Summary
MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.
Abstract
RNA is een biopolymeer dat aanwezig is in alle domeinen van het leven en de interacties met andere moleculen en / of reactieve soorten, bijvoorbeeld DNA, eiwitten, ionen, medicijnen en vrije radicalen, zijn alomtegenwoordig. Als gevolg hiervan ondergaat RNA verschillende reacties, waaronder de splitsing, afbraak of modificatie, wat leidt tot biologisch relevante soorten met verschillende functies en implicaties. Een voorbeeld is de oxidatie van guanine tot 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), die kan optreden in aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Over het algemeen zijn procedures die dergelijke producten en transformaties kenmerken grotendeels waardevol voor de wetenschappelijke gemeenschap. Hiertoe is matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie een veel gebruikte methode. Het huidige protocol beschrijft hoe RNA-fragmenten gevormd na enzymatische behandeling kunnen worden gekarakteriseerd. Het gekozen model maakt gebruik van een reactie tussen RNA en het exoribonuclease Xrn-1, waarbij de enzymatische spijsvertering wordt gestopt op geoxideerde plaatsen. Twee 20-nucleotide lange RNA-sequenties [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] werden verkregen via vastefasesynthese, gekwantificeerd door UV-vis spectroscopie, en gekarakteriseerd via MALDI-TOF. De verkregen strengen werden vervolgens (1) 5'-gefosforyleerd en gekarakteriseerd via MALDI-TOF; (2) behandeld met Xrn-1; (3) gefilterd en ontzout; (4) geanalyseerd via MALDI-TOF. Deze experimentele opstelling leidde tot de ondubbelzinnige identificatie van de fragmenten geassocieerd met het stallen van Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beschreven experimenten werden uitgevoerd met 200 picomol RNA (20 pmol gebruikt voor MALDI-analyses); lagere hoeveelheden kunnen echter resulteren in detecteerbare pieken met spectrometers met behulp van laserbronnen met meer vermogen dan degene die in dit werk wordt gebruikt. Belangrijk is dat de beschreven methodologie kan worden gegeneraliseerd en mogelijk kan worden uitgebreid tot productidentificatie voor andere processen waarbij RNA en DNA betrokken zijn, en kan helpen bij de karakterisering / opheldering van andere biochemische routes.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 is een veelgebruikte techniek voor de karakterisering en/of detectie van moleculen van verschillende groottes en eigenschappen. Sommige van de toepassingen omvatten diverse toepassingen, zoals het detecteren van tannines uit natuurlijke hulpbronnen4, beeldvorming van metabolieten in voedsel5, ontdekking of monitoring van cellulaire medicijndoelen of markers6 en klinische diagnostiek7, om er maar een paar te noemen. Van belang voor het huidige werk is het gebruik van MALDI-TOF met DNA of RNA, waarbij het gebruik ervan op oligonucleotiden dateert uit meer dan drie decennia8, waar verschillende beperkingen werden opgemerkt. Deze techniek is nu geëvolueerd naar een betrouwbaar, veelgebruikt middel om zowel biopolymeren9 te karakteriseren als chemische en biochemische reacties te identificeren/begrijpen, bijvoorbeeld karakterisering van platinated sites in RNA10, identificatie van RNA-fragmenten na strengsplitsing 11,12, of vorming van eiwit-DNA cross-links13 . Het is dus waardevol om belangrijke aspecten van het gebruik van deze techniek te illustreren en te benadrukken. De basis van MALDI-TOF is ook in videoformaat beschreven14 en zal hierin niet verder worden uitgewerkt. Bovendien is de toepassing ervan in een DNA- of eiwitcontext eerder beschreven en geïllustreerd in het genoemde formaat 15,16,17.
Het protocol voor het detecteren van RNA-fragmenten gevormd na enzymatische hydrolyse wordt hierin gerapporteerd. Het experimentele model werd gekozen op basis van een recente bevinding gepubliceerd door onze groep18, waar MALDI-TOF werd gebruikt om de unieke reactiviteit te bepalen tussen het exoribonuclease Xrn-1 en oligonucleotiden van RNA dat de oxidatieve laesie 8-oxoG bevat. De 20-nucleotide lange strengen werden verkregen via vaste-fase synthese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], terwijl Xrn-1 werd uitgedrukt en gezuiverd na het eerder beschreven rapport20. Kortom, Xrn-121 is een 5'-3' exoribonuclease met verschillende belangrijke biologische rollen die meerdere soorten RNA afbreken, waaronder geoxideerd RNA22. Het bleek dat de processiviteit van het enzym stagneert bij het tegenkomen van 8-oxoG, wat leidde tot RNA-fragmenten met 5'-gefosforyleerde uiteinden [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat massaspectrometrie een krachtige methode is die, door middel van verschillende methodologieën, kan worden aangepast aan andere doeleinden23,24; daarom is het kiezen van de juiste ionisatiemethode en andere experimentele opstellingen van het grootste belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit onderzoek werd RNase-vrij ultrazuiver water (tabel 1) gebruikt.
1. Concentratiebepaling van RNA-oplossing
- Bereid het RNA-monster voor volgens de onderstaande stappen.
- Gebruik een microcentrifugebuis (0,6 ml) om een oplossing van RNA te bereiden door 1 μL stamoplossing (verkregen via vastefasesynthese)19 te verdunnen tot 159 μL RNase-vrij H2O. Meng de oplossing door het mengsel herhaaldelijk op en neer te pipetteren (10x).
OPMERKING: Aangezien een breed scala aan cuvetten in de handel verkrijgbaar is, kunnen de benodigde volumes verschillen. Cuvetten met een pathlengte van 1 cm en een verminderd volume (150 μL) werden in dit werk gebruikt. - Spoel de UV-vis cuvette af met methanol (2x), gevolgd door water (ultrapuur H2O, 3x, zie Materialentabel). Gebruik een stroom stikstofgas om de cuvette grondig te drogen.
- Gebruik een pipet om de oplossing (stap 1.1.1) in de cuvette over te brengen, zodat er geen luchtbellen ontstaan. Dek de cuvette af en leg hem opzij totdat hij nodig is.
- Gebruik een microcentrifugebuis (0,6 ml) om een oplossing van RNA te bereiden door 1 μL stamoplossing (verkregen via vastefasesynthese)19 te verdunnen tot 159 μL RNase-vrij H2O. Meng de oplossing door het mengsel herhaaldelijk op en neer te pipetteren (10x).
- Bepaal de concentratie van de bereide RNA-oplossing met behulp van uv-vis spectrofotometer.
- Schakel de UV-Vis-spectrofotometer in door de schakelaar aan de achterkant van het instrument om te draaien. Laat het instrument de opstartprocedure voltooien en klik op het UV WinLab-pictogram om het bedienings- / bedieningsvenster van het instrument te openen.
- Schakel de Peltier-temperatuurregelaarspectrofotometer in met behulp van de schakelaar rechts van het instrument.
- Klik onder Basismethoden op Scannen - Lambda 365. Een ander scherm wordt geopend en de gebruiker wordt gevraagd ervoor te zorgen dat de celhouders leeg zijn. Klik op OK en laat het instrument zijn systeemcontroles uitvoeren. Het systeem geeft dan een lijst met controles weer, zorgt ervoor dat alle "Pass" en klik op OK.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om stappen 1.2.1-1.2.3 in de opgegeven volgorde te volgen; het wijzigen van deze volgorde van gebeurtenissen kan leiden tot softwarestoringen. - Pas de scanparameters aan door Gegevensverzameling te selecteren. Wijzig in het nieuwe venster onder Scaninstellingen de Start in 350 nm en de End in 215 nm.
- Activeer de Peltier door de + links van het Accessoire te selecteren. Klik op Multiple Cell Peltier, verander de temperatuur °C naar 25 en klik op Peltier On.
- Navigeer naar het tabblad Voorbeeldinformatie en voer het gewenste aantal voorbeelden, namen en celpositie in.
- Klik op Autozero en plaats de cuvette met de achtergrondoplossing. Zorg ervoor dat u deze cuvette in dezelfde sleuf plaatst waar de metingen worden uitgevoerd.
