 2A) et de la protéine (GFP, antiGFP, Figure 2B) peut être utilisée pour l’analyse de colocalisation des protéines et des ARNm.
Le 1a associé à l’insulinome (insm1a), un facteur de transcription à doigts de zinc, a été identifié pour la première fois à partir de la bibliothèque de réduction tumorale et a joué plusieurs fonctions dans la formation et la différenciation du système nerveux central et périphérique des vertébrés et du système neuroendocrinien. Des études récentes ont montré que l’insm1a est un régulateur important du développement des motoneurones. L’expression d’insm1a dans la moelle épinière et les motoneurones du poisson zèbre a été détectée par la lignée transgénique Tg (hb9:egfp), dans laquelle les neurones hb9 sont marqués par la GFP à la fluorescéine. La GFP n’a pas été exprimée chez le poisson-zèbre de type sauvage, mais seulement dans la lignée transgénique. La détection simultanée de l’expression de l’ARN (insm1a, la sonde pour insm1a, Figure 3A) et de la protéine (GFP, antiGFP, Figure 3B) peut être utilisée pour l’analyse de colocalisation des protéines et des ARNm. Ce protocole a été appliqué avec succès pour détecter la colocalisation des protéines et de l’ARN afin de comprendre leur relation spatiale.
Figure 1 : Aperçu de la méthode. Cet organigramme montre un flux de travail expérimental. Le workflow peut être complété en un minimum de 9 jours (voir le nombre de jours dans le coin supérieur droit de chaque phase du workflow), bien que certaines étapes puissent être complétées dans une période plus longue, comme décrit dans le protocole. Abréviations : PFA = paraformaldéhyde; O/N = nuit; RT = température ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Embryons montés sur des montures entières colorés avec une sonde 5-HT2C et un anticorps GFP dans Tg (foxP2:egfp-caax). Les images en fond clair (A), fluorescentes (B) et fusionnées (C) montrent l’expression 5-HT2C (la sonde pour htr2c, A) et GFP (antiGFP, B) dans les neurones foxP2 et les faisceaux axonaux. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Embryons montés sur des montures entières colorés avec une sonde insm1a et un anticorps GFP dans Tg (hb9:egfp). Les images en fond clair (A), fluorescentes (B) et fusionnées (C) montrent l’expression insm1a (la sonde pour insm1a, A) et GFP (anti-GFP, B) dans les neurones hb9. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Embryons | Heure |
| 24 HPF | 2 min |
| 30 hpf | 3 min |
| 36 hpf | 5 min |
| 48 HPF | 10 min |
| 72 HPF | 15 min |
| 96 HPF | 45 min |
| 4-5 dpf | 60 min |
Tableau 1 : Temps de digestion de la protéinase K pour les embryons de poisson zèbre. Abréviations : hpf = heures après la fécondation; DPF = jours après la fécondation.
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Discussion
Ce protocole propose une combinaison d’hybridation in situ et d’immunohistochimie, une étape importante dans les expériences de colocalisation sur des embryons de poisson zèbre. Cette méthode constitue un moyen simple et efficace d’analyser simultanément un ARNm et une protéine. L’hybridation in situ et la coloration des anticorps ont été effectuées sur des embryons de poisson zèbre. Contrairement à plusieurs protocoles publiés précédemment14,15,16, l’immunofluorescence et l’immunohistochimie ont été utilisées pour explorer l’expression des protéines. Peu d’anticorps spécifiques au poisson zèbre ont été validés de manière appropriée pour une utilisation dans les sections17. Les études précédentes n’ont utilisé qu’une seule technique : l’immunofluorescence, l’immunohistochimie ou l’hybridation in situ. La combinaison de l’hybridation in situ et de l’immunohistochimie pour analyser l’ARN et les protéines surmonte les limites de toute technique. La première étape a été l’hybridation in situ, qui protège grandement l’ARNm de la dégradation. La récupération de l’antigène a été induite par chauffage pour éviter la perturbation par le traitement de la protéinase K de la liaison des anticorps pendant la coloration immunohistochimique. L’efficacité de cette approche pour tous les antigènes nécessitera des tests supplémentaires. Les images des coupes ont montré que le récepteur 5-HT2C était coexprimé dans les neurones foxP2 et que le récepteur insm1a était coexprimé dans les neurones hb9.
L’hybridation in situ en montage entier préserve grandement l’intégrité des échantillons. L’hybridation in situ suivie d’une section peut réduire le temps d’incubation de la coloration des anticorps. De plus, la coloration des anticorps après hybridation in situ peut aider à éviter l’extinction par fluorescence.
Les étapes spécifiques suivantes sont essentielles au succès de l’expérience. La première étape critique consiste à refixer l’embryon dans du PFA à 4%. Cette étape arrête la réaction de la protéinase K car le PFA inactive la protéinase K. Les échantillons doivent être mélangés doucement pour exposer tous les embryons au PFA; Le tube peut également être placé sur le côté afin que les embryons soient répartis uniformément dans la solution. La deuxième étape critique est le traitement de l’embryon pendant l’implantation de l’OCT. Les embryons doivent être disposés dans une direction spécifique (dorso-ventrale ou latérale), en les maintenant droits afin qu’ils puissent être coupés en sections à partir de la même zone pour tous les embryons. Une petite aiguille est utilisée pour faire de petits mouvements conscients dans le milieu OCT visqueux afin de localiser l’embryon et d’éliminer les bulles.
Plusieurs modifications potentielles peuvent être appliquées au scénario décrit. Le temps de digestion de la protéinase K dans l’hybridation in situ peut être déterminé en fonction des différents stades de développement des embryons de poisson-zèbre (tableau 1). De plus, l’épaisseur des cryosections est très flexible et peut être déterminée en fonction des exigences expérimentales. Bien que l’on prévoie que cette approche conviendra à un large éventail d’expériences, elle présente certaines limites potentielles. Le succès de cette procédure dépend du maintien d’un échantillon complet à travers deux expériences successives. Il y a plusieurs points de pause possibles dans ce protocole. Les embryons déshydratés peuvent être conservés dans une solution de saccharose à 30 % à -20 °C pendant plusieurs mois14. De même, les lames préparées peuvent être conservées dans une boîte à diapositives à -20 °C pendant plus de 1 an14. Les blocs congelés peuvent être conservés à -80 °C pendant trois mois.
Ce protocole d’hybridation in situ combiné à l’immunohistochimie s’est avéré efficace pour détecter l’expression de 5-HT2C et d’insm1a dans les embryons de poisson zèbre et peut être facilement appliqué à une variété de tissus à différents stades de développement. En outre, ce protocole peut être appliqué aux neurones ou aux cellules gliales, fournissant une approche expérimentale robuste pour les neuroscientifiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), la Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) et la Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
