Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Abstract

Het darmslijmvlies is een complexe fysieke en biochemische barrière die een groot aantal belangrijke functies vervult. Het maakt het transport, de absorptie en het metabolisme van voedingsstoffen en xenobiotica mogelijk, terwijl het een symbiotische relatie met microbiota vergemakkelijkt en de invasie van micro-organismen beperkt. Functionele interactie tussen verschillende celtypen en hun fysieke en biochemische omgeving is van vitaal belang om de homeostase van darmweefsel tot stand te brengen en te behouden. Het modelleren van deze complexe interacties en geïntegreerde darmfysiologie in vitro is een formidabel doel met het potentieel om de manier waarop nieuwe therapeutische doelen en kandidaat-geneesmiddelen worden ontdekt en ontwikkeld te transformeren.

Organoïden en Organ-on-a-Chip-technologieën zijn onlangs gecombineerd om voor de mens relevante darmchips te genereren die geschikt zijn voor het bestuderen van de functionele aspecten van darmfysiologie en pathofysiologie in vitro. Organoïden afgeleid van de biopten van de kleine (twaalfvingerige darm) en dikke darm worden gezaaid in het bovenste compartiment van een orgaanchip en breiden vervolgens met succes uit als monolagen met behoud van de verschillende cellulaire, moleculaire en functionele kenmerken van elk darmgebied. Menselijke darmweefselspecifieke microvasculaire endotheelcellen worden opgenomen in het onderste compartiment van de orgaanchip om de epitheliaal-endotheelinterface te recreëren. Dit nieuwe platform vergemakkelijkt luminale blootstelling aan voedingsstoffen, geneesmiddelen en micro-organismen, waardoor studies van darmtransport, permeabiliteit en gastheer-microbe-interacties mogelijk worden.

Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de oprichting van darmchips die de menselijke twaalfvingerige darm (twaalfvingerige darmchip) en dikke darm (colonchip) vertegenwoordigen, en hun daaropvolgende cultuur onder continue stroom en peristaltiekachtige vervormingen. We demonstreren methoden voor het beoordelen van medicijnmetabolisme en CYP3A4-inductie in duodeenchip met behulp van prototypische inductoren en substraten. Ten slotte bieden we een stapsgewijze procedure voor de in vitro modellering van interferon gamma (IFNγ) -gemedieerde barrièreverstoring (leaky gut syndrome) in een darmchip, inclusief methoden voor het evalueren van de verandering van paracellulaire permeabiliteit, veranderingen in cytokinesecretie en transcriptomische profilering van de cellen in de chip.

Introduction

De menselijke darm is een complex en multitaskend orgaan dat in staat is tot zelfregeneratie. Het is verdeeld in de dunne en dikke darm. De primaire functie van de dunne darm is om voedsel uit de maag verder te verteren, alle voedingsstoffen te absorberen en het residu door te geven aan de dikke darm, die het water en de elektrolyten terugwint. De dunne darm is verder verdeeld in meerdere anatomisch verschillende regio's: de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum, die elk zijn aangepast om specifieke functies uit te voeren. De twaalfvingerige darm helpt bijvoorbeeld bij het afbreken van de chyme (maaginhoud) om de juiste opname van voedingsstoffen met eiwitten, koolhydraten, vitamines en mineralen in het jejunum mogelijk te maken. Dit proximale deel van de dunne darm is ook de belangrijkste plaats van intestinale geneesmiddelabsorptie en -metabolisme, en het wordt gekenmerkt door de hogere expressie van geneesmiddel-metaboliserende enzymen (bijv. CYP3A4) in vergelijking met hun expressie in het ileum en colon1. Naast zijn belangrijkste rol bij het verteren en absorberen van voedingsstoffen, is de darm ook een effectieve barrière tegen potentieel schadelijke luminale inhoud, zoals pathogene micro-organismen, microbiële metabolieten, voedingsantigenen en toxines 2,3. Het is opmerkelijk dat de menselijke dikke darm wordt bewoond door een groot aantal micro-organismen, die veel groter zijn dan die van totale cellen in het menselijk lichaam, die veel voordelen bieden voor voeding, metabolisme en immuniteit. Daarom is het behoud van de integriteit van de mucosale barrière gevormd door intestinale epitheelcellen van cruciaal belang voor het mogelijk maken van de symbiotische relatie tussen de darmmicrobiota en de gastheercellen door ze fysiek te scheiden om onnodige activering van immuuncellen te voorkomen2. Bovendien speelt geprogrammeerde darmceldood een essentiële rol als een zelfbeschermend mechanisme dat voorkomt dat geïnfecteerde cellen blijven bestaan of zich vermenigvuldigen - waardoor potentiële pathogenen worden verspreid3 - terwijl de voortdurende zelfvernieuwing van het darmepitheel om de vier tot zeven dagen compenseert voor het celverlies dat de integriteit van de barrière en weefselhomeostase garandeert. Aantastingen van beschreven darmfuncties, waaronder opname van voedingsstoffen, barrière-integriteit of onbalans in darmceldood en zelfvernieuwing, kunnen leiden tot de ontwikkeling van een reeks gastro-intestinale stoornissen, waaronder ondervoeding en inflammatoire darmziekte (IBD)2,3.

Eerder werden diermodellen en getransformeerde van kanker afgeleide darmcellijnen gebruikt om de fysiologische en pathofysiologische functies van menselijk darmweefsel te bestuderen. Steeds prominentere zorgen over de vertaalbaarheid van dieronderzoek naar mensen, veroorzaakt door de aanwezigheid van aanzienlijke verschillen tussen de twee soorten, wezen echter op de behoefte aan voor de mens relevante alternatieve methoden4. De meest gebruikte in vitro darmcellijnen omvatten T84-, Caco-2- en HT29-cellen. Hoewel ze bepaalde aspecten van de darmbarrièrefunctie en het membraantransport nabootsen, worden ze gekenmerkt door een veranderde expressie van geneesmiddelmetaboliserende enzymen5, oppervlaktereceptoren en transporters4. Bovendien missen ze darmsegmentspecificiteit en slagen ze er niet in om de complexiteit van het darmepitheel te recapituleren, waarbij elk model slechts één van de vijf epitheelceltypen bevat die in de darm aanwezig zijn6.

Onlangs werden menselijke intestinale organoïde culturen die zijn vastgesteld uit verse biopsieën van de dunne darm en dikke darm 7,8 of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)9 geïntroduceerd als alternatieve experimentele modellen met potentieel om dierproeven in de toekomst aan te vullen, te verminderen en misschien te vervangen. Hoewel iPSC's op een niet-invasieve manier kunnen worden verkregen, vereist het vaststellen van organoïden uit iPSC's het gebruik van complexe en langdurige protocollen (met verschillende experimentele stappen) en genereert het culturen die lijken op menselijk foetaal weefsel. Biopsie-afgeleide organoïden zijn daarentegen zeer schaalbaar, omdat ze gebruik kunnen maken van de inherente vernieuwingscapaciteit van darmweefsel en voor onbepaalde tijd in vitro kunnen worden gepasseerd en vermeerderd. Belangrijk is dat van biopsie afgeleide organoïden de ziekte- en darmregiospecifieke kenmerken van het primaire weefsel waaruit ze zijn ontwikkeld, behouden en de cellulaire diversiteit van het darmepitheel nabootsen. Organoïden kunnen in vitro worden gebruikt als patiëntspecifieke avatars om de biologie en pathogenese van verschillende gastro-intestinale aandoeningen te ontrafelen en hun therapeutisch beheer te verbeteren. Hoewel intestinale organoïden een indrukwekkende mate van fysiologische functionaliteit hebben bereikt, slagen ze er nog steeds niet in om de complexiteit van de inheemse organen te reproduceren vanwege hun gebrek aan kritieke stromale componenten - waaronder bloedvaten, bindweefsel, perifere zenuwen en immuuncellen - evenals mechanische stimulatie. Van mechanische parameters, zoals stroming, schuifspanning, rek en druk, is bekend dat ze de morfogenese en homeostase van weefsel in vivo beïnvloeden en eerder werd aangetoond dat ze de rijping van cellen in vitro verbeteren 10,11,12,13. Een bijkomend belangrijk nadeel van organoïde systemen is de ontoegankelijkheid van het lumen en dus van de apicale kant van het epitheel. Dit vormt een uitdaging voor het onderzoeken van verschillende mechanismen die verband houden met de gepolariseerde expressie van ionen- en medicijntransporters, interacties tussen gastheer en microbioom en farmaceutische toxiciteitstests. Ten slotte lijden organoïde culturen aan aanzienlijke variabiliteit in grootte, morfologie en functie, als gevolg van de stochastische aard van het in vitro zelforganisatieproces en de keuzes voor het lot van cellen. Daarom, om het volledige potentieel van intestinale organoïden in ziektemodellering, medicijnscreening en regeneratieve geneeskunde te realiseren, is het noodzakelijk om nieuwe strategieën te verkennen die de variabiliteit in organoïde ontwikkeling verminderen, de toegang tot het luminale compartiment verbeteren en ontbrekende cel-celinteracties opnemen.