- Klik op Start en plaats de cuvette (stap 1.1.3) in de gewenste cel. Zorg ervoor dat het cuvette-venster evenwijdig aan de voorkant van het instrument is georiënteerd. Klik op OK om de eerste scan bij 25 °C te starten.
- Herhaal voor metingen bij hogere temperaturen de stappen 1.2.5-1.2.8 en verander de temperatuur in de gewenste monstertemperatuur (90 °C in het onderhavige geval).
- Klik op Bestand > Exporteren en kies de gewenste bestandslocatie. Selecteer XY Data om een .txt bestand te verkrijgen.
OPMERKING: Een illustratief hulpmiddel van stap 1.2 is te vinden in aanvullend dossier 1 (S1-S7).
- Voer gegevensverzameling uit voor het bepalen van de RNA-concentratie.
- Zoek het bestand voor elk spectrum op het tabblad Resultaten . Om de absorptie te verkrijgen, plaatst u de muisaanwijzer op de lijn, navigeert u naar 260 nm en registreert u de weergegeven absorpties. U kunt ook via de cascade Bestand > Exporteren de gegevens exporteren als een .txt bestand voor verdere grafische analyse met behulp van andere plotsoftware.
OPMERKING: Als 0,1 < A ≥ 1, moet de concentratie van het in stap 1.1.1 bereide RNA-monster worden verdund of verhoogd. - Gebruik de wet van Beer-Lambert om de concentratie van de oplossing te berekenen.
OPMERKING: Wet van Bier: A = εcl, waarbij:
A: Absorptie (in dit geval bij 260 nm vanaf stap 1.3.1)
ε: Extinctiecoëfficiënt. Voor de hierin gebruikte sequentie is 208.000 L mol-1 cm-1 de waarde verkregen uit een OligoAnalyzer tool.
l: Padlengte, 1 cm
c: concentratie van het monster - Gebruik deze berekeningen om de gewenste oplossing van RNA voor te bereiden die kan worden gebruikt voor volgende experimenten. In deze studie werden oplossingen met [RNA] = 200 μM gebruikt.
- Zoek het bestand voor elk spectrum op het tabblad Resultaten . Om de absorptie te verkrijgen, plaatst u de muisaanwijzer op de lijn, navigeert u naar 260 nm en registreert u de weergegeven absorpties. U kunt ook via de cascade Bestand > Exporteren de gegevens exporteren als een .txt bestand voor verdere grafische analyse met behulp van andere plotsoftware.
2. Hydrolyse van oligonucleotiden van RNA door Xrn-1
- Voer 5 'fosforylering van RNA uit volgens de onderstaande stappen.
- Gebruik een microcentrifugebuis van 0,6 ml om de volgende oplossing (totaal volume van 50 μl) te bereiden.
- Voeg RNase-vrij H2O (33,5 μL) toe; volumes kunnen variëren afhankelijk van [RNA].
- Voeg vervolgens oplossing A (5 L, tabel 1) toe.
- Voeg een waterige oplossing van adenosinetrifosfaat (ATP, zie Materialentabel) toe (6 L, 10 mM, 60 nmol).
- Voeg RNA-waterige oplossing toe (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
- Voeg polynucleotidekinase (PNK-enzym, zie Materialentabel) oplossing toe (4,5 l, 45 eenheden). Meng voorzichtig door het mengsel op en neer te pipetteren (10x).
- Incubeer het reactiemengsel bij 37 °C gedurende 45 minuten door het in een waterbad te plaatsen.
- Inactiveer het enzym door de reactiebuis in een voorverwarmd warmteblok (65 °C) te plaatsen en de oplossing gedurende 10 minuten te incuberen.
- Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur (RNA-fosforylering werd gekarakteriseerd via MALDI-TOF-analyse, zie representatieve resultaten) om een uiteindelijke 5'-gefosforyleerde RNA-oplossing (4 μM, 50 μL) te verkrijgen.
- Gebruik een microcentrifugebuis van 0,6 ml om de volgende oplossing (totaal volume van 50 μl) te bereiden.
- Voer RNA-hydrolyse uit door Xrn-1 volgens de onderstaande stappen.
- Voer met behulp van de oplossing (50 μL) uit stap 2.1.4 de volgende stappen uit.
- Voeg oplossing B toe (5 L, tabel 1).
