Summary
생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.
Abstract
장 점막은 무수한 중요한 기능을 수행하는 복잡한 물리적, 생화학적 장벽입니다. 그것은 영양소와 이종 바이오틱스의 운반, 흡수 및 신진 대사를 가능하게하면서 미생물과의 공생 관계를 촉진하고 미생물의 침입을 제한합니다. 다양한 세포 유형과 물리적 및 생화학적 환경 간의 기능적 상호 작용은 장 조직 항상성을 확립하고 유지하는 데 필수적입니다. 이러한 복잡한 상호 작용과 통합 된 장 생리학을 시험관 내에서 모델링하는 것은 새로운 치료 표적 및 약물 후보가 발견되고 개발되는 방식을 변화시킬 수있는 잠재력을 가진 강력한 목표입니다.
Organoids 및 Organ-on-a-Chip 기술은 최근 시험 관 내에서 장 생리학 및 병리 생리학의 기능적 측면을 연구하는 데 적합한 인간 관련 장 칩을 생성하기 위해 결합되었습니다. 소장 (십이지장) 및 대장의 생검에서 유래 된 오가노이드는 장기 칩의 상부 구획에 시딩 된 다음 각 장 영역의 뚜렷한 세포, 분자 및 기능적 특징을 보존하면서 단층으로 성공적으로 확장됩니다. 인간 장 조직-특이적 미세혈관 내피 세포는 상피-내피 계면을 재생성하기 위해 기관 칩의 하부 구획에 혼입된다. 이 새로운 플랫폼은 영양소, 약물 및 미생물에 대한 발광 노출을 용이하게하여 장 수송, 투과성 및 숙주 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 가능하게합니다.
여기서, 인간 십이지장 (십이지장 칩) 및 결장 (결장 칩)을 나타내는 장 칩의 확립을 위한 상세한 프로토콜이 제공되고, 이들의 후속 배양은 연속 유동 및 연동 유사 변형 하에서 제공된다. 우리는 원형 유도제 및 기질을 사용하여 십이지장 칩에서 약물 대사 및 CYP3A4 유도를 평가하는 방법을 시연합니다. 마지막으로, 우리는 결장 칩에서 인터페론 감마(IFNγ) 매개 장벽 파괴(leaky gut syndrome)의 시험관 내 모델링을 위한 단계별 절차를 제공하며, 칩 내 세포의 부세포 투과성의 변화, 사이토카인 분비의 변화, 및 전사체 프로파일링을 평가하는 방법을 포함한다.
Introduction
인간의 창자는 자기 재생이 가능한 복잡하고 멀티 태스킹 기관입니다. 그것은 소장과 대장으로 나뉩니다. 소장의 주요 기능은 위장에서 나오는 음식을 더 소화하고 모든 영양소를 흡수하며 잔류 물을 대장으로 전달하여 물과 전해질을 회수하는 것입니다. 소장은 해부학적으로 구별되는 여러 영역으로 더 나뉘어집니다 : 십이지장, 제주눔 및 장폐색은 각각 특정 기능을 수행하도록 조정됩니다. 예를 들어, 십이지장은 제주눔에서 단백질, 탄수화물, 비타민 및 미네랄을 포함하는 영양소의 적절한 흡수를 가능하게하기 위해 chyme (위 내용물)을 분해하는 데 도움이됩니다. 소장의 이러한 근위 부분은 또한 장내 약물 흡수 및 대사의 주요 부위이며, 장폐색 및 결장1에서의 발현에 비해 약물 대사 효소 (예를 들어, CYP3A4)의 발현이 더 높은 것을 특징으로합니다. 영양소의 소화 및 흡수에 대한 주요 역할 외에도 창자는 병원성 미생물, 미생물 대사 산물,식이 항원 및 독소 2,3과 같은 잠재적으로 유해한 발광 내용물에 대한 효과적인 장벽이기도합니다. 인간의 결장에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있으며, 인체의 총 세포보다 훨씬 많으며 영양, 신진 대사 및 면역에 많은 이점을 제공한다는 점은 주목할 만합니다. 따라서, 장 상피 세포에 의해 형성된 점막 장벽의 완전성의 유지는 불필요한 면역 세포 활성화를 피하기 위해 이들을 물리적으로 분리함으로써 장내 미생물과 숙주 세포 사이의 공생 관계를 허용하는 데 매우 중요하다2. 또한, 프로그램된 장 세포 사멸은 감염된 세포가 지속되거나 증식하는 것을 방지하여 잠재적 병원체3를 전파하는 것을 방지하는 자기 보호 메커니즘으로서 필수적인 역할을 하며, 사흘에서 칠일마다 장 상피의 지속적인 자기 재생은 장벽 완전성과 조직 항상성을 보장하는 세포 손실을 보상합니다. 영양 흡수, 장벽 완전성 또는 장 세포 사멸 및 자기 재생의 불균형을 포함하여 설명 된 장 기능의 손상은 영양 실조 및 염증성 장 질환 (IBD)2,3을 포함한 다양한 위장 장애의 발달을 초래할 수 있습니다.
이전에, 동물 모델 및 형질전환된 암 유래 장 세포주는 인간 장 조직의 생리학적 및 병리생리학적 기능을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 두 종 사이에 상당한 불균형의 존재로 인한 인간에 대한 동물 연구의 번역성에 대한 점점 더 두드러진 우려는 인간 관련 대안 방법4에 대한 필요성을 강조했다. 일반적으로 사용되는 시험관내 장 세포주는 T84, Caco-2 및 HT29 세포를 포함한다. 그들은 장 장벽 기능과 막 수송의 특정 측면을 모방하지만, 약물 대사 효소5, 표면 수용체 및 수송체4의 변경된 발현을 특징으로합니다. 또한, 그들은 장 세그먼트 특이성이 부족하고 장 상피의 복잡성을 회복하지 못하며, 각 모델은 장내에 존재하는 다섯 가지 상피 세포 유형 중 하나만 포함합니다6.
최근에, 소장 및 결장7,8 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)9의 신선한 생검으로부터 확립된 인간 장 오가노이드 배양물이 미래에 동물 실험을 보완, 감소 및 대체할 수 있는 잠재력을 갖는 대안적인 실험 모델로서 도입되었다. iPSC는 비침습적 방식으로 얻을 수 있지만, iPSC로부터 오가노이드를 확립하려면 복잡하고 긴 프로토콜(몇 가지 실험 단계 포함)을 사용해야 하며 인간 태아 조직과 유사한 배양물을 생성합니다. 대조적으로, 생검 유래 오가노이드는 장 조직의 고유 한 재생 능력을 활용할 수 있고 시험관 내에서 무기한 계대 및 전파 될 수 있기 때문에 확장성이 뛰어납니다. 중요하게도, 생검 유래 오가노이드는 이들이 개발된 일차 조직의 질환 및 장 부위 특이적 특성을 유지하고 장 상피의 세포 다양성을 에뮬레이트한다. 오가노이드는 다양한 위장 장애의 생물학 및 병인을 풀고 치료 관리를 개선하기 위해 시험관 내에서 환자 특이적 아바타로 사용할 수 있습니다. 장내 오가노이드는 인상적인 수준의 생리적 기능을 달성했지만, 혈관, 결합 조직, 말초 신경 및 면역 세포를 포함한 중요한 기질 구성 요소와 기계적 자극이 없기 때문에 네이티브 기관의 복잡성을 재현하지 못합니다. 유동, 전단 응력, 스트레치 및 압력과 같은 기계적 파라미터 는 생체내에서 조직 형태형성 및 항상성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이전에 시험관내10,11,12,13에서 세포의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다. 오가노이드 시스템의 또 다른 중요한 단점은 내강이 접근 할 수 없기 때문에 상피의 정점 측에 접근 할 수 없다는 것입니다. 이는 이온 및 약물 수송체의 편광된 발현, 숙주-마이크로바이옴 상호작용, 및 제약 독성 시험과 관련된 다양한 메카니즘을 조사하기 위한 도전을 제시한다. 마지막으로, 오가노이드 배양물은 시험관내 자기 조직 과정 및 세포 운명 선택의 확률적 특성으로 인해 크기, 형태학 및 기능면에서 상당한 변동성을 겪습니다. 따라서 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학에서 장 오가노이드의 잠재력을 최대한 실현하려면 오가노이드 개발의 변동성을 줄이고 발광 구획에 대한 접근성을 향상 시키며 누락 된 세포 - 세포 상호 작용을 통합하는 새로운 전략을 모색 할 필요가 있습니다.