Organ-on-a-Chip-technologie heeft veel technieken geïntroduceerd voor de integratie van mechanische krachten en vloeistofstroom in darmcelculturen in vitro. Omdat de meeste van de eerste proof-of-concept studies echter van kanker afgeleide cellijnen hebben gebruikt die niet voldoende cellulaire diversiteit vertoonden, is de relevantie van deze systemen in twijfel getrokken. Onlangs hebben we synergetisch intestinale organoïden en organ-on-a-chip-technologie gecombineerd om de beste kenmerken van elke aanpak in één in vitro systeem op te nemen 14,15,16. De resulterende darm-chip recapituleert de meercellige architectuur van het darmepitheel, de aanwezigheid van de epitheliaal-endotheelweefselinterface en de mechanische krachten van vloeistofstroom en -stretch, waardoor emulatie van functies op orgaanniveau in vitro mogelijk wordt. Bovendien verhoogt het gebruik van van primair weefsel afgeleide organoïden (die kunnen worden bemonsterd uit verschillende regio's van de menselijke darm) als uitgangsmateriaal de veelzijdigheid van dit model, omdat chips die menselijke twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en colon vertegenwoordigen, kunnen worden vastgesteld na vergelijkbare zaai- en kweekprocedures. Belangrijk is dat Intestine-Chips real-time beoordeling mogelijk maken van: de integriteit van de darmbarrière; activiteit van de borstelrand en enzymen voor het geneesmiddelmetabolisme; productie van mucines; secretie van cytokines; en interactie van darmcellen met pathogene en commensale micro-organismen, zoals aangetoond in de eerder gepubliceerde rapporten. Met name toen darmchips werden vastgesteld met behulp van organoïden gegenereerd uit het weefsel van verschillende individuen, legden deze modellen de verwachte interdonorvariabiliteit vast in de functionele reacties op verschillende geneesmiddelen en behandelingen. Al met al opent het samenvoegen van organoïden met Organ-on-a-Chip-technologie de deur naar meer geavanceerde, gepersonaliseerde, in vivo relevante modellen die de fysiologische relevantie en nauwkeurigheid van de in vitro bevindingen kunnen verbeteren, evenals hun extrapolatie naar mensen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het vaststellen van de darmchip en de toepassing ervan in de studies van fysiologische functies van de twee darmsegmenten: twaalfvingerige darm en dikke darm. Ten eerste worden de methoden beschreven voor het beoordelen van de activiteit van het geneesmiddel-metaboliserende enzym CYP3A4 in de twaalfvingerige darmchip, evenals de inductie ervan door prototypische verbindingen zoals rifampicine en vitamine D3. Ten tweede worden de stappen die nodig zijn om "lekkende darm" in de darmchip te modelleren beschreven in het protocol, waarbij de verstoring van de epitheliale barrière wordt uitgevoerd met behulp van kenmerkende cytokines die betrokken zijn bij de pathogenese van de IBD. Kortom, organoïden afgeleid van menselijke biopsieën worden in vitro vermeerderd, onderworpen aan enzymatische spijsvertering en geïntroduceerd in het bovenste kanaal van de chip. In aanwezigheid van continue perfusie met groeifactorverrijkte media ontwikkelen ze zich tot een confluente epitheliale monolaag met 3D-architectuur en een gemakkelijk toegankelijk apicale celoppervlak. Het onderste, "vasculaire" chipcompartiment is bezaaid met microvasculaire endotheelcellen geïsoleerd uit de dunne of dikke darm. Het epitheel en endotheel worden gescheiden door een poreus rekbaar membraan, dat de paracriene interacties tussen de twee weefsels vergemakkelijkt en, wanneer het wordt blootgesteld aan cyclische vervormingen, peristaltiekachtige bewegingen van de menselijke darm emuleert. De cocultuur wordt gehandhaafd onder de dynamische stroomomstandigheden die worden gegenereerd door luminale en vasculaire perfusie met geschikte celkweekmedia. Ten slotte beschrijven we tal van soorten assays en eindpuntanalyses die direct op de chip of uit bemonsterde celkweek effluenten kunnen worden uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle celculturen moeten worden behandeld met behulp van een juiste aseptische techniek.

De menselijke darmorganoïden die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van de Johns Hopkins University en alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met goedgekeurde richtlijnen en voorschriften. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).

1. Bereiding van de celkweekreagentia

  1. Bereid het menselijke organoïde groeimedium voor volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen) en vul het aan met 100 μg / ml primocine.
  2. Bereid het groeimedium van menselijke microvasculaire endotheelcellen voor volgens de instructies van de fabrikant (tabel met materialen) en vul aan met 1:20 vol/vol FBS en 50 μg/ml in plaats daarvan 100 μg/ml primocine.
  3. Resuspendeer Y-27632 (rhokinaseremmer) in steriele 0,1% BSA in DPBS om een 10 mM stockoplossing te bereiden. Aliquot in steriele microbuisjes en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  4. Resuspendeer CHIR99021 (GSK-3-remmer) in steriel dimethylsulfoxide (DMSO) om een 5 mM stockoplossing te bereiden. Aliquot in steriele microbuisjes en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  5. Bereid de humane organoïde vergistingsoplossing door een 1:1 vol/vol organoïden dissociatieoplossing (Materiaaltabel) te mengen met DPBS-oplossing (Materiaaltabel) en deze aan te vullen met 10 μM stamoplossing van Y-27632. Dit reagens moet voor elk gebruik vers worden gemaakt.

2. Kweek van menselijke intestinale microvasculaire endotheelcellen (HIMEC's)

  1. Start de HIMEC-cultuur (Table of Materials) 7 dagen voordat u deze op de chip zaait. Alleen HIMEC's bij passage 1-6 kunnen worden gebruikt voor chip seeding.
  2. Voeg 5 ml van de bevestigingsfactoroplossing (materiaaltabel) toe aan een T150-kolf; incubeer bij 37 °C gedurende 1 min en gooi de oplossing weg.
  3. Voeg 19 ml voorverwarmd endotheelcelgroeimedium bij kamertemperatuur (zie stap 1.2) toe aan de kolf.
  4. Ontdooi een bevroren injectieflacon MET HIMEC (2 miljoen cellen/injectieflacon) in een waterbad van 37°C.
  5. Breng de inhoud van de injectieflacon over in de kolf en schommel de kolf voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats de kolf een nacht in een incubator van 37 °C om de endotheelcellen te laten hechten.
  6. Vervang het medium door 20 ml endotheelcelgroeimedium dat de volgende dag en daarna om de 3 dagen bij kamertemperatuur wordt voorverwarmd. Culturen zouden 90% van de samenvloeiing moeten bereiken op de dag van de celoogst voor chipexperimenten.

3. Microfabricage en bereiding van de chip

  1. Koop chips van een commerciële leverancier (Tabel met materialen). Pak de chips uit en plaats ze in de chiphouder die in een vierkante petrischaal (Table of Materials) is geplaatst. Label de voorkant van elke chipdrager met de experimentele omstandigheden (figuur 1A).
    OPMERKING: Hoewel het gepresenteerde protocol afhankelijk is van het gebruik van een specifieke commercieel verkrijgbare chip en instrumentatie, zijn er verschillende microfluïdische apparaten die via verschillende leveranciers worden aangeboden, die alternatieve voordelen kunnen bieden, maar niet de mogelijkheid hebben om stretch op te nemen. Bovendien kan microfabricage van de organen-op-chips "in eigen huis" worden uitgevoerd volgens de procedures beschreven in Huh et al.21.