- Voeg een oplossing van Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol) toe. Meng de oplossing door voorzichtig op en neer te pipetteren (10x).
- Incubeer de reactiebuis bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Breng het reactiemengsel (stap 2.2.1.3) over in een centrifugaalapparaat ter grootte van een porie van 10 kDa (zie materiaaltabel) en filtreer de enzymen door te centrifugeren (700 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur).
- Breng het filtraat over in een centrifugebuis van 0,6 ml.
- Was het resterende RNA op de centrifugaalbuis (stap 2.2.2.) door toevoeging van RNase-vrij H2O (20 L), gevolgd door centrifugeren (700 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur).
- Combineer het filtraat met het filtraat uit stap 2.2.3.
- Bewaar de buis met de resulterende oplossing in een vriezer (0 °C) of verzend voor analyse.
- Voer met behulp van de oplossing (50 μL) uit stap 2.1.4 de volgende stappen uit.
3. Ontzouting van RNA-oplossing, MALDI-TOF-plaatspotting
- Ontzout en concentreer het monster met behulp van in de handel verkrijgbare C18-pipetpunten van kationenuitwisseling (zie materiaaltabel).
- Plaats een 10 L C18 pipetpunt (pipetpunt geladen met een bed van C18 chromatografiemedia aan het uiteinde bevestigd) op een pipet van 10 μL en ga dan verder met het volgende:
- Was de C18-punt twee keer met 50% waterige acetonitril (10 μL) oplossing. Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis.
- Breng de C18-tip tweemaal in evenwicht met een waterige trifluorazijnzuuroplossing (0,1% TFA, 10 μL). Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis.
- Verwijder de C18-tip handmatig uit de pipet en bevestig deze op een pipet van 200 μL met een P200-pipetpunt (de C18-tip wordt nu bevestigd aan de P200-pipetpunt).
- Dompel de C18-tip onder in de oplossing (stap 2.2.6) en laat de oplossing tien keer door de C18-tip lopen.
OPMERKING: Het RNA-monster wordt gebonden aan de kationenuitwisselingshars in de punt. - Maak de C18-tip los van de P200-pipet en plaats deze op een pipet van 10 μL.
- Was de C18-tip twee keer met een waterige oplossing van 0,1% TFA (10 μL). Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis.
- Was de C18-tip twee keer met RNase-vrij water (10 μL). Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis.
- Plaats een 10 L C18 pipetpunt (pipetpunt geladen met een bed van C18 chromatografiemedia aan het uiteinde bevestigd) op een pipet van 10 μL en ga dan verder met het volgende:
- Spot op de MALDI-plaat volgens de onderstaande stappen.
- Eluteer het RNA-oligonucleotide uit de C18-tip (stap 3.1.1.7) door het monster onder te dompelen in de gewenste matrix (10 μL, 1:1 oplossing van C en D, tabel 1), gevolgd door de oplossing terug in de buis te doseren. Herhaal dit proces tien keer.
- Pipetteer de oplossing van 3.2.1 op twee afzonderlijke plaatsen op de plaat (elk 1 μL, 20 pmol). Laat de plekken aan de lucht drogen (figuur 1A en video 1).
OPMERKING: Dit proces kan op dezelfde plek worden herhaald om de monsterconcentratie op elke plek te verhogen. - Pipetteer gewenst kalibrant (1 L) op twee afzonderlijke plaatsen fysiek dicht bij de monsterlocatie en laat aan de lucht drogen.
OPMERKING: De in deze studie gebruikte teststandaard is verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel met materialen). - Leg de [volledig gedroogde] kalibrant over de gewenste matrix (1 L). Laat aan de lucht drogen.
OPMERKING: Het is belangrijk om de positie te volgen waar de monsters en kalibraanten worden gespot voordat ze in het instrument worden ingebracht. Noteer dit met behulp van het plaatcoördinatensysteem, bijvoorbeeld monster 1 bevindt zich op positie (C,3)
4. Gegevensverzameling en -verwerking
OPMERKING: Over het algemeen vereist THAP een hoger laservermogen om ionisatie te bereiken. Bovendien kunnen oligo's moeilijk te ioniseren zijn zonder te fragmenteren. Daarom is het meestal nodig om een zo laag mogelijk laservermogen te gebruiken en de detectorwinsten en / of lagere laserfrequentie te verhogen om de detectie te maximaliseren en fragmentatie te minimaliseren.
