Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kombination af humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi til modellering af tarmregionsspecifik funktionalitet

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Biopsiafledte tarmorganoider og organ-on-a-chips-teknologier kombineres til en mikrofysiologisk platform for at rekapitulere regionsspecifik tarmfunktionalitet.

Abstract

Tarmslimhinden er en kompleks fysisk og biokemisk barriere, der opfylder et utal af vigtige funktioner. Det muliggør transport, absorption og metabolisme af næringsstoffer og xenobiotika, samtidig med at det letter et symbiotisk forhold til mikrobiota og begrænser invasionen af mikroorganismer. Funktionel interaktion mellem forskellige celletyper og deres fysiske og biokemiske miljø er afgørende for at etablere og opretholde tarmvævshomeostase. Modellering af disse komplekse interaktioner og integreret tarmfysiologi in vitro er et formidabelt mål med potentiale til at transformere den måde, hvorpå nye terapeutiske mål og lægemiddelkandidater opdages og udvikles.

Organoider og Organ-on-a-Chip-teknologier er for nylig blevet kombineret for at generere humanrelevante tarmchips, der er egnede til at studere de funktionelle aspekter af tarmfysiologi og patofysiologi in vitro. Organoider afledt af biopsierne i den lille (tolvfingertarmen) og tyktarmen podes ind i det øverste rum i en organchip og udvides derefter med succes som monolag, samtidig med at de forskellige cellulære, molekylære og funktionelle træk ved hver tarmregion bevares. Humane tarmvævsspecifikke mikrovaskulære endotelceller er inkorporeret i det nederste rum af organchippen for at genskabe epitel-endotelgrænsefladen. Denne nye platform letter luminal eksponering for næringsstoffer, lægemidler og mikroorganismer, hvilket muliggør undersøgelser af tarmtransport, permeabilitet og værtsmikrobeinteraktioner.

Her gives en detaljeret protokol til etablering af tarmchips, der repræsenterer det menneskelige tolvfingertarm (tolvfingertarmschip) og tyktarmen (tyktarmschip) og deres efterfølgende kultur under kontinuerlig strømning og peristaltiklignende deformationer. Vi demonstrerer metoder til vurdering af lægemiddelmetabolisme og CYP3A4 induktion i tolvfingertarmschip ved hjælp af prototypiske induktorer og substrater. Endelig giver vi en trinvis procedure til in vitro-modellering af interferon gamma (IFNγ) -medieret barriereforstyrrelse (utæt tarmsyndrom) i en tyktarmschip, herunder metoder til evaluering af ændring af paracellulær permeabilitet, ændringer i cytokinsekretion og transkriptomisk profilering af cellerne i chippen.

Introduction

Den menneskelige tarm er et komplekst og multitasking organ, der er i stand til selvregenerering. Det er opdelt i tyndtarmen og tyktarmen. Tyndtarmens primære funktion er at fordøje mad, der kommer fra maven, absorbere alle næringsstoffer og videregive resten til tyktarmen, som genvinder vandet og elektrolytterne. Tyndtarmen er yderligere opdelt i flere anatomisk forskellige regioner: tolvfingertarmen, jejunum og ileum, som hver især er tilpasset til at udføre specifikke funktioner. For eksempel hjælper tolvfingertarmen med at nedbryde chymen (maveindholdet) for at muliggøre korrekt absorption af næringsstoffer, der involverer proteiner, kulhydrater, vitaminer og mineraler i jejunum. Denne proksimale del af tyndtarmen er også det vigtigste sted for intestinal lægemiddelabsorption og metabolisme, og det er kendetegnet ved den højere ekspression af lægemiddelmetaboliserende enzymer (fx CYP3A4) sammenlignet med deres ekspression i ileum og kolon1. Ud over sin vigtigste rolle i fordøjelsen og absorptionen af næringsstoffer er tarmen også en effektiv barriere mod potentielt skadeligt luminalt indhold, såsom patogene mikroorganismer, mikrobielle metabolitter, diætantigener og toksiner 2,3. Det er bemærkelsesværdigt, at den menneskelige tyktarm er beboet af et stort antal mikroorganismer, der langt overstiger de samlede celler i menneskekroppen, hvilket giver mange fordele for ernæring, stofskifte og immunitet. Derfor er opretholdelsen af integriteten af slimhindebarrieren dannet af tarmepitelceller afgørende for at tillade det symbiotiske forhold mellem tarmmikrobiotaen og værtscellerne ved fysisk at adskille dem for at undgå unødvendig immuncelleaktivering2. Derudover spiller programmeret tarmcelledød en væsentlig rolle som en selvbeskyttende mekanisme, der forhindrer inficerede celler i at fortsætte eller formere sig - og derved sprede potentielle patogener3 - mens den kontinuerlige selvfornyelse af tarmepitelet hver fjerde til syv dage kompenserer for celletabet, hvilket sikrer barriereintegritet og vævshomeostase. Forringelser af beskrevne tarmfunktioner, herunder næringsstofabsorption, barriereintegritet eller ubalance i tarmcelledød og selvfornyelse, kan resultere i udvikling af en række gastrointestinale lidelser, herunder underernæring og inflammatorisk tarmsygdom (IBD)2,3.