Organ-on-a-Chip 기술은 시험관 내에서 장내 세포 배양물에 기계적 힘과 유체 흐름을 통합하기위한 많은 기술을 도입했습니다. 그러나, 초기 개념 증명 연구의 대부분은 충분한 세포 다양성을 나타내지 않은 암 유래 세포주를 사용했기 때문에, 이들 시스템의 관련성에 의문이 제기되어 왔다. 최근에, 우리는 장내 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 시너지 효과로 결합하여 각 접근법의 최상의 특징을 하나의 시험관 내 시스템14,15,16에 통합했습니다. 그 결과 장-칩은 장 상피의 다세포 구조, 상피-내피 조직 계면의 존재, 유체 흐름과 스트레칭의 기계적 힘을 되새겨 시험관 내에서 장기 수준 기능의 에뮬레이션을 가능하게 합니다. 추가적으로, 출발 물질로서 원발-조직 유래 오가노이드(인간 장의 상이한 영역으로부터 샘플링될 수 있음)의 사용은 인간 십이지장, 제주눔, 장폐색 및 결장을 나타내는 칩이 유사한 시딩 및 배양 절차에 따라 확립될 수 있기 때문에, 이 모델의 다재다능성을 증가시킨다. 중요하게도, 장-칩은 다음과 같은 실시간 평가를 가능하게 한다: 장 장벽 완전성; 브러쉬 경계 및 약물-대사 효소의 활성; 뮤신의 생산; 사이토카인의 분비; 이전에 발표 된 보고서에서 입증 된 바와 같이 장내 세포와 병원성 및 공생 미생물의 상호 작용. 특히, 다른 개인의 조직에서 생성 된 오가노이드를 사용하여 장 칩을 확립했을 때,이 모델은 다양한 약물 및 치료에 대한 기능적 반응에서 예상되는 기증자 간 변동성을 포착했습니다. 전체적으로 오가노이드를 Organ-on-a-Chip 기술과 병합하면 시험관 내 발견의 생리적 관련성과 정확성뿐만 아니라 인간에 대한 외삽을 향상시킬 수있는보다 진보되고 개인화 된 생체 관련 모델의 문이 열립니다. 여기에서, 장 칩을 확립하고 두 장의 세그먼트의 생리 기능 연구에 적용하기위한 상세한 프로토콜이 제시됩니다 : 십이지장과 결장. 먼저, 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 CYP3A4의 활성을 평가하는 방법뿐만 아니라 리팜피신 및 비타민 D3와 같은 원형 화합물에 의한 그의 유도가 기재되어 있다. 둘째, 결장 칩에서 "새는 장"을 모델링하는 데 필요한 단계는 프로토콜에 요약되어 있으며, 상피 장벽의 붕괴는 IBD의 발병기전에 연루된 특징적인 사이토카인을 사용하여 수행됩니다. 간략하게, 인간 생검으로부터 유래된 오가노이드는 시험관내에서 전파되고, 효소적 소화를 겪고, 칩의 상부 채널에 도입된다. 성장 인자가 풍부한 배지와의 지속적인 관류가 존재할 때 그들은 3D 아키텍처와 쉽게 접근 할 수있는 정점 세포 표면을 갖춘 합류 상피 단층으로 발전합니다. 바닥, "혈관" 칩 구획은 소장 또는 대장으로부터 분리된 미세혈관 내피 세포로 시딩된다. 상피와 내피는 다공성 연신 가능한 막으로 분리되어 두 조직 간의 파라크린 상호 작용을 용이하게하고 순환 변형을 겪을 때 인간의 내장의 연동 운동과 같은 움직임을 모방합니다. 공동-배양은 적절한 세포 배양 배지를 사용한 발광 및 혈관 관류에 의해 생성된 동적 유동 조건 하에서 유지된다. 마지막으로, 우리는 온칩 또는 샘플링 된 세포 배양 유출물에서 직접 수행 할 수있는 수많은 유형의 분석 및 종점 분석을 설명합니다.
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Protocol
참고: 모든 세포 배양은 적절한 무균 기술을 사용하여 처리되어야 합니다.
이 연구에 사용 된 인간 장 오가노이드는 존스 홉킨스 대학에서 얻었으며 모든 방법은 승인 된 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 기관 검토위원회 (IRB #NA 00038329)의 승인을 받았다.
1. 세포배양시약의 제조
- 제조업체의 지시 사항 (재료 표)에 따라 인간 오가노이드 성장 배지를 준비하고 100 μg / mL의 프리모신으로 보충하십시오.
- 제조업체의 지시 사항 (재료 표)에 따라 인간 미세 혈관 내피 세포 성장 배지를 준비하고 프리모신 100 μg / ml 대신 1:20 vol / vol FBS 및 50 μg / ml로 보충하십시오.
- Y-27632(Rho-kinase Inhibitor)를 멸균된 0.1% BSA에 DPBS에 재현탁시켜 10 mM 원액을 제조하였다. 분취량을 멸균 마이크로튜브에 넣고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
- CHIR99021 (GSK-3 억제제)을 멸균 디메틸설폭사이드(DMSO)에 재현탁시켜 5 mM 원액을 제조하였다. 분취량을 멸균 마이크로튜브에 넣고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
- 1:1 vol/vol 오가노이드 해리 용액(재료 표)을 DPBS 용액(재료 표)과 혼합하고 Y-27632의 10μM 원액으로 보충하여 인간 오가노이드 소화 용액을 준비합니다. 이 시약은 각 용도에 대해 신선하게 만들어야합니다.
2. 인간 장내 미세혈관 내피세포(HIMECs)의 배양
- HIMEC 배양물을 칩 상에 시딩하기 7일 전에 개시한다(표 물질). 통로 1-6의 HIMEC만 칩 시딩에 사용할 수 있습니다.
- 5 mL의 부착인자 용액(표 재료)을 T150 플라스크에 첨가하는 단계; 37°C에서 1분 동안 인큐베이션하고 용액을 버린다.
- 실온에서 미리 가온된 내피 세포 성장 배지 19 mL를 플라스크에 첨가한다(단계 1.2 참조).
- 냉동 바이알인 HIMEC 바이알(2백만 셀/바이알)을 37°C 수조에서 해동합니다.
- 바이알의 내용물을 플라스크로 옮기고 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 밤새 놓아 내피 세포가 부착되도록 한다.
- 배지를 20 mL의 내피 세포 성장 배지로 교체하고 그 다음 날과 그 후 3일마다 실온에서 미리 가온한다. 배양물은 칩 실험을 위해 세포 수확 당일에 컨플루언시의 90 %에 도달해야합니다.
3. 칩의 미세 제조 및 준비
- 상업 공급 업체로부터 칩을 얻으십시오 (재료 표). 칩의 포장을 풀고 사각형의 페트리 접시에 놓인 칩 크래들에 놓습니다 (재료 표). 각 칩 캐리어의 앞면에 실험 조건을 표시하십시오(그림 1A).
참고: 제시된 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 특정 칩 및 계측기의 사용에 의존하지만, 다른 공급 업체를 통해 제공되는 여러 미세 유체 장치가 있으며, 이는 대체 이점을 제공 할 수 있지만 스트레치를 통합 할 수있는 기능이 부족합니다. 또한, Organs-on-Chips의 미세 제작은 Huh et al.21에 설명 된 절차에 따라 "사내"수행 할 수 있습니다.
4. 멤브레인의 활성화 및 ECM 코팅
- 활성화 용액의 제조
- ER-1 및 ER-2 시약 (재료 표)을 실온으로 가져와 사용 전에 평형을 유지하십시오. ER-1은 빛에 민감하므로 어둠 속에서 다루어야합니다.
- ER-2 시약 10 mL에 ER-1을 재구성하여 최종 농도가 0.5 mg/mL가 되도록 하고 ER-1이 완전히 용해되었는지 확인합니다.
- 표면 활성화
- ER-1 용액 50μL를 칩의 두 채널을 통해 부드럽게 밀어 넣습니다(그림 1A).
- 흡인기기를 사용하여 칩 표면에서 과도한 ER-1 용액을 제거하십시오.
- 칩을 검사하여 모든 칩이 ER-1 솔루션을 받았는지 확인합니다. 기포의 경우 기포가 완전히 제거 될 때까지 ER-1 용액을 더 도입하십시오.
- 칩을 UV 램프 챔버 (재료 테이블) 내부에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오. UV 램프가 일관성 설정으로 설정되어 있는지 확인합니다.
- ER-1 활성화 칩을 생물안전 캐비닛(BSC)으로 다시 가져옵니다. 두 채널 모두에서 ER-1 솔루션을 흡인합니다. ER-1 용액의 임의의 잔류물을 200 μL의 ER-2로 세척한다.
- 멸균된 둘베코 인산염 완충 식염수(DBPS) 200 μL를 채널(표 자료)을 통해 밀어 넣고 다음 단계까지 DBPS를 채널에 둡니다.
- 세포외 매트릭스 (ECM) 및 막 코팅의 제조
- ECM 성분의 스톡 솔루션 제조
- 멸균 세포 배양 등급 물 (물질 표)을 사용하여 콜라겐 IV (물질 표) 및 피브로넥틴 (물질 표)을 최종 농도 1mg / mL로 재구성하십시오. 분취량을 준비하고 사용할 때까지 -20 ° C에 보관하십시오.
- 멤브레인 코팅을 위한 ECM 작동 용액의 제조
- 코팅할 칩 12개마다 상단 및 하단 채널에 대해 각 ECM 용액 1.5mL를 준비합니다. ECM 용액은 항상 사용 직전에 준비해야합니다.
- 상단 채널의 경우, 콜라겐 IV와 가용화된 기저막 매트릭스(BMM)(물질 표)를 각각 200μg/mL 및 100μg/mL의 멸균 냉장 DBPS에 혼합합니다. 하단 채널의 경우, 콜라겐 IV와 피브로넥틴을 각각 200 μg/mL 및 30 μg/mL의 멸균 냉장 DPBS에 혼합하십시오.
- 칩의 ECM 코팅
- 칩의 두 채널에서 DBPS를 흡인하고 각 채널에 적합한 ECM 작동 솔루션으로 교체합니다(그림 1A).
- 각 칩을 검사하여 코팅 용액을 받았는지 확인합니다. 기포의 경우 모든 기포가 완전히 제거 될 때까지 더 많은 코팅 용액을 밀어 넣으십시오.
- 멸균된 DPBS를 칩 크래들에 첨가하고, 칩이 들어있는 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 놓는다. ECM 단백질이 활성화된 PDMS 막과 이온 결합을 형성할 수 있도록 밤새 인큐베이션한다. 원하는 경우, 세포는 칩의 코팅 후 2 h에서 1 일 사이에 언제든지 시딩될 수 있다. 대안적으로, 코팅된 칩은 하룻밤 동안 4°C에서 저장될 수 있고, 이어서 37°C에서 밤새 인큐베이션되고 칩 시딩될 수 있다.
- ECM 성분의 스톡 솔루션 제조
5. 칩의 하단 채널에서 장내 미세혈관 내피세포(HIMECs)의 시딩
참고: 작은 장 및 결장 HIMECs는 십이지장 및 결장 칩의 바닥 채널에 각각 시딩됩니다.
- 칩 준비
- ECM 코팅 칩을 BSC로 전송합니다. 칩의 두 채널 모두로부터 ECM 코팅을 부드럽게 흡인한 다음, 두 채널을 각각 200 μL의 오가노이드 성장 배지 및 내피 세포 성장 배지로 세척한다.
- 세척된 칩을 내피 세포 시딩을 진행할 때까지 37°C 인큐베이터에 보관하십시오.
- 내피 세포 수확
- HIMEC 배양 플라스크를 BSC로 가져오고 멸균된 DPBS를 사용하여 세척한다.
- 해리 용액 3 mL를 플라스크에 넣고 37°C 인큐베이터에 2분 동안 두어 완전한 세포 분리를 가능하게 한다.
- 세포를 15 mL 원뿔형 튜브에 모으고 10 mL에 도달 할 때까지 내피 세포 성장 배지를 첨가하십시오. 세포 계수를 위한 샘플 15-20 μL의 세포 현탁액. 150 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 조심스럽게 흡인하고 HIMECs를 내피 세포 성장 배지에서 8-10 x 106 cells/mL의 밀도로 재현탁하십시오.
- 내피 세포를 칩의 바닥 채널로 시드
- 칩이 들어있는 페트리 접시를 BSC로 가져오고 1,000μL 피펫을 사용하여 바닥 채널에서 모든 미디어를 부드럽게 제거합니다.
- 10-15 μL의 HIMEC 현탁액을 칩의 하단 채널에 도입한다. 시딩 직후에 칩을 검사하여 최적의 시딩 밀도(커버리지의 80%-90%)와 채널 내에서 균질한 셀 분포를 확인합니다(그림 1D). 시딩 밀도가 예상보다 높거나 낮거나 고르지 않은 경우, 채널 2x를 200 μL의 내피 세포 성장 배지로 세척하고 시딩 절차를 반복한다.
- 여섯 개의 칩의 각 배치를 시딩한 직후에 페트리 디쉬를 반전시켜 PDMS 멤브레인의 하단에 내피 세포 부착을 허용한다. 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 30분~1시간 동안 또는 하단 채널의 HIMEC가 멤브레인에 부착될 때까지 놓습니다(그림 1D).
- 칩 세척
- 200 μL의 내피 세포 성장 배지를 바닥 채널 입구를 통해 부드럽게 밀어 넣어 부착되지 않은 세포를 제거하고 배지의 영양소를 보충하십시오.
- 상부 채널에 부착되지 않은 세포를 5 μM CHIR99021 및 10 μM Y-27632로 보충된 200 μL의 오가노이드 성장 배지로 세척한다.
- 상피 세포 시딩이 진행될 때까지 칩을 37°C 인큐베이터에 놓는다.
6. 칩의 상단 채널에서 오가노이드 단편의 시딩
주: 다양한 장 영역의 생검으로부터 분리된 오가노이드는 장 칩(7)에서 배양될 수 있다. 인간 장 토굴의 격리 및 오가노이드 문화의 확립을 위해 Fujii et al.에 기술된 절차를 따르십시오22. 여기서, 십이지장 및 결장 오가노이드는 십이지장 및 결장 칩을 각각 생성하는데 사용된다. 오가노이드 형성 및 성장에서 높은 배치 대 배치 및 공여체 대 공여자 변동성을 감안할 때, 8백만 세포/mL의 최적 시딩 밀도를 달성하기 위해 오가노이드 현탁 배양물(24-웰 플레이트 형식)에서 세포 밀도에 대한 파일럿 평가를 수행하는 것이 좋습니다.
- 정적 오가노이드 배양의 세포 수/웰의 파일럿 평가.
참고: 다음 절차는 칩 시딩에 필요한 오가노이드 현탁 배양의 웰 수를 결정하기 위한 것입니다. 생성 된 단일 세포는 칩 시딩에 사용되어서는 안됩니다.- 오가노이드 배양 플레이트의 세 웰에서 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 500 μL의 빙냉 BMM 해리 용액 (표 재료)을 각 웰에 첨가하고 플라스틱 스크레이퍼를 사용하여 가용화 된 BMM을 플라스틱에서 분리하십시오.
- 오가노이드 현탁액을 빙냉 1,000 μL 피펫을 사용하여 멸균된 저단백질 결합 원뿔형 튜브에 수집한다. 60 분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 튜브를 부드럽게 흔들어 15 분마다 혼합하십시오. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 상층액을 흡인하고 트립신 2 mL를 첨가하십시오. 37°C에서 30분 동안 배양하여 오가노이드를 단일 세포 수준으로 소화시키고 10mL의 완전한 오가노이드 성장 배지를 첨가하여 효소 반응을 중지시킨다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿을 완전한 오가노이드 성장 배지 1 mL에 재현탁시키고, 표준 방법에 따라 혈소세포계를 사용하여 총 세포 수를 계수한다.
- 오가노이드 단편의 제조 및 칩에서의 시딩
참고: 다음 절차는 칩의 상단 채널에 십이지장 또는 결장 오가노이드를 시드하는 데 사용할 수 있습니다. 생체내 관련 3D 세포구조를 갖는 상피 단일층의 확립은 흐름15,23의 존재 및 오가노이드 단편의 성공적인 시딩에 달려 있다.- 정적 오가노이드 배양물의 웰 수로부터 배지를 조심스럽게 흡인하며, 이는 단계 6.1에서 결정된 바와 같이, 8백만 세포/mL의 최종 시딩 밀도를 달성하기에 충분하다. 500μL의 얼음처럼 차가운 BMM 해리 용액을 각 웰에 첨가한다.
- 가용화된 BMM을 플라스틱 스크레이퍼 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 웰의 표면으로부터 분리한다. 현탁액을 15 mL 저단백질 결합 원뿔형 튜브에 수집한다.
- 현탁액을 얼음 위에 60분 동안 보관하고, 튜브를 부드럽게 흔들어 15분마다 혼합한다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리를 진행한다. 잘 정의 된 오가노이드 펠릿은 원심분리 후에 볼 수 있어야합니다. 투명한 겔층이 세포 펠릿 (가용화된 BMM의 잔기) 위에서 관찰되면(도 1B), 다음 단계를 진행한다.
- 상청액과 세포 펠릿을 혼합하고 튜브에 동일한 부피의 BMM 해리 용액을 첨가한다. 얼음 위에 부드럽게 혼합하고 추가로 10분 동안 보관하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리를 진행한다.
- 필요한 경우, 가용화된 BMM 잔기가 존재하지 않을 때까지 단계 6.2.3.1을 반복한다.
- 상청액을 버리고 오가노이드 펠렛을 오가노이드 소화 용액으로 재현탁시킨다(단계 1.5 참조). 펠렛의 완전한 침수를 보장하기 위해 충분한 양의 오가노이드 소화 용액을 사용하십시오. 2mL의 용액은 대략 2,400-12,000개의 중간 크기의 오가노이드에 적합하다(그림 1D, 포스트 시딩). 37°C에서 1-3분 동안 배양한다.
- 튜브에 고급 DMEM/F-12를 추가하여 효소 반응을 중지시킵니다. 사용 된 소화 용액의 네 배를 사용하십시오. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고 5 μM CHIR99021 및 10 μM Y-27632로 보충된 완전한 오가노이드 성장 배지에서 오가노이드 단편 펠릿을 재현탁하여 8백만 세포/mL를 달성한다. 360 μL 분취량의 현탁액을 멸균된 1.5 mL 저단백질 결합 튜브에 준비하여 벽에 부착으로 인한 세포 밀도의 감소를 방지한다.
- 코팅된 칩의 상부 채널로부터 매질을 제거한다. 30 μL의 세포 현탁액을 각 칩의 상부 채널에 첨가한다. 칩을 37°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 오가노이드 단편이 ECM 코팅된 멤브레인에 부착되도록 합니다(그림 1D).
7. 장 칩의 동적 문화 - 흐름과 연동 운동과 같은 운동의 개시 및 유지
- 매체 준비 및 탈기
- 칩을 통한 일정한 층류를 유지하기 위해 매체 온도가 실온으로 평형을 이루도록 한 다음 진공 펌프 및 PVDF 필터 원뿔형 튜브 (매체 탈기)를 사용하여 10 분 동안 진공 구동 여과를 실시하십시오.
- 휴대용 모듈의 프라이밍
참고: 휴대용 모듈은 칩과 배양 모듈 사이의 인터페이스 역할을 하는 저장소로, 배지의 샘플링 및 투약을 반복할 수 있습니다.- BSC에서 휴대용 모듈을 열고 휴대용 모듈의 정렬을 위한 특수 컨테이너인 배양 모듈 트레이에 놓습니다.
- 5 μM CHIR99021 및 10 μM Y-27632로 보충된 사전 평형화된 완전 오가노이드 성장 배지 3 mL를 상부 입구 저장소에 첨가하고, 3 mL의 사전 평형화된 내피 세포 성장 배지를 하단 입구 저장소에 첨가한다(도 1C). 300 μL의 동일한 배지를 각각의 출구 저장소에 첨가한다.
- 트레이를 37°C 인큐베이터로 가져와 배양 모듈에 밀어 넣습니다(그림 1C). 배양 모듈 화면의 컨트롤을 사용하여 "프라임 사이클"(1 분 길이)을 실행하십시오. 상태 표시줄에 "준비됨"이 표시되면 프라임 사이클이 완료됩니다. 프라임 사이클을 반복하여 칩을 성공적으로 연결하기에 충분한 물방울이 형성되었는지 확인합니다.
- 모든 휴대용 모듈이 프라이밍되어 있고 보이는 미디어 방울이 있는지 확인하십시오.
- 흐름의 소개
참고: 흐름은 전형적으로 장 상피 세포가 막에 단단히 부착될 수 있도록 오가노이드 단편을 시딩한 후 24시간 후에 개시된다.- 시딩된 칩의 두 채널을 200 μL의 각각의 배지로 세척하여 임의의 기포 또는 세포 파편을 제거한다. 세척 후 포트에 작은 미디어 방울을 남겨 두십시오. 칩 캐리어를 휴대용 모듈에 밀어 넣습니다(그림 1C).
- 휴대용 모듈을 트레이에 놓은 다음 문화권 모듈에 넣습니다. 배양 모듈의 화면에 있는 컨트롤을 사용하여 적절한 장기 칩 배양 조건(유량 및 스트레치)을 프로그래밍합니다.
참고: 표준 십이지장 및 결장 칩 배양 조건의 경우, 상단 및 하단 채널 모두에 대해 유량을 각각 30μL/h15 및60μL/h 16 으로 설정하십시오. 그러나 각 채널의 유량은 독립적으로 제어되며 0-1,000 μL / h 사이에서 설정할 수 있습니다. 주사기 또는 연동 펌프는 여기에 제시된 배양 모듈 대신 미세 유체 칩에 층류를 도입하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 튜브와 커넥터를 사용하여 칩과 펌프 간에 신뢰할 수 있는 유체 연결을 설정하는 것은 여러 칩의 동시 관류가 필요한 경우 기술적으로 어려울 수 있습니다. - 기포의 핵형성을 방지하기 위해 휴대용 모듈과 칩에서 배양 배지에 압력을 가하는 "조절 사이클"(2 시간 길이)을 시작하십시오. 프로그램된 조건은 조절 주기가 완료된 후 재개됩니다.
- 미디어 변경
- 두 채널 모두에 대해 새 미디어를 준비하고 입구 저장소에 2mL의 신선한 배지를 추가하여 48시간마다 보충합니다(그림 1C).
- 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 BSC로 가져옵니다. 모든 저수지에서 미디어를 열망하고 신선한 미디어로 보충하십시오. 트레이를 다시 가져오고 흐름을 다시 시작합니다.
- 스트레치 소개
참고: 순환 변형을 적용하기 전에 세포가 100% 합류로 성장할 수 있도록 하십시오. 스트레치는 전형적으로 시딩 후 3일 또는 유체 배양의 개시 후 48 h 후에 도입된다. 0.2 또는 0.15 Hz의 주파수에서 2% 순환 변형률, 십이지장11 및 결장 24 장 칩에 대해 각각 초기24 h에 대해 적용된다. 이어서, 생체내에서 장 상피 세포에 의해 경험되는 고리형 균주와 매우 유사하게 장 칩 배양의 잔여 지속 기간 동안 10%로 더욱 증가된다(도 1D)25. 배양 모듈은 2%-12% 순환 변형률의 적용과 최대 0.4Hz의 주파수를 지원할 수 있습니다.- 진행중인 유체 배양에 스트레칭을 도입하려면 배양 모듈을 일시 중지하십시오. 화면에서 컨트롤을 사용하여 스트레치 설정을 2% 스트레치, 0.2Hz 또는 0.15Hz 주파수로 변경하고 culture 모듈을 다시 시작합니다.
- 24시간 후 7.5.1단계를 반복하여 10% 스트레치, 0.2Hz 또는 0.15Hz 주파수를 적용합니다.
8. 십이지장 칩에서 원형 CYP 유도제를 사용한 CYP450 유도
참고: 시토크롬 P450 (CYP450) 유도 분석은 시험 화합물이 특정 CYP450 효소의 mRNA 수준 및/또는 촉매 활성을 증가시키는지 여부를 평가할 수 있게 한다. 여기에서는 시험관내 CYP 유도제, 리팜피신(RIF) 및 1,2-디하이드록시비타민 D3(VD3)가 권장하는 업계 표준 및 조절제에 의한 CYP3A4 유도의 평가를 위한 프로토콜을 설명한다. 제시된 방법은 인간 장 조직에서 CYP450의 상이한 이소형을 유도하는 다양한 시험 화합물의 가능성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 프라이머 및 프로브 기질의 특정 세트는 평가될 각각의 효소 이소형에 대해 선택될 필요가 있을 것이다.
- CYP 유도제에 노출
- 멸균 DMSO를 사용하여 20 mM RIF, 100 mM VD3 및 200 mM 테스토스테론 (재료 표)의 스톡 용액을 준비하십시오.
주의: 테스토스테론은 스케줄 III 조절 물질입니다. 취급 중에 규제 절차를 따르십시오. - 20 μM RIF, VD3의 100 nmol / L을 달성하기 위해 완전한 오가노이드 성장 배지 및 내피 세포 성장 배지에서 스톡 용액을 희석하여 CYP 유도제로 투약 배지를 준비하십시오. DMSO를 각각의 매질에 희석하여 DMSO의 0.1%를 달성함으로써 비히클 제어를 준비한다.
- 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 BSC로 가져옵니다. 모든 입구 저장소의 배지를 유도제 또는 비히클 제어로 2mL의 투약 매체로 교체하십시오. 휴대용 모듈을 배양 모듈로 되돌리고 30μL/h에서 흐름을 다시 시작합니다.
- 24시간 후 배지를 유도 용액으로 교체하고 8.1.2-8.1.3단계를 반복합니다. 유도 용액은 매일 신선하게 준비되어야하며 실험 과정에서 24 시간마다 보충되어야하며, 이는 일반적으로 48-72 시간 길이입니다.
- 멸균 DMSO를 사용하여 20 mM RIF, 100 mM VD3 및 200 mM 테스토스테론 (재료 표)의 스톡 용액을 준비하십시오.
- 원형 기질 (테스토스테론)과의 인큐베이션
- 수확 당일, Advanced DMEM/F12의 상응하는 유도제와 함께 테스토스테론의 프로브 기질 용액을 준비하여 최종 농도 200 μM을 산출하십시오. LCMS 분석을 방해할 수 있으므로 배지에 혈청을 첨가하는 것을 생략하십시오.
- 트레이를 BSC로 가져 와서 모든 저수지에서 투약 매체를 흡인하십시오. 상단 및 하단 입구 저장소를 세척하고 따뜻한 고급 DMEM/F12 배지 및 내피 세포 성장 배지로 교체하십시오.
- 저장고로부터 세척 배지를 제거하고 이를 단계 8.2.1에서 제조된 프로브 기질 용액 1 mL로 교체한다. 칩을 1,000μL/h의 높은 유속으로 5분 동안 관류하고 상단 및 하단 출구 저장소를 모두 흡인합니다. 칩을 배양 모듈로 되돌리고 300μL/h의 일정한 흐름 하에서 1시간 동안 배양한다.
- 데이터 분석
- LCMS 분석을 위한 샘플 수집
- 미리 표지된 1.5 mL 튜브에 0.1% 포름산으로 아세토니트릴을 함유하는 정지 용액 200 μL를 분취하여 얼음 위에 놓는다. LCMS 정지 용액의 조성은 분석될 필요가 있는 기질에 기초하여 변할 수 있다.
- 1 시간의 처리가 완료되면 흐름을 멈추고 트레이를 BSC로 다시 가져옵니다. 상단 출구 저장소에서 100μL의 유출물을 수집하여 정지 용액이 들어있는 해당 튜브에 첨가합니다(그림 2A). 튜브를 드라이 아이스 위에 즉시 놓습니다. 분석을 진행하기 전에 샘플을 -80°C에 보관하십시오.
- HPLC 또는 LC-MS/MS 기술을 사용하여 샘플을 추출하고 분석하여 대사산물-6β-하이드록시테스토스테론(6β-OH-T)의 형성을 모니터링합니다. CYP 효소 활성은 pmol/min/mg 단백질로 표현될 수 있으며, 여기서 pmol은 반응 중에 형성된 대사산물(6β-OH-T)의 양을 의미한다. 칩당 총 단백질 함량(protein; mg)은 단계 8.3.2에 기재된 브래드포드 검정을 수행함으로써 결정된다.
폴드-유도 활성은 CYP 활성(유도)/CYP 활성(비히클)에 의해 계산된다. - mRNA 분석을 위해 샘플을 수집하는 경우, 단계 8.3.3을 참조한다.
- 단백질 발현 분석을 위한 세포의 용해
참고: 온칩 세포로부터의 단백질 추출은 프로테아제 및 포스파타제 억제제로 보충된 단백질 용해 완충액을 사용하여 수행됩니다(표 자료). 추출된 단백질은 브래드포드 분석법을 사용하여 정량화되고 다운스트림 분석에 사용된다.- 휴대용 모듈에서 칩을 분리하여 페트리 접시에 넣으십시오. 두 채널을 200 μL의 멸균 DPBS로 세척한다.
- 바닥 채널 출구를 200μL 필터 피펫 팁으로 차단합니다. 해리 용액 50 μL를 바닥 채널을 통해 관류시키고, 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
- 내피 세포의 완전한 분리를 확인하기 위해 검사하십시오. 피펫을 1-2회 위아래로 피펫하고 채널에서 해리 용액을 제거한다. 세척을 반복하십시오.
- 상단 채널 출구를 200μL 필터 피펫 팁으로 차단합니다. 75 μL의 단백질 용해 완충액을 상부 채널을 통해 퍼퓨즈한다. 피펫 팁이 삽입된 상태로 두고, 상부 채널 입구를 차단하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 5-10회 상하로 피펫하고, 세포 용해물을 미리 표지된 1.5 mL 튜브에서 수집한다.
- 8.3.2.4단계를 반복합니다. 세포의 완전한 분리가 관찰 될 때까지. 세포 용해물을 동일한 1.5 mL 튜브에 수집하고, 분석될 때까지 -80°C에 보관한다.
- 표준 방법에 따라 단백질 분획을 추출하고 Bradford 분석법을 사용하여 총 단백질을 정량합니다 (표 of Materials).
- 유전자 발현 분석을 위한 세포의 용해
참고 : RNA 추출을위한 온칩 세포 용해는 0.1 % 2- 메르캅토 에탄올로 보충 된 RNA 용해 버퍼를 사용하여 달성 할 수 있습니다 (표 자료). 또는 NGS 및 마이크로어레이 분석에 적합한 고품질 RNA의 높은 수율이 필요한 경우 페놀 기반 RNA 용해 버퍼를 사용할 수 있습니다.- 단계 8.3.2.1 내지 8.3.2.2를 수행하여 용해를 위한 장 칩을 제조한다.
- 200 μL 필터 피펫 팁을 사용하여 상부 채널의 출구를 차단한다. 150 μL의 RNA 용해 완충액을 상부 채널을 통해 퍼퓨즈한다. 피펫 팁을 삽입한 상태로 두어 상단 채널의 유입을 차단합니다. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다. 페놀계 RNA 용해 완충액을 사용한 용해를 위해서는 시약 350μL를 사용한다.
- 5-10회 상하로 피펫팅하고 세포 용해물을 미리 라벨링된 1.5 mL 튜브에서 수집한다. 또 다른 150 μL의 RNA 용해 완충액으로 단계를 반복하고 수집한다. 세포 용해물을 분석될 때까지 -80°C에서 저장한다. 후속 RNA 시퀀싱 분석의 경우, 용해 후 1개월 이내에 분석을 진행한다.
- RNA 정제 키트를 사용하여 세포 용해물로부터 총 RNA를 추출한다.
- 역전사효소 키트를 이용하여 cDNA로 역전사하고 실시간 PCR 사이클러 및 적절한 프라이머 및 버퍼를 사용하여 실시간 PCR을 수행한다. 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 결과를 정량화한다.
- LCMS 분석을 위한 샘플 수집
9. 결장 칩에서 전염증성 사이토카인을 이용한 상피 장벽의 파괴
참고: 이 프로토콜은 사이토카인 인터페론 감마(IFNγ)26,27,28,29에 의한 장 상피 장벽의 붕괴를 기술한다. 사이토카인은 장 상피 세포 상피 세포에서 IFNγ 수용체의 기저측성 발현을 주어진 결장 칩의 바닥 채널에 투여된다. 전염증성 자극은 P앱이 0.5 x 10-6 cm/s 이하로 안정화되는 즉시 배양 5일째에 칩에 도입된다. 유사한 투약 요법이 다른 전염증성 사이토카인 및 장벽 파괴제에 대해 사용될 수 있다.
- IFNγ를 이용한 자극
- 멸균 세포 배양물에 IFNγ (물질 표)의 100 μg / mL의 원액을 준비하십시오. 실험 과정에서 원액을 -80°C에 보관하십시오. 각 실험마다 항상 IFNγ의 신선한 스톡을 사용하고 세 번 이상의 동결 및 해동 사이클을 피하십시오.
- 탈기된 내피 세포 성장 배지에서 원액을 희석하여 IFNγ 투약 용액을 준비하여 10-100 ng/mL의 최종 농도를 달성하십시오.
- 트레이를 BSC로 가져와 하단 채널 입구 저장소에서 배지를 제거하고 IFNγ 함유 배지 3mL로 교체합니다. IFNγ 투약 배지를 매일 새로 고칩니다.
- 트레이를 배양 모듈에 넣고 칩을 1,000μL/h의 높은 유량으로 5분 동안 관류하여 IFNγ 처리를 시작합니다. 유속을 다시 60μL/h로 전환하고 유체 배양을 계속합니다.