4. Activering en ECM-coating van het membraan

  1. Bereiding van de activeringsoplossing
    1. Breng de ER-1- en ER-2-reagentia (materiaaltabel) voor gebruik op kamertemperatuur om in evenwicht te brengen. ER-1 is lichtgevoelig en moet in het donker worden gehanteerd.
    2. Reconstitueer ER-1 in 10 ml ER-2-reagens om een eindconcentratie van 0,5 mg/ml te maken en bevestig dat de ER-1 volledig is opgelost.
  2. Surface activeren
    1. Duw voorzichtig 50 μL van de ER-1-oplossing door beide kanalen van de chip (figuur 1A).
    2. Verwijder overtollige ER-1-oplossing van het oppervlak van de chip met behulp van een aspirator.
    3. Inspecteer de chips om er zeker van te zijn dat alle chips de ER-1-oplossing hebben ontvangen. In het geval van luchtbellen, introduceer meer ER-1-oplossing totdat de bellen volledig zijn verwijderd.
    4. Incubeer de chips in de UV-lampkamer (Table of Materials) gedurende 15 minuten. Controleer of het UV-lampje is ingesteld op de instelling Consistent.
    5. Breng de ER-1 geactiveerde chips terug naar de bioveiligheidskast (BSC). Aspirateer de ER-1 oplossing uit beide kanalen. Was alle resten van de ER-1-oplossing met 200 μL ER-2.
    6. Duw 200 μL steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DBPS) door de kanalen (Table of Materials) en laat DBPS in de kanalen tot de volgende stap.
  3. Bereiding van extracellulaire matrix (ECM) en membraancoating
    1. Bereiding van voorraadoplossingen van ECM-componenten
      1. Reconstitueer collageen IV (tabel van materialen) en fibronectine (tabel van materialen) met behulp van steriel water van celkweekkwaliteit (tabel met materialen) tot een eindconcentratie van 1 mg / ml. Bereid aliquots en bewaar ze bij -20°C tot gebruik.
    2. Bereiding van ECM-werkoplossing voor membraancoating
      1. Bereid 1,5 ml van elke ECM-oplossing voor het bovenste en onderste kanaal voor elke 12 chips die moeten worden gecoat. De ECM-oplossing moet altijd vlak voor gebruik worden bereid.
      2. Meng voor het bovenste kanaal collageen IV en opgeloste keldermembraanmatrix (BMM) (Tabel van materialen) in steriele koude DBPS bij respectievelijk 200 μg / ml en 100 μg / ml. Meng voor het onderste kanaal collageen IV en fibronectine in steriele koude DPBS op respectievelijk 200 μg / ml en 30 μg / ml.
    3. ECM coating van de chips
      1. Adem de DBPS uit beide kanalen van de chips en vervang deze door de juiste ECM-werkoplossing voor elk kanaal (figuur 1A).
      2. Inspecteer elke chip om er zeker van te zijn dat deze de coatingoplossing heeft ontvangen. In het geval van luchtbellen, duw door meer coatingoplossing totdat alle bellen volledig zijn verwijderd.
      3. Voeg steriele DPBS toe aan de chiphouder en plaats de petrischaal met de chips in een incubator van 37 °C. Incubeer 's nachts om de ECM-eiwitten ionische bindingen te laten vormen met het geactiveerde PDMS-membraan. Indien gewenst kunnen cellen op elk moment tussen 2 uur en 1 dag na het coaten van de chips worden gezaaid. Als alternatief kunnen gecoate chips 's nachts bij 4 °C worden bewaard, gevolgd door 's nachts incubatie bij 37 °C en chipzaaien.

5. Zaaien van intestinale microvasculaire endotheelcellen (HIMEC's) in het onderste kanaal van de chip

OPMERKING: Dunne darm en colon-HIMEC's worden gezaaid in het onderste kanaal van respectievelijk de twaalfvingerige darm en de darmchip.

  1. Bereid chips
    1. Breng de ECM-gecoate chips over naar de BSC. Zuig de ECU-coating voorzichtig op uit beide kanalen van de chips en was vervolgens beide kanalen met respectievelijk 200 μL organoïde groeimedium en endotheelcelgroeimedium.
    2. Bewaar de gewassen chips in een incubator van 37 °C totdat u doorgaat met het zaaien van endotheelcellen.
  2. Oogst de endotheelcellen
    1. Breng de HIMEC kweekfles naar de BSC en was met steriele DPBS.
    2. Voeg 3 ml dissociatieoplossing toe aan de kolf en plaats deze gedurende 2 minuten in de incubator van 37 °C om volledige celloslating mogelijk te maken.
    3. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml en voeg endotheelcelgroeimedia toe totdat deze 10 ml bereikt. Monster 15-20 μL van de celsuspensie voor celtelling. Centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 min.
    4. Aspirateer het supernatant zorgvuldig en suspensieer de HIMEC's opnieuw tot een dichtheid van 8-10 x 106 cellen / ml in endotheelcelgroeimedia.
  3. Zaad endotheelcellen in het onderste kanaal van de chip
    1. Breng de petrischaal met de chips naar de BSC en verwijder voorzichtig alle media uit het onderste kanaal met een pipet van 1.000 μL.
    2. Breng 10-15 μL van de HIMEC-suspensie in het onderste kanaal van de chip. Inspecteer de chip direct na het zaaien om een optimale zaaidichtheid (80% -90% van de dekking) en homogene celverdeling binnen het kanaal te garanderen (figuur 1D). Als de zaaidichtheid hoger of lager is dan verwacht of ongelijk, wast u het kanaal 2x met 200 μL endotheelcelgroeimedia en herhaalt u de zaaiprocedure.
    3. Keer de petrischaal onmiddellijk na het zaaien van elke batch van zes chips om endotheelcelaanhechting aan de onderkant van het PDMS-membraan mogelijk te maken. Plaats de petrischalen in de incubator van 37°C gedurende 30 minuten tot 1 uur, of totdat de HIMEC's in het onderste kanaal zich aan het membraan hebben bevestigd (figuur 1D).
  4. Was de chips
    1. Duw voorzichtig 200 μL endotheelcelgroeimedia door de onderste kanaalinlaat om eventuele niet-losgemaakte cellen te verwijderen en de voedingsstoffen in de media aan te vullen.
    2. Spoel de cellen weg die zich niet in het bovenste kanaal hechtten met 200 μL organoïde groeimedium aangevuld met 5 μM CHIR99021 en 10 μM Y-27632.
    3. Plaats de chips in de incubator van 37°C totdat u doorgaat naar het epitheelcelzaaien.

6. Zaaien van organoïde fragmenten in het bovenste kanaal van de chip

OPMERKING: Organoïden geïsoleerd uit biopsieën van verschillende darmgebieden kunnen worden gekweekt in de darmchip7. Volg de procedures beschreven in Fujii et al. voor de isolatie van menselijke darmcrypten en de oprichting van organoïde culturen22. Hier worden duodenale en colonorganoïden gebruikt om respectievelijk de twaalfvingerige darm- en darmchips te genereren. Gezien de hoge batch-to-batch en donor-to-donor variabiliteit in organoïde vorming en groei, wordt voorgesteld om een pilotevaluatie van de celdichtheid uit te voeren in de organoïde suspensiecultuur (24-well plaatformaat) om de optimale zaaidichtheid van 8 miljoen cellen / ml te bereiken.

  1. Pilot evaluatie van de celaantallen/put van statische organoïde cultuur.
    OPMERKING: De volgende procedure is uitsluitend bedoeld om het aantal putten organoïde suspensiecultuur te bepalen dat nodig is voor het chipzaaien. De resulterende enkele cellen mogen niet worden gebruikt voor het zaaien van de chip.
    1. Haal het supernatant voorzichtig uit drie putten van de organoïde kweekplaat. Voeg 500 μL ijskoude BMM-dissociatieoplossing (tabel met materialen) toe aan elke put en gebruik een plastic schraper om de opgeloste BMM van het plastic los te maken.
    2. Verzamel de organoïde suspensie in een steriele laag-eiwitbindende conische buis met behulp van een ijskoude pipet van 1.000 μL. Incubeer op ijs gedurende 60 minuten en meng elke 15 minuten door de buis voorzichtig te schudden. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4°C.
    3. Aspirateer het supernatant en voeg 2 ml Trypsine toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om de organoïden te verteren tot het niveau van één cel en voeg 10 ml volledig organoïde groeimedium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4°C.
    4. Resuspendeer de celpellet in 1 ml volledig organoïde groeimedium en tel het totale aantal cellen met behulp van een hematocytometer volgens standaardmethoden.
  2. Bereiding van organoïde fragmenten en hun zaaien in de chip
    OPMERKING: De volgende procedures kunnen worden gebruikt om duodenale of colonorganoïden in het bovenste kanaal van de chip te zaaien. De oprichting van een epitheliale monolaag met een in vivo relevante 3D-cytoarchitectuur is afhankelijk van de aanwezigheid van flow15,23 en het succesvol zaaien van organoïde fragmenten.
    1. Aspirateer het medium zorgvuldig uit het aantal putten van de statische organoïde cultuur, wat voldoende is, zoals bepaald in stap 6.1, om de uiteindelijke zaaidichtheid van 8 miljoen cellen / ml te bereiken. Voeg 500 μL ijskoude BMM-dissociatieoplossing toe aan elk putje.
    2. Maak de opgeloste BMM los van het oppervlak van de putten met behulp van een plastic schraper of een pipet van 1.000 μL. Verzamel de suspensie in een 15 ml eiwitarme bindingsbuis.
    3. Bewaar de suspensie gedurende 60 minuten op ijs en meng elke 15 minuten door de buis voorzichtig te schudden. Ga over tot centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C. Een goed gedefinieerde organoïde pellet moet zichtbaar zijn na de centrifugatie. Als een transparante gellaag wordt waargenomen boven de celpellet (residuen van opgeloste BMM) (figuur 1B), ga dan verder met de volgende stappen.
      1. Meng het supernatant en de celpellet en voeg een gelijk volume BMM-dissociatieoplossing toe aan de buis. Meng en bewaar voorzichtig op ijs gedurende nog eens 10 minuten en ga verder met centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      2. Herhaal indien nodig stap 6.2.3.1 totdat er geen opgeloste BMM-residuen aanwezig zijn.
    4. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de organoïde pellet met organoïde verteringsoplossing (zie stap 1.5). Gebruik een voldoende volume organoïde verteringsoplossing om volledige onderdompeling van de pellet te garanderen. 2 ml oplossing is geschikt voor ongeveer 2.400-12.000 middelgrote organoïden (figuur 1D, post-seeding). Incubeer bij 37°C gedurende 1-3 min.
    5. Voeg Advanced DMEM/F-12 toe aan de buis om de enzymatische reactie te stoppen. Gebruik vier keer het volume van de gebruikte spijsverteringsoplossing. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min bij 4°C.
    6. Adem het supernatant aan en resuspensieer de organoïde fragmenten pellet in een compleet organoïde groeimedium aangevuld met 5 μM CHIR99021 en 10 μM Y-27632 om 8 miljoen cellen /ml te bereiken. Bereid 360 μL aliquots van de suspensie in steriele 1,5 ml eiwitarme bindingsbuizen om de vermindering van de celdichtheid als gevolg van aanhechting op de wanden te voorkomen.
    7. Verwijder het medium uit het bovenste kanaal van de gecoate chips. Voeg 30 μL celsuspensie toe in het bovenste kanaal van elke chip. Incubeer de chips een nacht in een incubator van 37 °C om de organoïde fragmenten te laten hechten aan het met ECM gecoate membraan (figuur 1D).

7. Dynamische cultuur van darmchip - initiatie en onderhoud van stromings- en peristaltiekachtige bewegingen

  1. Mediavoorbereiding en ontgassing
    1. Om een constante laminaire stroom door de chip te behouden, laat u de mediatemperatuur in evenwicht komen tot kamertemperatuur en onderwerpt u deze vervolgens gedurende 10 minuten aan vacuümgestuurde filtratie met behulp van een vacuümpomp en PVDF-filter conische buizen (mediaontgassing).
  2. Aanzuigen van draagbare modules
    OPMERKING: Draagbare modules zijn reservoirs die fungeren als een interface tussen de chips en de kweekmodule die het mogelijk maakt om bemonstering en dosering van media te herhalen.
    1. Open de draagbare modules, in de BSC, en plaats ze op de kweekmodulebakken, die gespecialiseerde containers zijn voor het uitlijnen van de draagbare modules.
    2. Voeg 3 ml voorgebalanceerd compleet organoïde groeimedium aangevuld met 5 μM CHIR99021 en 10 μM Y-27632 toe aan het bovenste inlaatreservoir en 3 ml voorgebalanceerd endotheelcelgroeimedium in het onderste inlaatreservoir (figuur 1C). Voeg 300 μL van hetzelfde medium toe aan de respectieve uitlaatreservoirs.
    3. Breng de trays naar de incubator van 37°C en schuif ze in de kweekmodule (figuur 1C). Gebruik bedieningselementen op het scherm van de cultuurmodule om de "Prime Cycle" (1 minuut lang) uit te voeren. Wanneer de statusbalk "Gereed" aangeeft, is de Prime Cycle voltooid. Herhaal de Prime Cycle om ervoor te zorgen dat er voldoende druppels zijn gevormd om de chips met succes te verbinden.
    4. Zorg ervoor dat alle draagbare modules zijn geprimed en zichtbare mediadruppels hebben.
  3. Introductie van flow
    OPMERKING: De stroom wordt meestal 24 uur na het zaaien van organoïde fragmenten geïnitieerd om de darmepitheelcellen stevig aan het membraan te laten hechten.
    1. Was beide kanalen van de gezaaide chips met 200 μL van de respectieve media om eventuele bellen of celresten te verwijderen. Laat na het wassen kleine druppeltjes medium op de poorten achter. Schuif de chipdrager in de draagbare module (figuur 1C).
    2. Plaats de draagbare modules op de lades en vervolgens in de kweekmodule. Gebruik de bedieningselementen op het scherm van de kweekmodule om de juiste orgaanchipcultuuromstandigheden (stroomsnelheid en rek) te programmeren.
      OPMERKING: Voor standaard twaalfvingerige darm- en darmchipkweekomstandigheden stelt u het debiet in op respectievelijk 30 μL/h15 en 60 μL/h16 , voor zowel het bovenste als het onderste kanaal. De stroomsnelheden voor elk kanaal worden echter onafhankelijk geregeld en kunnen worden ingesteld tussen 0-1.000 μL/h. Spuit- of peristaltische pompen kunnen worden gebruikt, in plaats van hier gepresenteerde kweekmodules, om laminaire stroming naar microfluïdische chips te introduceren. Het tot stand brengen van betrouwbare vloeistofverbindingen tussen chips en pompen met behulp van buizen en connectoren kan echter technisch een uitdaging zijn wanneer gelijktijdige perfusie van meerdere chips vereist is.
    3. Start de "Regulate Cycle" (2 uur lang) die de kweekmedia in draagbare module en chip onder druk zet om nucleatie van de luchtbellen te voorkomen. Geprogrammeerde omstandigheden worden hervat na voltooiing van de regulatiecyclus.
  4. Media verandering
    1. Bereid verse media voor beide kanalen en vul deze om de 48 uur aan door 2 ml vers medium aan de inlaatreservoirs toe te voegen (figuur 1C).
    2. Pauzeer de kweekmodules en breng de trays naar BSC. Aspirateer media in alle reservoirs en vul aan met verse media. Breng de trays terug en start de flow opnieuw.
  5. Introductie van stretch
    OPMERKING: Laat de cellen groeien tot 100% samenvloeiing voordat ze cyclische stam toepassen. Stretch wordt meestal 3 dagen na het zaaien of 48 uur na het begin van de vloeibare cultuur geïntroduceerd. 2% cyclische stam met de frequentie van 0,2 of 0,15 Hz, voor respectievelijk de darmchip van de twaalfvingerige darm11 en de dikke darm24 , wordt toegepast voor de eerste 24 uur. Vervolgens wordt het verder verhoogd tot 10% voor de resterende duur van de darmchipcultuur om sterk te lijken op de cyclische stam die intestinale epitheelcellen in vivo ervaren (figuur 1D)25. De kweekmodule kan toepassing van 2%-12% cyclische belasting en frequentie tot 0,4 Hz ondersteunen.
    1. Om stretch te introduceren in de voortdurende fluïde cultuur, pauzeer je de cultuurmodule. Wijzig met behulp van de bedieningselementen op het scherm de stretchinstellingen in 2% stretch, 0,2 of 0,15 Hz frequentie en start de cultuurmodule opnieuw.
    2. Herhaal na 24 uur stap 7.5.1 om een rekfrequentie van 10%, 0,2 of 0,15 Hz toe te passen.

8. CYP450-inductie met behulp van prototypische CYP-inductoren in de twaalfvingerige darmchip

OPMERKING: De inductietest voor cytochroom P450 (CYP450) maakt het mogelijk om te beoordelen of de testverbinding de mRNA-niveaus en/of katalytische activiteit van specifieke CYP450-enzymen verhoogt. Hier beschrijven we het protocol voor de evaluatie van CYP3A4-inductie door de industriestandaard en door de regulator aanbevolen in vitro CYP-inductoren, Rifampicine (RIF) en 1,2-dihydroxy vitamine D3 (VD3). De gepresenteerde methode kan worden gebruikt om het potentieel van verschillende testverbindingen te identificeren om verschillende isovormen van CYP450 in menselijk darmweefsel te induceren. Specifieke sets primers en sondesubstraat moeten worden geselecteerd voor elk te evalueren enzymisovorm.

  1. Blootstelling aan CYP-inductoren
    1. Bereid voorraadoplossingen van 20 mM RIF, 100 mM VD3 en 200 mM testosteron (tabel met materialen) met behulp van steriele DMSO.
      LET OP: Testosteron is een Schedule III gereguleerde stof. Volg de wettelijke procedures tijdens de behandeling.
    2. Bereid doseermedia voor met CYP-inductoren door de stamoplossingen te verdunnen in volledig organoïde groeimedium en endotheelcelgroeimedium om 20 μM RIF, 100 nmol/L VD3 te bereiken. Bereid de voertuigcontrole voor door DMSO in de respectieve media te verdunnen om 0,1% DMSO te bereiken.
    3. Pauzeer de kweekmodule en breng de trays naar BSC. Vervang de media in alle inlaatreservoirs door 2 ml doseermedia door inductoren of voertuigbesturing. Breng de draagbare modules terug naar de kweekmodule en start de stroom opnieuw op 30 μL/h.
    4. Vervang na 24 uur het medium door een inducerende oplossing en herhaal stap 8.1.2-8.1.3. Inducerende oplossingen moeten dagelijks vers worden bereid en elke 24 uur worden aangevuld in de loop van het experiment, dat meestal 48-72 uur lang is.
  2. Incubatie met een prototypisch substraat (testosteron)
    1. Bereid op de dag van de oogst de sondesubstraatoplossing van testosteron samen met overeenkomstige inductoren in Advanced DMEM / F12 om een eindconcentratie van 200 μM te verkrijgen. Laat de toevoeging van het serum aan de media weg, omdat dit de LCMS-analyse kan verstoren.
    2. Breng de trays naar BSC en haal het doseermedium uit alle reservoirs. Was en vervang de bovenste en onderste inlaatreservoirs met respectievelijk warm Advanced DMEM/F12 medium en endotheelcelgroeimedium.
    3. Verwijder het wasmedium uit de reservoirs en vervang het door 1 ml sondesubstraatoplossing, bereid in stap 8.2.1. Perfuseer de chips met een hoog debiet van 1.000 μL/h gedurende 5 minuten en adem zowel de bovenste als de onderste uitlaatreservoirs aan. Breng de chips terug naar de kweekmodule en incubeer gedurende 1 uur onder de constante stroom van 300 μL/h.
  3. Data-analyse
    1. Monsterverzameling voor LCMS-analyse
      1. Aliquot 200 μL stopoplossing met acetonitril met 0,1% mierenzuur in vooraf gelabelde buisjes van 1,5 ml en plaats ze op ijs. De samenstelling van de LCMS-stopoplossing kan variëren op basis van het substraat dat moet worden geanalyseerd.
      2. Nadat 1 uur behandeling is voltooid, stopt u de stroom en brengt u de trays terug naar BSC. Verzamel 100 μL effluent uit het bovenste uitlaatreservoir en voeg dit toe aan de overeenkomstige buis met de stopoplossing (figuur 2A). Plaats de buisjes direct op droogijs. Bewaar de monsters bij -80°C voordat u overgaat tot analyse.
      3. Extract en analyseer monsters met behulp van HPLC- of LC-MS / MS-technieken, waarbij de vorming van metaboliet-6β-hydroxytestosteron (6β-OH-T) wordt bewaakt. CYP-enzymactiviteit kan worden uitgedrukt als pmol/min/mg-eiwit waarbij pmol verwijst naar de hoeveelheid metaboliet (6β-OH-T) die tijdens de reactie wordt gevormd. Het totale eiwitgehalte per chip (eiwit; mg) wordt bepaald door een Bradford-test uit te voeren die wordt beschreven in stap 8.3.2.
        Equation 1
        De vouwinductieactiviteit wordt berekend door: CYP-activiteit (geïnduceerd) / CYP-activiteit (voertuig).
      4. Als u monsters verzamelt voor mRNA-analyse, zie stap 8.3.3.
    2. Lysis van de cellen voor eiwitexpressieanalyse
      OPMERKING: Eiwitextractie uit cellen op de chip wordt uitgevoerd met behulp van een eiwitlysisbuffer, aangevuld met protease- en fosfataseremmers (tabel met materialen). Geëxtraheerd eiwit wordt vervolgens gekwantificeerd met behulp van de Bradford-test en gebruikt in downstream-analyse.
      1. Maak de chips los van draagbare modules en plaats ze in een petrischaaltje. Was beide kanalen met 200 μL steriele DPBS.
      2. Blokkeer de onderste kanaaluitlaat met een filterpipetpunt van 200 μL. Perfuseer 50 μL van de dissociatieoplossing door het bodemkanaal en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Inspecteer om volledige onthechting van de endotheelcellen te bevestigen. Pipetteer 1-2 keer op en neer en verwijder de dissociatieoplossing uit het kanaal. Opnieuw wassen.
      4. Blokkeer de uitlaat van het bovenste kanaal met een filterpipetpunt van 200 μL. Perfuseer 75 μL eiwitlysisbuffer door het bovenste kanaal. Laat de pipetpunt inbrengen om de inlaat van het bovenste kanaal te blokkeren en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer 5-10 keer op en neer en verzamel de cellysaten in een vooraf gelabelde buis van 1,5 ml.
      5. Herhaal stap 8.3.2.4. totdat volledige loslating van cellen wordt waargenomen. Verzamel de cellysaten in dezelfde buis van 1,5 ml en bewaar ze bij -80 °C tot de analyse.
      6. Extraheer de eiwitfractie volgens standaardmethoden en kwantificeer het totale eiwit met behulp van de Bradford-test (Tabel van materialen).
    3. Lysis van de cellen voor genexpressieanalyse
      OPMERKING: On-chip cellyse voor RNA-extractie kan worden bereikt met behulp van een RNA-lysisbuffer, aangevuld met 0,1% 2-mercaptoethanol (Tabel van materialen). Als alternatief kan een op fenol gebaseerde RNA-lysisbuffer worden gebruikt als hoge opbrengsten van hoogwaardig RNA dat geschikt is voor NGS- en microarrays-analyse vereist zijn.
      1. Volg de stappen 8.3.2.1 tot en met 8.3.2.2 om de darmchip voor te bereiden op lysis.
      2. Blokkeer de uitlaat van het bovenste kanaal met een filterpipetpunt van 200 μL. Perfuseer 150 μL RNA-lysisbuffer door het bovenste kanaal. Laat de pipetpunt inbrengen om de inlaat van het bovenste kanaal te blokkeren. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik voor lysis met behulp van een op fenol gebaseerde RNA-lysisbuffer 350 μL van het reagens.
      3. Pipetteer 5-10 keer op en neer en verzamel de cellysaten in een vooraf gelabelde buis van 1,5 ml. Herhaal de stap met nog eens 150 μL RNA-lysisbuffer en verzamel. Bewaar de cellysaten bij -80 °C tot analyse. In het geval van daaropvolgende RNA-sequencinganalyse, ga verder met de analyse binnen 1 maand na het liegen.
      4. Extraheer totaal RNA uit de cellysaten met behulp van een RNA-zuiveringskit.
      5. Reverse-transcribe in cDNA met behulp van een reverse transcriptase kit en voer real-time PCR uit met behulp van een real-time PCR cycler en de juiste primers en buffer. Kwantificeer de resultaten met behulp van de 2-ΔΔCt-methode .

9. Verstoring van de epitheliale barrière met behulp van pro-inflammatoire cytokines in darmchip

OPMERKING: Dit protocol beschrijft verstoring van de intestinale epitheliale barrière door het cytokine interferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Het cytokine wordt gedoseerd in het onderste kanaal van de darmchip, gegeven de basolaterale expressie van IFNγ-receptor op intestinale epitheelcellen.  De pro-inflammatoire stimulus wordt op dag 5 van de kweek in de chip geïntroduceerd, zodra deP-app is gestabiliseerd onder 0,5 x 10-6 cm/s. Een vergelijkbaar doseringsregime kan worden gebruikt voor andere pro-inflammatoire cytokines en barrièreverstorende middelen.