Tidligere er dyremodeller og transformerede kræftafledte tarmcellelinjer blevet brugt til at studere de fysiologiske og patofysiologiske funktioner i humant tarmvæv. De stadig mere fremtrædende bekymringer om dyreforskningens omsættelighed til mennesker som følge af betydelige forskelle mellem de to arter understregede imidlertid et behov for humanrelevante alternative metoder4. De almindeligt anvendte in vitro tarmcellelinjer omfatter T84,Caco-2 og HT29 celler. Mens de efterligner visse aspekter af tarmbarrierefunktionen og membrantransporten, er de kendetegnet ved et ændret udtryk for lægemiddelmetaboliserende enzymer5, overfladereceptorer og transportører4. Derudover mangler de tarmsegmentspecificitet og undlader at rekapitulere kompleksiteten af tarmepitelet, hvor hver model kun indeholder en ud af de fem epitelcelletyper, der er til stede i tarmen6.

For nylig blev humane tarmorganoidkulturer etableret fra friske biopsier af tyndtarmen og tyktarmen 7,8 eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC)9 introduceret som alternative eksperimentelle modeller med potentiale til at supplere, reducere og måske erstatte dyreforsøg i fremtiden. Mens iPSC'er kan opnås på en ikke-invasiv måde, kræver etablering af organoider fra iPSC'er brug af komplekse og lange protokoller (med flere eksperimentelle trin) og genererer kulturer, der ligner humant føtalvæv. I modsætning hertil er biopsiafledte organoider meget skalerbare, da de kan udnytte tarmvævets iboende fornyelseskapacitet og kan passeres og formeres in vitro på ubestemt tid. Det er vigtigt, at biopsiafledte organoider opretholder sygdommen og tarmregionsspecifikke egenskaber ved det primære væv, hvorfra de blev udviklet, og emulerer den cellulære mangfoldighed af tarmepitelet. Organoider kan bruges som patientspecifikke avatarer in vitro til at opklare biologi og patogenese af forskellige gastrointestinale lidelser og forbedre deres terapeutiske styring. Selvom tarmorganoider har opnået en imponerende grad af fysiologisk funktionalitet, undlader de stadig at reproducere kompleksiteten af de indfødte organer på grund af deres mangel på kritiske stromale komponenter - herunder blodkar, bindevæv, perifere nerver og immunceller - samt mekanisk stimulering. Mekaniske parametre, såsom flow, forskydningsspænding, strækning og tryk, er kendt for at påvirke vævsmorfogenese og homeostase in vivo og blev tidligere vist at forbedre modning af celler in vitro 10,11,12,13. En yderligere vigtig ulempe ved organoidsystemer er lumenets utilgængelighed og dermed til den apikale side af epitelet. Dette udgør en udfordring for at undersøge forskellige mekanismer forbundet med polariseret ekspression af ion- og lægemiddeltransportører, værtsmikrobiominteraktioner og farmaceutisk toksicitetstest. Endelig lider organoidkulturer af betydelig variation i størrelse, morfologi og funktion på grund af den stokastiske karakter af in vitro-selvorganiseringsprocessen og celleskæbnevalg. For at realisere det fulde potentiale af tarmorganoider i sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og regenerativ medicin er det derfor nødvendigt at udforske nye strategier, der reducerer variationen i organoidudvikling, forbedrer adgangen til luminalrummet og inkorporerer manglende celle-celle-interaktioner.

Organ-on-a-Chip-teknologi har introduceret mange teknikker til inkorporering af mekaniske kræfter og væskestrøm til tarmcellekulturer in vitro. Men da de fleste af de indledende proof-of-concept-undersøgelser har brugt kræftafledte cellelinjer, der ikke udviste tilstrækkelig cellulær mangfoldighed, er relevansen af disse systemer blevet stillet spørgsmålstegn ved. For nylig har vi synergistisk kombineret tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi for at inkorporere de bedste funktioner i hver tilgang i et in vitro-system 14,15,16. Den resulterende tarmchip rekapitulerer den multicellulære arkitektur af tarmepitelet, tilstedeværelsen af epitel-endotelvævsgrænseflade og de mekaniske kræfter i væskestrøm og strækning, hvilket muliggør emulering af funktioner på organniveau in vitro. Derudover øger brugen af primære vævsafledte organoider (som kan udtages fra forskellige regioner i den menneskelige tarm) som udgangsmateriale denne models alsidighed, da chips, der repræsenterer humant tolvfingertarm, jejunum, ileum og tyktarm, kan etableres efter lignende sånings- og dyrkningsprocedurer. Det er vigtigt, at tarmchips muliggør realtidsvurdering af: tarmbarrierens integritet; aktivitet af børstegrænsen og lægemiddelmetabolisme enzymer; produktion af muciner; sekretion af cytokiner; og interaktion mellem tarmceller og patogene og kommensale mikroorganismer, som det fremgår af de tidligere offentliggjorte rapporter. Især når tarmchips blev etableret ved hjælp af organoider genereret fra forskellige individers væv, fangede disse modeller den forventede interdonorvariation i de funktionelle reaktioner på forskellige lægemidler og behandlinger. Alt i alt åbner sammenlægning af organoider med Organ-on-a-Chip-teknologi døren til mere avancerede, personaliserede, in vivo-relevante modeller, der kan forbedre den fysiologiske relevans og nøjagtighed af in vitro-resultaterne samt deres ekstrapolering til mennesker. Her præsenteres en detaljeret protokol til etablering af tarmchippen og dens anvendelse i undersøgelserne af fysiologiske funktioner i de to tarmsegmenter: tolvfingertarmen og tyktarmen. For det første beskrives metoderne til vurdering af aktiviteten af det lægemiddelmetaboliserende enzym CYP3A4 i tolvfingertarmen, såvel som dets induktion af prototypiske forbindelser, såsom rifampicin og vitamin D3. For det andet er de trin, der kræves for at modellere "utæt tarm" i tyktarmschippen, beskrevet i protokollen, hvor forstyrrelsen af epitelbarrieren udføres ved hjælp af kendetegnende cytokiner, der er impliceret i patogenesen af IBD. Kort fortalt formeres organoider afledt af humane biopsier in vitro, udsættes for enzymatisk fordøjelse og introduceres i chippens øverste kanal. I nærvær af kontinuerlig perfusion med vækstfaktorberigede medier udvikler de sig til et sammenflydende epitelmonolag med 3D-arkitektur og en let tilgængelig apikal celleoverflade. Det nederste "vaskulære" chiprum er podet med mikrovaskulære endotelceller isoleret fra tyndtarmen eller tyktarmen. Epitelet og endotelet adskilles af en porøs strækbar membran, som letter de parakrine interaktioner mellem de to væv og, når de udsættes for cykliske deformationer, emulerer peristaltiklignende bevægelser af den menneskelige tarm. Samkulturen opretholdes under de dynamiske strømningsbetingelser, der genereres af luminal og vaskulær perfusion med passende cellekulturmedier. Endelig beskriver vi adskillige typer assays og endpointanalyser, der kan udføres direkte på chip eller fra samplede cellekulturudløb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle cellekulturer skal håndteres ved hjælp af en korrekt aseptisk teknik.

De humane tarmorganoider, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra Johns Hopkins University, og alle metoder blev udført i overensstemmelse med godkendte retningslinjer og regler. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).

1. Fremstilling af cellekulturreagenserne

  1. Forbered det humane organoide vækstmedium efter producentens anvisninger (Materialetabel) og suppler det med 100 μg / ml primocin.
  2. Forbered humant mikrovaskulært endotelcellevækstmedium efter producentens anvisninger (materialetabel) og suppler med 1:20 vol / vol FBS og 50 μg / ml i stedet 100 μg / ml primocin.
  3. Resuspend Y-27632 (Rho-kinase Inhibitor) i steril 0,1% BSA i DPBS til fremstilling af en 10 mM stamopløsning. Aliquot i sterile mikrorør og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
  4. Resuspend CHIR99021 (GSK-3-hæmmer) i sterilt dimethylsulfoxid (DMSO) til fremstilling af en 5 mM stamopløsning. Aliquot i sterile mikrorør og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
  5. Den humane organoidfordøjelsesopløsning fremstilles ved at blande en 1:1 vol/vol organoiddissociationsopløsning (materialetabel) med DPBS-opløsning (materialetabel) og supplere den med 10 μM stamopløsning af Y-27632. Dette reagens skal fremstilles frisk for hver anvendelse.

2. Dyrkning af humane intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMEC'er)

  1. Start HIMEC-kulturen (Table of Materials) 7 dage før såning på chippen. Kun HIMEC'er ved passage 1-6 kan bruges til chipsåning.
  2. Der tilsættes 5 ml fastgørelsesfaktoropløsning (materialetabel) til en T150-kolbe. inkuberes ved 37 °C i 1 minut, og opløsningen kasseres.
  3. Der tilsættes 19 ml endotelcellevækstmedium forvarmet ved stuetemperatur (se trin 1.2) til kolben.
  4. Optø et frossent hætteglas med HIMEC (2 millioner celler/hætteglas) i et 37 °C vandbad.
  5. Indholdet af hætteglasset overføres til kolben, og kolben vippes forsigtigt for at fordele cellerne jævnt. Kolben anbringes i en 37 °C kuvøse natten over, så endotelcellerne kan klæbe fast.
  6. Udskift mediet med 20 ml endotelcellevækstmedium forvarmet ved stuetemperatur den næste dag og derefter hver 3. dag. Kulturer skal nå 90% af sammenløbet på dagen for cellehøst til chipforsøg.

3. Mikrofabrikation og forberedelse af chippen

  1. Få chips fra en kommerciel leverandør (materialetabel). Pak chipsene ud og læg dem i chipholderen placeret i en firkantet petriskål (Materialebord). Mærk forsiden af hver chipbærer med de eksperimentelle betingelser (figur 1A).
    BEMÆRK: Mens den præsenterede protokol er afhængig af brugen af en specifik kommercielt tilgængelig chip og instrumentering, er der flere mikrofluidiske enheder, der tilbydes gennem forskellige leverandører, hvilket kan tilbyde alternative fordele, men mangler evnen til at inkorporere stretch. Derudover kan mikrofabrikation af organerne-på-chips udføres "internt" efter de procedurer, der er beskrevet i Huh et al.21.