- 데이터 분석
- 상피 장벽 기능의 평가. 상피 겉보기 투과성 (Papp) 또는 장벽 기능은 IFNγ로 처리 후 배양의 다양한 시점에서, 두 채널의 입구 및 출구 저장소의 유출 배지에서 측정될 수 있다. 형광 추적자는Papp의 평가 4 h 전에 상부 채널 오가노이드 성장 배지에 첨가되어야 한다. 전형적으로, 3 kDa 덱스트란 캐스케이드 블루가 형광 트레이서로서 사용되고, 24시간 전에 배지에 첨가된다.
- 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 BSC로 가져옵니다.
- 라벨링하고 웰 당 100 μL의 DPBS로 96-웰 흑벽 플레이트를 제조하였다. 200μL 다채널 피펫을 사용하여 모든 저장소에서 50μL의 유출물을 수집하여 각 웰에 첨가합니다(그림 2B).
- 표준 곡선을 준비하려면 DPBS에 3 kDa 덱스트란 캐스케이드 블루 1:3의 100 μg/mL를 함유하는 배지를 희석한다. 이어서, DPBS에서 내피 세포 성장 배지의 삼배 희석을 사용하여 연속 희석을 수행한다.
- 플레이트 판독기를 사용하여 375 nm 여기 및 420 nm 방출에서 형광을 판독한다. 측정된 OD 값을 사용하여 다음과 같이 겉보기 투과도(Papp)를 계산합니다.
- 온칩 세포의 면역형광염색
- 각 채널에 대해 200 μL의 DPBS를 사용하여 세 번 세척한다.
- 200 μL의 고정 용액(DPBS에서 4% PFA)을 각 채널에 퍼퓨즈한다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 세척 단계 9.2.2.1을 반복한다. 이 단계에서 세척된 칩은 4°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
- 각 채널에 대해 200 μL의 투과화 용액 (DPBS 중의 10% 정상 당나귀 혈청 (NDS) 중 0.1% Triton-X 100)을 사용하여 세포를 투과시킨다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세척 단계 9.2.2.1을 반복한다.
- 각 채널에 대해 200 μL의 블로킹 용액 (DPBS의 10% NDS)을 사용하여 칩 상의 세포를 차단한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 1차 항체를 다음과 같이 항체 용액 (DPBS에서 5% NDS)에 희석한다: 항-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, 상피 타이트 접합 마커), 항-오클루딘 (1:100, 상피 타이트 접합 마커), 항-클라우딘 4 (1:100, 상피 타이트한 접합 마커), 항-E-카데린 (1:100, 상피 부착 접합 마커 (표 물질). 200 μL의 일차 항체 용액을 각 채널을 통해 퍼퓨즈하고 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 세척 단계 9.2.2.1을 반복한다.
- 이차 항체를 항체 용액 (DPBS에서 1:300, 5% NDS)에 희석한다. 이 용액 200 μL를 각 채널을 통해 퍼퓨즈하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 세척 단계 9.2.2.1을 반복한다. 원하는 경우, 세포골격 마커인 phalloidin을 이차 항체 용액에 첨가할 수 있다.
- DPBS에 50 μg/mL의 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액을 준비하고 이를 사용하여 각 채널을 통해 200μL를 관류합니다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 세척 단계를 반복하십시오. 이 시점에서 염색된 칩은 4°C에서 최대 14일 동안 보관할 수 있습니다.
- 카스파제 3 절단의 평가
- 단계 8.3.2에 기재된 바와 같이 상피 세포의 단백질 총량을 분리하고 정량화한다. 세척 단계 8.3.2.1을 생략한다. 샘플을 DPBS로 희석하여 최종 농도 400μg/mL로 합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 카스파제 3 검출 키트를 사용하여 총 및 절단된 카스파아제 3의 수준을 정량화합니다.
- 전염증성 사이토카인 분비의 평가
- 결장 칩의 두 채널의 출구에서 수집 된 유출물을 사용하여 제조업체가 제공 한 프로토콜에 따라 분비 된 급성기 전염증성 사이토카인을 정량화하십시오. V-PLEX 혈관 손상 패널 2 인간 키트에 대해 5배 희석을 수행하고 V-PLEX 인간 전염증성 패널 II에 대해 2배 희석을 수행한다.
- 상피 장벽 기능의 평가. 상피 겉보기 투과성 (Papp) 또는 장벽 기능은 IFNγ로 처리 후 배양의 다양한 시점에서, 두 채널의 입구 및 출구 저장소의 유출 배지에서 측정될 수 있다. 형광 추적자는Papp의 평가 4 h 전에 상부 채널 오가노이드 성장 배지에 첨가되어야 한다. 전형적으로, 3 kDa 덱스트란 캐스케이드 블루가 형광 트레이서로서 사용되고, 24시간 전에 배지에 첨가된다.
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Representative Results
도 1D 는 장 칩 배양의 타임라인을 요약하고, 칩 상에 시딩하기 전과 시의 장 내피 세포 및 오가노이드를 예시한다. 또한, 십이지장과 결장 칩 사이의 뚜렷한 형태 학적 차이를 보여 주며, 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재와 작은 장 구조의 대표에 의해 강조됩니다.
도 3A,B는 3개의 상이한 오가노이드 공여체로부터의 십이지장 칩에서의 폴드 CYP3A4 유도 반응을 입증한다. 칩을 48시간 동안 20μM RIF 또는 100nM VD3에 노출시키고, CYP450 효소의 mRNA 수준(A) 및/또는 폴드 촉매 활성(B)을 평가하는데 사용되었다. 테스토스테론 대사산물인 6β-하이드록시테스토스테론(6β-OH-T)의 증가된 수준은 상승된 CYP3A4 mRNA 유전자 발현과 일치하며, RIF 및 VD3에 노출된 십이지장 칩에서 관찰되었으며, 이는 시험된 세 공여자 모두에 걸쳐 적절한 유도 반응을 나타낸다. n=3개의 생물학적으로 독립적인 칩의 SEM± 수단이 도시되어 있다.
도 4는 (A,C) 상피 세포 형태학 및 타이트한 접합 완전성의 변화, (B) 장벽 기능의 감소, (D) 아폽토시스의 유도 및 (E) IFNγ 처리에 반응하는 사이토카인 분비 증가를 포함하는 결장 칩에서의 누설 장 증후군의 모델링에 대한 대표적인 결과를 묘사한다.
도 4A는 대조군 및 IFNγ 처리된(50 ng/mL, 48 h) 결장 칩의 상피 단일층의 대표적인 밝은 필드 이미지를 도시한다. 칩을 배양 모듈에서 제거하고 상피 형태를 매일 현미경으로 평가했습니다. 이미지는 밝은 필드 현미경과 10x 목표를 사용하여 획득되었습니다. IFNγ로 처리된 결장 칩은 손상된 세포 형태학 및 기둥 상피의 손실을 나타낸다.
도 4B 는 IFNγ로 자극시 또는 기준선 조건 하에서 배양된 결장 칩 상에서 수행된 겉보기 투과성 분석의 대표적인 결과를 입증한다. 3 kDa 덱스트란 캐스케이드 블루 트레이서를 상부 채널 저장고에 100 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. IFNγ를 50 ng/mL의 최종 농도로 배양 5일째에 바닥 채널 내로 투약하였다. 칩은 60 mL/h로 관류되었다. 다음에, 배지를 상부 및 하부 채널 둘 다의 입구 및 출구 저장소로부터 매일(노출 후 최대 72시간까지) 수집하였다. 각 샘플의 50 μL를 수집하고, 프로토콜의 단계 9.2.1에 기재된 바와 같이 처리하고, 플레이트 판독기를 사용하여 375-420 nm에서 형광을 조사하였다. 상피 부세포 투과성의 유의한 증가는 IFNγ 자극의 48 h 이후에 관찰되었다.
도 4C 는 대조군 및 IFNγ 처리(50 ng/mL, 48 h) 결장 칩에서 상피 타이트(Zonula Occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) 및 부착체(E-cadherin) 접합부의 대표적인 면역형광 이미지를 도시한다. 칩을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고, 프로토콜의 단계 9.2.2에 기재된 바와 같이 추가로 처리하였다. 이미지는 공초점 현미경과 20x 장거리 대물을 사용하여 획득하고 표준 프로토콜에 따라 피지 버전 2.0을 사용하여 처리되었습니다. IFNγ를 사용한 처리는 증가된 세포질 신호에 의해 나타난 바와 같이 ZO-1 및 클라우딘-4의 변위 및 오클루딘 및 E-카데린의 내재화를 촉발시킨다.
