Summary
MALDI-TOF는 산화된 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응성으로부터 수득된 단편을 특성화하는데 사용되었다. 본 프로토콜은 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 다른 공정에 적용될 수 있는 방법론을 기술한다.
Abstract
RNA는 생명의 모든 도메인에 존재하는 생체 고분자이며, 다른 분자 및 / 또는 반응성 종, 예를 들어 DNA, 단백질, 이온, 약물 및 자유 라디칼과의 상호 작용은 유비쿼터스입니다. 결과적으로, RNA는 절단, 분해 또는 변형을 포함한 다양한 반응을 겪으며 뚜렷한 기능과 함의를 가진 생물학적으로 관련된 종으로 이어집니다. 한 가지 예는 반응성 산소 종 (ROS)의 존재 하에서 발생할 수 있는 7,8-디히드로-8-옥소구아닌 (8-oxoG)에 대한 구아닌의 산화이다. 전반적으로, 그러한 제품과 변형을 특징 짓는 절차는 과학계에 크게 가치가 있습니다. 이를 위해, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광법은 널리 사용되는 방법이다. 본 프로토콜은 효소적 처리 후에 형성된 RNA 단편을 특성화하는 방법을 기술한다. 선택된 모델은 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응을 사용하며, 여기서 효소 소화는 산화된 부위에서 중단된다. 두 개의 20-뉴클레오티드 긴 RNA 서열 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]를 고상 합성을 통해 수득하고, UV-vis 분광법에 의해 정량하고, MALDI-TOF를 통해 특성화하였다. 수득된 가닥은 이어서 (1) 5'-인산화되고 MALDI-TOF를 통해 특성화되고; (2) Xrn-1로 처리된 단계; (3) 여과 및 탈염; (4) MALDI-TOF를 통해 분석. 이러한 실험적 셋업은 Xrn-1의 실속과 관련된 단편의 명백한 동정을 이끌었다: [5'-H2PO4-(8-옥소G)g cua AAA 구], [5'-H2PO4-(8-옥소G)(8-옥소G) cua aaa gu], 및 [5'-H2PO4-(8-옥소G) cua AAA 구]. 기술된 실험은 200개의 피코몰의 RNA (MALDI 분석에 사용된 20 pmol)로 수행되었다; 그러나 더 적은 양은이 작업에 사용 된 것보다 더 많은 전력을 가진 레이저 소스를 사용하여 분광계로 감지 가능한 피크를 초래할 수 있습니다. 중요하게도, 기술된 방법론은 일반화될 수 있고 잠재적으로 RNA 및 DNA를 포함하는 다른 공정에 대한 생성물 식별로 확장될 수 있고, 다른 생화학적 경로의 특성화/해명에 도움이 될 수 있다.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3은 다양한 크기와 특성을 가진 분자의 특성화 및/또는 검출을 위해 널리 사용되는 기술입니다. 그것의 용도 중 일부는 천연 자원으로부터의 탄닌 검출4, 식품5의 대사 산물 이미징, 세포 약물 표적 또는 마커6의 발견 또는 모니터링, 임상 진단7과 같은 다양한 응용을 포함한다. 본 연구와 관련성 중 하나는 MALDI-TOF를 DNA 또는 RNA와 함께 사용하는 것이며, 올리고뉴클레오티드에 대한 사용은 삼십 년8 이상으로 거슬러 올라가며, 몇 가지 한계가 지적되었다. 이 기술은 이제 바이오폴리머(9)를 특성화하고 화학적 및 생화학적 반응, 예를 들어 RNA 10에서 도금된 부위의 특성화, 가닥 절단11,12에 따른 RNA 단편의 확인, 또는 단백질-DNA 가교결합의 형성(13)을 식별/이해하기 위해 신뢰할 수 있고 일반적으로 사용되는 수단으로 진화되었다. . 따라서이 기술을 사용하는 중요한 측면을 설명하고 강조하는 것이 중요합니다. MALDI-TOF의 기초는 비디오 포맷 뿐만 아니라도 14에서 설명되었으며, 여기서 더 이상 설명되지 않을 것이다. 더욱이, DNA 또는 단백질 맥락에서의 그의 적용은 상기 포맷15,16,17에 이전에 기술되고 예시되었다.
효소적 가수분해 후에 형성된 RNA 단편을 검출하기 위한 프로토콜이 본원에 보고된다. 실험 모델은 우리 그룹18에 의해 발표 된 최근 발견에 기초하여 선택되었으며, 여기서 MALDI-TOF는 exoribonuclease Xrn-1과 산화 병변 8-oxoG를 포함하는 RNA의 올리고뉴클레오티드 사이의 독특한 반응성을 결정하기 위해 사용되었습니다. 20-뉴클레오티드 긴 가닥을 고체상 합성19를 통해 수득하였고, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], Xrn-1은 앞서 기술된 보고서20에 따라 발현되고 정제되었다. 간단히 말해서, Xrn-121은 산화된 RNA22를 포함한 여러 유형의 RNA를 분해하는 다양한 주요 생물학적 역할을 갖는 5'-3' 엑소리보뉴클레아제이다. 효소의 처리성이 8-oxoG를 만나면 멈추는 것으로 밝혀졌으며, 이는 5'-인산화된 말단[5'-H2PO4-(8-옥소G)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA gu], 및 [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18을 함유하는 RNA 단편으로 이어졌다.
마지막으로, 질량 분광법은 다양한 방법론을 통해 다른 목적에 적응할 수있는 강력한 방법이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다23,24; 따라서 올바른 이온화 방법과 다른 실험 설정을 선택하는 것이 가장 중요합니다.
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Protocol
RNase-무함유 초순수 (표 1)를 본 연구에 사용하였다.
1. RNA 용액의 농도 결정
- 아래 단계에 따라 RNA 샘플을 준비한다.
- 마이크로 원심분리 튜브 (0.6 mL)를 사용하여 RNase-free H2O. 159 μL의 RNase-freeH2O.를 넣고 19 μL의 원액을 희석하여 RNA 용액을 제조하였다 (10x).
참고: 다양한 큐벳이 상용화되어 있기 때문에 필요한 부피가 다를 수 있습니다. 이 작업에는 1cm 경로 길이와 감소 된 부피 (150 μL)를 가진 큐벳이 사용되었습니다. - UV-vis 큐벳을 메탄올 (2x)로 헹구고 물을 뿌린 다음 물 (초순수H2O, 3x, 자료표 참조)으로 헹구십시오. 질소 가스의 흐름을 사용하여 큐벳을 완전히 건조시킵니다.
- 피펫을 사용하여 용액(1.1.1단계)을 큐벳으로 옮겨 기포가 없도록 합니다. 큐벳을 뚜껑을 덮고 필요할 때까지 옆으로 놓습니다.
- 마이크로 원심분리 튜브 (0.6 mL)를 사용하여 RNase-free H2O. 159 μL의 RNase-freeH2O.를 넣고 19 μL의 원액을 희석하여 RNA 용액을 제조하였다 (10x).
- UV-vis 분광광도계를 사용하여 제조된 RNA 용액의 농도를 결정한다.
- 기기 뒷면에 있는 스위치를 뒤집어 UV-Vis 분광광도계를 켭니다. 계측기가 시동 절차를 완료하고 UV WinLab 아이콘을 클릭하여 계측기 작동/제어 창을 엽니다.
- 펠티에 온도 컨트롤러 분광 광도계는 기기의 오른쪽에 위치한 스위치를 사용하여 켭니다.
- 기본 방법에서 스캔 - Lambda 365를 클릭합니다. 다른 화면이 열리고 사용자에게 셀 홀더가 비어 있는지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인을 클릭하고 계측기가 시스템 검사를 수행하도록 허용합니다. 그런 다음 시스템은 검사 목록을 표시하고 모든 "통과"를 확인하고 확인을 클릭하십시오.
참고: 제공된 순서대로 1.2.1-1.2.3단계를 수행하는 것이 좋습니다. 이 이벤트 시퀀스를 변경하면 소프트웨어 오작동이 발생할 수 있습니다. - 데이터 수집을 선택하여 스캔 매개 변수를 조정합니다. 스캔 설정 아래의 새 창에서 시작을 350nm로, 끝을 215nm로 변경합니다.
- 액세서리 왼쪽에 있는 + 를 선택하여 펠티에를 활성화 합니다. 다중 셀 펠티에를 클릭하고 온도 °C 를 25로 변경한 다음 펠티에 온을 클릭합니다.
- 샘플 정보 탭 으로 이동하여 원하는 대로 샘플, 이름 및 셀 위치의 수를 입력합니다.
- Autozero를 클릭하고 배경 솔루션이 들어있는 큐벳을 삽입하십시오. 이 큐벳을 측정이 수행될 동일한 슬롯에 배치해야 합니다.
- 시작을 클릭하고 원하는 셀에 큐벳 (1.1.3 단계)을 삽입하십시오. 큐벳 창이 계측기의 앞면과 평행하게 향하도록 하십시오. 확인을 클릭하여 25°C에서 첫 번째 스캔을 시작합니다.
- 더 높은 온도에서 측정하려면 1.2.5-1.2.8 단계를 반복하고 온도를 원하는 샘플 온도(현재 경우 90°C)로 변경합니다.
- 파일 > 내보내기 를 클릭하고 원하는 파일 위치를 선택하십시오. XY 데이터를 선택하여 .txt 파일을 가져옵니다.
참고: 1.2단계의 예시적 지원은 보충 파일 1(S1-S7 )에서 찾을 수 있습니다.
- RNA 농도를 결정하기 위한 데이터 수집을 수행한다.
- 결과 탭에서 각 스펙트럼에 대한 파일을 찾습니다. 흡광도를 얻으려면 선 위로 마우스를 가져가서 260nm로 이동한 다음 표시된 흡광도를 기록합니다. 또는 파일 > 내보내기 캐스케이드를 통해 다른 플로팅 소프트웨어를 사용하여 추가 그래픽 분석을 위해 데이터를 .txt 파일로 내보냅니다.
참고: 0.1 < A ≥ 1인 경우, 단계 1.1.1에서 제조된 RNA 샘플의 농도를 희석하거나 증가시켜야 할 것이다. - Beer-Lambert 법칙을 사용하여 용액의 농도를 계산하십시오.
참고 : 맥주의 법칙 : A = εcl, 여기서 :
A: 흡광도(이 경우 260nm에서, 단계 1.3.1부터)
ε: 멸종 계수. 본원에 사용된 서열에 대해, 208,000 L mol-1 cm-1은 OligoAnalyzer 툴로부터 수득된 값이다.
l: 경로 길이, 1cm
c: 시료의 농도 - 이러한 계산을 사용하여 후속 실험에 사용할 RNA의 원하는 용액을 준비하십시오. [RNA] = 200 μM을 갖는 용액을 본 연구에 사용하였다.
- 결과 탭에서 각 스펙트럼에 대한 파일을 찾습니다. 흡광도를 얻으려면 선 위로 마우스를 가져가서 260nm로 이동한 다음 표시된 흡광도를 기록합니다. 또는 파일 > 내보내기 캐스케이드를 통해 다른 플로팅 소프트웨어를 사용하여 추가 그래픽 분석을 위해 데이터를 .txt 파일로 내보냅니다.
2. Xrn-1에 의한 RNA의 올리고뉴클레오티드의 가수분해
- RNA의 5' 인산화는 아래의 단계에 따라 수행한다.
- 0.6 mL 마이크로원심분리 튜브를 사용하여 다음 용액(총 부피 50 μL)을 제조하였다.
- RNase-freeH2O(33.5 μL)를 추가로 함유하고; 부피는 [RNA]에 따라 달라질 수 있습니다.
- 이어서, 용액 A (5 L, 표 1)를 첨가한다.
- 아데노신 트리포스페이트 수용액 (ATP, 표 참조)을 첨가한다 (6 L, 10 mM, 60 nmol).
- RNA 수용액 (1 μL, 200 μM, 200 pmol)을 첨가한다.
- 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK 효소, 표 참조) 용액 (4.5 L, 45 단위)을 첨가한다. 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞으십시오 (10x).
- 반응 혼합물을 수조에 위치시켜 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 반응 튜브를 예열된 열 블록(65°C)에 위치시켜 효소를 불활성화시키고 용액을 10분 동안 인큐베이션한다.
- 용액을 실온으로 냉각시키도록(RNA 인산화는 MALDI-TOF 분석을 통해 특성화되었으며, 대표적인 결과 참조) 최종 5'-인산화된 RNA 용액(4 μM, 50 μL)을 수득하였다.
- 0.6 mL 마이크로원심분리 튜브를 사용하여 다음 용액(총 부피 50 μL)을 제조하였다.
- Xrn-1에 의한 RNA 가수분해를 수행하는 단계는 하기의 단계에 따른다.
- 단계 2.1.4로부터의 용액(50 μL)을 사용하여, 다음 단계를 수행한다.
- 용액 B (5 L, 표 1)를 첨가한다.
- Xrn-1 (0.5 L, 1 ng, 30 fmol)의 용액을 첨가한다. 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하십시오 (10x).
- 반응 튜브를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 반응 혼합물을 (단계 2.2.1.3) 10 kDa 기공 크기의 원심 장치 ( 표 참조)에 옮기고, 원심분리 (실온에서 10분 동안 700 x g )에 의해 효소를 여과한다.
- 여액을 0.6 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
- RNase-free H2O (20 L)를 첨가하여 원심분리 튜브 상에서 잔류 RNA를 세척하고(단계 2.2.2), 이어서 원심분리하였다(실온에서 10분 동안 700 x g).
- 여액을 단계 2.2.3으로부터 수득된 것과 조합한다.
- 생성된 용액을 함유하는 튜브를 분석을 위해 냉동고(0°C) 또는 선박에 보관한다.
- 단계 2.1.4로부터의 용액(50 μL)을 사용하여, 다음 단계를 수행한다.
3. RNA 용액의 탈염, MALDI-TOF 플레이트 스포팅
- 시판되는 양이온 교환 C18 피펫 팁을 사용하여 샘플을 탈염하고 농축 시킨다(표 참조).
- 10 L C18 피펫 팁(그 끝에 고정된 C18 크로마토그래피 매질의 베드가 로딩된 피펫 팁)을 10 μL 피펫 상에 위치시키고, 이어서 다음을 계속한다:
- C18 팁을 50% 수성 아세토니트릴(10 μL) 용액으로 두 번 세척한다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.
- C18 팁을 트리플루오로아세트산 수용액(0.1% TFA, 10 μL)으로 두 번 평형화시킨다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.
- 피펫에서 C18 팁을 수동으로 제거하고 P200 피펫 팁이 들어있는 200μL 피펫 위에 고정합니다(C18 팁은 이제 P200 피펫 팁에 부착됨).
- C18 팁을 용액에 담그고(단계 2.2.6), 흡인물-C18 팁을 통해 용액을 10회 방출한다.
참고: RNA 샘플은 팁 내부의 양이온 교환 수지에 결합됩니다. - P200 피펫에서 C18 팁을 분리하고 10μL 피펫 위에 놓습니다.
- C18 팁을 0.1% TFA(10 μL) 수용액을 사용하여 두 번 세척한다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.
- C18 팁을 RNase가 없는 물(10 μL)로 두 번 세척한다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.
- 10 L C18 피펫 팁(그 끝에 고정된 C18 크로마토그래피 매질의 베드가 로딩된 피펫 팁)을 10 μL 피펫 상에 위치시키고, 이어서 다음을 계속한다:
- 아래 단계에 따라 MALDI 플레이트 위에 스팟합니다.
- C18 팁으로부터 RNA 올리고뉴클레오티드를 떼어내고(단계 3.1.1.7), 샘플을 원하는 매트릭스 (10 μL, C 및 D의 1:1 용액, 표 1)에 침지시키고, 용액을 다시 튜브 내로 분배하였다. 이 과정을 열 번 반복하십시오.
- 용액을 3.2.1로부터 플레이트 상의 두 개의 분리된 스폿 상에 피펫한다(각각 1 μL, 20 pmol). 공기 중 반점이 건조되도록 합니다(그림 1A 및 비디오 1).
참고: 이 과정은 각 지점에서 시료 농도를 높이기 위해 동일한 지점에서 반복될 수 있습니다. - 피펫은 시료 위치에 물리적으로 가까운 두 개의 개별 스팟에 교정제(1L)를 원했고 공기 건조를 허용했습니다.
참고: 본 연구에 사용된 시험 표준은 상업적 공급원으로부터 수득되었다( 표 참조). - [완전히 건조된] 교정제를 원하는 매트릭스(1 L)로 오버레이합니다. 공기 건조를 허용하십시오.
참고: 계측기에 삽입하기 전에 샘플과 교정제가 발견된 위치를 추적하는 것이 중요합니다. 플레이트 좌표계를 사용하여이를 기록하십시오 (예 : 샘플 1은 위치 (C,3)에 위치합니다.
4. 데이터 수집 및 처리
참고: 일반적으로 THAP는 이온화를 달성하기 위해 더 높은 레이저 파워를 필요로 합니다. 추가적으로, 올리고는 단편화하지 않고 이온화하기가 어려울 수 있다. 따라서, 일반적으로 가능한 한 낮은 레이저 전력을 사용하고 검출기 이득 및/또는 더 낮은 레이저 주파수를 상승시켜 검출을 최대화하고 단편화를 최소화할 필요가 있다.
- 아래 단계에 따라 데이터 수집을 수행합니다.
참고: 분자량 측정은 질량 분광계를 사용하여 수행되었다(참조 물자의 표) 양이온에서, 이온 소스 전압이 20kV, 검출기 이득이 ~2.8kV, 레이저 주파수가 20Hz인 선형 모드. 스캔 범위는 예상 분자량을 기준으로 설정되었다. 이것들은 전하 초과 질량 (m / z)으로 계산되고 표현되었으며, 여기서 전하는 1이었다. 외부 교정은 단백질 교정 혼합물을 사용하여 수행되었다 (박테리아 시험 표준, 참조 물자의 표)를 샘플에 인접한 지점에 위치시킨다. 그런 다음 원시 데이터가 flexAnalysis 소프트웨어에서 처리되었습니다( 참조 재료 표).- 작동을 위해 "Flexcontrol 소프트웨어"를 엽니다. 계측기의 녹색 입력/출력 버튼을 누르고 대상 스테이지가 움직일 때까지 기다린 다음 진공 청소기로 환기시킵니다. 뚜껑을 열고 완전히 건조 된 대상 플레이트를 장비에 넣으십시오. 올바른 방향으로 정렬해야 합니다(그림 1B).
- 뚜껑을 부드럽게 내린 다음 녹색 입력/출력 버튼을 누릅니다. 플레이트가 수축되고 계측기가 다시 펌핑될 때까지 기다립니다. 상태 표시줄(소프트웨어 창의 오른쪽 아래 모서리)에 '준비됨'이 표시되면 보정을 진행합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 계측기를 교정하려면 다음을 수행하십시오.
- 파일 > 선택 방법을 클릭하거나 로드된 메서드 옆에 있는 선택 단추를 눌러 원하는 방법을 선택합니다. 보정 지점의 좌표를 클릭합니다. 교정 탭으로 이동하여 올바른 교정자가 선택되었는지 확인합니다. 랜덤 워크가 꺼져 있는지 확인합니다(샘플 캐리어 탭에서).
- 시작을 누르고 레이저를 수정을 따라 수동으로 향하게 합니다(카메라 보기에서 원하는 위치에 있는 마우스 화살표 클릭). 필요한 경우 레이저 파워를 조정합니다. 설정이 만족되면 시작을 눌러 스펙트럼을 수집하고 합계 버퍼에 추가합니다.
- 충분한 강도에 도달할 때까지 합계에 스펙트럼을 추가합니다. 합계 버퍼만 보도록 토글하고, 베이스라인을 빼고, 매끄럽게 합니다. 그런 다음 자동 할당을 클릭하십시오. 할당된 각 피크를 확인하고 ppm 오류를 확인합니다. 할당 및 오류에 만족하면 적용을 클릭하십시오.
- 합계 버퍼를 지우고 첫 번째 샘플의 위치로 이동합니다.
- 원하는 스캔 범위('감지' 탭)를 확인합니다. 녹색 영역이 예상 질량을 대표하도록 "질량 범위"의 막대를 조정하십시오.
- 확대 창을 직접 클릭하여 십자선이 원하는 결정화된 조각에 맞도록 합니다(더 큰 결정체는 종종 최상의 결과를 산출합니다, 그림 2).
- 큰 결정을 따라 몇 개의 스펙트럼을 수집하여 필요에 따라 레이저 출력을 조정하십시오. 적절한 설정은 피크가 나타나는 전력보다 5 % -10 % 높습니다.
- 스펙트럼을 얻으려면 다음을 수행하십시오.
- 시작을 클릭하여 증가하는 스펙트럼 강도와 함께 레이저 플래시를 관찰하십시오 (오른쪽 상단의 창에 표시됨). 마우스 화살표를 클릭하여 수정의 길이를 따라 레이저를 움직입니다(비디오 2).
- 시작 바로 아래에 있는 추가를 클릭합니다.
- 원하는 강도/샷 수에 도달할 때까지 이 작업을 여러 번 반복합니다(스펙트럼 창의 y축에 반영됨).
- 초기 스캔이 만족스럽지 않은 경우 레이저 전력 및/또는 속도 및/또는 검출기 이득을 조정하십시오. 필요에 따라 4.1.4.1-4.1.4.3단계를 반복합니다.
- 스펙트럼에 만족하면 다른 이름으로 저장을 클릭하여 스펙트럼을 지정된 이름으로 저장합니다. 그런 다음 다른 샘플이 필요한 경우 합계 지우기를 클릭하고 4.1.4 단계의 단계를 반복합니다.
- 데이터 처리를 수행합니다.
참고: 4.2단계에서는 flexAnalysis 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하는 한 가지 방법을 설명합니다.- 원하는 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 파일을 선택하여 스펙트럼 (a)를 엽니 다. 드롭다운 메뉴에서 열기를 선택합니다.
- 새 창이 표시됩니다. 찾아보기를 클릭하여 4.1.4단계에서 저장된 파일을 찾습니다. 원하는 파일의 확인란을 선택한 다음 왼쪽에서 열기 를 클릭하십시오. 단일 스펙트럼에만 분석이 필요한 경우 파일을 소프트웨어 창에 끌어다 놓기만 하면 됩니다.
- 대량 분석을 위해 로드된 파일을 강조 표시합니다. 도구 모음에서 프로세스 탭으로 이동합니다. 드롭다운에서 질량 스펙트럼 베이스라인 빼기를 선택합니다.
참고: 뺄셈에 사용되는 알고리즘은 4.1.3단계에서 선택한 방법에 따라 결정됩니다. - 도구 모음에서 프로세스 탭으로 이동합니다. 드롭다운에서 부드러운 질량 스펙트럼을 선택합니다.
참고: 평활화에 사용되는 알고리즘은 4.1.3단계에서 선택한 방법에 따라 결정됩니다. - 질량 목록 탭을 클릭하십시오. 드롭다운에서 찾기를 선택합니다. 이 명령은 자동으로 피크를 질량으로 레이블을 지정합니다. 질량 목록이 오른쪽 화면에 표시됩니다.
- 피크를 추가하거나 삭제하려면 질량 목록 탭으로 진행하십시오. 드롭 다운에서 편집을 클릭하십시오.
- 스펙트럼의 x축 위로 마우스를 가져갑니다. 세로선은 커서가 있는 스펙트럼의 위치를 나타냅니다.
참고: 그래프와 커서가 있는 아이콘은 클릭하여 새 질량을 추가할 수 있을 때 나타납니다. 이 아이콘은 클릭하여 삭제할 수 있는 봉우리 위로 마우스를 가져갈 때 나타납니다( 보충 파일 1의 4.2.7단계 참조). - 추가 스펙트럼에 대해 4.1.3-4.1.7단계를 반복합니다. 왼쪽의 파일을 강조 표시하기 위해 클릭하고 드래그하여 모든 스펙트럼에 대한 질량 목록을 내보내고 다음 메뉴를 캐스케이드 파일 > 대량 목록을 Excel로 내보내> 실행합니다.
- 화면에 표시된 대로 스펙트럼을 내보내려면 스크린샷을 찍거나 보고서로 내보냅니다. 후자의 경우 보고서 메뉴로 이동합니다. 드롭다운에서 PDF로 저장을 선택합니다.
참고: 스펙트럼 아래의 세 탭을 사용하거나 강조 표시된 파일을 변경하여 스펙트럼이 표시되는 방식을 변경할 수 있습니다. 화면이 나타납니다. PDF 문서의 이름을 원하는 대로 지정하고 설정/레이아웃을 조정한 다음 저장을 클릭하여 스펙트럼 이미지를 생성합니다. - 생성 된 이미지는 소프트웨어 프로그램의 스펙트럼보기를 반영합니다. 보기를 조작하려면 다음을 수행합니다.
- 확대: 도구 모음에서 확대 단추를 클릭합니다.
- x축 위로 마우스를 가져간 다음 원하는 범위에 도달할 때까지 클릭합니다.
- 축소/실행 취소: 축소 버튼을 클릭하고 스펙트럼의 아무 곳이나 클릭하여 전체 보기로 돌아갑니다.
참고: 단계 4.1 및 4.2에 대한 예시 도움말은 보충 파일 1 (각각 pp S8-S23 및 S24-S30)에서 찾을 수 있습니다.
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Representative Results
이 작업에 사용된 올리고뉴클레오티드는 사용 전에 합성, 특성화 및 정량화되었다. 모든 올리고뉴클레오티드의 농도는 이차 구조물의 잠재적 형성으로부터 발생하는 잘못된 판독을 피하기 위해 90°C에서 기록된 UV-vis 분광법을 통해 결정되었다. 도 3은 이 작업에 사용된 RNA의 모델 올리고뉴클레오티드의 스펙트럼을 상온에서 취하고, 열을 가한 후에 측정한 것이다.
Xrn-1 실속을 일으키는 산화 병변의 구조와 함께 전체 절차가 그림 4에 설명되어 있습니다. 올리고뉴클레오티드 (1)는 위치-11에 하나의 8-oxoG를 함유하고, 여기서 Xrn-1 활성이 차단되어, RNA 가닥의 가수분해가 중단된다. 중요하게도, 이 도면에 묘사된 결과는 모 가닥(1)의 200 pmol을 함유하는 용액을 사용하여 수행된 실험에 해당하지만, 플레이트 상에서 단지 20 pmol만이 발견되었다. 모든 계산에 평균 질량이 사용되었고 1-3 원자 질량 단위 (amu) 사이에서 변화하는 불일치가 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 도면은 두 가지 과정, (1) 예상 생성물에 상응하는 단 하나의 피크 (1')의 출현에 의해 입증된 RNA의 효율적인 5'-인산화, 및 (2) Xrn-1을 사용한 샘플 혼합물의 처리로부터 발생하는 스톨링 단편을 보여준다. 키나아제 (PNK)의 부재 하에서, 모 가닥이 동일한 조건 하에서 처리되었던 대조 실험, 및 리보뉴클레아제(Xrn-1)는 도 4 (RNA 가닥 1)에 나타낸 것들과 차이를 나타내지 않았다.
동일한 결과가 두 개의 산화성 병변을 포함하는 상이한 서열 (3)을 사용하여 수득되었다 (도 5). 상응하는 인산화 및 효소 분해는 효소가 8-oxoG를 함유하는 두 부위 모두에서 연속적으로 실속된다는 것을 시사하는 두 가지 주요 생성물을 산출했다. 관심있는 단편에 상응하는 질량 스펙트럼에 묘사 된 바와 같이, MALDI-TOF 획득에 대한 불일치는 다른 날에 동일한 올리고뉴클레오티드의 스펙트럼을 취할 때 관찰되었다. 이것은 그림 4에 예시되어 있으며, 여기서 두 개의 추가적인 원자 단위가 관찰되었다. 이 도면에 묘사 된 결과는 부모 가닥 (3)의 100 pmol로 수행 된 실험에 해당합니다. 효소 분해 전후의 샘플에 내부 표준을 도입함으로써 생화학 공정의 전반적인 효율성 (및 MALDI-TOF를 통한 완전한 추적)을 평가하기 위해 정량적 데이터를 얻을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
도 1: RNA 용액의 스포팅. (A) MALDI 플레이트 상으로 스포팅. (B) MALDI-분광계 상의 MALDI 플레이트 배치의 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 샘플의 형성을 보여주는 카메라 샷: 플레이트에 발견된 매트릭스 크리스탈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 각각 25°C 및 90°C에서 기록된 올리고뉴클레오티드 (1) 및 (3)의 UV-vis 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 각 단계에 대한 올리고뉴클레오티드 제조 및 질량 스펙트럼을 위한 실험 과정 . (A) 올리고뉴클레오티드를 이용한 전체 단계 (1)가 도시되어 있다. 사건의 서열은 (B) 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)의 존재 하에서의 5'-인산화에 상응하고, 이어서 Xrn-1의 존재 하에 (C) 효소적 가수분해에 이어진다. 두 생화학적 공정 전후에 얻어진 MALDI-TOF 스펙트럼이 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Xrn-1을 사용한 처리 전(왼쪽)/후(오른쪽)에서 얻은 올리고뉴클레오티드(3)를 사용하는 MALDI-TOF 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 용액 | 구성 | ||
| A | 트리스-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7.6, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 완충액 | ||
| B | NaCl (1 M), 트리스-HCl (0.5 M),MgCl2 (0.1 M), DTT (10 mM), pH 7.9 | ||
| C | 2,4,6-티하이드록시아세토페논 일수화물(THAP, 25 mM), 시트르산암모늄(10 mM) | ||
| D | 불화암모늄 (300 mM in 50 % aq. 아세토니트릴) | ||
| RNase-freeH2O | 초순수는 디에틸 피로카보네이트 (DEPC, 물 1 리터당 1 mL)로 처리하고, 37°C (12 h)에서 인큐베이션하고, 오토클레이브 (1 h)하였다. | ||
표 1: 연구에 사용된 용액 조성물.
비디오 1 : MALDI 플레이트에 스팟팅하기위한 데모. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 데이터 분석을 간략하게 설명하는 데모. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: UV-vis 소프트웨어(단계 1.2), MS 데이터 수집(단계 4.1) 및 MS 데이터 처리(단계 4.2)를 처리하기 위한 단계별 예시. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 워크플로우의 주요 과제는 실험을 마무리하고 질량 분광 분석을 수행하는 사이에 있었습니다. 실험은 콜로라도 덴버 대학에서 수행되고 완료되었으며 콜로라도 주립 대학 시설로 (하룻밤) 운송되었습니다. 데이터 수집은 편의에 따라 수령시 수행되었습니다. 몇 가지 예기치 않은 상황으로 인해 프로세스가 시간 지연되었습니다. 일례로, 예상치 못한 기기 오작동으로 인해 시료를 발견하거나 획득하기 전에 샘플을 동결(21일 동안 한 번)해야 했습니다. 그러나이 시간 지연은 RNA의 분해 (신호 강도 감소로 이어짐)를 배제 할 수는 없지만 실험 결과에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.
기술된 실험의 한계는, RNA 농도의 관점에서, 단일 RNA 서열23,24에 대해, 생체내에서 수득될 수 있는 것보다 더 높은 [RNA]로 실험이 수행되었다는 것이었다. 우리는 20 pmol의 RNA (플레이트에서 발견 된 2 pmol) 또는 더 낮은 양으로 실험을 수행 할 때 예상되는 피크가 관찰되지 않았 음을 발견했습니다. 레이저 파워가 향상된 분광계를 사용하면 신호가 향상되고 검출 한계가 낮아질 수 있습니다.
효소를 분리하기 위해 효소가 여과되는 단계(10 kDa 여과 장치 사용)는 피할 수 있을 것으로 예상된다. 이 단계 없이 수행된 실험은 유사한 결과를 가져왔다. 그러나 샘플을 잠시 동안 선적하거나 보관해야하는 경우 여과 단계를 권장합니다.
제공된 단계들은 몇몇 생화학적 공정들을 특성화하고 이해하는 데 적합할 수 있다. 그 예로는 손상된 DNA25, 펩티드26,27, 또는 RNA 접합체(28)를 포함하는 공정의 특성화를 포함할 수 있다. 일반적으로, 우리는 본원에 예시된 과정이 핵산, 단백질, 생체재료, 및/또는 다른 바이오폴리머를 포함하는 다양한 실험 셋업에 적용될 수 있다고 추측한다. 또한, 향상된 분광계의 개발은 앞서 언급 한 생체 분자와 관련된 분야에서 향상된 결과와 중요한 발견으로 이어질 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 세 기관, 두 연구 그룹 및 하나의 핵심 시설 간의 공동 노력이라는 점에 유의해야합니다. 분배 및 작업량은 다음과 같이 수행되었다: 단백질 (Xrn-1) 발현은 덴버 대학 (Denver, CO)에서 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 합성, 정량화 및 실험(주로 효소적 분해)은 콜로라도 덴버 대학(Denver, CO)에서 수행되었다. 최적화도 거기에서 수행되었습니다. MALDI-TOF 탐지, 인수 및 분석은 콜로라도 주립 대학의 분석 자원 핵심 시설에서 수행되었습니다. (포트 콜린스, CO). SS는 UROP 어워드(CU Denver)와 유레카 보조금(CU Denver)을 인정하여 지원을 받고 싶습니다. E. G.C.는 R00GM115757 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. MJER는 1R15GM132816 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. K.B.는 리소스 ID: SCR_021758을 승인합니다. 이 작품은 또한 Henry Dreyfus Foundation의 교사 - 학자 상 (MJER), TH-21-028에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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