4. Aktivering og ECM-belægning af membranen

  1. Fremstilling af aktiveringsopløsningen
    1. Reagenserne ER-1 og ER-2 (materialetabel) bringes til stuetemperatur for at afbalanceres før brug. ER-1 er lysfølsom og skal håndteres i mørke.
    2. ER-1 rekonstitueres i 10 ml ER-2-reagens for at opnå en slutkoncentration på 0,5 mg/ml og bekræfte, at ER-1 er helt opløst.
  2. Overflade aktivering
    1. Skub forsigtigt 50 μL af ER-1-opløsningen gennem begge kanaler i chippen (figur 1A).
    2. Fjern overskydende ER-1-opløsning fra overfladen af chippen ved hjælp af en aspirator.
    3. Undersøg chipsene for at sikre, at alle chips har modtaget ER-1-løsningen. I tilfælde af luftbobler skal du indføre mere ER-1-opløsning, indtil boblerne er helt fjernet.
    4. Inkuber chipsene inde i UV-lampekammeret (Materialebord) i 15 min. Bekræft, at UV-lampen er indstillet til indstillingen Konsekvent.
    5. Bring de ER-1 aktiverede chips tilbage til biosikkerhedsskabet (BSC). Opsuge ER-1-løsningen fra begge kanaler. Eventuelle rester af ER-1-opløsningen vaskes med 200 μL ER-2.
    6. Skub 200 μL steril Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DBPS) gennem kanalerne (Materialetabel), og lad DBPS stå i kanalerne indtil næste trin.
  3. Fremstilling af ekstracellulær matrix (ECM) og membranbelægning
    1. Fremstilling af stamopløsninger af ECM-komponenter
      1. Rekonstituere kollagen IV (materialetabel) og fibronectin (materialetabel) ved hjælp af sterilt vand af cellekulturkvalitet (materialetabel) til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Forbered aliquoter og opbevar dem ved -20 ° C indtil brug.
    2. Fremstilling af ECM-arbejdsløsning til membranbelægning
      1. Forbered 1,5 ml af hver ECM-opløsning til den øverste og nederste kanal for hver 12 chips, der skal overtrækkes. ECM-opløsningen skal altid fremstilles lige før brug.
      2. For den øverste kanal blandes kollagen IV og opløselig kældermembranmatrix (BMM) (Materialetabel) i steril kold DBPS ved henholdsvis 200 μg/ml og 100 μg/ml. For den nederste kanal blandes kollagen IV og fibronectin i steril kold DPBS ved henholdsvis 200 μg / ml og 30 μg / ml.
    3. ECM-belægning af chipsene
      1. Opsuge DBPS fra begge kanaler i chipsene og udskift med den passende ECM-arbejdsløsning for hver kanal (figur 1A).
      2. Undersøg hver chip for at sikre, at den har modtaget belægningsløsningen. I tilfælde af luftbobler skal du skubbe gennem mere belægningsopløsning, indtil alle boblerne er helt fjernet.
      3. Tilsæt steril DPBS til chipholderen, og læg petriskålen indeholdende chipsene i en 37 °C inkubator. Inkuber natten over for at tillade ECM-proteinerne at danne ionbindinger med den aktiverede PDMS-membran. Hvis det ønskes, kan celler podes når som helst mellem 2 timer og 1 dag efter belægning af chipsene. Alternativt kan coatede chips opbevares ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubation natten over ved 37 ° C og chipsåning.

5. Såning af intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMEC'er) i chippens nederste kanal

BEMÆRK: Tyndtarms- og colon-HIMEC'er er podet i henholdsvis bundkanalen i tolvfingertarmen og tyktarmschippen.

  1. Forbered chips
    1. Overfør de ECM-belagte chips til BSC. Sug forsigtigt ECM-belægningen fra begge chipskanaler, og vask derefter begge kanaler med henholdsvis 200 μL organoidvækstmedium og endotelcellevækstmedium.
    2. Opbevar de vaskede chips i en 37 ° C inkubator, indtil du fortsætter med såning af endotelceller.
  2. Høst endotelcellerne
    1. Bring HIMEC-kulturkolben til BSC, og vask med steril DPBS.
    2. Der tilsættes 3 ml dissociationsopløsning til kolben, og den anbringes i 37 °C-inkubatoren i 2 minutter for at muliggøre fuldstændig celleafmontering.
    3. Saml cellerne i et 15 ml konisk rør og tilsæt endotelcellevækstmedier, indtil det når 10 ml. Prøve 15-20 μL af cellesuspensionen til celletælling. Centrifuger ved 150 x g i 5 min.
    4. Opsuge supernatanten forsigtigt og suspendere HIMEC'erne til en tæthed på 8-10 x 106 celler / ml i endotelcellevækstmedier.
  3. Frø endotelceller i chippens nederste kanal
    1. Medbring petriskålen, der indeholder chipsene, til BSC, og fjern forsigtigt alle medier fra den nederste kanal ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
    2. Indfør 10-15 μL af HIMEC-suspensionen i chippens bundkanal. Undersøg chippen lige efter såning for at sikre optimal såtæthed (80%-90% af dækningen) og homogen cellefordeling i kanalen (figur 1D). Hvis såtætheden er højere eller lavere end forventet eller ujævn, vaskes kanalen 2x med 200 μL endotelcellevækstmedier og gentages såningsproceduren.
    3. Vend petriskålen straks efter såning af hvert parti på seks chips for at tillade endotelcellefastgørelse til undersiden af PDMS-membranen. Anbring petriskålene i 37 °C inkubatoren i 30 minutter til 1 time, eller indtil HIMEC'erne i den nederste kanal har fastgjort sig til membranen (figur 1D).
  4. Vask chipsene
    1. Skub forsigtigt 200 μL endotelcellevækstmedier gennem bundkanalindløbet for at fjerne eventuelle ikke-bundne celler og genopfylde næringsstofferne i mediet.
    2. Vask de celler væk, der ikke vedhæftede sig i den øverste kanal med 200 μL organoid vækstmedium suppleret med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632.
    3. Anbring chipsene i 37 ° C inkubatoren, indtil du fortsætter til epitelcellesåningen.

6. Såning af organoidfragmenter i chippens øverste kanal

BEMÆRK: Organoider isoleret fra biopsier af forskellige tarmregioner kan dyrkes i tarmchippen7. Følg de procedurer, der er beskrevet i Fujii et al. for isolering af humane tarmkrypter og etablering af organoidkulturer22. Her bruges duodenale og coloniske organoider til at generere henholdsvis tolvfingertarmen og tyktarmschips. I betragtning af den høje batch-til-batch og donor-til-donor-variation i organoiddannelse og vækst foreslås det at udføre en pilotevaluering af celletætheden i organoidsuspensionskulturen (24-brønds pladeformat) for at opnå den optimale såtæthed på 8 millioner celler / ml.

  1. Pilotevaluering af celletal/brønd i statisk organoidkultur.
    BEMÆRK: Følgende procedure er udelukkende at bestemme antallet af brønde af organoid suspensionskultur, der kræves til chipsåningen. De resulterende enkeltceller bør ikke anvendes til chipsåning.
    1. Opsuge supernatanten forsigtigt fra tre brønde på organoidkulturpladen. Der tilsættes 500 μL iskold BMM-dissociationsopløsning (materialetabel) til hver brønd, og brug en plastskraber til at løsne den opløselige BMM fra plasten.
    2. Organoidophænget opsamles i et sterilt konisk rør med lavt proteinbinding ved hjælp af en iskold 1.000 μL pipette. Inkuberes på is i 60 minutter, blandes hvert 15. minut ved forsigtigt at ryste røret. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Aspirere supernatanten og tilsæt 2 ml Trypsin. Inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter for at fordøje organoiderne til enkeltcelleniveauet og tilsæt 10 ml komplet organoidvækstmedium for at stoppe den enzymatiske reaktion. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Resuspender cellepillen i 1 ml komplet organoid vækstmedium og tæl det samlede antal celler ved hjælp af et hæmatocytometer i henhold til standardmetoder.
  2. Fremstilling af organoidfragmenter og deres såning i chippen
    BEMÆRK: Følgende procedurer kan bruges til at frø duodenale eller coloniske organoider i chippens øverste kanal. Etableringen af et epitelmonolag med en in vivo-relevant 3D-cytoarkitektur er betinget af tilstedeværelsen afflow 15,23 og vellykket såning af organoidfragmenter.
    1. Opsuges forsigtigt mediet fra antallet af brønde i den statiske organoidkultur, hvilket er tilstrækkeligt, som bestemt i trin 6.1, til at opnå en endelig såtæthed på 8 millioner celler / ml. Der tilsættes 500 μL iskold BMM-dissociationsopløsning til hver brønd.
    2. Fjern den opløselige BMM fra overfladen af brøndene ved hjælp af en plastskraber eller 1.000 μL pipette. Suspensionen opsamles i et 15 ml konisk rør med lavt proteinindhold.
    3. Opbevar suspensionen på is i 60 minutter, bland hvert 15. minut ved forsigtigt at ryste røret. Der fortsættes til centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. En veldefineret organoidpellet skal være synlig efter centrifugeringen. Hvis der observeres et gennemsigtigt gellag over cellepillen (rester af opløselig BMM) (figur 1B), skal du fortsætte med følgende trin.
      1. Bland supernatanten og cellepelletet, og tilsæt et lige stort volumen BMM-dissociationsopløsning i røret. Bland forsigtigt og opbevar på is i yderligere 10 minutter, og fortsæt til centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
      2. Om nødvendigt gentages trin 6.2.3.1, indtil der ikke er opløselige BMM-rester til stede.
    4. Supernatanten kasseres, og organoidpelleten resuspenderes med organoidfordøjelsesopløsning (se trin 1.5). Brug et tilstrækkeligt volumen organoid fordøjelsesopløsning for at sikre fuldstændig nedsænkning af pelleten. 2 ml opløsning er passende for ca. 2.400-12.000 mellemstore organoider (figur 1D, post-såning). Inkuberes ved 37 °C i 1-3 min.
    5. Tilføj Advanced DMEM / F-12 til røret for at stoppe den enzymatiske reaktion. Brug fire gange volumenet af den anvendte fordøjelsesopløsning. Centrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Aspirere supernatanten og resuspender organoidfragmenterne pellet i et komplet organoidvækstmedium suppleret med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632 for at opnå 8 millioner celler / ml. 360 μL alikvoter af suspensionen fremstilles i sterile 1,5 ml lavproteinbindende rør for at forhindre reduktion af celletæthed på grund af fastgørelse på væggene.
    7. Fjern mediet fra den øverste kanal af de belagte chips. Tilsæt 30 μL cellesuspension i den øverste kanal af hver chip. Inkuber chipsene natten over i en 37 ° C inkubator for at tillade organoidfragmenterne at klæbe til den ECM-belagte membran (figur 1D).