- Voer gegevensverzameling uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Metingen van het molecuulgewicht werden uitgevoerd met behulp van een massaspectrometer (zie Tabel met materialen) in positieve ionen, lineaire modus met een ionenbronspanning van 20 kV, detectorwinst van ~2,8 kV en een laserfrequentie van 20 Hz. Scanbereiken werden ingesteld op basis van het verwachte molecuulgewicht(en). Deze werden berekend en uitgedrukt als massa over lading (m/z), waarbij de lading 1 was. Externe kalibratie werd uitgevoerd met behulp van een eiwitkalibratiemengsel (Bacterial Test Standard, zie Tabel met materialen) op een plaats naast het monster. De ruwe gegevens werden vervolgens verwerkt in de flexanalysesoftware (zie Tabel met materialen).- Open "Flexcontrol-software" voor gebruik. Druk op de groene in/uit-knop van het instrument, wacht tot de doeltrap beweegt en stofzuig om te ontluchten. Open het deksel, plaats de volledig gedroogde doelplaat in het instrument. Zorg ervoor dat u in de juiste richting uitlijnt (figuur 1B).
- Laat het deksel voorzichtig zakken en druk vervolgens op de groene in/uit-knop . Wacht tot de plaat is ingetrokken en het instrument weer naar beneden is gepompt. Zodra de statusbalk (rechterbenedenhoek van het softwarevenster) 'Gereed' aangeeft, gaat u verder met kalibratie.
- Om de instrumenten te kalibreren met behulp van de software, voert u het volgende uit.
- Selecteer de gewenste methode door op de > Selecteer methode of druk op de knop Selecteren naast de geladen methode. Klik op de Coördinaat voor de kalibrantspot. Navigeer naar het tabblad Kalibratie en controleer of de juiste kalibrant is geselecteerd. Zorg ervoor dat Random Walk is uitgeschakeld (op het tabblad Sample Carrier ).
- Druk op Start en richt de laser handmatig langs een kristal (klik op de muispijl op de gewenste locatie in de cameraweergave). Pas indien nodig het laservermogen aan. Zodra u tevreden bent met de instellingen, drukt u op Start om spectra te verzamelen en deze toe te voegen aan de sombuffer.
- Voeg spectra toe aan de som totdat voldoende intensiteit is bereikt. Schakel in om alleen de sombuffer weer te geven, de basislijn af te trekken en vloeiend te maken. Klik vervolgens op Automatisch toewijzen. Controleer elke toegewezen piek en noteer de ppm-fout. Als u tevreden bent met opdrachten en fouten, klikt u op Toepassen.
- Wis de sombuffer en navigeer naar de positie van het eerste monster.
- Bevestig het gewenste scanbereik (tabblad 'Detectie'). Pas de balken in het "Massabereik" aan zodat het groene gebied representatief is voor de verwachte massa(s).
- Klik direct op het vergrotingsvenster zodat het vizier op het gewenste gekristalliseerde fragment wordt georiënteerd (grotere kristallen leveren vaak de beste resultaten op, figuur 2).
- Verzamel een paar spectra langs de grote kristallen en pas het laservermogen indien nodig aan. De juiste instelling is 5%-10% boven het vermogen waarbij pieken verschijnen.
- Voer het volgende uit om spectra te verkrijgen.
- Klik op Start om de laserflits te observeren in combinatie met toenemende spectrale intensiteit (weergegeven in het venster rechtsboven). Beweeg de laser over de lengte van het kristal door met de muispijl op en neer te klikken in het kristal (video 2).
- Klik op Toevoegen direct onder Start.
- Herhaal dit meerdere keren totdat de gewenste intensiteit/het gewenste aantal opnamen is bereikt (gereflecteerd op de y-as van het spectrale venster)
- Pas het laservermogen en/of de snelheid en/of detectorwinst aan als de eerste scans onbevredigend zijn. Herhaal stap 4.1.4.1-4.1.4.3 indien nodig.
- Als u tevreden bent met het spectrum, klikt u op Opslaan als om het spectrum onder een opgegeven naam op te slaan. Als er vervolgens andere voorbeelden nodig zijn, klikt u op Som wissen en herhaalt u de stappen onder stap 4.1.4.
- Voer gegevensverwerking uit.
OPMERKING: Stap 4.2 beschrijft een manier om de gegevens te analyseren met behulp van de flexAnalysis-software.- Open de gewenste software. Open vervolgens spectrum (a) door Bestand te selecteren. Selecteer in het vervolgkeuzemenu de optie Openen.
- Er wordt een nieuw venster weergegeven. Klik op Bladeren om de bestanden te zoeken die zijn opgeslagen in stap 4.1.4. Vink de vakjes voor de gewenste bestanden aan en klik vervolgens op Openen aan de linkerkant. Als slechts één spectrum analyse vereist, sleept u het bestand eenvoudig naar het softwarevenster.
- Markeer de geladen bestanden voor bulkanalyse. Navigeer naar het tabblad Proces op de werkbalk. Selecteer in de vervolgkeuzelijst Massaspectrumbasislijn aftrekken.
OPMERKING: Het algoritme dat voor de aftrekking wordt gebruikt, wordt bepaald door de methode die is geselecteerd in stap 4.1.3. - Navigeer naar het tabblad Proces op de werkbalk. Selecteer in de vervolgkeuzelijst vloeiend massaspectrum.
OPMERKING: Het algoritme dat wordt gebruikt voor het afvlakken wordt bepaald door de methode die is geselecteerd in stap 4.1.3. - Klik op het tabblad Massalijst ; selecteer in de vervolgkeuzelijst de optie Zoeken. Dit commando labelt automatisch pieken met hun massa's; een lijst met de massa's wordt weergegeven op het scherm aan de rechterkant.
- Als u pieken wilt toevoegen of verwijderen, gaat u naar het tabblad Massalijst . Klik in de vervolgkeuzelijst op Bewerken.
- Plaats de muisaanwijzer op de x-as van het spectrum; een verticale lijn vertegenwoordigt de locatie van het spectrum waarop de cursor zich bevindt.
OPMERKING: Er verschijnt een pictogram met een grafiek en cursor wanneer een nieuwe massa kan worden toegevoegd door te klikken. Dit pictogram verschijnt wanneer u de muisaanwijzer op pieken plaatst die kunnen worden verwijderd door te klikken (zie stap 4.2.7 in Aanvullend bestand 1). - Herhaal stap 4.1.3-4.1.7 voor aanvullende spectra. Exporteer de massalijst voor alle spectra door te klikken en te slepen om de bestanden aan de linkerkant te markeren en voer de volgende menutrap Bestand uit > Exporteer > massalijst naar Excel.
- Als u spectra wilt exporteren zoals weergegeven op het scherm, maakt u een screenshot of exporteert u deze als een rapport. Voor dit laatste navigeert u naar het menu Rapport . Selecteer in de vervolgkeuzelijst Opslaan als PDF.
OPMERKING: Men kan de manier waarop de spectra worden weergegeven wijzigen met behulp van de drie tabbladen onder de spectra en / of de gemarkeerde bestanden variëren. Er verschijnt een scherm. Geef het PDF-document de gewenste naam, pas de instellingen/lay-out aan en klik op Opslaan om een afbeelding van het spectrum te genereren. - Het gegenereerde beeld weerspiegelt de spectrale weergave in het softwareprogramma. Voer het volgende uit om de weergave te bewerken.
- Inzoomen: Klik op de knop Inzoomen in de werkbalk.
- Plaats de muisaanwijzer op de x-as en klik totdat het gewenste bereik is bereikt.
- Uitzoomen/ongedaan maken: Klik op de knop Uitzoomen en klik ergens in het spectrum om terug te keren naar de volledige weergave.
OPMERKING: Een illustratief hulpmiddel voor stap 4.1 en 4.2 is te vinden in aanvullend dossier 1 (respectievelijk pp S8-S23 en S24-S30).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De oligonucleotiden die in dit werk werden gebruikt, werden voorafgaand aan gebruik gesynthetiseerd, gekarakteriseerd en gekwantificeerd. De concentratie van alle oligonucleotiden werd bepaald via UV-vis spectroscopie geregistreerd bij 90 °C om foutieve metingen als gevolg van de potentiële vorming van de secundaire structuren te voorkomen. Figuur 3 toont de spectra van de model oligonucleotiden van RNA die in dit werk worden gebruikt, genomen bij kamertemperatuur en na het toepassen van warmte.
De algemene procedure, samen met de structuur van de oxidatieve laesie die Xrn-1-stagnatie veroorzaakt, wordt geïllustreerd in figuur 4. Oligonucleotide (1) bevat één 8-oxoG op positie-11 en is waar de Xrn-1-activiteit wordt geblokkeerd, wat resulteert in gestopte hydrolyse van de RNA-streng. Belangrijk is dat de resultaten in deze figuur overeenkomen met experimenten die zijn uitgevoerd met oplossingen die 200 pmol van de bovenliggende streng bevatten (1), hoewel slechts 20 pmol op de plaat werd waargenomen. Het is belangrijk op te merken dat de gemiddelde massa in alle berekeningen werd gebruikt en dat discrepanties variërend tussen 1-3 atomaire massa-eenheden (amu) werden waargenomen. De figuur toont twee processen, (1) de efficiënte 5'-fosforylering van RNA, wat blijkt uit het verschijnen van slechts één piek (1') die overeenkomt met het verwachte product, en (2) het stagnerende fragment dat voortvloeit uit de behandeling van het monstermengsel met Xrn-1. Controle-experimenten waarbij de bovenliggende streng onder dezelfde omstandigheden werd behandeld, in afwezigheid van het kinase (PNK), en de ribonuclease (Xrn-1) vertoonde geen verschillen met die in figuur 4 (RNA-streng 1).
Dezelfde resultaten werden verkregen met behulp van een andere sequentie (3) die twee oxidatieve laesies bevatte (figuur 5). De bijbehorende fosforylering en enzymatische afbraak leverden twee hoofdproducten op die suggereerden dat het enzym achtereenvolgens vastloopt op beide locaties die 8-oxoG bevatten. Zoals weergegeven in de massaspectra die overeenkomen met de fragmenten van belang, werd een discrepantie waargenomen bij MALDI-TOF-acquisitie bij het nemen van spectra van hetzelfde oligonucleotide op verschillende dagen. Dit wordt geïllustreerd in figuur 4, waar twee extra atomaire eenheden werden waargenomen. De resultaten in deze figuur komen overeen met experimenten uitgevoerd met 100 pmol van de bovenliggende streng (3). Het is belangrijk op te merken dat kwantitatieve gegevens kunnen worden verkregen om de algehele efficiëntie van het biochemische proces (en volledige tracking via MALDI-TOF) te beoordelen door een interne standaard voor monsters voor en na enzymatische afbraak in te voeren.
Figuur 1: Spotting van RNA-oplossing. (A) Spotting op de MALDI-plaat. (B) Illustratie van de plaatsing van de MALDI-plaat op de MALDI-spectrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De camera-opname die de vorming van het monster illustreert: matrixkristallen die op de plaat zijn gespot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: UV-visspectra van oligonucleotiden (1) en (3) geregistreerd bij respectievelijk 25 °C en 90 °C. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4: Experimenteel proces voor oligonucleotidepreparaat en massaspectra voor elke stap. (A) Algemene stappen met oligonucleotide (1) worden geïllustreerd. De volgorde van gebeurtenissen komt overeen met (B) 5'-fosforylering in aanwezigheid van polynucleotidekinase (PNK), gevolgd door (C) enzymatische hydrolyse in aanwezigheid van Xrn-1. De MALDI-TOF spectra verkregen voor en na beide biochemische processen worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MALDI-TOF spectra, met behulp van oligonucleotide (3), verkregen vóór (links)/na (rechts) behandeling met Xrn-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Compositie | ||
| Een | Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7,6, T4 polynucleotide kinase buffer | ||
| B | NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M), MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7,9 | ||
| C | 2,4,6-Tihydroxyacetofenonmonohydraat (THAP, 25 mM), ammoniumcitraat (10 mM) | ||
| D | Ammoniumfluoride (300 mM in 50 % aq. acetonitril) | ||
| RNase-vrij H2O | Ultrazuiver water werd behandeld met diethylpyrocarbonaat (DEPC, 1 ml per liter water), geïncubeerd bij 37 °C (12 uur) en geautoclaveerd (1 uur) | ||
Tabel 1: Oplossingssamenstellingen die in het onderzoek zijn gebruikt.