도 4D 는 아폽토시스 활성화를 나타내는 IFNγ의 50 ng/mL에 반응하여 결장 칩에서 Caspase 3 절단의 시간-과정을 나타낸다. 상피 세포를 칩 상에 용해시키고, 단백질 샘플을 표준 방법에 따라 정제하였다. 총 및 절단된 Caspase 3의 세포내 함량은 프로토콜의 단계 9.2.3에 기재된 바와 같이 측정되었다. IFNγ는 앞서도 29에 기술된 바와 같이, 칩 상에서 배양된 결장 상피 세포에서, 48시간의 자극 후에 아폽토시스의 활성화를 유도한다.
도 4E는 50 ng/mL IFNγ로 자극시 결장 칩으로부터 사이토카인이 분비되는 시간-과정을 보여준다. 200 μL의 유출 배지를 상부 및 하부 채널 모두의 출구 저장소로부터 매일 수집하였다. 유출물 샘플은 분석 전에 -80°C에서 24시간 동안 보관하였고 4°C에서 밤새 해동시켰다. 칩 배양 배지 내의 사이토카인 수준은 프로토콜의 단계 9.2.4에 기재된 바와 같이 메조 스케일 디스커버리 기술을 사용하여 평가하였다. IFNγ는 혈관세포 부착 단백질 1(VCAM-1) 및 인터루킨 6(IL-6)의 기저측성 분비와 세포간 부착 분자 1(ICAM-1) 및 혈청 아밀로이드 단백질 A(SAA)의 정점 분비에 의해 나타난 바와 같이 결장 칩에서 전염증성 분자의 극화된 분비를 유도하였다. VCAM-1, ICAM-1, IL-6 및 SAA의 가용성 형태의 혈청 수준은 염증30,31의 지표로서 임상 실험실에서 사용된다.
도 1: 장내 칩의 확립15,16. (A) 칩 활성화 및 코팅의 개략도. 간단히 말해서, 칩은 칩 크래들에 배치되고, ER1 용액으로 관류되고 UV 광 하에서 활성화된다. 다음으로, 칩을 ER2 및 DPBS로 세척한다. 마지막으로, 칩은 각 세포 유형에 특이적인 빙냉 ECM 용액으로 코팅되고, 37°C에서 하룻밤 동안 배양된다. (B) 칩에 오가노이드를 도입하는 과정을 나타낸 개략도이다. 오가노이드는 24-웰 플레이트로부터 원뿔형 튜브로 옮겨지고 BMM 해리 용액의 존재하에 얼음 상에서 인큐베이션되어 가용화된 BMM으로부터 오가노이드를 회수한다. 이어서, 오가노이드 현탁액을 원심분리하고, 가용화된 BMM 잔기의 존재에 대해 평가한다. BMM의 투명한 층이 세포 펠릿 위에 여전히 보이면 과정을 반복해야합니다. 잘 정의된 펠릿이 가시적인 겔 잔기 없이 관찰되는 경우, 오가노이드는 효소적으로 해리되고 칩의 상부 채널(파란색)에 도입된다. 칩의 바닥 채널(magenta)은 조직 특이적 미세혈관 내피 세포로 시딩된다. (c) 배지 흐름 및 순환 연동 유사 스트레치를 지원하는 배양 모듈에 대한 칩의 연결을 보여주는 개략도. 프라이밍 사이클은 칩 포트 및 휴대용 모듈 저항기의 끝에서 세포 배양 배지 액적의 생성을 가능하게 한다. 이를 통해 칩과 휴대용 모듈 사이에 액체-액체 인터페이스가 생성되어 칩이 모듈로 슬라이딩되고 안전하게 연결될 수 있습니다. 마지막으로 휴대용 모듈을 트레이에 배치하고 트레이를 문화권 모듈에 삽입합니다. (d) 십이지장 및 결장 칩을 포함하는 생검 유래 장 칩 플랫폼의 확립을 위한 주요 단계를 강조하는 실험 타임라인. 브라이트필드 이미지는 칩에 시딩하기 전과 후인 0일째의 내피 및 오가노이드 유래 세포뿐만 아니라 칩 배양 8일째에 합류 및 3D 상피 조직의 형성을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 소장 칩으로부터의 유출 배지의 수집. (A) 휴대용 모듈로부터의 미디어 유출물의 수집을 묘사하는 개략도. 배지는 상부 및 하부 채널의 출구 저장소로부터 수집되고, 추가 ELISA 또는 LC-MS/LC-MS/MS 분석이 있을 때까지 -80°C에서 저장된다. (b) 상피 겉보기 투과성의 하류 평가를 위해 다중 채널 피펫을 사용한 유출 샘플의 수집 및 96-웰 흑벽 플레이트로의 이들의 이송을 보여주는 개략도(Papp). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 십이지장 칩에서의 CYP3A4 유도 15. (A) 20 μM RIF 및 100 nM VD3에 48시간 노출에 의한 십이지장 칩에서의 CYP3A4 mRNA 수준의 유도. 평균 ± SEM, N = 3 칩 / 상태 / 기증자, 양방향 ANOVA, Tukey의 사후 테스트, ******p < 0.0001 (DMSO 대조군과 비교). (b) 프로브 기질 대사산물의 LC-MS/MS 정량화에 의해 평가된 원형형 유도제에 노출된 십이지장 칩에서의 CYP3A4 활성의 유도: 6β-하이드록시테스토스테론. CYP3A4 활성의 유의한 증가는 48시간 동안 20 μM RIF 또는 100 nM VD3로 처리된 십이지장 칩에서 관찰되었다. 평균 ± SEM, N = 3 칩 / 조건 / 기증자, 양방향 ANOVA, Tukey의 사후 테스트, ******p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: IFNγ 16을 사용한 결장 칩의 상피 장벽의 붕괴. (A) 기준선 조건 하에서 그리고 48시간 동안 50 ng/mL IFNγ로 자극했을 때 상피 세포의 형태를 보여주는 브라이트필드 이미지. 스케일 바: 100 μm. (B) 50 ng/mL의 IFNγ로 72시간 자극을 가하는 과정에서 3 kDa 덱스트란에 대한 상피 장벽의 겉보기 투과성. 평균 ± 95% CI, N = 5-9 칩/조건, 양방향 ANOVA, Tukey의 사후 테스트, ****p < 0.0001입니다. (C) 48시간 동안 50ng/mL의 IFNγ로 자극시 상피 타이트하고 부착 접합부의 붕괴를 묘사하는 면역형광 이미지. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (적색) 단단한 접합부, E-cadherin (적색) 부착 접합부, 오클루딘(적색) 단단한 접합부, 클라우딘-4(적색) 단단한 접합부, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(청색) 핵. 스케일 바: 50 μm. (D) 50 ng/mL의 IFNγ로 처리함으로써 결장 칩에서 카스파아제 3 절단의 유도. 네 개의 서로 다른 시점이 72시간의 노출에 걸쳐 평가되었다. 평균 ± 95% CI, N = 3-6 칩/조건, 양방향 ANOVA, Tukey의 사후 테스트, ****p < 0.0001입니다. (E) 사이토카인의 분비 증가: 혈관 세포 부착 단백질 1 (VCAM-1) 및 인터루킨 6 (IL-6), 하부 채널에서, 그리고 세포 간 부착 분자 1 (ICAM-1) 및 혈청 아밀로이드 단백질 A (SAA)를 상부 채널 유출물 배지에서, IFNγ의 50 ng/mL로 결장 칩의 72 h 자극 과정에 걸쳐. 평균 ± 95% CI, N = 3 칩/조건, 양방향 ANOVA, Tukey의 사후 검정, *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
장기 온 칩 기술과 장내 오가노이드의 결합은 인간의 장 생리학 및 병리 생리학의 정확한 모델링을 약속합니다. 여기서, 우리는 미세유체 장치에서 공동 배양된 생검 유래 소장 또는 결장 상피 및 장 미세혈관 내피 세포를 함유하는 장 칩의 확립을 위한 간단하고 강력한 단계별 프로토콜( 도 1에 요약됨)을 제공한다. 인간 창자에 대한 이 칩 기반 시뮬레이션은 생리적, 발광적, 혈관 흐름과 연동 운동과 같은 움직임을 통합합니다. 또한, 우리는 십이지장 칩의 약물 대사 및 결장 칩의 장벽 기능과 같은 중요한 장 기능의 평가를위한 절차를 설명합니다.
장내 항상성의 유지와 칩상의 장 조직의 정확한 모델링에 필수적인 상피-내피 세포 상호작용을 재구하기 위해서는 PDMS 막의 양쪽에 기능적이고 온전한 세포 단층을 확립하는 것이 중요하다. 성공적인 칩 시딩을 향한 첫 번째 단계는 PDMS 표면과 ECM 단백질 사이의 안정적인 결합의 개발을 허용하는 PDMS 표면의 화학적 활성화입니다. 부적절한 활성화는 세포의 부착을 방해하고 불완전한 세포 단일층의 형성을 초래할 수 있습니다. 활성화 용액은 빛에 민감하고 분해되기 쉽기 때문에 신선하게 준비해야합니다. UV 활성화 및 후속 ECM 코팅 동안, 각 채널 내에서 시약의 균등한 분포를 보장하는 것이 중요하다. 상부 및 하부 채널을 코팅하는데 사용되는 용액의 특정 조성 및 농도는 각각 상피 및 내피 세포의 요구에 적합하도록 최적화되었다. 장 칩의 세포 조성에 대한 변화가 필요한 경우, 최적의 결과를 얻기 위해 ECM 조건을 다시 최적화해야 할 수도 있습니다.
ECM 코팅 후, PDMS 멤브레인의 하단에 완전하고 균질한 단층을 얻기 위해 높은 셀 시딩 밀도 (8 x 106 cells/mL)로 HIMEC를 시드하는 것이 중요합니다. 완전한 세포 컨플루언시, 컨플루언시가 달성되지 않는 경우, 시딩 동안 내피 세포 현탁액의 밀도를 더욱 증가시키거나 HIMECs가 완전히 합류할 때까지 칩의 상부 채널에서 오가노이드 단편의 시딩을 지연시키는 것이 좋다. 오가노이드의 효소적 소화를 통해 수득된 단일 세포의 현탁액보다는 단편화된 오가노이드의 사용은 이전에 장 칩(14) 내의 장 단일층 형성의 성공 및 재현성을 향상시키는 것으로 나타났다. 따라서 약 10-30 세포 (40-100 μm 크기)로 구성된 오가노이드 단편을 생성하는 효소와의 최적 배양 시간을 보장하기 위해 오가노이드 소화 과정을 면밀히 모니터링하는 것이 좋습니다. 부적절한 해리는 원하는 단층 대신 미세 유체 칩에서 낭성 오가노이드 구조의 개혁을 초래할 수 있습니다. 또한, 단일 세포로의 과도한 오가노이드 해리를 피하여 세포 생존, 회복 및 칩 내에서 합류 단층을 형성하지 못하는 것을 피하는 것이 중요합니다.
배양 모듈을 사용하여 지지된 장내 칩 배양물 내로의 유체 유동(shear stress) 및 순환 균주의 혼입은 기능적 장 장벽의 형성을 향상시키고 상피 조직(13)의 3D 아키텍처의 자발적인 개발을 촉진하는 것으로 나타났다. 그러나 Organs-on-Chips를 사용하여 미세 유체 실험을 수행 할 때 세포 스트레스 또는 막으로부터의 분리를 초래할 수있는 채널에 마이크로 버블이 형성되지 않도록 사용하기 전에 세포 배양 배지를 미리 따뜻하게하고 탈기하는 것이 중요합니다.
여기에 표시된 특정 응용 분야 외에도 창자 칩 모델은 기초 과학에서 신약 또는 약물 전달 기술의 발견 및 테스트에 이르기까지 다양한 과학적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 인간의 장 발달, 줄기 세포 성숙 및 상피 세포 기능에 대한 연구를 촉진 할 수 있습니다. 특히 장 조직의 성장과 항상성에서 역학의 역할을 평가하는 맥락에서. 최근의 발견에 따르면 건강한 장 상피의 동적 평형은 크립트 빌리 구조를 정의하고, 세포 유형을 구획화하고, 세포 이동을 지시하고, 세포 정체성, 증식 및 죽음을 공간과 시간에서 조절하는 다양한 힘을 정확하게 조정하는 능력에 의존한다는 것을 밝혀 냈습니다32. 장 칩은 기계적 힘 (예 : 긴장 또는 전단 스트레스), 세포 운명 및 기능 간의 상호 작용을 더 잘 해명 할 수있는 기회를 제공하여 장 mechanobiology의 신흥 분야에 남아있는 많은 매혹적인 질문에 대답합니다. 더욱이, 호르몬을 분비하는 장내분비 세포의 존재와 다양한 영양소 운반체(15,16)의 정확한 국소화 덕분에 감지 및 장 수송 과정에 대한 연구를 허용할 수 있다. 장내 칩 모델은 또한 장 염증성 장애, 숙주-병원체 및 숙주-미생물 상호작용에 대한 연구를 위해 공생 또는 병원성 미생물뿐만 아니라 면역 세포를 통합하도록 변형될 수 있을 뿐만 아니라, 앞서 17,20,33,34,35에 나타난 바와 같이 면역종양학 제품의 오프 타겟 독성을 정확하게 예측한다.
또한, 특정 유전자형 및 표현형 특성을 가진 개인으로부터 임상 생검 표본을 사용하면 치료법에 대한 반응뿐만 아니라 환자 특정 질병 메커니즘의 분석이 가능하므로 향후 개인화 된 의학을 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 각 칩에 합류 장 상피를 형성하기 위해 많은 수의 오가노이드 (~ 60-80)로부터의 단편이 필요하다는 것입니다. 이는 단층의 증식 팽창 및 3D 조직 아키텍처의 확립을 지원하기 위해 적절한 수의 장 줄기 세포가 존재하도록 보장하기 위해 오가노이드 단편이 고밀도 시딩을 필요로 하기 때문이다. 칩 상의 완전히 분화된 장 상피는 모든 주요 장 상피 세포 유형(흡수성 장세포, 파네스 세포, 잔 세포 및 장내분비 세포)과 생체내 대응물과 매우 유사한 전사 프로파일을 보유한다. 그러나, 현재의 모델은 여전히 장 섬유아세포, 상주 면역 세포 (예를 들어, 대식세포, 상피내 림프구 및 수지상 세포) 및 장내 신경계를 포함하는 살아있는 장의 다른 중요한 성분들을 결여하고 있다.
이러한 것들이 잠재적 인 단점이지만, 이전 연구에 따르면 Organ-on-a-Chip 기술 접근법의 힘은 생체 내 조직과 미세 환경의 다양한 구성 요소를 점진적으로 통합함으로써 인간 장기의 구조적 및 기능적 복잡성을 모방 할 수있는 능력에 있습니다36,37. 시험관내 조직 공학에 대한 이러한 합성 생물학 접근법은 다양한 수준의 시스템 복잡성에서 기관 수준의 생리적 및 병리생리학적 반응에 대한 개별 세포 및 분자 성분의 기여를 연구하는 방법을 제공한다. 또한 상호 작용하는 조직의 생화학적, 유전 적 및 현미경 분석을 개별적으로 실시간으로 수행 할 수 있으므로 세포 간 신호 및 조직 - 조직 상호 작용이 특정 기관 수준 행동에 어떻게 기여하는지에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 창자 칩 기술의 또 다른 주목할만한 특징은 다양성입니다. 미세 환경 요소에 대한 정밀한 제어는 혈류에 노출 된 내피 세포에 의해 감지되는 전단 응력 및 장 조직의 순환 연동 운동과 같이 인체의 세포가 경험하는 자연력을 재현하기 위해 매체 유량 및 변형 매개 변수를 미세 조정할 수 있습니다. 또한, 오가노이드와 장기 온 칩의 시너지 조작은 소장과 대장 사이의 생리적 상호 작용을 연구하기 위해 서로 유동적으로 연결될 수있는 장 조직의 다양한 영역을 나타내는 혈관화 된 장기 온 칩을 만들 수있게합니다. 따라서 우리는 장내 칩이 장 상피의 우수한 모델을 나타내며 기초 과학뿐만 아니라 전임상 및 규제 설정에서 3Rs (감소, 정제 및 교체) 원칙을 구현하는 데 도움이 될 수 있다고 믿습니다.
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Disclosures
Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi 및 Magdalena Kasendra는 Emulate Inc.의 현재 또는 이전 직원이며 지분을 보유 할 수 있습니다. Emulate Inc.는 오르간 칩 장치를 제조하고이 기사에 명시된 작업과 관련된 특허를 발표 한 회사입니다.
Acknowledgments
우리는 장 생검 유래 오가노이드를 제공 한 Mark Donowitz 교수와 칩, 휴대용 및 문화 모듈의 과학적 삽화를 설계 한 Brett Clair에게 감사드립니다. 나머지 모든 과학적 삽화는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | - | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | - | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | - | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | - | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | - | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | - | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | - | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | - |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | - | - | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | - | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | - | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel - Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
| SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
| MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
| Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | - | Confocal microscope |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | - | 20X long-distance objective lenses |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | - | Brightfield microscope |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | - | 10X objective lenses |
References
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