  1. Stimulatie met IFNγ
    1. Bereid een 100 μg/ml stamoplossing van IFNγ (Tabel van Materialen) in steriel celkweekwater. Bewaar de voorraadoplossing in de loop van het experiment bij -80°C. Gebruik voor elk experiment altijd een verse voorraad IFNγ en vermijd meer dan drie vries- en dooicycli.
    2. Bereid ifnγ doseringsoplossing door het verdunnen van de stamoplossing in ontgast endotheelcelgroeimedium om een eindconcentratie van 10-100 ng / ml te bereiken.
    3. Breng de trays naar BSC en verwijder het medium uit de onderste kanaalinlaatreservoirs en vervang het door 3 ml van het IFNγ-bevattende medium. Ververs het IFNγ doseringsmedium dagelijks.
    4. Plaats de trays in de kweekmodule en perfuseer de chips met een hoog debiet van 1.000 μL/h gedurende 5 minuten om de IFNγ-behandeling te starten. Schakel het debiet terug naar 60 μL/h en zet de vloeistofcultuur voort.
  2. Data-analyse
    1. Beoordeling van de epitheliale barrièrefunctie. De epitheliale schijnbare permeabiliteit (P-app), of barrièrefunctie, kan worden gemeten op verschillende tijdstippen van de kweek na de behandeling met IFNγ, in de effluentmedia van de inlaat- en uitlaatreservoirs van beide kanalen. De fluorescerende tracer moet 4 uur vóór de beoordeling van deP-app aan het bovenste kanaal organoïde groeimedium worden toegevoegd. Meestal wordt 3 kDa Dextran Cascade Blue gebruikt als fluorescerende tracer en wordt het 24 uur eerder in het medium toegevoegd.
      1. Pauzeer de kweekmodule en breng de trays naar de BSC.
      2. Label en bereid een 96-well zwartwandige plaat met 100 μL DPBS per putje. Verzamel met behulp van een meerkanaalspipet van 200 μL 50 μL effluent uit alle reservoirs en voeg deze toe aan de respectieve putten (figuur 2B).
      3. Om de standaardcurve voor te bereiden, verdunt u het medium met 100 μg/ml 3 kDa dextran Cascade Blue 1:3 in DPBS. Voer vervolgens seriële verdunningen uit met behulp van een drievoudige verdunning van endotheelcelgroeimedium in DPBS.
      4. Lees de fluorescentie bij 375 nm excitatie en 420 nm emissie met behulp van een platenlezer. Gebruik de gemeten OD-waarden om de schijnbare permeabiliteit (P-app) als volgt te berekenen:
        Equation 2
    2. Immunofluorescentiekleuring van cellen op de chip
      1. Was met 200 μL DPBS voor elk kanaal, drie keer.
      2. Perfuseer 200 μL van de fixatieve oplossing (4% PFA in DPBS) in elk kanaal. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      3. Herhaal de wasstap 9.2.2.1. In dit stadium kunnen gewassen chips tot 7 dagen bij 4°C worden bewaard.
      4. Permeabiliseer de cellen met behulp van 200 μL permeabilisatieoplossing (0,1% Triton-X 100 in 10% normaal ezelserum (NDS) in DPBS) voor elk kanaal. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap 9.2.2.1.
      5. Blokkeer de cellen op de chip met behulp van 200 μL blokkerende oplossing (10% NDS in DPBS) voor elk kanaal. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      6. Verdun de primaire antilichamen in antilichaamoplossing (5% NDS in DPBS) als volgt: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epitheliale tight junction marker), anti-Occludin (1:100, epitheliale tight junction marker), anti-Claudin 4 (1:100, epitheliale tight junction marker), anti-E-cadherine (1:100, epithelial adherens junctions marker (Tabel van Materialen). Perfuseer 200 μL van de primaire antilichaamoplossing door elk kanaal en incubeer 's nachts bij 4 °C. Herhaal de wasstap 9.2.2.1.
      7. Verdun de secundaire antilichamen in antilichaamoplossing (1:300, 5% NDS in DPBS). Perfuseer 200 μL van deze oplossing door elk kanaal en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap 9.2.2.1. Indien gewenst kan falloïdine, een cytoskeletmarker, worden toegevoegd aan de secundaire antilichaamoplossing.
      8. Bereid een 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing in DPBS en gebruik deze om 200 μL door elk kanaal te persen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Herhaal de wasstap. Op dit punt kunnen gekleurde chips maximaal 14 dagen bij 4 °C worden bewaard.
    3. Beoordeling van Caspase 3 splitsing
      1. Isoleer en kwantificeer de totale hoeveelheid eiwit van epitheelcellen zoals beschreven in stap 8.3.2. Laat de wasstap 8.3.2.1 achterwege. Verdun de monsters met DPBS tot een eindconcentratie van 400 μg/ml.
      2. Kwantificeer de niveaus van totaal en gespleten caspase 3 met behulp van caspase 3 detectiekit volgens het protocol van de fabrikant.
    4. Beoordeling van pro-inflammatoire cytokines secretie
      1. Gebruik de effluenten verzameld uit de uitlaat van beide kanalen van de darmchip om uitgescheiden pro-inflammatoire cytokines in de acute fase te kwantificeren, volgens protocollen die door de fabrikant zijn verstrekt. Voer een 5-voudige verdunning uit voor V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit en een tweevoudige verdunning voor V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1D vat de tijdlijn van de darmchipcultuur samen en illustreert de intestinale endotheelcellen en organoïden voor en bij het zaaien op de chip. Bovendien toont het de duidelijke morfologische verschillen tussen de twaalfvingerige darm en de darmchips, benadrukt door de aanwezigheid van de villi-achtige formaties in de twaalfvingerige darmchip en representatief voor de dunne darmarchitectuur.

Figuur 3A,B toont de vouw CYP3A4 inductieresponsen in de twaalfvingerige darmchip van drie verschillende organoïde donoren. De chips werden gedurende 48 uur blootgesteld aan 20 μM RIF of 100 nM VD3 en werden gebruikt om de mRNA-niveaus (A) en/of de vouwkatalytische activiteit (B) van het CYP450-enzym te beoordelen. Verhoogde niveaus van testosteronmetaboliet, 6β-hydroxytestosteron (6β-OH-T), consistent met de verhoogde CYP3A4 mRNA-genexpressie werd waargenomen in de duodeenchip blootgesteld aan RIF en VD3, wat wijst op geschikte inductieresponsen bij alle drie de geteste donoren. De middelen ± SEM van n = 3 biologisch onafhankelijke chips worden getoond.

Figuur 4 toont de representatieve resultaten voor de modellering van het lekkende darmsyndroom in de darmchip, waaronder (A,C) veranderingen in epitheelcelmorfologie en tight junction integriteit, (B) afname van de barrièrefunctie, (D) inductie van apoptose en (E) verhoogde cytokinesecretie als reactie op de IFNγ-behandeling.

Figuur 4A toont representatieve brightfieldbeelden van de controle- en IFNγ-behandelde (50 ng/ml, 48 h) epitheliale monolaag van de colonchip. De chips werden uit de kweekmodule verwijderd en de epitheliale morfologie werd dagelijks onder de microscoop beoordeeld. Beelden werden verkregen met behulp van een brightfield microscoop en een 10x objectief. Darmchips behandeld met IFNγ vertonen een gecompromitteerde celmorfologie en verlies van het zuilvormige epitheel.

Figuur 4B toont een representatief resultaat van de schijnbare permeabiliteitstest uitgevoerd op darmchips gekweekt onder baselineomstandigheden of bij stimulatie met IFNγ. 3 kDa Dextran Cascade Blue tracer werd toegevoegd aan het bovenste kanaalreservoir tot een eindconcentratie van 100 μg/ml. IFNγ bij een eindconcentratie van 50 ng/ml werd op dag 5 van de kweek in het onderste kanaal gedoseerd. Chips werden doordrenkt met 60 ml / h. Vervolgens werden de media dagelijks verzameld (tot dag 72 uur na blootstelling) uit inlaat- en uitlaatreservoirs van zowel het bovenste als het onderste kanaal. 50 μL van elk monster werd verzameld, verwerkt zoals beschreven in stap 9.2.1 van het protocol, en onderzocht op fluorescentie bij 375-420 nm met behulp van een platenlezer. Een significante toename van de epitheliale paracellulaire permeabiliteit werd waargenomen na 48 uur IFNγ-stimulatie.

Figuur 4C toont representatieve immunofluorescente beelden van de epitheliale tight (Zonula Occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) en adherens (E-cadherine) juncties in control en IFNγ-behandelde (50 ng/ml, 48 h) colonchip. De chips werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) en verder verwerkt zoals beschreven in stap 9.2.2 van het protocol. Beelden werden verkregen met behulp van een confocale microscoop en 20x langeafstandsobjectief en verwerkt met Fiji versie 2.0 volgens standaardprotocollen. Behandeling met IFNγ veroorzaakt verplaatsing van ZO-1 en Claudin-4 en internalisatie van Occludin en E-cadherine, zoals blijkt uit het verhoogde cytoplasmatische signaal.

Figuur 4D geeft het tijdsverloop weer van Caspase 3-splitsing in colonchip in reactie op 50 ng/ml IFNγ, wat wijst op activering van apoptose. Epitheelcellen werden op de chips gelyseerd en eiwitmonsters werden gezuiverd volgens standaardmethoden. Het intracellulaire gehalte van het totale en gespleten Caspase 3 werd gemeten zoals beschreven in stap 9.2.3 van het protocol. IFNγ induceert activering van apoptose, zoals eerder beschreven29, in de colonepitheelcellen gekweekt op de chip, na 48 uur stimulatie.

Figuur 4E toont het tijdsverloop van de secretie van het cytokine uit de darmchip bij stimulatie met 50 ng/ml IFNγ. Dagelijks werd 200 μL effluentmedia verzameld uit de uitlaatreservoirs van zowel het bovenste als het onderste kanaal. Effluentmonsters werden bewaard bij -80 °C en 24 uur voordat de analyse 's nachts bij 4 °C werd ontdooid. De cytokineniveaus in de chipcultuurmedia werden beoordeeld met behulp van Meso Scale Discovery-technologie zoals beschreven in stap 9.2.4 van het protocol. IFNγ induceerde een gepolariseerde secretie van pro-inflammatoire moleculen in de darmchip, zoals blijkt uit de basolaterale secretie van Vasculaire Cel Adhesie Eiwit 1 (VCAM-1) en Interleukine 6 (IL-6) en de apicale secretie van Intercellulair Adhesie Molecuul 1 (ICAM-1) en Serum Amyloïde eiwit A (SAA). Serumspiegels van de oplosbare vormen van VCAM-1, ICAM-1, IL-6 en SAA worden in klinische laboratoria gebruikt als indicator voor ontsteking30,31.

Figure 1
Figuur 1: Vaststelling van de darmchip15,16. (A) Schematische weergave van de chipactivering en -coating. Kortom, de chips worden in een chiphouder geplaatst, doordrenkt met ER1-oplossing en geactiveerd onder UV-licht. Vervolgens worden de chips gewassen met ER2 en DPBS. Ten slotte worden de chips gecoat met een ijskoude ECM-oplossing, specifiek voor elk celtype, en 's nachts geïncubeerd bij 37 °C. (B) Schematisch dat het proces van het introduceren van organoïden in de chip weergeeft. Organoïden worden overgebracht van de 24-wells plaat in een conische buis en geïncubeerd op ijs in aanwezigheid van de BMM-dissociatieoplossing om organoïden uit de opgeloste BMM te herstellen. Organoïde suspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd en geëvalueerd op de aanwezigheid van opgeloste BMM-residuen. Als er nog steeds een transparante laag BMM zichtbaar is boven de celpellet, moet het proces worden herhaald. Als een goed gedefinieerde pellet wordt waargenomen zonder zichtbare gelresiduen, worden organoïden enzymatisch gedissocieerd en in het bovenste kanaal (blauw) van de chip gebracht. Het onderste kanaal (magenta) van de chip is bezaaid met weefselspecifieke microvasculaire endotheelcellen. (C) Schematisch met de verbinding van de chips met de kweekmodule, die de mediastroom en cyclische peristaltiekachtige rek ondersteunt. De primingcyclus maakt het mogelijk om de druppels van het celkweekmedium over de chippoorten en aan het einde van de draagbare moduleweerstanden te genereren. Dit zorgt voor het creëren van de vloeistof-vloeistof interface tussen de chip en de draagbare module, waardoor de chip in de module glijdt en hun veilige verbinding. Ten slotte worden de draagbare modules in trays geplaatst en worden trays in de kweekmodule geplaatst. (D) Experimentele tijdlijn met de belangrijkste stappen voor de oprichting van het van biopsie afgeleide darmchipplatform, inclusief twaalfvingerige darm en darmchip. Brightfield-afbeeldingen illustreren de endotheel- en organoïde-afgeleide cellen op dag 0, voor en na het zaaien in de chip, evenals de vorming van confluent- en 3D-epitheelweefsel op dag 8 van de chipkweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Verzameling van effluentmedia uit de darmchip. (A) Schematische weergave van de verzameling media-effluent van de draagbare module. Media worden verzameld uit de uitlaatreservoirs van het bovenste en onderste kanaal en opgeslagen bij -80 °C tot verdere ELISA- of LC-MS / LC-MS / MS-analyse. (B) Schematische weergave van de verzameling effluentmonsters met behulp van een meerkanaals pipet en hun overdracht in een 96-well zwartwandige plaat voor downstream beoordeling van epitheliale schijnbare permeabiliteit (Papp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: CYP3A4-inductie in de twaalfvingerige darmchip15. (A) Inductie van CYP3A4-mRNA-niveaus in duodeenchip door 48 uur blootstelling aan 20 μM RIF en 100 nM VD3. Gemiddelde ± SEM, N = 3 chips/conditie/donor, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001 (vergeleken met DMSO-controles). (B) Inductie van CYP3A4-activiteit in de twaalfvingerige darmchip blootgesteld aan prototypische inductoren zoals beoordeeld door LC-MS/MS kwantificering van probe substraatmetaboliet: 6β-hydroxytestosteron. Een significante toename van de CYP3A4-activiteit werd waargenomen in de twaalfvingerige darmchip behandeld met 20 μM RIF of 100 nM VD3 gedurende 48 uur. Gemiddelde ± SEM, N = 3 chips/conditie/donor, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Verstoring van de epitheliale barrière in de darmchip met behulp van IFNγ16. (A) Brightfield-beelden die de morfologie van de epitheelcellen tonen onder basisomstandigheden en bij stimulatie met 50 ng / ml IFNγ gedurende 48 uur. Schaalbalk: 100 μm. (B) Schijnbare permeabiliteit van de epitheliale barrière tot 3 kDa Dextran in de loop van een 72 h stimulatie met 50 ng/ml IFNγ. Gemiddelde ± 95% BI, N = 5-9 chips/conditie, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001. (C) Immunofluorescentiebeelden die de verstoring van de epitheliale tight en adherens junctions weergeven bij stimulatie met 50 ng/ml IFNγ gedurende 48 h. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (rood) tight junctions, E-cadherine (rood) adherens junctions, Occludin (rode) tight junctions, Claudin-4 (red) tight junctions, 4′,6-diamidino-2-fenyledool (DAPI) (blauwe) kernen. Schaalbalk: 50 μm. (D) Inductie van Caspase 3-splitsing in colonchip door de behandeling met 50 ng / ml IFNγ. Vier verschillende tijdstippen werden beoordeeld over 72 uur blootstelling. Gemiddelde ± 95% BI, N = 3-6 chips/ conditie, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001. (E) Verhoogde secretie van cytokines: Vasculaire celadhesie-eiwit 1 (VCAM-1) en interleukine 6 (IL-6), in het onderste kanaal, en intercellulaire adhesiemolecuul 1 (ICAM-1) en serumamyloïde eiwit A (SAA) in de bovenste kanaal effluentmedia, in de loop van een 72 uur stimulatie van de darmchip met 50 ng / ml IFNγ. Gemiddelde ± 95% BI, N = 3 chips/ conditie, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De combinatie van organ-on-a-chip-technologie en intestinale organoïden is veelbelovend voor nauwkeurige modellering van menselijke darmfysiologie en pathofysiologie. Hier bieden we een eenvoudig en robuust stapsgewijs protocol (beschreven in figuur 1) voor het vaststellen van de darmchip met biopsie-afgeleid klein darm- of colonepitheel en intestinale microvasculaire endotheelcellen die samen worden gekweekt in een microfluïdisch apparaat. Deze chipgebaseerde simulatie van de menselijke darm omvat fysiologische, luminale en vasculaire stroming en peristaltiekachtige bewegingen. Daarnaast beschrijven we procedures voor de beoordeling van kritieke darmfuncties, zoals medicijnmetabolisme in de twaalfvingerige darmchip en barrièrefunctie in de darmchip.

Om epitheliaal-endotheel cellulaire interacties samen te vatten, die essentieel zijn voor het behoud van darmhomeostase en daarom de nauwkeurige modellering van darmweefsel op chip, is het van cruciaal belang om functionele en intacte celmonolagen aan beide zijden van het PDMS-membraan vast te stellen. De eerste stap naar succesvol chipzaaien is chemische activering van het PDMS-oppervlak dat de ontwikkeling van een stabiele koppeling tussen het PDMS-oppervlak en ECM-eiwitten mogelijk maakt. Onjuiste activering kan de aanhechting van cellen belemmeren en resulteren in de vorming van onvolledige cellulaire monolagen. De activeringsoplossing moet vers worden bereid omdat deze lichtgevoelig en gevoelig voor degradatie is. Tijdens UV-activering en daaropvolgende ECM-coating is het belangrijk om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van reagentia binnen elk kanaal. De specifieke samenstelling en concentratie van oplossingen die worden gebruikt om de bovenste en onderste kanalen te coaten, zijn geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van respectievelijk de epitheel- en endotheelcellen. Als veranderingen in de cellulaire samenstelling van de darmchip nodig zijn, moeten de ECU-omstandigheden mogelijk opnieuw worden geoptimaliseerd om optimale resultaten te bereiken.

Na ECM-coating is het belangrijk om HIMEC's te zaaien met een hoge celzaaidichtheid (8 x 106 cellen / ml) om een complete en homogene monolaag aan de onderkant van het PDMS-membraan te verkrijgen. Als volledige celconfluentie niet wordt bereikt, confluentie, wordt geadviseerd om de dichtheid van de endotheelcelsuspensie tijdens het zaaien verder te verhogen of om het zaaien van organoïde fragmenten in het bovenste kanaal van de chip uit te stellen totdat HIMEC's volledig confluent worden. Het gebruik van gefragmenteerde organoïden, in plaats van suspensie van afzonderlijke cellen verkregen door enzymatische vertering van organoïden, bleek eerder het succes en de reproduceerbaarheid van de intestinale monolaagvorming in de darmchip te verbeteren14. Daarom wordt sterk aanbevolen om het organoïde verteringsproces nauwlettend te volgen om de optimale incubatietijd met het enzym te garanderen, wat resulteert in organoïde fragmenten bestaande uit ongeveer 10-30 cellen (40-100 μm groot). Onvoldoende dissociatie kan leiden tot reformatie van de cystische organoïde structuur in de microfluïdische chips in plaats van de gewenste monolaag. Bovendien is het van cruciaal belang om overmatige organoïde dissociatie in afzonderlijke cellen te voorkomen die kan leiden tot verminderde celoverleving, herstel en het niet vormen van confluente monolaag in de chip.

Het is aangetoond dat de opname van vloeistofstroom (schuifspanning) en cyclische spanning in de darmchipcultuur, ondersteund met behulp van de kweekmodule, de vorming van de functionele darmbarrière verbetert en de spontane ontwikkeling van de 3D-architectuur van het epitheelweefsel bevordert13. Bij het uitvoeren van microfluïdische experimenten met het gebruik van Organs-on-Chips, is het echter van cruciaal belang om de celkweekmedia voor te verwarmen en te ontgassen voor gebruik om de vorming van microbubbels in de kanalen te voorkomen, wat kan leiden tot cellulaire stress of zelfs onthechting van het membraan.

Naast de specifieke toepassingen die hier worden getoond, kan het darmchipmodel worden gebruikt om een verscheidenheid aan wetenschappelijke vragen aan te pakken, van basiswetenschap tot het ontdekken en testen van nieuwe geneesmiddelen of technologieën voor medicijnafgifte. Het kan studies van de menselijke darmontwikkeling, stamcelrijping en epitheelcelfunctie vergemakkelijken; met name in het kader van het evalueren van de rol van mechanica in de groei en homeostase van het darmweefsel. Recente ontdekkingen onthulden dat dynamisch evenwicht van het gezonde darmepitheel afhankelijk is van zijn vermogen om verschillende krachten nauwkeurig te coördineren die de crypt-villi-architectuur definiëren, celtypen compartimenteren, celmigratie directe celmigratie en celidentiteit, proliferatie en dood in ruimte en tijd reguleren32. De darmchip biedt een kans om het samenspel tussen mechanische krachten (bijv. Spanning of schuifspanning), cellot en functie beter op te helderen om enkele van de vele fascinerende vragen te beantwoorden die nog steeds in het opkomende gebied van darmmechanobiologie zijn. Bovendien kan het studies van detectie- en darmtransportprocessen mogelijk maken, dankzij de aanwezigheid van hormoonafscheidende entero-endocriene cellen en correcte lokalisatie van verschillende voedingstransporters15,16. Het darmchipmodel kan ook worden aangepast om immuuncellen en commensale of pathogene micro-organismen op te nemen voor studies naar darmontstekingsstoornissen, gastheer-pathogeen en gastheer-microbioominteracties, evenals om nauwkeurig off-target toxiciteiten van immuno-oncologische producten te voorspellen, zoals eerder aangetoond 17,20,33,34,35.

Bovendien kan het gebruik van klinische biopsiemonsters van personen met specifieke genotypische en fenotypische kenmerken analyse van patiëntspecifieke ziektemechanismen en respons op therapieën mogelijk maken, waardoor gepersonaliseerde geneeskunde in de toekomst wordt bevorderd.

De belangrijkste beperking van deze methode is dat fragmenten van een groot aantal organoïden (~60-80) nodig zijn om op elke chip een confluent darmepitheel te vormen. Dit komt omdat organoïde fragmenten zaaien met hoge dichtheid vereisen om ervoor te zorgen dat er voldoende intestinale stamcellen aanwezig zijn om de proliferatieve expansie van de monolaag en de oprichting van een 3D-weefselarchitectuur te ondersteunen. Een volledig gedifferentieerd darmepitheel op een chip bezit alle belangrijke intestinale epitheelceltypen (absorberende enterocyten, Paneth-cellen, bokaalcellen en entero-endocriene cellen) en transcriptioneel profiel dat sterk lijkt op de in vivo tegenhanger. Het huidige model mist echter nog steeds andere belangrijke componenten van de levende darm, waaronder intestinale fibroblasten, residente immuuncellen (bijv. Macrofagen, intra-epitheliale lymfocyten en dendritische cellen) en het enterische zenuwstelsel.

Hoewel dit potentiële nadelen zijn, hebben eerdere studies aangetoond dat de kracht van de Organ-on-a-Chip-technologiebenadering ligt in het vermogen om de structurele en functionele complexiteit van menselijke organen na te bootsen door geleidelijk verschillende componenten van in vivo weefsels en hun micro-omgeving één voor één te integreren36,37. Deze synthetische biologische benadering van in vitro tissue engineering biedt een manier om de bijdrage van individuele cellulaire en moleculaire componenten aan fysiologische en pathofysiologische reacties op orgaanniveau op verschillende niveaus van systeemcomplexiteit te bestuderen. Bovendien maakt het het mogelijk om de biochemische, genetische en microscopische analyse van de interagerende weefsels individueel en in realtime uit te voeren, waardoor inzicht wordt verkregen in hoe intercellulaire signalen en weefsel-weefselinteracties bijdragen aan specifiek gedrag op orgaanniveau. Een ander opmerkelijk kenmerk van darmchiptechnologie is veelzijdigheid. Nauwkeurige controle over micro-omgevingselementen maakt fijnafstemming van mediastroomsnelheden en spanningsparameters mogelijk om natuurlijke krachten te reproduceren die cellen in het menselijk lichaam ervaren, zoals de schuifspanning die wordt waargenomen door de endotheelcellen die worden blootgesteld aan bloedstroom en de cyclische peristaltische bewegingen van het darmweefsel. Bovendien maakt synergetische engineering van organoïden en organen-op-chips het mogelijk om gevasculariseerde organen-op-chips te creëren die verschillende regio's van darmweefsels vertegenwoordigen die vloeibaar met elkaar kunnen worden verbonden om fysiologische interacties tussen de dunne en dikke darm te bestuderen. We geloven dus dat de darmchip een superieur model van het darmepitheel vertegenwoordigt en kan helpen om het 3Rs-principe (Reductie, Verfijning en Vervanging) te implementeren in de basiswetenschap en in de preklinische en regelgevende opzet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi en Magdalena Kasendra zijn huidige of voormalige werknemers van Emulate Inc. en kunnen aandelen bezitten. Emulate Inc. is het bedrijf dat de orgaanchipapparaten produceert en patenten heeft gepubliceerd die relevant zijn voor het werk dat in dit artikel wordt vermeld.

Acknowledgments

We bedanken professor Mark Donowitz voor het leveren van de van darmbiopsie afgeleide organoïden en Brett Clair voor het ontwerpen van de wetenschappelijke illustraties van de chip-, draagbare en kweekmodule. Alle andere wetenschappelijke illustraties zijn gegenereerd met behulp van de BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Tags

Bio-engineering Nummer 183
Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter