Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifikation af RNA-fragmenter som følge af enzymatisk nedbrydning ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63720
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Summary

MALDI-TOF blev anvendt til at karakterisere fragmenter opnået ved reaktiviteten mellem oxideret RNA og exoribonuklease Xrn-1. Den foreliggende protokol beskriver en metode, der kan anvendes på andre processer, der involverer RNA og / eller DNA.

Abstract

RNA er en biopolymer, der er til stede i alle livets domæner, og dets interaktioner med andre molekyler og / eller reaktive arter, f.eks. DNA, proteiner, ioner, lægemidler og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gennemgår RNA forskellige reaktioner, der inkluderer dets spaltning, nedbrydning eller modifikation, hvilket fører til biologisk relevante arter med forskellige funktioner og implikationer. Et eksempel er oxidation af guanin til 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), som kan forekomme i nærvær af reaktive oxygenarter (ROS). Samlet set er procedurer, der karakteriserer sådanne produkter og transformationer, stort set værdifulde for det videnskabelige samfund. Til dette formål er matrixassisteret laserdesorptionsioniseringstid (MALDI-TOF) massespektrometri en meget anvendt metode. Den foreliggende protokol beskriver, hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk behandling. Den valgte model anvender en reaktion mellem RNA og exoribonuklease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøjelse standses på oxiderede steder. To lange RNA-sekvenser med 20 nukleotid [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] blev opnået ved fastfasesyntese, kvantificeret ved UV-vis-spektroskopi og karakteriseret via MALDI-TOF. De opnåede tråde blev derefter (1) 5'-fosforyleret og karakteriseret via MALDI-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; 3) filtreret og afsaltet (4) analyseret via MALDI-TOF. Denne eksperimentelle opsætning førte til en entydig identifikation af fragmenterne i forbindelse med standsningen af Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimenter blev udført med 200 picomol RNA (20 pmol anvendt til MALDI-analyser); lavere mængder kan dog resultere i detekterbare toppe med spektrometre ved hjælp af laserkilder med mere effekt end den, der anvendes i dette arbejde. Det er vigtigt, at den beskrevne metode kan generaliseres og potentielt udvides til produktidentifikation for andre processer, der involverer RNA og DNA, og kan hjælpe med karakterisering / belysning af andre biokemiske veje.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 er en meget anvendt teknik til karakterisering og/eller påvisning af molekyler af varierende størrelse og egenskaber. Nogle af dets anvendelser omfatter forskellige anvendelser såsom påvisning af tanniner fra naturressourcer4, billeddannelse af metabolitter i fødevarer5, opdagelse eller overvågning af cellulære lægemiddelmål eller markører6 og klinisk diagnostik7, for at nævne nogle få. Af relevans for det nuværende arbejde er brugen af MALDI-TOF med DNA eller RNA, med dets anvendelse på oligonukleotider, der går tilbage til over tre årtier8, hvor flere begrænsninger blev noteret. Denne teknik har nu udviklet sig til et pålideligt, almindeligt anvendt middel til at karakterisere både biopolymerer9 og identificere/forstå kemiske og biokemiske reaktioner, f.eks. karakterisering af platinerede steder i RNA10, identifikation af RNA-fragmenter efter strengspaltning11,12 eller dannelse af protein-DNA-tværbindinger13 . Det er således værdifuldt at illustrere og fremhæve vigtige aspekter ved at bruge denne teknik. Det grundlæggende i MALDI-TOF er også beskrevet i videoformat14 og vil ikke blive uddybet yderligere heri. Desuden er dets anvendelse i en DNA- eller proteinsammenhæng tidligere blevet beskrevet og illustreret i det nævnte format 15,16,17.

Protokollen til påvisning af RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk hydrolyse er rapporteret heri. Den eksperimentelle model blev valgt på baggrund af et nyligt fund offentliggjort af vores gruppe18, hvor MALDI-TOF blev brugt til at bestemme den unikke reaktivitet mellem exoribonuklease Xrn-1 og oligonukleotider af RNA indeholdende den oxidative læsion 8-oxoG. De lange 20-nukleotidstrenge blev opnået ved fastfasesyntese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 blev udtrykt og renset efter den tidligere beskrevne rapport20. Kort fortalt er Xrn-121 en 5'-3' exoribonuklease med forskellige biologiske nøgleroller, der nedbryder flere typer RNA, herunder oxideret RNA22. Det blev konstateret, at enzymets processivitet går i stå ved mødet med 8-oxoG, hvilket førte til RNA-fragmenter indeholdende 5'-phosphorylerede ender [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Endelig er det vigtigt at bemærke, at massespektrometri er en kraftfuld metode, der gennem forskellige metoder kan tilpasses til andre formål23,24; Derfor er det yderst vigtigt at vælge den rigtige ioniseringsmetode såvel som anden eksperimentel opsætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

RNase-frit ultrarent vand (tabel 1) blev anvendt til denne undersøgelse.

1. Koncentrationsbestemmelse af RNA-opløsning

  1. Forbered RNA-prøven ved at følge nedenstående trin.
    1. Der anvendes et mikrocentrifugerør (0,6 ml) til fremstilling af en opløsning af RNA ved fortynding af 1 μL stamopløsning (opnået ved fastfasesyntese)19 til 159 μL RNasefriH20. Opløsningen blandes ved at pipettere blandingen op og ned gentagne gange (10x).
      BEMÆRK: Da en bred vifte af kuvetter er kommercielt tilgængelige, kan de nødvendige mængder variere. Kuvetter med en 1 cm stilængde og reduceret volumen (150 μL) blev brugt i dette arbejde.
    2. Uv-vis-kuvetten skylles med methanol (2x) efterfulgt af vand (ultrarentH20, 3x, se materialetabellen). Brug en strøm af nitrogengas til at tørre kuvetten grundigt.
    3. Brug en pipette til at overføre opløsningen (trin 1.1.1) til kuvetten, så der ikke er luftbobler. Dæk kuvetten og læg den til siden, indtil det er nødvendigt.
  2. Bestem koncentrationen af den fremstillede RNA-opløsning under anvendelse af UV-vis spektrofotometer.
    1. Tænd for UV-Vis-spektrofotometeret ved at dreje kontakten bag på instrumentet. Tillad instrumentet at fuldføre opstartsproceduren, og klik på UV WinLab-ikonet for at åbne instrumentets betjenings- / kontrolvindue.
    2. Tænd for Peltier Temperature Controller-spektrofotometeret ved hjælp af kontakten til højre for instrumentet.
    3. Klik på Scan - Lambda 365 under Basismetoder. En anden skærm åbnes og beder brugeren om at sikre, at celleholderne er tomme. Klik på OK, og lad instrumentet udføre sine systemkontroller. Systemet viser derefter en liste over kontroller, sikrer, at alle "Pass" og klikker på OK.
      BEMÆRK: Det anbefales at følge trin 1.2.1-1.2.3 i den angivne rækkefølge; Ændring af denne rækkefølge af hændelser kan føre til softwarefejl.
    4. Juster scanningsparametrene ved at vælge Dataindsamling. I det nye vindue under Scanningsindstillinger skal du ændre Start til 350 nm og Slut til 215 nm.
    5. Aktivér Peltier ved at vælge + til venstre for tilbehøret. Klik på Multiple Cell Peltier, skift temperaturen ° C til 25, og klik på Peltier On.
    6. Naviger til fanen Eksempeloplysninger, og angiv antallet af prøver, navne og celleplacering efter ønske.
    7. Klik på Autozero , og indsæt kuvetten, der indeholder baggrundsopløsningen. Sørg for at placere denne kuvette i den samme spalte, hvor målingerne skal udføres.
    8. Klik på Start , og indsæt kuvetten (trin 1.1.3) i den ønskede celle. Sørg for, at kuvettevinduet er orienteret parallelt med instrumentets forside. Klik på OK for at starte den første scanning ved 25 °C.
    9. Ved målinger ved højere temperaturer gentages trin 1.2.5-1.2.8 og temperaturen ændres til den ønskede prøvetemperatur (i det foreliggende tilfælde 90 °C).
    10. Klik på File > Export, og vælg den ønskede filplacering. Vælg XY Data for at hente en .txt fil.
      BEMÆRK: En illustrativ hjælp af trin 1.2 findes i Supplerende fil 1 (S1-S7).
  3. Udfør dataindsamling til bestemmelse af RNA-koncentrationen.
    1. Find filen for hvert spektrum under fanen Resultater . For at opnå absorbansen skal du holde markøren over linjen, navigere til 260 nm og registrere de viste absorbanser. Alternativt kan du via kaskaden File > Export eksportere dataene som en .txt fil til yderligere grafisk analyse ved hjælp af anden plottesoftware.
      BEMÆRK: Hvis 0,1 < A ≥ 1, vil det være nødvendigt enten at fortynde eller øge koncentrationen af RNA-prøven fremstillet i trin 1.1.1.
    2. Brug Beer-Lambert-loven til at beregne koncentrationen af opløsningen.
      BEMÆRK: Ølloven: A = εcl, hvor:
      A: Absorbans (ved 260 nm i dette tilfælde fra trin 1.3.1)
      ε: Udryddelseskoefficient. For den sekvens, der anvendes heri, er 208.000 L mol-1 cm-1 den værdi, der opnås fra et OligoAnalyzer-værktøj.
      l: Sti længde, 1 cm
      c: koncentration af prøven
    3. Brug disse beregninger til at forberede den ønskede opløsning af RNA, der skal anvendes til efterfølgende eksperimenter. Opløsninger med [RNA] = 200 μM blev anvendt i denne undersøgelse.

2. Hydrolyse af oligonukleotider af RNA af Xrn-1

  1. Udfør 5 'fosforylering af RNA ved at følge nedenstående trin.
    1. Brug et 0,6 ml mikrocentrifugerør til at fremstille følgende opløsning (50 μL totalvolumen).
      1. Tilsæt RNase-friH20(33,5 μL); volumener kan variere afhængigt af [RNA].
      2. Derefter tilsættes opløsning A (5 L, tabel 1).
      3. Der tilsættes en vandig opløsning af adenosintrifosfat (ATP, se materialetabellen) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
      4. Tilsæt RNA vandig opløsning (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. Tilsæt polynukleotidkinase (PNK-enzym, se tabel over materialer) opløsning (4,5 L, 45 enheder). Bland forsigtigt ved at pipettere blandingen op og ned (10x).
    2. Inkuber reaktionsblandingen ved 37 °C i 45 minutter ved at anbringe den i et vandbad.
    3. Inaktiver enzymet ved at placere reaktionsrøret i en forvarmet varmeblok (65 °C) og inkubere opløsningen i 10 minutter.
    4. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur (RNA-phosphorylering blev karakteriseret via MALDI-TOF-analyse, se Repræsentative resultater) for at give en endelig 5'-phosphoryleret RNA-opløsning (4 μM, 50 μL).
  2. Udfør RNA-hydrolyse ved Xrn-1 ved at følge nedenstående trin.
    1. Brug opløsningen (50 μL) fra trin 2.1.4 til at udføre følgende trin.
      1. Der tilsættes opløsning B (5 L, tabel 1).
      2. Tilsæt en opløsning af Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Bland opløsningen ved forsigtigt at pipettere op og ned (10x).
      3. Inkuber reaktionsrøret ved stuetemperatur i 2 timer.
    2. Overfør reaktionsblandingen (trin 2.2.1.3) til en 10 kDa centrifugalanordning i porestørrelse (se materialetabel), og filtrer enzymerne ved centrifugering (700 x g i 10 minutter ved stuetemperatur).
    3. Overfør filtratet til et 0,6 ml centrifugerør.
    4. Det resterende RNA vaskes på centrifugalrøret (trin 2.2.2.) ved at tilsætte RNasefriTH20 (20 L) efterfulgt af centrifugering (700 x g i 10 minutter ved stuetemperatur).
    5. Filtratet kombineres med det, der er opnået i trin 2.2.3.
    6. Røret, der indeholder den resulterende opløsning, opbevares i en fryser (0 °C) eller sendes til analyse.

3. Afsaltning af RNA-opløsning, MALDI-TOF pladespotting

  1. Afsalt og koncentrer prøven ved hjælp af kommercielt tilgængelige C18-pipettespidser til kationudveksling (se materialetabellen).
    1. Anbring en 10 L C18-pipettespids (pipettespids lastet med et bed af C18-kromatografimedier fastgjort i enden) på en 10 μL pipette, og fortsæt derefter med følgende:
      1. C18-spidsen vaskes med 50 % vandig acetonitrilopløsning (10 μL) to gange. Kassér de brugte mængder i et separat affaldsrør hver gang.
      2. C18-spidsen udlignes med en vandig trifluoreddikesyreopløsning (0,1% TFA, 10 μL) to gange. Kassér de brugte mængder i et separat affaldsrør hver gang.
      3. Fjern C18-spidsen manuelt fra pipetten, og fastgør den på en 200 μL pipette, der indeholder en P200-pipettespids (C18-spidsen fastgøres nu til P200-pipettespidsen).
      4. C18-spidsen nedsænkes i opløsningen (trin 2.2.6), og aspirer opløsningen frigives gennem C18-spidsen ti gange.
        BEMÆRK: RNA-prøven bliver bundet til kationbytterharpiksen inde i spidsen.
      5. Fjern C18-spidsen fra P200-pipetten, og anbring den på en 10 μL-pipette.
      6. C18-spidsen vaskes med en vandig opløsning på 0,1 % TFA (10 μL) to gange. Kassér de brugte mængder i et separat affaldsrør hver gang.
      7. Vask C18-spidsen med RNase-frit vand (10 μL) to gange. Kassér de brugte mængder i et separat affaldsrør hver gang.
  2. Spot på MALDI-pladen ved at følge nedenstående trin.
    1. Eluter RNA-oligonukleotid fra C18-spidsen (trin 3.1.1.7) ved at nedsænke prøven i den ønskede matrix (10 μL, 1:1 opløsning af C og D, tabel 1) efterfulgt af dispensering af opløsningen tilbage i røret. Gentag denne proces ti gange.
    2. Pipette opløsningen fra 3.2.1 på to separate pletter på pladen (1 μL hver, 20 pmol). Lad pletter lufttørre (figur 1A og video 1).
      BEMÆRK: Denne proces kan gentages på samme sted for at øge prøvekoncentrationen på hvert sted.
    3. Pipetten ønskede kalibrering (1 L) på to separate steder fysisk tæt på prøvestedet og tillader lufttørring.
      BEMÆRK: Den teststandard, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra kommercielle kilder (se tabel over materialer).
    4. Overlejr den [fuldt tørrede] kalibrant med den ønskede matrix (1 L). Lad det lufttørre.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at spore den position, hvor prøverne og kalibranterne ses, inden de indsættes i instrumentet. Vær opmærksom på dette ved hjælp af pladekoordinatsystemet, f.eks. er prøve 1 placeret i position (C,3)

4. Dataindsamling og -behandling

BEMÆRK: Generelt kræver THAP højere lasereffekt for at opnå ionisering. Derudover kan oligoer være vanskelige at ionisere uden fragmentering. Således er det normalt nødvendigt at bruge så lav lasereffekt som muligt og øge detektorgevinster og / eller lavere laserfrekvens for at maksimere detektion og minimere fragmentering.

  1. Udfør dataindsamling ved at følge nedenstående trin.
    BEMÆRK: Molekylvægtsmålinger blev udført ved hjælp af et massespektrometer (se Tabel over materialer) i positiv ion, lineær tilstand med en ionkildespænding på 20 kV, detektorforstærkning på ~2,8 kV og en laserfrekvens på 20 Hz. Scanningsintervaller blev indstillet ud fra forventede molekylvægt(e). Disse blev beregnet og udtrykt som masse over ladning (m/z), hvor ladningen var 1. Ekstern kalibrering blev udført ved hjælp af en proteinkalibreringsblanding (Bacterial Test Standard, se Tabel over materialer) på et sted, der støder op til prøven. De rå data blev derefter behandlet i flexAnalyse-softwaren (se Tabel over materialer).
    1. Åbn "Flexcontrol-software" til drift. Tryk på instrumentets grønne ind/ud-knap , vent på, at måltrinnet bevæger sig, og støvsug for at udlufte. Åbn låget, anbring den fuldt tørrede målplade i instrumentet. Sørg for at justere i den rigtige retning (figur 1B).
    2. Sænk forsigtigt låget, og tryk derefter på den grønne ind/ud-knap . Vent på, at pladen trækkes tilbage, og instrumentet pumpes ned igen. Når statuslinjen (nederste højre hjørne af softwarevinduet) afspejler 'Klar', skal du fortsætte med kalibreringen.
    3. For at kalibrere instrumenterne ved hjælp af softwaren skal du udføre følgende.
      1. Vælg den ønskede metode ved at klikke på File > Select Method eller trykke på knappen Select ved siden af den indlæste metode. Klik på koordinatet for kalibreringsstedet. Naviger til fanen Kalibrering , og bekræft, at den korrekte kalibrering er valgt. Sørg for , at Tilfældig gåtur er slået fra (under fanen Eksempelbærer ).
      2. Tryk på Start , og ret laseren manuelt langs en krystal (klik på musepilen på det ønskede sted i kameravisningen). Juster lasereffekten, hvis det er nødvendigt. Når du er tilfreds med indstillingerne, skal du trykke på Start for at indsamle spektre og føje dem til sumbufferen.
      3. Tilsæt spektre til summen, indtil tilstrækkelig intensitet er nået. Skift for kun at få vist sumbufferen, træk basislinjen fra og udjævn. Klik derefter på Automatisk tildeling. Kontroller hver tildelt top, og bemærk ppm-fejlen. Hvis du er tilfreds med opgaver og fejl, skal du klikke på Anvend.
      4. Ryd sumbufferen, og naviger til placeringen af den første prøve.
      5. Bekræft det ønskede scanningsområde (fanen 'Registrering'). Juster søjlerne i "Mass Range", så det grønne område er repræsentativt for den eller de forventede masse(r).
      6. Klik direkte på forstørrelsesvinduet , så trådkorset er orienteret mod det ønskede krystalliserede fragment (større krystaller giver ofte de bedste resultater, figur 2).
      7. Saml et par spektre langs de store krystaller, og juster lasereffekten efter behov. Den korrekte indstilling er 5% -10% over den effekt, hvor toppe vises.
    4. For at opnå spektre skal du udføre følgende.
      1. Klik på Start for at observere laserblitzen sammen med stigende spektralintensitet (vist i vinduet øverst til højre). Flyt laseren langs krystallens længde ved at klikke musepilen op og ned ad krystallen (Video 2).
      2. Klik på Tilføj direkte under Start.
      3. Gentag dette flere gange, indtil den ønskede intensitet/antal skud er nået (reflekteret på spektralvinduets y-akse)
      4. Juster lasereffekten og/eller hastigheden og/eller detektorgevinster, hvis de indledende scanninger er utilfredsstillende. Gentag trin 4.1.4.1-4.1.4.3 efter behov.
      5. Hvis du er tilfreds med spektret, skal du klikke på Gem som for at gemme spektret under et bestemt navn. Derefter, hvis der er behov for andre prøver, skal du klikke på Ryd sum og gentage trin under trin 4.1.4.
  2. Udfør databehandling.
    BEMÆRK: Trin 4.2 beskriver en måde at analysere dataene på ved hjælp af flexAnalysis-softwaren.
    1. Åbn den ønskede software. Åbn derefter spektrum (a) ved at vælge Filer. Vælg Åbn i rullemenuen.
    2. Et nyt vindue vises. Klik på Gennemse for at finde de filer, der er gemt fra trin 4.1.4. Marker afkrydsningsfelterne for de ønskede filer, og klik derefter på Åbn til venstre. Hvis kun et enkelt spektrum kræver analyse, skal du blot trække og slippe filen i softwarevinduet.
    3. Fremhæv den eller de indlæste filer til masseanalyse. Naviger til fanen Proces på værktøjslinjen. Vælg Træk massespektrumgrundlinje fra i rullemenuen.
      BEMÆRK: Den algoritme, der anvendes til subtraktionen, bestemmes af den metode, der er valgt i trin 4.1.3.
    4. Naviger til fanen Proces på værktøjslinjen. Vælg Smooth Mass Spectrum i rullemenuen.
      BEMÆRK: Den algoritme, der anvendes til udjævningen, bestemmes af den metode, der er valgt i trin 4.1.3.
    5. Klik på fanen Masseliste ; vælg Find på rullelisten. Denne kommando mærker automatisk toppe med deres masser; en liste over masserne vises på skærmen til højre.
    6. Hvis du vil tilføje eller slette toppe, skal du fortsætte til fanen Masseliste . Klik på Rediger i rullemenuen.
    7. Hold markøren over x-aksen i spektret; en lodret linje repræsenterer placeringen af spektret, hvor markøren er tændt.
      BEMÆRK: Et ikon med en graf og markør vises, når en ny masse kan tilføjes ved at klikke. Dette ikon vises, når du holder markøren over toppe, der kan slettes ved at klikke (se trin 4.2.7 i Supplerende fil 1).
    8. Gentag trin 4.1.3-4.1.7 for yderligere spektre. Eksporter masselisten for alle spektre ved at klikke og trække for at fremhæve filerne til venstre og udfør følgende menukaskade Fil > Eksporter > Masseliste til Excel.
    9. Hvis du vil eksportere spektre som vist på skærmen, skal du enten tage et skærmbillede eller eksportere det som en rapport. For sidstnævnte skal du navigere til menuen Rapport . Vælg Gem som PDF i rullemenuen.
      BEMÆRK: Man kan ændre, hvordan spektrene vises ved hjælp af de tre faner under spektrene og / eller variere de fremhævede filer. En skærm vises. Navngiv PDF-dokumentet efter ønske, juster indstillingerne / layoutet, og klik på Gem for at generere et billede af spektret.
    10. Det genererede billede afspejler spektralvisningen i softwareprogrammet. Udfør følgende for at manipulere visningen.
      1. Zoom ind: Klik på knappen Zoom ind på værktøjslinjen.
      2. Hold markøren over x-aksen, og klik, indtil det ønskede interval er opnået.
      3. Zoom ud / fortryd: Klik på knappen Zoom ud , og klik et vilkårligt sted i spektret for at vende tilbage til fuld visning.
        BEMÆRK: En illustrativ hjælp til trin 4.1 og 4.2 findes i supplerende fil 1 (henholdsvis pp S8-S23 og S24-S30).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De oligonukleotider, der blev anvendt i dette arbejde, blev syntetiseret, karakteriseret og kvantificeret inden brug. Koncentrationen af alle oligonukleotider blev bestemt ved hjælp af UV-vis-spektroskopi registreret ved 90 °C for at undgå fejlagtige aflæsninger som følge af den potentielle dannelse af de sekundære strukturer. Figur 3 viser spektrene af modellen oligonukleotider af RNA, der anvendes i dette arbejde, taget ved stuetemperatur og efter påføring af varme.

Den overordnede procedure sammen med strukturen af den oxidative læsion, der forårsager Xrn-1 stalling, er illustreret i figur 4. Oligonukleotid (1) indeholder en 8-oxoG i position-11 og er, hvor Xrn-1-aktivitet blokeres, hvilket resulterer i standset hydrolyse af RNA-strengen. Det er vigtigt, at resultaterne afbildet i denne figur svarer til eksperimenter udført ved anvendelse af opløsninger indeholdende 200 pmol af moderstrengen (1), selvom kun 20 pmol blev set på pladen. Det er vigtigt at bemærke, at den gennemsnitlige masse blev brugt i alle beregningerne, og at uoverensstemmelser varierende mellem 1-3 atommasseenheder (amu) blev observeret. Figuren viser to processer, (1) den effektive 5'-phosphorylering af RNA, hvilket fremgår af udseendet af kun en top (1') svarende til det forventede produkt, og (2) det stallende fragment, der stammer fra behandlingen af prøveblandingen med Xrn-1. Kontrolforsøg, hvor moderstrengen blev behandlet under de samme betingelser, i fravær af kinasen (PNK), og ribonukleasen (Xrn-1) viste ikke forskelle fra dem, der er vist i figur 4 (RNA-streng 1).

De samme resultater blev opnået ved anvendelse af en anden sekvens (3), der indeholdt to oxidative læsioner (figur 5). Den tilsvarende fosforylering og enzymatiske nedbrydning gav to hovedprodukter, der antydede, at enzymet successivt går i stå begge steder indeholdende 8-oxoG. Som afbildet i massespektrene svarende til de fragmenter af interesse, blev der observeret en uoverensstemmelse ved MALDI-TOF-erhvervelse, når der blev taget spektre af det samme oligonukleotid på forskellige dage. Dette er illustreret i figur 4, hvor yderligere to atomare enheder blev observeret. Resultaterne afbildet i denne figur svarer til eksperimenter udført med 100 pmol af moderstrengen (3). Det er vigtigt at bemærke, at der kan indhentes kvantitative data for at vurdere den samlede effektivitet af den biokemiske proces (og fuldstændig sporing via MALDI-TOF) ved at indføre en intern standard for prøver før og efter enzymatisk nedbrydning.

Figure 1
Figur 1: Spotting af RNA-opløsning. (A) Spotting på MALDI-pladen. (B) Illustration af MALDI-pladens placering på MALDI-spektrometeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kamerabilledet, der illustrerer dannelsen af prøven: matrixkrystaller spottet på pladen.

Figure 3
Figur 3: UV-vis-spektre af oligonukleotider (1) og (3) registreret ved henholdsvis 25 °C og 90 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Eksperimentel proces til oligonukleotidpræparation og massespektre for hvert trin. (A) Overordnede trin ved anvendelse af oligonukleotid (1) er illustreret. Hændelsessekvensen svarer til (B) 5'-phosphorylering i nærvær af polynukleotidkinase (PNK) efterfulgt af (C) enzymatisk hydrolyse i nærvær af Xrn-1. MALDI-TOF-spektrene opnået før og efter begge biokemiske processer vises. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: MALDI-TOF-spektre ved hjælp af oligonukleotid (3) opnået før (venstre)/efter (højre) behandling med Xrn-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Opløsning Sammensætning
En Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7,6, T4 polynukleotidkinasebuffer
B NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M),MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7,9
C 2,4,6-Tihydroxyacetophenonmonohydrat (THAP, 25 mM), ammoniumcitrat (10 mM)
D Ammoniumfluorid (300 mM i 50 % aq. acetonitril)
RNase-fri H2O Ultrarent vand blev behandlet med diethylpyrocarbonat (DEPC, 1 ml pr. liter vand), inkuberet ved 37 °C (12 timer) og autoklaveret (1 time)

Tabel 1: Opløsningssammensætninger anvendt i undersøgelsen.

Video 1: Demonstration til spotting på MALDI-pladen. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Demonstration, der skitserer dataanalyserne. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende fil 1: Trin-for-trin illustration til håndtering af UV-vis-software (trin 1.2), MS-dataindsamling (trin 4.1) og MS-databehandling (trin 4.2). Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største udfordring i denne arbejdsgang opstod mellem færdiggørelsen af eksperimenterne og udførelsen af massespektrometriske analyser. Eksperimenter blev udført og afsluttet ved University of Colorado Denver og afsendt (natten over) til Colorado State University faciliteter. Dataindsamling blev udført ved modtagelse, som bekvemmelighed. Flere uventede omstændigheder førte til tidsforsinkelser i processen. I et tilfælde krævede uventede instrumentfejl, at prøverne blev frosset (en gang i 21 dage) inden spotting og erhvervelse; Denne tidsforsinkelse syntes imidlertid ikke at påvirke det eksperimentelle resultat, selvom nedbrydning af RNA'et (hvilket fører til nedsat signalintensitet) ikke kan udelukkes.

Begrænsningen af de beskrevne eksperimenter, hvad angår RNA-koncentration, var, at eksperimenterne blev udført med [RNA] højere end hvad der kan opnås in vivo, for en enkelt RNA-sekvens23,24. Vi fandt ud af, at når eksperimenter blev udført med 20 pmol RNA (2 pmol spottet på pladen) eller lavere mængder, blev de forventede toppe ikke observeret. Brugen af spektrometre med forbedret lasereffekt kan sandsynligvis føre til forbedret signal og lavere detektionsgrænser.

Det forventes, at det trin, hvor enzymerne filtreres (ved hjælp af en 10 kDa filtreringsanordning) for at adskille enzymerne, kan undgås. Eksperimenter udført uden dette trin førte til lignende resultater. Filtreringstrinnet anbefales dog, hvis prøver skal sendes eller opbevares i et stykke tid.

De angivne trin kan være modtagelige for at karakterisere og forstå flere biokemiske processer. Eksempler kan omfatte karakterisering af processer, der involverer beskadiget DNA25, peptider26,27 eller RNA-konjugater28, blandt mange andre. Generelt spekulerer vi i, at den proces, der er illustreret heri, kan være anvendelig på forskellige eksperimentelle opsætninger, der involverer nukleinsyrer, proteiner, biomaterialer og / eller andre biopolymerer. Desuden vil udviklingen af forbedrede spektrometre føre til forbedrede resultater og vigtige opdagelser inden for områder, der involverer de førnævnte biomolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Det er vigtigt at bemærke, at dette arbejde var et samarbejde mellem tre institutioner, to forskningsgrupper og en kernefacilitet. Fordelingen og arbejdsbyrden blev udført som følger: Protein (Xrn-1) ekspression blev udført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantificering og eksperimentering (hovedsageligt enzymatisk nedbrydning) blev udført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimering blev også udført der. MALDI-TOF spotting, erhvervelse og analyse blev udført på Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS vil gerne anerkende en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskud (CU Denver) til støtte. E. G.C. anerkender støtte fra NIGMS via R00GM115757. MJER anerkender støtte fra NIGMS via 1R15GM132816. K.B. anerkender ressource-ID: SCR_021758. Arbejdet blev også støttet af en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
  16. Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Tags

Biokemi Udgave 182 MALDI-TOF RNA-karakterisering nukleinsyremassespektrometri 8-oxoG i RNA ribonukleasereaktivitet enzymatisk nedbrydning
Identifikation af RNA-fragmenter som følge af enzymatisk nedbrydning ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schowe, S. W., Langeberg, C. J.,… More

Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter