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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Abstract

Die Darmschleimhaut ist eine komplexe physikalische und biochemische Barriere, die eine Vielzahl wichtiger Funktionen erfüllt. Es ermöglicht den Transport, die Aufnahme und den Stoffwechsel von Nährstoffen und Xenobiotika und erleichtert gleichzeitig eine symbiotische Beziehung mit der Mikrobiota und begrenzt die Invasion von Mikroorganismen. Die funktionelle Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen und ihrer physikalischen und biochemischen Umgebung ist für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Homöostase des Darmgewebes von entscheidender Bedeutung. Die Modellierung dieser komplexen Wechselwirkungen und der integrierten Darmphysiologie in vitro ist ein gewaltiges Ziel mit dem Potenzial, die Art und Weise, wie neue therapeutische Ziele und Arzneimittelkandidaten entdeckt und entwickelt werden, zu verändern.

Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologien wurden kürzlich kombiniert, um humanrelevante Darmchips zu erzeugen, die geeignet sind, die funktionellen Aspekte der Darmphysiologie und Pathophysiologie in vitro zu untersuchen. Organoide, die aus den Biopsien des Dünndarms (Zwölffingerdarm) und des Dickdarms gewonnen werden, werden in das obere Kompartiment eines Organchips gesät und dehnen sich dann erfolgreich als Monoschichten aus, während die unterschiedlichen zellulären, molekularen und funktionellen Merkmale jeder Darmregion erhalten bleiben. Gewebespezifische mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Darms werden in das untere Kompartiment des Organchips integriert, um die epithelial-endotheliale Schnittstelle nachzubilden. Diese neuartige Plattform erleichtert die luminale Exposition gegenüber Nährstoffen, Medikamenten und Mikroorganismen und ermöglicht Untersuchungen des Darmtransports, der Permeabilität und der Wirt-Mikroben-Interaktionen.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von Darmchips, die den menschlichen Zwölffingerdarm (Zwölffingerdarmchip) und Dickdarm (Dickdarmchip) darstellen, und deren anschließende Kultur unter kontinuierlicher Strömung und peristaltisartigen Verformungen bereitgestellt. Wir demonstrieren Methoden zur Beurteilung des Arzneimittelstoffwechsels und der CYP3A4-Induktion im Zwölffingerdarmchip anhand prototypischer Induktoren und Substrate. Schließlich bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die In-vitro-Modellierung von Interferon-gamma (IFNγ)-vermittelter Barrierestörung (Leaky-Gut-Syndrom) in einem Dickdarmchip an, einschließlich Methoden zur Bewertung der Veränderung der parazellulären Permeabilität, Veränderungen der Zytokinsekretion und transkriptomischer Profilierung der Zellen innerhalb des Chips.

Introduction

Der menschliche Darm ist ein komplexes und multitaskingfähiges Organ, das sich selbst regenerieren kann. Es ist in den Dünn- und Dickdarm unterteilt. Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht darin, die aus dem Magen kommende Nahrung weiter zu verdauen, alle Nährstoffe aufzunehmen und die Rückstände an den Dickdarm weiterzugeben, der das Wasser und die Elektrolyte zurückgewinnt. Der Dünndarm ist weiter in mehrere anatomisch unterschiedliche Regionen unterteilt: Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum, von denen jede angepasst ist, um bestimmte Funktionen zu erfüllen. Zum Beispiel hilft der Zwölffingerdarm, den Speisebrei (Mageninhalt) abzubauen, um die richtige Aufnahme von Nährstoffen mit Proteinen, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralien im Jejunum zu ermöglichen. Dieser proximale Teil des Dünndarms ist auch der Hauptort der intestinalen Arzneimittelabsorption und des Metabolismus und zeichnet sich durch die höhere Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (z. B. CYP3A4) im Vergleich zu ihrer Expression im Ileum und Dickdarm1 aus. Zusätzlich zu seiner Hauptrolle bei der Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen ist der Darm auch eine wirksame Barriere gegen potenziell schädliche luminale Inhaltsstoffe wie pathogene Mikroorganismen, mikrobielle Metaboliten, diätetische Antigene und Toxine 2,3. Es ist bemerkenswert, dass der menschliche Dickdarm von einer großen Anzahl von Mikroorganismen bewohnt wird, die weit über die der gesamten Zellen im menschlichen Körper hinausgehen, die viele Vorteile für Ernährung, Stoffwechsel und Immunität bieten. Daher ist die Aufrechterhaltung der Integrität der Schleimhautbarriere, die von Darmepithelzellen gebildet wird, entscheidend für die symbiotische Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und den Wirtszellen, indem sie physisch getrennt werden, um eine unnötige Aktivierung von Immunzellen zu vermeiden2. Darüber hinaus spielt der programmierte Darmzelltod eine wesentliche Rolle als Selbstschutzmechanismus, der verhindert, dass infizierte Zellen persistieren oder sich vermehren - wodurch potenzielle Krankheitserregerverbreitet werden 3 -, während die kontinuierliche Selbsterneuerung des Darmepithels alle vier bis sieben Tage den Zellverlust kompensiert und die Barriereintegrität und Gewebehomöostase sicherstellt. Beeinträchtigungen der beschriebenen Darmfunktionen, einschließlich Nährstoffaufnahme, Barriereintegrität oder Ungleichgewicht beim Tod und der Selbsterneuerung von Darmzellen, können zur Entwicklung einer Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen führen, einschließlich Unterernährung und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)2,3.

Zuvor wurden Tiermodelle und transformierte Krebs-abgeleitete Darmzelllinien verwendet, um die physiologischen und pathophysiologischen Funktionen des menschlichen Darmgewebes zu untersuchen. Immer deutlichere Bedenken hinsichtlich der Übertragbarkeit von Tierversuchen auf den Menschen, die durch das Vorhandensein erheblicher Unterschiede zwischen den beiden Arten verursacht werden, unterstrichen jedoch die Notwendigkeit humanrelevanter Alternativmethoden4. Zu den häufig verwendeten In-vitro-Darmzelllinien gehören T84-, Caco-2- und HT29-Zellen. Während sie bestimmte Aspekte der Darmbarrierefunktion und des Membrantransports nachahmen, sind sie durch eine veränderte Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen5, Oberflächenrezeptoren und Transportern4 gekennzeichnet. Darüber hinaus fehlt es ihnen an Spezifität des Darmsegments und sie können die Komplexität des Darmepithels nicht rekapitulieren, wobei jedes Modell nur einen der fünf im Darm vorhandenen Epithelzelltypen enthält6.

Kürzlich wurden humane Darmorganoidkulturen, die aus frischen Biopsien des Dünndarms und des Dickdarms7,8 oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)9 hergestellt wurden, als alternative experimentelle Modelle mit dem Potenzial eingeführt, Tierversuche in Zukunft zu ergänzen, zu reduzieren und vielleicht zu ersetzen. Während iPS-Zellen auf nicht-invasive Weise erhalten werden können, erfordert die Etablierung von Organoiden aus iPS-Zellen die Verwendung komplexer und langwieriger Protokolle (mit mehreren experimentellen Schritten) und erzeugt Kulturen, die menschlichem fötalem Gewebe ähneln. Im Gegensatz dazu sind Biopsie-abgeleitete Organoide hochgradig skalierbar, da sie die inhärente Erneuerungskapazität von Darmgewebe nutzen können und auf unbestimmte Zeit in vitro durchgangen und vermehrt werden können. Wichtig ist, dass Biopsie-abgeleitete Organoide die krankheits- und darmregionenspezifischen Eigenschaften des primären Gewebes, aus dem sie entwickelt wurden, beibehalten und die zelluläre Vielfalt des Darmepithels nachahmen. Organoide können als patientenspezifische Avatare in vitro verwendet werden, um die Biologie und Pathogenese verschiedener Magen-Darm-Erkrankungen zu entschlüsseln und ihr therapeutisches Management zu verbessern. Obwohl Darmorganoide einen beeindruckenden Grad an physiologischer Funktionalität erreicht haben, können sie die Komplexität der nativen Organe aufgrund ihres Mangels an kritischen Stromakomponenten - einschließlich Blutgefäßen, Bindegewebe, peripheren Nerven und Immunzellen - sowie der mechanischen Stimulation immer noch nicht reproduzieren. Es ist bekannt, dass mechanische Parameter wie Strömung, Scherspannung, Dehnung und Druck die Morphogenese und Homöostase des Gewebes in vivo beeinflussen und in vitro 10,11,12,13 die Reifung von Zellen verbessern. Ein weiterer wichtiger Nachteil von Organoidsystemen ist die Unzugänglichkeit des Lumens und damit der apikalen Seite des Epithels. Dies stellt eine Herausforderung für die Untersuchung verschiedener Mechanismen dar, die mit der polarisierten Expression von Ionen- und Arzneimitteltransportern, Wirt-Mikrobiom-Interaktionen und pharmazeutischen Toxizitätstests verbunden sind. Schließlich leiden Organoidkulturen aufgrund der stochastischen Natur des In-vitro-Selbstorganisationsprozesses und der Wahl des Zellschicksals unter erhebliche Variabilität in Größe, Morphologie und Funktion. Um das volle Potenzial von Darmorganoiden in der Krankheitsmodellierung, im Arzneimittelscreening und in der regenerativen Medizin auszuschöpfen, ist es daher notwendig, neue Strategien zu erforschen, die die Variabilität in der Organoidentwicklung reduzieren, den Zugang zum luminalen Kompartiment verbessern und fehlende Zell-Zell-Interaktionen einbeziehen.