Video 1: Demonstratie voor spotting op de MALDI plaat. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Demonstratie van de data-analyses. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Stapsgewijze illustratie voor het omgaan met UV-vis-software (stap 1.2), MS-gegevensverzameling (stap 4.1) en MS-gegevensverwerking (stap 4.2). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste uitdaging in deze workflow lag tussen het afronden van de experimenten en het uitvoeren van de massaspectrometrische analyses. Experimenten werden uitgevoerd en voltooid aan de Universiteit van Colorado Denver en ('s nachts) verscheept naar de faciliteiten van de Colorado State University. Gegevensverzameling werd uitgevoerd na ontvangst, zoals het gemak biedt. Verschillende onverwachte omstandigheden leidden tot tijdsvertragingen in het proces. In één geval moesten onverwachte instrumentstoringen de monsters worden ingevroren (één keer gedurende 21 dagen) voordat ze werden gespot en verkregen; deze tijdsvertraging leek echter geen invloed te hebben op de experimentele uitkomst, hoewel degradatie van het RNA (wat leidt tot verminderde signaalintensiteiten) niet kan worden uitgesloten.
De beperking van de beschreven experimenten, in termen van RNA-concentratie, was dat de experimenten werden uitgevoerd met [RNA] hoger dan wat in vivo kan worden verkregen, voor een enkele RNA-sequentie23,24. We ontdekten dat wanneer experimenten werden uitgevoerd met 20 pmol RNA (2 pmol gespot op de plaat), of lagere hoeveelheden, de verwachte pieken niet werden waargenomen. Het gebruik van spectrometers met een verbeterd laservermogen kan waarschijnlijk leiden tot een verbeterd signaal en lagere detectielimieten.
Verwacht wordt dat de stap waarbij de enzymen worden gefilterd (met behulp van een 10 kDa filterapparaat) om de enzymen te scheiden, kan worden vermeden. Experimenten uitgevoerd zonder deze stap leidden tot vergelijkbare resultaten. De filtratiestap wordt echter aanbevolen als monsters moeten worden verzonden of een tijdje moeten worden opgeslagen.
De verstrekte stappen kunnen vatbaar zijn voor het karakteriseren en begrijpen van verschillende biochemische processen. Voorbeelden hiervan zijn de karakterisering van processen met beschadigd DNA25, peptiden26,27 of RNA-conjugaten28, naast vele anderen. Over het algemeen speculeren we dat het hierin geïllustreerde proces van toepassing kan zijn op verschillende experimentele opstellingen met nucleïnezuren, eiwitten, biomaterialen en / of andere biopolymeren. Bovendien zal de ontwikkeling van verbeterde spectrometers leiden tot verbeterde resultaten en belangrijke ontdekkingen op gebieden met betrekking tot de bovengenoemde biomoleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het is belangrijk op te merken dat dit werk een gezamenlijke inspanning was tussen drie instellingen, twee onderzoeksgroepen en één kernfaciliteit. De verdeling en werklast werden als volgt uitgevoerd: Eiwit (Xrn-1) expressie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Denver (Denver, CO). Oligonucleotidesynthese, kwantificering en experimenten (voornamelijk enzymatische afbraak) werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Denver (Denver, CO). Daar werd ook optimalisatie uitgevoerd. MALDI-TOF spotting, acquisitie en analyse werden uitgevoerd in de Analytical Resources Core Facility aan de Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS wil graag een UROP Award (CU Denver) en Eureca-subsidies (CU Denver) voor ondersteuning erkennen. E. G.C. erkent de steun van NIGMS, via R00GM115757. MJER erkent ondersteuning van NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. erkent bron-ID: SCR_021758. Het werk werd ook ondersteund door een Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, van de Henry Dreyfus Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J.
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al.
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