Die Organ-on-a-Chip-Technologie hat viele Techniken zur Integration mechanischer Kräfte und des Flüssigkeitsflusses in Darmzellkulturen in vitro eingeführt. Da jedoch die meisten der ersten Proof-of-Concept-Studien Krebszelllinien verwendet haben, die keine ausreichende zelluläre Vielfalt aufwiesen, wurde die Relevanz dieser Systeme in Frage gestellt. Vor kurzem haben wir intestinale Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologie synergetisch kombiniert, um die besten Eigenschaften jedes Ansatzes in ein In-vitro-System zu integrieren 14,15,16. Der resultierende Darm-Chip rekapituliert die multizelluläre Architektur des Darmepithels, das Vorhandensein einer epithelial-endothelialen Gewebeschnittstelle und die mechanischen Kräfte des Flüssigkeitsflusses und der Dehnung, was die Emulation von Funktionen auf Organebene in vitro ermöglicht. Darüber hinaus erhöht die Verwendung von aus Primärgewebe gewonnenen Organoiden (die aus verschiedenen Regionen des menschlichen Darms entnommen werden können) als Ausgangsmaterial die Vielseitigkeit dieses Modells, da Chips, die den menschlichen Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm darstellen, nach ähnlichen Aussaat- und Kulturverfahren etabliert werden können. Wichtig ist, dass Darm-Chips eine Echtzeit-Bewertung von: der Integrität der Darmbarriere ermöglichen; Aktivität der Bürstengrenze und der Arzneimittelstoffwechselenzyme; Erzeugung von Mucinen; Sekretion von Zytokinen; und Interaktion von Darmzellen mit pathogenen und kommensalen Mikroorganismen, wie in den zuvor veröffentlichten Berichten gezeigt. Insbesondere als Darmchips mit Organoiden aus dem Gewebe verschiedener Individuen hergestellt wurden, erfassten diese Modelle die erwartete Variabilität zwischen den Spendern in den funktionellen Reaktionen auf verschiedene Medikamente und Behandlungen. Insgesamt öffnet die Verschmelzung von Organoiden mit der Organ-on-a-Chip-Technologie die Tür zu fortschrittlicheren, personalisierten, in vivo relevanten Modellen, die die physiologische Relevanz und Genauigkeit der In-vitro-Befunde sowie deren Extrapolation auf den Menschen verbessern könnten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung des Darmchips und seiner Anwendung in den Studien der physiologischen Funktionen der beiden Darmsegmente Zwölffingerdarm und Dickdarm vorgestellt. Zunächst werden die Methoden zur Beurteilung der Aktivität des arzneimittelmetabolisierenden Enzyms CYP3A4 im Zwölffingerdarmchip sowie dessen Induktion durch prototypische Verbindungen wie Rifampicin und Vitamin D3 beschrieben. Zweitens sind die Schritte, die erforderlich sind, um den "undichten Darm" im Dickdarmchip zu modellieren, im Protokoll beschrieben, wobei die Störung der Epithelbarriere unter Verwendung von charakteristischen Zytokinen durchgeführt wird, die an der Pathogenese der IBD beteiligt sind. Kurz gesagt, Organoide, die aus menschlichen Biopsien gewonnen werden, werden in vitro vermehrt, einer enzymatischen Verdauung unterzogen und in den oberen Kanal des Chips eingeführt. Bei kontinuierlicher Perfusion mit wachstumsfaktorangereicherten Medien entwickeln sie sich zu einer konfluierenden epithelialen Monoschicht mit 3D-Architektur und einer leicht zugänglichen apikalen Zelloberfläche. Das untere, "vaskuläre" Chipkompartiment ist mit mikrovaskulären Endothelzellen bestückt, die aus dem Dünn- oder Dickdarm isoliert sind. Epithel und Endothel sind durch eine poröse dehnbare Membran getrennt, die die parakrinen Wechselwirkungen zwischen den beiden Geweben erleichtert und bei zyklischen Verformungen peristaltisähnliche Bewegungen des menschlichen Darms nachahmt. Die Kokultur wird unter den dynamischen Strömungsbedingungen gehalten, die durch luminale und vaskuläre Perfusion mit geeigneten Zellkulturmedien erzeugt werden. Schließlich beschreiben wir zahlreiche Arten von Assays und Endpunktanalysen, die direkt auf dem Chip oder aus entnommenen Zellkulturabwässern durchgeführt werden können.

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Protocol

HINWEIS: Alle Zellkulturen sollten mit einer geeigneten aseptischen Technik gehandhabt werden.

Die in dieser Studie verwendeten humanen Darmorganoide wurden von der Johns Hopkins University bezogen und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit genehmigten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle experimentellen Protokolle wurden vom Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329) genehmigt.

1. Herstellung der Zellkulturreagenzien

  1. Bereiten Sie das menschliche Organoid-Wachstumsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialverzeichnis) vor und ergänzen Sie es mit 100 μg / ml Primocin.
  2. Bereiten Sie das Wachstumsmedium für humane mikrovaskuläre Endothelzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialverzeichnis) vor und ergänzen Sie es mit 1:20 vol/vol FBS und 50 μg/ml anstelle von 100 μg/ml primocin.
  3. Resuspendiert Y-27632 (Rho-Kinase-Inhibitor) in sterilem 0,1% BSA in DPBS, um eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Aliquot in sterile Mikroröhrchen geben und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.
  4. Resuspendiert CHIR99021 (GSK-3-Inhibitor) in sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 5 mM Stammlösung herzustellen. Aliquot in sterile Mikroröhrchen geben und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.
  5. Bereiten Sie die humane Organoid-Verdauungslösung vor, indem Sie eine 1:1-vol/vol-Organoid-Dissoziationslösung (Table of Materials) mit DPBS-Lösung (Table of Materials) mischen und mit 10 μM Stammlösung von Y-27632 ergänzen. Dieses Reagenz muss für jede Verwendung frisch hergestellt werden.

2. Kultur menschlicher intestinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HIMECs)

  1. Initiieren Sie die HIMEC-Kultur (Table of Materials) 7 Tage vor der Aussaat auf den Chip. Nur HIMECs in der Passage 1-6 können für die Chipsaussaat verwendet werden.
  2. Fügen Sie 5 ml der Befestigungsfaktorlösung (Table of Materials) zu einem T150-Kolben hinzu; Bei 37 °C für 1 min inkubieren und die Lösung entsorgen.
  3. 19 ml Endothelzell-Wachstumsmedium, vorerwärmt bei Raumtemperatur (siehe Schritt 1.2), in den Kolben geben.
  4. Tauen Sie eine gefrorene Durchstechflasche HIMEC (2 Millionen Zellen/Durchstechflasche) in einem 37 ° C warmen Wasserbad auf.
  5. Übertragen Sie den Inhalt der Durchstechflasche in den Kolben und schaukeln Sie den Kolben vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie den Kolben über Nacht in einen 37 ° C-Inkubator, damit die Endothelzellen anhaften können.
  6. Ersetzen Sie das Medium durch 20 ml Endothelzell-Wachstumsmedium, das am nächsten Tag bei Raumtemperatur vorerwärmt ist, und danach alle 3 Tage. Kulturen sollten 90% des Zusammenflusses am Tag der Zellernte für Chip-Experimente erreichen.

3. Mikrofabrikation und Vorbereitung des Chips

  1. Holen Sie sich Chips von einem kommerziellen Lieferanten (Table of Materials). Packen Sie die Chips aus und positionieren Sie sie in der Chipswiege in einer quadratischen Petrischale (Table of Materials). Beschriften Sie die Vorderseite jedes Chipträgers mit den experimentellen Bedingungen (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Während das vorgestellte Protokoll auf der Verwendung eines bestimmten kommerziell erhältlichen Chips und einer bestimmten Instrumentierung beruht, gibt es mehrere mikrofluidische Geräte, die von verschiedenen Anbietern angeboten werden, die möglicherweise alternative Vorteile bieten, aber nicht in der Lage sind, Stretch zu integrieren. Darüber hinaus kann die Mikrofabrikation der Organs-on-Chips "im Haus" nach den in Huh et al.21 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

4. Aktivierung und ECM-Beschichtung der Membran

  1. Vorbereitung der Aktivierungslösung
    1. Bringen Sie die ER-1- und ER-2-Reagenzien (Materialtabelle) vor Gebrauch auf Raumtemperatur, um sich auszugleichen. ER-1 ist lichtempfindlich und muss im Dunkeln gehandhabt werden.
    2. Rekonstituieren Sie ER-1 in 10 ml ER-2-Reagenz, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erreichen und zu bestätigen, dass das ER-1 vollständig gelöst ist.
  2. Oberflächenaktivierung
    1. Drücken Sie 50 μL der ER-1-Lösung vorsichtig durch beide Kanäle des Chips (Abbildung 1A).
    2. Entfernen Sie überschüssige ER-1-Lösungen mit einem Aspirator von der Oberfläche des Chips.
    3. Überprüfen Sie die Chips, um sicherzustellen, dass alle Chips die ER-1-Lösung erhalten haben. Im Falle von Luftblasen führen Sie mehr ER-1-Lösung ein, bis die Blasen vollständig entfernt sind.
    4. Die Chips in der UV-Lampenkammer (Table of Materials) für 15 min inkubieren. Vergewissern Sie sich, dass die UV-Lampe auf die Einstellung "Konsistent" eingestellt ist.
    5. Bringen Sie die ER-1-aktivierten Chips zurück in die Biosicherheitskabine (BSC). Extrahieren Sie die ER-1-Lösung aus beiden Kanälen. Waschen Sie alle Rückstände der ER-1-Lösung mit 200 μL ER-2.
    6. Drücken Sie 200 μL sterile Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DBPS) durch die Kanäle (Table of Materials) und lassen Sie DBPS bis zum nächsten Schritt in den Kanälen.
  3. Herstellung von extrazellulärer Matrix (ECM) und Membranbeschichtung
    1. Aufbereitung von Lagerlösungen von ECM-Komponenten
      1. Rekonstituieren Sie Kollagen IV (Tabelle der Materialien) und Fibronektin (Tabelle der Materialien) unter Verwendung von sterilem Zellkulturwasser (Tabelle der Materialien) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml. Aliquots vorbereiten und bis zur Verwendung bei -20°C lagern.
    2. Herstellung einer ECM-Arbeitslösung für die Membranbeschichtung
      1. Bereiten Sie 1,5 ml jeder ECM-Lösung für den oberen und unteren Kanal für jeweils 12 zu beschichtende Chips vor. Die ECM-Lösung sollte immer kurz vor dem Einsatz vorbereitet werden.
      2. Für den oberen Kanal mischen Sie Kollagen IV und solubilisierte Basalmembranmatrix (BMM) (Table of Materials) in sterilem kaltem DBPS bei 200 μg / ml bzw. 100 μg / ml. Für den unteren Kanal Collagen IV und Fibronektin in sterilen kalten DPBS bei 200 μg/ml bzw. 30 μg/ml mischen.
    3. ECM-Beschichtung der Chips
      1. Saugen Sie den DBPS von beiden Kanälen der Chips ab und ersetzen Sie ihn durch die entsprechende ECM-Arbeitslösung für jeden Kanal (Abbildung 1A).
      2. Prüfen Sie jeden Chip, um sicherzustellen, dass er die Beschichtungslösung erhalten hat. Im Falle von Luftblasen drücken Sie mehr Beschichtungslösung durch, bis alle Blasen vollständig entfernt sind.
      3. Sterile DPBS in die Chipswiege geben und die Petrischale mit den Chips in einen 37 °C Inkubator stellen. Inkubieren Sie über Nacht, damit die ECM-Proteine Ionenbindungen mit der aktivierten PDMS-Membran eingehen können. Auf Wunsch können die Zellen jederzeit zwischen 2 h und 1 Tag nach der Beschichtung der Chips ausgesät werden. Alternativ können beschichtete Chips über Nacht bei 4 °C gelagert werden, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 37 °C und einer Chipsaussaat.

5. Aussaat von intestinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HIMECs) im unteren Kanal des Chips

HINWEIS: Dünndarm- und Dickdarm-HIMECs werden im unteren Kanal des Zwölffingerdarms bzw. des Dickdarmchips ausgesät.

  1. Chips vorbereiten
    1. Übertragen Sie die ECM-beschichteten Chips an das BSC. Saugen Sie die ECM-Beschichtung vorsichtig aus beiden Kanälen der Chips ab und waschen Sie dann beide Kanäle mit 200 μL Organoid-Wachstumsmedium bzw. Endothelzell-Wachstumsmedium.
    2. Lagern Sie die gewaschenen Chips in einem 37 ° C-Inkubator, bis Sie mit der Aussaat der Endothelzellen fortfahren.
  2. Ernten Sie die Endothelzellen
    1. Bringen Sie den HIMEC-Kulturkolben zum BSC und waschen Sie ihn mit sterilem DPBS.
    2. Geben Sie 3 ml Dissoziationslösung in den Kolben und legen Sie sie für 2 Minuten in den 37 ° C-Inkubator, um eine vollständige Zellablösung zu ermöglichen.
    3. Sammeln Sie die Zellen in einer 15 ml konischen Röhre und fügen Sie Endothelzellwachstumsmedien hinzu, bis sie 10 ml erreichen. Probe 15-20 μL der Zellsuspension für die Zellzählung. Zentrifuge bei 150 x g für 5 min.
    4. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren Sie die HIMECs auf eine Dichte von 8-10 x 106 Zellen / ml in Endothelzellwachstumsmedien.
  3. Samen Sie Endothelzellen in den unteren Kanal des Chips
    1. Bringen Sie die Petrischale mit den Chips zum BSC und entfernen Sie vorsichtig alle Medien aus dem unteren Kanal mit einer 1.000-μL-Pipette.
    2. Führen Sie 10-15 μL der HIMEC-Suspension in den unteren Kanal des Chips ein. Prüfen Sie den Chip direkt nach der Aussaat, um eine optimale Aussaatdichte (80%-90% der Abdeckung) und eine homogene Zellverteilung innerhalb des Kanals sicherzustellen (Abbildung 1D). Wenn die Aussaatdichte höher oder niedriger als erwartet oder ungleichmäßig ist, waschen Sie den Kanal 2x mit 200 μL Endothelzellwachstumsmedien und wiederholen Sie den Aussaatvorgang.
    3. Drehen Sie die Petrischale sofort nach dem Aussäen jeder Charge von sechs Chips um, damit Endothelzellen an der Unterseite der PDMS-Membran befestigt werden können. Legen Sie die Petrischalen für 30 min bis 1 h in den 37 °C-Inkubator oder bis die HIMECs im unteren Kanal an der Membran befestigt sind (Abbildung 1D).
  4. Chips waschen
    1. Drücken Sie vorsichtig 200 μL Endothelzell-Wachstumsmedien durch den unteren Kanaleinlass, um nicht gebundene Zellen zu entfernen und die Nährstoffe in den Medien wieder aufzufüllen.
    2. Waschen Sie die Zellen, die nicht im oberen Kanal befestigt waren, mit 200 μL Organoid-Wachstumsmedium ab, ergänzt durch 5 μM CHIR99021 und 10 μM Y-27632.
    3. Legen Sie die Chips in den 37°C-Inkubator, bis Sie mit der Epithelzellaussaat fortfahren.

6. Aussaat von Organoidfragmenten im oberen Kanal des Chips

HINWEIS: Organoide, die aus Biopsien verschiedener Darmregionen isoliert wurden, können im Darmchip7 kultiviert werden. Befolgen Sie die in Fujii et al. beschriebenen Verfahren zur Isolierung menschlicher Darmkrypten und zur Etablierung von Organoidkulturen22. Hier werden Zwölffingerdarm- und Kolonorganoide verwendet, um die Zwölffingerdarm- bzw. Dickdarmchips zu erzeugen. Angesichts der hohen Batch-to-Batch- und Donor-to-Donor-Variabilität bei der Organoidbildung und dem Organoidwachstum wird empfohlen, eine Pilotbewertung der Zelldichte in der Organoid-Suspensionskultur (24-Well-Plattenformat) durchzuführen, um die optimale Seeding-Dichte von 8 Millionen Zellen / ml zu erreichen.

  1. Pilotauswertung der Zellzahlen/Vertiefung der statischen Organoidkultur.
    HINWEIS: Das folgende Verfahren dient ausschließlich dazu, die Anzahl der Vertiefungen der organoiden Suspensionskultur zu bestimmen, die für die Chipsaussaat erforderlich sind. Die resultierenden Einzelzellen sollten nicht für die Chip-Aussaat verwendet werden.
    1. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus drei Vertiefungen der Organoid-Kulturplatte ab. Geben Sie 500 μL eiskalte BMM-Dissoziationslösung (Table of Materials) zu jeder Vertiefung und verwenden Sie einen Kunststoffschaber, um das gelöste BMM vom Kunststoff zu lösen.
    2. Sammeln Sie die organoide Suspension in einem sterilen konischen Röhrchen mit niedriger Proteinbindung mit einer eiskalten 1.000 μL-Pipette. 60 min auf Eis inkubieren und alle 15 min durch sanftes Schütteln der Tube mischen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4°C.
    3. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu. Inkubieren Sie bei 37 ° C für 30 Minuten, um die Organoide auf Einzelzellebene zu verdauen, und fügen Sie 10 ml vollständiges Organoid-Wachstumsmedium hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4°C.
    4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml vollständigem Organoid-Wachstumsmedium und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämatoktometer nach Standardmethoden.
  2. Herstellung von Organoidfragmenten und deren Aussaat im Chip
    HINWEIS: Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um Zwölffingerdarm- oder Kolonorganoide im oberen Kanal des Chips zu säen. Die Etablierung einer epithelialen Monoschicht mit einer in vivo relevanten 3D-Zytoarchitektur ist abhängig von der Anwesenheit von Flow15,23 und einer erfolgreichen Aussaat von Organoidfragmenten.
    1. Das Medium wird vorsichtig aus der Anzahl der Vertiefungen der statischen Organoidkultur abgesaugt, was ausreicht, wie in Schritt 6.1 bestimmt, um eine endgültige Aussaatdichte von 8 Millionen Zellen/ml zu erreichen. Geben Sie 500 μL eiskalte BMM-Dissoziationslösung zu jeder Vertiefung.
    2. Lösen Sie das gelöste BMM mit einem Kunststoffschaber oder einer 1.000-μL-Pipette von der Oberfläche der Vertiefungen. Sammeln Sie die Suspension in einem 15 ml proteinarmen konischen Röhrchen.
    3. Lagern Sie die Suspension 60 Minuten lang auf Eis und mischen Sie alle 15 Minuten, indem Sie die Tube vorsichtig schütteln. Fahren Sie mit der Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C fort. Ein gut definiertes Organoid-Pellet sollte nach der Zentrifugation sichtbar sein. Wenn eine transparente Gelschicht über dem Zellpellet (Rückstände von gelöstem BMM) beobachtet wird (Abbildung 1B), fahren Sie mit den folgenden Schritten fort.
      1. Mischen Sie den Überstand und das Zellpellet und fügen Sie ein gleiches Volumen BMM-Dissoziationslösung in die Tube hinzu. Vorsichtig mischen und für weitere 10 Minuten auf Eis lagern und mit der Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C fortfahren.
      2. Wiederholen Sie bei Bedarf Schritt 6.2.3.1, bis keine gelösten BMM-Rückstände vorhanden sind.
    4. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Organoidpellet mit Organoid-Aufschlusslösung (siehe Schritt 1.5). Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen an Organoid-Aufschlusslösung, um ein vollständiges Eintauchen des Pellets sicherzustellen. 2 ml Lösung eignen sich für ca. 2.400-12.000 mittelgroße Organoide (Abbildung 1D, Post-Seeding). Bei 37°C für 1-3 min inkubieren.
    5. Fügen Sie Advanced DMEM/F-12 in die Röhre ein, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Verwenden Sie das Vierfache des Volumens der verwendeten Aufschlusslösung. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4°C.
    6. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Organoidfragment-Pellet in einem vollständigen Organoid-Wachstumsmedium, ergänzt mit 5 μM CHIR99021 und 10 μM Y-27632, um 8 Millionen Zellen / ml zu erreichen. Bereiten Sie 360 μL Aliquots der Suspension in sterilen 1,5 mL Low-Protein-Bindungsröhrchen vor, um die Verringerung der Zelldichte aufgrund der Befestigung an den Wänden zu verhindern.
    7. Entfernen Sie das Medium aus dem oberen Kanal der beschichteten Chips. Fügen Sie 30 μL Zellsuspension in den oberen Kanal jedes Chips hinzu. Die Chips werden über Nacht in einem 37 °C-Inkubator inkubiert, damit die Organoidfragmente an der ECM-beschichteten Membran haften können (Abbildung 1D).

7. Dynamische Kultur des Darmchips - Initiierung und Aufrechterhaltung von Strömungs- und Peristaltik-ähnlichen Bewegungen

  1. Medienaufbereitung und -entgasung
    1. Um einen konstanten laminaren Fluss durch den Chip aufrechtzuerhalten, lassen Sie die Medientemperatur auf Raumtemperatur ausgleichen und unterziehen Sie sie dann einer vakuumgetriebenen Filtration für 10 Minuten mit einer Vakuumpumpe und PVDF-Filterkonikrohren (Medienentgasung).
  2. Grundierung von portablen Modulen
    HINWEIS: Tragbare Module sind Reservoirs, die als Schnittstelle zwischen den Chips und dem Kulturmodul fungieren und die wiederholte Probenahme und Dosierung von Medien ermöglichen.
    1. Öffnen Sie die tragbaren Module im BSC und legen Sie sie auf die Kulturmodulschalen, bei denen es sich um spezielle Behälter für die Ausrichtung der tragbaren Module handelt.
    2. 3 ml voräquilibriertes vollständiges organoides Wachstumsmedium, ergänzt mit 5 μM CHIR99021 und 10 μM Y-27632 in das obere Einlassreservoir und 3 ml voräquilibriertes Endothelzellwachstumsmedium im unteren Einlassreservoir (Abbildung 1C). Geben Sie 300 μL des gleichen Mediums in die jeweiligen Auslassbehälter.
    3. Bringen Sie die Schalen in den 37 °C-Inkubator und schieben Sie sie in das Kulturmodul (Abbildung 1C). Verwenden Sie Bedienelemente auf dem Bildschirm des Kulturmoduls, um den "Prime Cycle" (1 min lang) auszuführen. Wenn in der Statusleiste "Bereit" angezeigt wird, ist der Prime Cycle abgeschlossen. Wiederholen Sie den Prime Cycle, um sicherzustellen, dass sich genügend Tröpfchen gebildet haben, um die Chips erfolgreich anzuschließen.
    4. Stellen Sie sicher, dass alle tragbaren Module grundiert sind und sichtbare Medientröpfchen aufweisen.
  3. Einführung der Strömung
    HINWEIS: Der Fluss wird typischerweise 24 Stunden nach dem Aussäen von Organoidfragmenten eingeleitet, damit sich die Darmepithelzellen fest an die Membran anheften können.
    1. Waschen Sie beide Kanäle der ausgesäten Chips mit 200 μL des jeweiligen Mediums, um Blasen oder Zellablagerungen zu entfernen. Lassen Sie nach dem Waschen kleine Medientröpfchen auf den Anschlüssen. Schieben Sie den Chipträger in das tragbare Modul (Abbildung 1C).
    2. Legen Sie die tragbaren Module auf die Trays und dann in das Kulturmodul. Verwenden Sie die Bedienelemente auf dem Bildschirm des Kulturmoduls, um die entsprechenden Organchip-Kulturbedingungen (Durchflussrate und Dehnung) zu programmieren.
      HINWEIS: Stellen Sie für die Standardbedingungen für Zwölffingerdarm- und Dickdarmchipkulturen die Durchflussrate auf 30 μL/h15 bzw. 60 μL/h16 ein, sowohl für den oberen als auch für den unteren Kanal. Die Durchflussraten für jeden Kanal werden jedoch unabhängig voneinander gesteuert und können zwischen 0-1.000 μL/h eingestellt werden. Anstelle der hier vorgestellten Kulturmodule können Spritzen- oder Peristaltikpumpen verwendet werden, um mikrofluidische Chips mit laminarer Strömung zu versehen. Der Aufbau zuverlässiger fluidischer Verbindungen zwischen Chips und Pumpen unter Verwendung von Schläuchen und Steckverbindern kann jedoch eine technische Herausforderung darstellen, wenn eine gleichzeitige Durchblutung mehrerer Chips erforderlich ist.
    3. Starten Sie den "Regulated Cycle" (2 h lang), der die Kulturmedien in tragbarem Modul und Chip unter Druck setzt, um die Keimbildung der Luftblasen zu verhindern. Die programmierten Bedingungen werden nach Abschluss des Regelzyklus wieder aufgenommen.
  4. Medienwandel
    1. Bereiten Sie frische Medien für beide Kanäle vor und füllen Sie sie alle 48 Stunden auf, indem Sie 2 ml frisches Medium in die Einlassbehälter geben (Abbildung 1C).
    2. Pausieren Sie die Kulturmodule und bringen Sie die Trays zu BSC. Aspirieren Sie Medien in allen Reservoirs und füllen Sie sie mit frischen Medien auf. Bringen Sie die Trays zurück und starten Sie den Flow neu.
  5. Einführung von Stretch
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen vor der Anwendung des zyklischen Stammes auf 100% Konfluenz wachsen. Stretch wird typischerweise 3 Tage nach der Aussaat oder 48 h nach Beginn der fluidischen Kultur eingeführt. 2% zyklische Belastung bei der Frequenz von 0,2 oder 0,15 Hz, für den Zwölffingerdarm11 bzw. Dickdarm 24 Darmchip, wird für die anfänglichen24 h angewendet. Es wird dann für die verbleibende Dauer der Darmchipkultur weiter auf 10% erhöht, um dem zyklischen Stamm der Darmepithelzellen in vivo sehr ähnlich zu sein (Abbildung 1D)25. Das Kulturmodul kann die Anwendung von 2%-12% zyklischer Dehnung und Frequenz von bis zu 0,4 Hz unterstützen.
    1. Um Stretch in die laufende fluidische Kultur einzuführen, pausieren Sie das Kulturmodul. Ändern Sie mithilfe der Steuerelemente auf dem Bildschirm die Dehnungseinstellungen auf 2 % Dehnung, 0,2 oder 0,15 Hz und starten Sie das Kulturmodul neu.
    2. Wiederholen Sie nach 24 h Schritt 7.5.1, um eine 10%ige Dehnung, eine Frequenz von 0,2 oder 0,15 Hz anzuwenden.

8. CYP450-Induktion mit prototypischen CYP-Induktoren im Zwölffingerdarm-Chip

HINWEIS: Der Induktionsassay Cytochrom P450 (CYP450) ermöglicht die Beurteilung, ob die Testverbindung die mRNA-Spiegel und/oder die katalytische Aktivität spezifischer CYP450-Enzyme erhöht. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Bewertung der CYP3A4-Induktion durch den Industriestandard und die von den Reglern empfohlenen In-vitro-CYP-Induktoren , Rifampicin (RIF) und 1,2-Dihydroxy-Vitamin D3 (VD3). Die vorgestellte Methode kann verwendet werden, um das Potenzial verschiedener Testverbindungen zu identifizieren, verschiedene Isoformen von CYP450 im menschlichen Darmgewebe zu induzieren. Für jede zu bewertende Enzymisoform müssen spezifische Sätze von Primern und Sondensubstrat ausgewählt werden.

  1. Exposition gegenüber CYP-Induktoren
    1. Bereiten Sie Lagerlösungen von 20 mM RIF, 100 mM VD3 und 200 mM Testosteron (Table of Materials) mit sterilem DMSO vor.
      ACHTUNG: Testosteron ist eine kontrollierte Substanz der Liste III. Befolgen Sie die regulatorischen Verfahren während der Handhabung.
    2. Bereiten Sie Dosiermedien mit CYP-Induktoren vor, indem Sie die Stammlösungen in vollständigem Organoid-Wachstumsmedium und Endothelzell-Wachstumsmedium verdünnen, um 20 μM RIF, 100 nmol/L VD3 zu erreichen. Bereiten Sie die Fahrzeugkontrolle vor, indem Sie DMSO in den jeweiligen Medien verdünnen, um 0,1% des DMSO zu erreichen.
    3. Pausieren Sie das Kulturmodul und bringen Sie die Trays zu BSC. Ersetzen Sie die Medien in allen Einlassbehältern durch 2 ml Dosiermedien mit Induktoren oder Fahrzeugsteuerung. Bringen Sie die tragbaren Module zurück zum Kulturmodul und starten Sie den Durchfluss mit 30 μL/h neu.
    4. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Medium durch eine induzierende Lösung, und wiederholen Sie die Schritte 8.1.2-8.1.3. Induzierende Lösungen sollten täglich frisch zubereitet und im Laufe des Experiments, das typischerweise 48-72 h lang ist, alle 24 h aufgefüllt werden.
  2. Inkubation mit einem prototypischen Substrat (Testosteron)
    1. Bereiten Sie am Tag der Ernte die Sondensubstratlösung von Testosteron zusammen mit den entsprechenden Induktoren in Advanced DMEM/F12 vor, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten. Lassen Sie die Zugabe des Serums zu den Medien weg, da dies die LCMS-Analyse beeinträchtigen kann.
    2. Bringen Sie die Schalen zu BSC und saugen Sie das Dosiermedium aus allen Behältern ab. Waschen und ersetzen Sie die oberen und unteren Einlassbehälter durch warmes Advanced DMEM/F12-Medium bzw. Endothelzell-Wachstumsmedium.
    3. Entfernen Sie das Waschmedium aus den Behältern und ersetzen Sie es durch 1 ml Sondensubstratlösung, die in Schritt 8.2.1 vorbereitet wurde. Perfundieren Sie die Späne mit einer hohen Durchflussrate von 1.000 μL/h für 5 min und saugen Sie sowohl die oberen als auch die unteren Auslassbehälter ab. Die Chips werden in das Kulturmodul zurückgeführt und 1 h unter dem konstanten Fluss von 300 μL/h inkubiert.
  3. Datenanalyse
    1. Probenentnahme für die LCMS-Analyse
      1. Aliquot 200 μL Stopplösung, die Acetonitril mit 0,1% Ameisensäure enthält, in vormarkierten 1,5 ml-Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Die Zusammensetzung der LCMS-Stopplösung kann je nach zu analysierendem Substrat variieren.
      2. Nachdem 1 Stunde der Behandlung abgeschlossen ist, stoppen Sie den Fluss und bringen Sie die Schalen zurück zu BSC. Sammeln Sie 100 μl Abwasser aus dem oberen Auslassbehälter und fügen Sie es dem entsprechenden Röhrchen hinzu, das die Stopplösung enthält (Abbildung 2A). Stellen Sie die Röhren sofort auf Trockeneis. Lagern Sie die Proben bei -80 ° C, bevor Sie mit der Analyse fortfahren.
      3. Extrahieren und analysieren Sie Proben entweder mit HPLC- oder LC-MS / MS-Techniken und überwachen Sie die Bildung von Metabolit-6β-hydroxytestosteron (6β-OH-T). Die CYP-Enzymaktivität kann als pmol/min/mg-Protein ausgedrückt werden, wobei sich pmol auf die Menge an Metaboliten (6β-OH-T) bezieht, die während der Reaktion gebildet werden. Der Gesamtproteingehalt pro Chip (Protein; mg) wird durch Durchführung eines in Schritt 8.3.2 beschriebenen Bradford-Tests bestimmt.
        Equation 1
        Die Falteninduktionsaktivität wird berechnet durch: CYP-Aktivität (induziert) / CYP-Aktivität (Fahrzeug).
      4. Wenn Sie Proben für die mRNA-Analyse entnehmen, lesen Sie Schritt 8.3.3.
    2. Lyse der Zellen zur Proteinexpressionsanalyse
      HINWEIS: Die Proteinextraktion aus Zellen auf dem Chip wird unter Verwendung eines Proteinlysepuffers durchgeführt, der mit Protease- und Phosphataseinhibitoren ergänzt wird (Materialverzeichnis). Das extrahierte Protein wird dann mit dem Bradford-Assay quantifiziert und in der nachgelagerten Analyse verwendet.
      1. Lösen Sie die Chips von tragbaren Modulen und legen Sie sie in eine Petrischale. Waschen Sie beide Kanäle mit 200 μL sterilem DPBS.
      2. Blockieren Sie den unteren Kanalauslass mit einer 200 μL Filterpipettenspitze. Perfundieren Sie 50 μL der Dissoziationslösung durch den unteren Kanal und inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur.
      3. Untersuchen Sie, um die vollständige Ablösung der Endothelzellen zu bestätigen. Pipettieren Sie 1-2 Mal auf und ab und entfernen Sie die Dissoziationslösung aus dem Kanal. Wiederholen Sie die Wäsche.
      4. Blockieren Sie den oberen Kanalauslass mit einer 200-μL-Filterpipettenspitze. Perfuse 75 μL Proteinlysepuffer durch den oberen Kanal. Lassen Sie die Pipettenspitze eingelegt, um den oberen Kanaleinlass zu blockieren und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang zu inkubieren. Pipettieren Sie 5-10 Mal auf und ab und sammeln Sie die Zelllysate in einem vormarkierten 1,5-ml-Röhrchen.
      5. Wiederholen Sie Schritt 8.3.2.4. bis eine vollständige Ablösung der Zellen beobachtet wird. Sammeln Sie die Zelllysate im selben 1,5-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bis zur Analyse bei -80 ° C.
      6. Extrahieren Sie die Proteinfraktion nach Standardmethoden und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit dem Bradford-Assay (Table of Materials).
    3. Lyse der Zellen zur Genexpressionsanalyse
      HINWEIS: Die On-Chip-Zelllyse für die RNA-Extraktion kann mit einem RNA-Lysepuffer erreicht werden, der mit 0,1% 2-Mercaptoethanol ergänzt wird (Tabelle der Materialien). Alternativ kann ein phenolbasierter RNA-Lysepuffer verwendet werden, wenn hohe Ausbeuten an hochwertiger RNA erforderlich sind, die für die NGS- und Microarray-Analyse geeignet ist.
      1. Befolgen Sie die Schritte 8.3.2.1 bis 8.3.2.2, um den Darmchip für die Lyse vorzubereiten.
      2. Blockieren Sie den Auslass des oberen Kanals mit einer 200 μL Filterpipettenspitze. Perfuse 150 μL RNA-Lysepuffer durch den oberen Kanal. Lassen Sie die Pipettenspitze eingelegt, um den Einlass des oberen Kanals zu blockieren. Inkubiere für 2 min bei Raumtemperatur. Für die Lyse mit einem phenolbasierten RNA-Lysepuffer verwenden Sie 350 μL des Reagenzes.
      3. Pipette 5-10 Mal auf und ab und sammeln die Zelllysate in einem vormarkierten 1,5 ml Röhrchen. Wiederholen Sie den Schritt mit einem weiteren 150 μL RNA-Lysepuffer und sammeln Sie. Lagern Sie die Zelllysate bis zur Analyse bei -80 °C. Im Falle einer anschließenden RNA-Sequenzierungsanalyse fahren Sie mit der Analyse innerhalb von 1 Monat nach der Lysing fort.
      4. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den Zelllysaten mit einem RNA-Reinigungskit.
      5. Reverse-Transkribieren in cDNA mit einem Reverse-Transkriptase-Kit und Durchführung einer Echtzeit-PCR mit einem Real-Time-PCR-Cycler und den entsprechenden Primern und Puffern. Quantifizieren Sie die Ergebnisse mit der 2-ΔΔCt-Methode .

9. Störung der Epithelbarriere mit proinflammatorischen Zytokinen im Dickdarmchip

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Störung der intestinalen Epithelbarriere durch das Zytokin Interferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Das Zytokin wird im unteren Kanal des Dickdarmchips unter Berücksichtigung der basolateralen Expression des IFNγ-Rezeptors auf Darmepithelzellen dosiert.  Der proinflammatorische Reiz wird am Tag 5 der Kultur in den Chip eingeführt, sobald dieP-App unter 0,5 x 10-6 cm/s stabilisiert wurde. Ein ähnliches Dosierungsschema kann für andere proinflammatorische Zytokine und Barrierestörer verwendet werden.

  1. Stimulation mit IFNγ
    1. Bereiten Sie eine 100 μg/ml Stammlösung von IFNγ (Table of Materials) in sterilem Zellkulturwasser vor. Lagern Sie die Stammlösung im Laufe des Experiments bei -80 ° C. Verwenden Sie für jedes Experiment immer einen frischen Vorrat an IFNγ und vermeiden Sie mehr als drei Gefrier- und Tauzyklen.
    2. Bereiten Sie die IFNγ-Dosierlösung vor, indem Sie die Stammlösung in entgastem Endothelzell-Wachstumsmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 10-100 ng / ml zu erreichen.
    3. Bringen Sie die Trays zu BSC und entfernen Sie das Medium aus den unteren Kanaleinlassbehältern und ersetzen Sie es durch 3 ml des IFNγ-haltigen Mediums. Aktualisieren Sie das IFNγ-Dosiermedium täglich.
    4. Legen Sie die Trays in das Kulturmodul und perfusionieren Sie die Chips bei einer hohen Durchflussrate von 1.000 μL/h für 5 Minuten, um die IFNγ-Behandlung einzuleiten. Schalten Sie die Durchflussrate wieder auf 60 μL/h um und setzen Sie die fluidische Kultur fort.
  2. Datenanalyse
    1. Beurteilung der epithelialen Barrierefunktion. Die epitheliale scheinbare Permeabilität (P-App) oder Barrierefunktion kann zu verschiedenen Zeitpunkten der Kulturnachbehandlung mit IFNγ in den Abwassermedien der Ein- und Auslassbehälter beider Kanäle gemessen werden. Der fluoreszierende Tracer sollte 4 h vor der Bewertung derP-App in das organische Wachstumsmedium des oberen Kanals gegeben werden. Typischerweise wird 3 kDa Dextran Cascade Blue als fluoreszierender Tracer verwendet und im Medium 24 h vorher zugegeben.
      1. Pausieren Sie das Kulturmodul und bringen Sie die Trays zum BSC.
      2. Beschriften und bereiten Sie eine schwarzwandige Platte mit 96 Well mit 100 μL DPBS pro Vertiefung vor. Sammeln Sie mit einer 200-μL-Mehrkanalpipette 50 μL Abwasser aus allen Reservoirs und fügen Sie es den jeweiligen Bohrlöchern hinzu (Abbildung 2B).
      3. Um die Standardkurve vorzubereiten, verdünnen Sie das Medium, das 100 μg/ml 3 kDa Dextran Cascade Blue 1:3 in DPBS enthält. Anschließend führen Sie serielle Verdünnungen unter Verwendung einer dreifachen Verdünnung des Endothelzellwachstumsmediums in DPBS durch.
      4. Lesen Sie die Fluoreszenz bei 375 nm Anregung und 420 nm Emission mit einem Plattenleser. Verwenden Sie die gemessenen OD-Werte, um die scheinbare Permeabilität (P-App) wie folgt zu berechnen:
        Equation 2
    2. Immunfluoreszenzfärbung von Zellen auf dem Chip
      1. Dreimal mit 200 μL DPBS für jeden Kanal waschen.
      2. Perfundieren Sie 200 μL der fixativen Lösung (4% PFA in DPBS) in jedem Kanal. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      3. Wiederholen Sie den Waschschritt 9.2.2.1. Zu diesem Zeitpunkt können gewaschene Späne bis zu 7 Tage bei 4 ° C gelagert werden.
      4. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 μL Permeabilisierungslösung (0,1% Triton-X 100 in 10% normalem Eselserum (NDS) in DPBS) für jeden Kanal. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt 9.2.2.1.
      5. Blockieren Sie die Zellen auf dem Chip, indem Sie 200 μL blockierende Lösung (10% NDS in DPBS) für jeden Kanal verwenden. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      6. Verdünnen Sie die primären Antikörper in Antikörperlösung (5% NDS in DPBS) wie folgt: Anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epithelialer Tight Junction Marker), Anti-Occludin (1:100, epithelialer Tight Junction Marker), Anti-Claudin 4 (1:100, epithelialer Tight Junction Marker), Anti-E-Cadherin (1:100, epithelial adherens junctions marker (Table of Materials). Perfundieren Sie 200 μL der primären Antikörperlösung durch jeden Kanal und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C. Wiederholen Sie den Waschschritt 9.2.2.1.
      7. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Antikörperlösung (1:300, 5% NDS in DPBS). Perfundieren Sie 200 μL dieser Lösung durch jeden Kanal und inkubieren Sie für 2 h bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt 9.2.2.1. Auf Wunsch kann Phalloidin, ein zytoskelettaler Marker, der sekundären Antikörperlösung zugesetzt werden.
      8. Bereiten Sie eine 50 μg/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung in DPBS vor und verwenden Sie sie, um 200 μL durch jeden Kanal zu perfundieren. Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt. Zu diesem Zeitpunkt können gebeizte Chips bis zu 14 Tage bei 4°C gelagert werden.
    3. Beurteilung der Caspase 3-Spaltung
      1. Isolieren und quantifizieren Sie die Gesamtproteinmenge der Epithelzellen, wie in Schritt 8.3.2 beschrieben. Lassen Sie den Waschschritt 8.3.2.1 weg. Verdünnen Sie die Proben mit DPBS auf eine Endkonzentration von 400 μg/ml.
      2. Quantifizieren Sie die Konzentrationen von Gesamt- und gespaltener Caspase 3 mit dem Caspase 3-Detektionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    4. Beurteilung der proinflammatorischen Zytokinsekretion
      1. Verwenden Sie die Abwässer, die aus dem Auslass beider Kanäle des Dickdarmchips gesammelt werden, um sezernierte proinflammatorische Zytokine in der akuten Phase gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen zu quantifizieren. Führen Sie eine 5-fache Verdünnung für V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit und eine zweifache Verdünnung für V-PLEX Human Proinflammatory Panel II durch.

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Representative Results

Abbildung 1D fasst die Zeitleiste der Darmchipkultur zusammen und veranschaulicht die intestinalen Endothelzellen und Organoide vor und nach der Aussaat auf dem Chip. Darüber hinaus zeigt es die deutlichen morphologischen Unterschiede zwischen dem Zwölffingerdarm und den Dickdarmchips, die durch das Vorhandensein der zottenartigen Formationen im Zwölffingerdarmchip hervorgehoben werden und repräsentativ für die Dünndarmarchitektur sind.

Abbildung 3A,B zeigt die falten CYP3A4-Induktionsreaktionen im Zwölffingerdarm-Chip von drei verschiedenen Organoidspendern. Die Chips wurden 48 h lang bei 20 μM RIF oder 100 nM VD3 exponiert und zur Beurteilung der mRNA-Spiegel (A) und/oder der faltenkatalytischen Aktivität (B) des CYP450-Enzyms verwendet. Erhöhte Spiegel des Testosteronmetaboliten, 6β-Hydroxytestosteron (6β-OH-T), im Einklang mit der erhöhten CYP3A4 mRNA-Genexpression wurden im Zwölffingerdarmchip beobachtet, der bei RIF und VD3 exponiert wurde, was auf geeignete Induktionsreaktionen bei allen drei getesteten Spendern hinweist. Es werden die Mittelwerte ± SEM von n = 3 biologisch unabhängigen Chips angezeigt.

Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Ergebnisse für die Modellierung des Leaky-Gut-Syndroms im Dickdarmchip, einschließlich (A,C) Veränderungen in der Epithelzellmorphologie und der Tight-Junction-Integrität, (B) Abnahme der Barrierefunktion, (D) Induktion von Apoptose und (E) erhöhter Zytokinsekretion als Reaktion auf die IFNγ-Behandlung.

Abbildung 4A zeigt repräsentative Hellfeldbilder der Kontroll- und IFNγ-behandelten (50 ng/ml, 48 h) epithelialen Monoschicht des Dickdarmchips. Die Chips wurden aus dem Kulturmodul entfernt und die Epithelmorphologie täglich unter dem Mikroskop untersucht. Die Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop und einem 10-fachen Objektiv aufgenommen. Mit IFNγ behandelte Dickdarmchips zeigen eine kompromittierte Zellmorphologie und einen Verlust des säulenförmigen Epithels.

Abbildung 4B zeigt ein repräsentatives Ergebnis des scheinbaren Permeabilitätstests, der an Dickdarm-Chips durchgeführt wurde, die unter Ausgangsbedingungen kultiviert wurden, oder bei Stimulation mit IFNγ. 3 kDa Dextran Cascade Blue Tracer wurde dem oberen Kanalreservoir bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. IFNγ in einer Endkonzentration von 50 ng/ml wurde am Tag 5 der Kultur in den unteren Kanal dosiert. Chips wurden mit 60 ml/h perfundiert. Als nächstes wurden die Medien täglich (bis zum Tag 72 h nach der Belichtung) aus den Ein- und Auslassbehältern des oberen und unteren Kanals gesammelt. 50 μL jeder Probe wurden gesammelt, wie in Schritt 9.2.1 des Protokolls beschrieben verarbeitet und mit einem Plattenleser auf Fluoreszenz bei 375-420 nm untersucht. Eine signifikante Zunahme der epithelialen parazellulären Permeabilität wurde nach 48 h IFNγ-Stimulation beobachtet.

Abbildung 4C zeigt repräsentative immunfluoreszierende Bilder der epitheliösen (Zonula occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) und adhärenen (E-cadherin) Übergänge in Kontrolle und IFNγ-behandelten (50 ng/ml, 48 h) Dickdarmchips. Die Chips wurden mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei Raumtemperatur fixiert und wie in Schritt 9.2.2 des Protokolls beschrieben weiterverarbeitet. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop und einem 20-fachen Fernobjektiv aufgenommen und mit Fidschi Version 2.0 nach Standardprotokollen verarbeitet. Die Behandlung mit IFNγ löst die Verdrängung von ZO-1 und Claudin-4 und die Internalisierung von Occludin und E-Cadherin aus, wie das erhöhte zytoplasmatische Signal zeigt.

Abbildung 4D zeigt den zeitlichen Verlauf der Caspase-3-Spaltung im Dickdarmchip als Reaktion auf 50 ng/ml IFNγ, was auf eine Apoptoseaktivierung hinweist. Auf den Chips wurden Epithelzellen lysiert und Proteinproben nach Standardmethoden gereinigt. Der intrazelluläre Gehalt der gesamten und gespaltenen Caspase 3 wurde wie in Schritt 9.2.3 des Protokolls beschrieben gemessen. IFNγ induziert die Aktivierung der Apoptose, wie zuvorbeschrieben 29, in den auf dem Chip kultivierten Dickdarmepithelzellen nach 48 h Stimulation.

Abbildung 4E zeigt den zeitlichen Verlauf der Sekretion des Zytokins aus dem Dickdarmchip bei Stimulation mit 50 ng/ml IFNγ. Täglich wurden 200 μL Abwassermedien aus den Auslassbehältern des oberen und unteren Kanals gesammelt. Die Abwasserproben wurden bei -80 °C und 24 h gelagert, bevor die Analyse über Nacht bei 4 °C aufgetaut wurde. Die Zytokinspiegel in den Chipkulturmedien wurden mit der Meso Scale Discovery-Technologie bewertet, wie in Schritt 9.2.4 des Protokolls beschrieben. IFNγ induzierte eine polarisierte Sekretion proinflammatorischer Moleküle im Dickdarmchip, wie die basolaterale Sekretion von Vascular Cell Adhesion Protein 1 (VCAM-1) und Interleukin 6 (IL-6) und die apikale Sekretion von Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) und Serum Amyloid Protein A (SAA) zeigen. Serumspiegel der löslichen Formen von VCAM-1, ICAM-1, IL-6 und SAA werden in klinischen Labors als Indikator für Entzündungenverwendet 30,31.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau des Darmchips15,16. (A) Schematische Darstellung der Chipaktivierung und -beschichtung. Kurz gesagt, die Chips werden in eine Chip-Halterung gelegt, mit ER1-Lösung durchblutet und unter UV-Licht aktiviert. Als nächstes werden die Chips mit ER2 und DPBS gewaschen. Schließlich werden die Chips mit einer eiskalten ECM-Lösung beschichtet, die für jeden Zelltyp spezifisch ist, und über Nacht bei 37 ° C inkubiert. (B) Schematische Darstellung des Prozesses der Einführung von Organoiden in den Chip. Organoide werden von der 24-Well-Platte in einen konischen Schlauch übertragen und in Gegenwart der BMM-Dissoziationslösung auf Eis inkubiert, um Organoide aus dem gelösten BMM zurückzugewinnen. Anschließend wird die Organoidsuspension zentrifugiert und auf das Vorhandensein von gelösten BMM-Rückständen untersucht. Wenn über dem Zellpellet noch eine transparente BMM-Schicht sichtbar ist, sollte der Vorgang wiederholt werden. Wenn ein gut definiertes Pellet ohne sichtbare Gelreste beobachtet wird, werden Organoide enzymatisch dissoziiert und in den oberen Kanal (blau) des Chips eingeführt. Der untere Kanal (Magenta) des Chips ist mit gewebespezifischen mikrovaskulären Endothelzellen ausgesät. (C) Schematische Darstellung der Verbindung der Chips mit dem Kulturmodul, das den Medienfluss und die zyklische Peristaltik-ähnliche Dehnung unterstützt. Der Grundierungszyklus ermöglicht die Erzeugung der Zellkulturmediumtröpfchen über die Chipports und am Ende der tragbaren Modulwiderstände. Dies gewährleistet die Schaffung der Flüssig-Flüssig-Schnittstelle zwischen dem Chip und dem tragbaren Modul, wodurch der Chip in das Modul gleiten und seine sichere Verbindung hergestellt werden kann. Schließlich werden die tragbaren Module in Trays platziert und Trays in das Kulturmodul eingesetzt. (D) Experimenteller Zeitplan, der die wichtigsten Schritte für die Etablierung der aus Biopsie abgeleiteten Darmchip-Plattform, einschließlich Zwölffingerdarm- und Dickdarmchip, hervorhebt. Hellfeldbilder veranschaulichen die Endothel- und Organoid-abgeleiteten Zellen am Tag 0, vor und nach der Aussaat im Chip, sowie die Bildung von konfluentem und 3D-Epithelgewebe an Tag 8 der Chipkultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Sammlung von Abwassermedien aus dem Darmchip. (A) Schematische Darstellung der Sammlung von Medienabwässern aus dem tragbaren Modul. Medien werden aus den Auslassbehältern des oberen und unteren Kanals gesammelt und bei -80 °C bis zur weiteren ELISA- oder LC-MS/LC-MS/MS-Analyse gelagert. (B) Schematische Darstellung der Entnahme von Abwasserproben mit einer Mehrkanalpipette und deren Übertragung in eine schwarzwandige 96-Well-Platte zur nachgeschalteten Beurteilung der epithelialen scheinbaren Permeabilität (P-App). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: CYP3A4-Induktion im Zwölffingerdarm-Chip15. (A) Induktion von CYP3A4-mRNA-Spiegeln im Zwölffingerdarm-Chip durch 48 h Exposition bei 20 μM RIF und 100 nM VD3. Mittelwert ± SEM, N = 3 Chips/Zustand/Donor, Zwei-Wege-ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test, ****p < 0,0001 (über DMSO-Kontrollen verglichen). (B) Induktion der CYP3A4-Aktivität im Zwölffingerdarmchip, der bei prototypischen Induktoren exponiert wurde, wie durch LC-MS/MS-Quantifizierung des Sondensubstratmetaboliten: 6β-Hydroxytestosteron bewertet. Ein signifikanter Anstieg der CYP3A4-Aktivität wurde in dem mit 20 μM RIF oder 100 nM VD3 für 48 h behandelten Zwölffingerdarmchip beobachtet. Mittelwert ± SEM, N = 3 Chips/Zustand/Donor, Zwei-Wege-ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Störung der Epithelbarriere im Dickdarmchip unter Verwendung von IFNγ16. (A) Hellfeldbilder, die die Morphologie der Epithelzellen unter Ausgangsbedingungen und bei Stimulation mit 50 ng/ml IFNγ für 48 h zeigen. Maßstabsstab: 100 μm. (B) Scheinbare Permeabilität der Epithelbarriere auf 3 kDa Dextran im Verlauf einer 72 h Stimulation mit 50 ng/ml IFNγ. Mittelwert ± 95% CI, N = 5-9 Chips/Zustand, Zwei-Wege-ANOVA, Tukeys Post-hoc-Test, ****p < 0,0001. (C) Immunfluoreszenzbilder, die die Störung der epithelialen Tight und Adherens Junctions bei Stimulation mit 50 ng/ml IFNγ für 48 h darstellen. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (rot) tight junctions, E-cadherin (red) adherens junctions, Occludin (red) tight junctions, Claudin-4 (red) tight junctions, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue) nucle. Maßstabsstab: 50 μm. (D) Induktion der Caspase-3-Spaltung im Dickdarmchip durch Behandlung mit 50 ng/ml IFNγ. Vier verschiedene Zeitpunkte wurden über 72 Stunden Exposition bewertet. Mittelwert ± 95% CI, N = 3-6 Chips/Zustand, Zwei-Wege-ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001. (E) Erhöhte Sekretion von Zytokinen: Vascular Cell Adhesion Protein 1 (VCAM-1) und Interleukin 6 (IL-6) im unteren Kanal und Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) und Serum Amyloid Protein A (SAA) in den oberen Kanalablaufmedien im Verlauf einer 72 h Stimulation des Dickdarmchips mit 50 ng/ml IFNγ. Mittelwert ± 95% CI, N = 3 Chips/ Zustand, Zwei-Wege-ANOVA, Tukey's Post Hoc Test, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Kombination von Organ-on-a-Chip-Technologie und Darmorganoiden verspricht eine genaue Modellierung der menschlichen Darmphysiologie und Pathophysiologie. Hier stellen wir ein einfaches und robustes Schritt-für-Schritt-Protokoll (in Abbildung 1 dargestellt) für die Etablierung des Darmchips bereit, der biopsiebasierte Dünndarm- oder Kolonepithel- und intestinale mikrovaskuläre Endothelzellen enthält, die in einem mikrofluidischen Gerät kokultiviert werden. Diese chipbasierte Simulation des menschlichen Darms umfasst physiologische, luminale und vaskuläre Strömungs- und Peristaltikbewegungen. Darüber hinaus beschreiben wir Verfahren zur Beurteilung kritischer Darmfunktionen, wie z.B. des Arzneimittelstoffwechsels im Zwölffingerdarmchip und der Barrierefunktion im Dickdarmchip.

Um epithelial-endotheliale zelluläre Interaktionen zu rekapitulieren, die für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase und damit für die genaue Modellierung von Darmgewebe auf dem Chip unerlässlich sind, ist es wichtig, funktionelle und intakte Zellmonoschichten auf beiden Seiten der PDMS-Membran zu etablieren. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Chip-Seeding ist die chemische Aktivierung der PDMS-Oberfläche, die die Entwicklung einer stabilen Verbindung zwischen der PDMS-Oberfläche und ECM-Proteinen ermöglicht. Eine unsachgemäße Aktivierung kann die Anheftung von Zellen behindern und zur Bildung unvollständiger zellulärer Monoschichten führen. Die Aktivierungslösung muss frisch zubereitet werden, da sie lichtempfindlich und anfällig für Degradation ist. Während der UV-Aktivierung und der anschließenden ECM-Beschichtung ist es wichtig, eine gleichmäßige Verteilung der Reagenzien innerhalb jedes Kanals zu gewährleisten. Die spezifische Zusammensetzung und Konzentration der Lösungen, die zur Beschichtung des oberen und unteren Kanals verwendet werden, wurde optimiert, um den Bedürfnissen der Epithel- bzw. Endothelzellen gerecht zu werden. Wenn Änderungen an der zellulären Zusammensetzung des Darmchips erforderlich sind, müssen die ECM-Bedingungen möglicherweise erneut optimiert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Nach der ECM-Beschichtung ist es wichtig, HIMECs mit hoher Zellaussaatdichte (8 x 106 Zellen/ml) zu säen, um eine vollständige und homogene Monoschicht auf der Unterseite der PDMS-Membran zu erhalten. Wenn keine Vollzellkonfluenz erreicht wird, wird empfohlen, die Dichte der Endothelzellsuspension während der Aussaat weiter zu erhöhen oder die Aussaat von Organoidfragmenten im oberen Kanal des Chips zu verzögern, bis HIMECs vollständig konfluent werden. Die Verwendung von fragmentierten Organoiden anstelle der Suspension einzelner Zellen, die durch enzymatische Verdauung von Organoiden erhalten wird, verbesserte zuvor den Erfolg und die Reproduzierbarkeit der Darmmonoschichtbildung innerhalb des Darmchips14. Daher wird dringend empfohlen, den Organoid-Verdauungsprozess genau zu überwachen, um den optimalen Zeitpunkt der Inkubation mit dem Enzym zu gewährleisten, was zu Organoidfragmenten führt, die aus etwa 10-30 Zellen (40-100 μm Größe) bestehen. Eine unzureichende Dissoziation kann zu einer Reformation der zystischen Organoidstruktur in den mikrofluidischen Chips anstelle der gewünschten Monoschicht führen. Darüber hinaus ist es wichtig, eine übermäßige organoide Dissoziation in einzelne Zellen zu vermeiden, die zu einem verminderten Überleben, einer verminderten Zellerholung und dem Versagen führen könnte, eine konfluente Monoschicht innerhalb des Chips zu bilden.

Es hat sich gezeigt, dass der Einbau von Fluidströmung (Scherspannung) und zyklischer Belastung in die Darmchipkultur, unterstützt durch das Kulturmodul, die Bildung der funktionellen Darmbarriere verbessert und die spontane Entwicklung der 3D-Architektur des Epithelgewebesfördert 13. Bei der Durchführung mikrofluidischer Experimente unter Verwendung von Organs-on-Chips ist es jedoch wichtig, die Zellkulturmedien vor der Verwendung vorzuwärmen und zu entgasen, um die Bildung von Mikroblasen in den Kanälen zu vermeiden, die zu zellulärem Stress oder sogar zur Ablösung von der Membran führen könnten.

Neben den hier gezeigten spezifischen Anwendungen kann das Darmchip-Modell verwendet werden, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten, von der Grundlagenforschung bis hin zur Entdeckung und Erprobung neuartiger Medikamente oder Drug-Delivery-Technologien. Es kann Studien der menschlichen Darmentwicklung, Stammzellreifung und Epithelzellfunktion erleichtern; insbesondere im Zusammenhang mit der Bewertung der Rolle der Mechanik beim Wachstum und der Homöostase des Darmgewebes. Jüngste Entdeckungen zeigten, dass das dynamische Gleichgewicht des gesunden Darmepithels auf seiner Fähigkeit beruht, verschiedene Kräfte präzise zu koordinieren, die die Krypto-Zotten-Architektur definieren, Zelltypen unterteilen, die Zellmigration steuern und die Zellidentität, die Proliferation und den Tod in Raum und Zeit regulieren32. Der Darmchip bietet die Möglichkeit, das Zusammenspiel zwischen mechanischen Kräften (z. B. Spannung oder Scherspannung), Zellschicksal und Funktion besser aufzuklären, um einige der vielen faszinierenden Fragen zu beantworten, die auf dem aufstrebenden Gebiet der Darmmechanobiologie verbleiben. Darüber hinaus kann es Studien zu Sensor- und Darmtransportprozessen ermöglichen, dank der Anwesenheit von hormonsezernierenden enteroendokrinen Zellen und der korrekten Lokalisation verschiedener Nährstofftransporter15,16. Das Darmchip-Modell kann auch modifiziert werden, um Immunzellen sowie kommensale oder pathogene Mikroorganismen für Studien zu entzündlichen Darmerkrankungen, Wirt-Pathogen- und Wirt-Mikrobiom-Interaktionen einzubeziehen und Off-Target-Toxizitäten von immunonkologischen Produkten präzise vorherzusagen, wie zuvor gezeigt 17,20,33,34,35.

Darüber hinaus kann die Verwendung klinischer Biopsieproben von Personen mit spezifischen genotypischen und phänotypischen Merkmalen die Analyse patientenspezifischer Krankheitsmechanismen sowie das Ansprechen auf Therapien ermöglichen und so dazu beitragen, die personalisierte Medizin in Zukunft voranzutreiben.

Die Haupteinschränkung dieser Methode besteht darin, dass Fragmente aus einer großen Anzahl von Organoiden (~ 60-80) erforderlich sind, um ein konfluierendes Darmepithel auf jedem Chip zu bilden. Dies liegt daran, dass Organoidfragmente eine Aussaat mit hoher Dichte erfordern, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Anzahl von Darmstammzellen vorhanden ist, um die proliferative Expansion der Monoschicht und die Etablierung einer 3D-Gewebearchitektur zu unterstützen. Ein vollständig differenziertes Darmepithel auf einem Chip besitzt alle wichtigen Darmepithelzelltypen (absorbierende Enterozyten, Paneth-Zellen, Becherzellen und enteroendokrine Zellen) und ein Transkriptionsprofil, das dem In-vivo-Gegenstück sehr ähnlich ist. Dem aktuellen Modell fehlen jedoch noch andere wichtige Komponenten des lebenden Darms, darunter intestinale Fibroblasten, residente Immunzellen (z. B. Makrophagen, intraepitheliale Lymphozyten und dendritische Zellen) und das enterische Nervensystem.

Während dies potenzielle Nachteile sind, haben frühere Studien gezeigt, dass die Stärke des Organ-on-a-Chip-Technologieansatzes in seiner Fähigkeit liegt, die strukturelle und funktionelle Komplexität menschlicher Organe nachzuahmen, indem verschiedene Komponenten von In-vivo-Geweben und ihre Mikroumgebung nacheinander schrittweise integriertwerden 36,37. Dieser Ansatz der synthetischen Biologie für das In-vitro-Tissue Engineering bietet eine Möglichkeit, den Beitrag einzelner zellulärer und molekularer Komponenten zu physiologischen und pathophysiologischen Reaktionen auf Organebene bei unterschiedlicher Systemkomplexität zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht es die biochemische, genetische und mikroskopische Analyse der interagierenden Gewebe, einzeln und in Echtzeit durchgeführt zu werden, wodurch Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie interzelluläre Signale und Gewebe-Gewebe-Interaktionen zu bestimmten Verhaltensweisen auf Organebene beitragen. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal der Darmchip-Technologie ist die Vielseitigkeit. Die präzise Kontrolle über Mikroumgebungselemente ermöglicht die Feinabstimmung von Medienflussraten und Dehnungsparametern, um Naturkräfte zu reproduzieren, die von Zellen im menschlichen Körper erlebt werden, wie z.B. die Scherspannung, die von den Endothelzellen, die dem Blutfluss ausgesetzt sind, wahrgenommen wird, und die zyklischen peristaltischen Bewegungen des Darmgewebes. Darüber hinaus ermöglicht das synergistische Engineering von Organoiden und Organs-on-Chips die Schaffung von vaskularisierten Organs-on-Chips, die verschiedene Regionen des Darmgewebes darstellen, die fließend miteinander verbunden werden könnten, um physiologische Wechselwirkungen zwischen Dünn- und Dickdarm zu untersuchen. Daher glauben wir, dass der Darmchip ein überlegenes Modell des Darmepithels darstellt und dazu beitragen könnte, das 3R-Prinzip (Reduktion, Verfeinerung und Ersatz) in der Grundlagenforschung sowie im präklinischen und regulatorischen Setup umzusetzen.

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Disclosures

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi und Magdalena Kasendra sind aktuelle oder ehemalige Mitarbeiter von Emulate Inc. und können Eigenkapital halten. Emulate Inc. ist das Unternehmen, das die Organchip-Geräte herstellt und Patente veröffentlicht hat, die für die in diesem Artikel genannte Arbeit relevant sind.

Acknowledgments

Wir danken Professor Mark Donowitz für die Bereitstellung der aus der Darmbiopsie gewonnenen Organoide und Brett Clair für die Entwicklung der wissenschaftlichen Illustrationen des Chip-, tragbaren und Kulturmoduls. Der Rest der wissenschaftlichen Illustrationen wurde mit dem BioRender erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

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References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

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Bioengineering Ausgabe 183
Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität
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Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

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