7. Dynamisk kultur af tarmchip - initiering og vedligeholdelse af flow og peristaltiklignende bevægelser

  1. Medieforberedelse og afgasning
    1. For at opretholde konstant laminær strømning gennem chippen skal du lade medietemperaturen afbalanceres til stuetemperatur og derefter udsætte den for vakuumdrevet filtrering i 10 minutter ved hjælp af en vakuumpumpe og PVDF-filterkoniske rør (medieafgasning).
  2. Grunding af bærbare moduler
    BEMÆRK: Bærbare moduler er reservoirer, der fungerer som en grænseflade mellem chipsene og kulturmodulet, hvilket giver mulighed for gentagen prøveudtagning og dosering af medier.
    1. Åbn de bærbare moduler i BSC, og placer dem på kulturmodulbakkerne, som er specialiserede beholdere til justering af de bærbare moduler.
    2. Der tilsættes 3 ml præækvilibreret komplet organoidvækstmedium suppleret med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632 til det øverste indgangsreservoir og 3 ml præækvilibreret endotelcellevækstmedium i bundindløbsreservoiret (figur 1C). Der tilsættes 300 μL af det samme medie i de respektive udløbsreservoirer.
    3. Bring bakkerne til 37 °C inkubatoren, og skub dem ind i kulturmodulet (figur 1C). Brug kontroller på skærmen i kulturmodulet til at køre "Prime Cycle" (1 min lang). Når statuslinjen angiver "Klar", er Prime Cycle afsluttet. Gentag Prime Cycle for at sikre, at der er dannet tilstrækkelige dråber til at forbinde chipsene med succes.
    4. Sørg for, at alle bærbare moduler er primet og har synlige mediedråber.
  3. Indførelse af flow
    BEMÆRK: Flow initieres typisk 24 timer efter såning af organoidfragmenter for at tillade tarmepitelcellerne at fastgøre sig fast til membranen.
    1. Vask begge kanaler i de podede chips med 200 μL af det respektive medie for at fjerne eventuelle bobler eller cellerester. Efterlad små dråber medier på portene efter vask. Skub chipholderen ind i det bærbare modul (figur 1C).
    2. Placer de bærbare moduler på bakkerne og derefter ind i kulturmodulet. Brug kontrollerne på kulturmodulets skærm til at programmere de relevante organchipkulturforhold (strømningshastighed og strækning).
      BEMÆRK: For standard tolvfingertarms- og kolonchipkulturbetingelser indstilles strømningshastigheden til henholdsvis 30 μL/h15 og 60 μL/h16 for både de øverste og nederste kanaler. Strømningshastighederne for hver kanal styres dog uafhængigt og kan indstilles mellem 0-1.000 μL/h. Sprøjte eller peristaltiske pumper kan bruges i stedet for kulturmoduler, der præsenteres her, til at introducere laminær strømning til mikrofluidiske chips. Etablering af pålidelige fluidiske forbindelser mellem chips og pumper ved hjælp af slanger og stik kan dog være teknisk udfordrende, når samtidig perfusion af flere chips er påkrævet.
    3. Start "Reguler cyklus" (2 timer lang), der sætter kulturmediet under tryk i bærbart modul og chip for at forhindre kimdannelse af luftboblerne. Programmerede betingelser genoptages efter afslutningen af reguleringscyklussen.
  4. Medieændring
    1. Forbered friske medier til begge kanaler og genopfyld dem hver 48. time ved at tilsætte 2 ml frisk medium til indløbsreservoirerne (figur 1C).
    2. Sæt kulturmodulerne på pause, og tag bakkerne med til BSC. Aspirer medier i alle reservoirer og genopfyld med friske medier. Bring bakkerne tilbage, og genstart flowet.
  5. Indførelse af strækning
    BEMÆRK: Lad cellerne vokse til 100% sammenløb før påføring af cyklisk stamme. Stretch introduceres typisk 3 dage efter såning eller 48 timer efter initiering af fluidisk kultur. 2% cyklisk belastning ved frekvensen 0, 2 eller 0, 15 Hz, for henholdsvis tolvfingertarmen11 og tyktarm24 tarmchip anvendes til de indledende 24 timer. Det øges derefter yderligere til 10% i den resterende varighed af tarmchipkulturen for at ligne den cykliske stamme, der opleves af tarmepitelceller in vivo (figur 1D)25. Kulturmodulet kan understøtte anvendelse af 2%-12% cyklisk belastning og frekvens på op til 0,4 Hz.
    1. For at introducere strækning til den igangværende fluidiske kultur skal du sætte kulturmodulet på pause. Brug kontroller på skærmen til at ændre strækningsindstillingerne til 2% strækning, 0,2 eller 0,15 Hz frekvens, og genstart kulturmodulet.
    2. Efter 24 timer gentages trin 7.5.1 for at anvende en 10% strækning, 0,2 eller 0,15 Hz frekvens.

8. CYP450 induktion ved hjælp af prototypiske CYP-induktorer i tolvfingertarmen

BEMÆRK: Cytokrom P450 (CYP450) induktionsassay gør det muligt at vurdere, om testforbindelsen øger mRNA-niveauerne og / eller katalytisk aktivitet af specifikke CYP450-enzymer. Her beskriver vi protokollen til evaluering af CYP3A4-induktion ved industristandarden og regulatorens anbefalede in vitro CYP-induktorer , Rifampicin (RIF) og 1,2-dihydroxy vitamin D3 (VD3). Den præsenterede metode kan anvendes til at identificere forskellige testforbindelsers potentiale til at inducere forskellige isoformer af CYP450 i humant tarmvæv. Specifikke sæt primere og sondesubstrat skal vælges for hver enzymisoform, der skal evalueres.

  1. Eksponering for CYP-inducere
    1. Forbered stamopløsninger af 20 mM RIF, 100 mM VD3 og 200 mM testosteron (materialetabel) ved hjælp af steril DMSO.
      FORSIGTIG: Testosteron er et skema III kontrolleret stof. Følg lovgivningsmæssige procedurer under håndtering.
    2. Doseringsmedierne forberedes med CYP-induktorer ved at fortynde stamopløsningerne i komplet organoidvækstmedium og endotelcellevækstmedium for at opnå 20 μM RIF, 100 nmol/L VD3. Forbered køretøjskontrol ved at fortynde DMSO i de respektive medier for at opnå 0,1% af DMSO.
    3. Sæt kulturmodulet på pause, og tag bakkerne med til BSC. Udskift mediet i alle indløbsreservoirer med 2 ml doseringsmedier med inducere eller køretøjskontrol. Sæt de bærbare moduler tilbage til kulturmodulet, og genstart flowet ved 30 μL/t.
    4. Efter 24 timer udskiftes mediet med inducerende opløsning, og trin 8.1.2-8.1.3 gentages. Inducerende opløsninger skal fremstilles friske dagligt og genopfyldes hver 24. time i løbet af eksperimentet, som typisk er 48-72 timer langt.
  2. Inkubation med et prototypisk substrat (testosteron)
    1. På høstdagen forberedes sondesubstratopløsningen af testosteron sammen med tilsvarende inducere i Advanced DMEM/F12 for at give en slutkoncentration på 200 μM. Udelad tilsætning af serum til mediet, da dette kan forstyrre LCMS-analysen.
    2. Bring bakkerne til BSC, og opsuge doseringsmediet fra alle reservoirerne. Vask og udskift de øverste og nederste indløbsreservoirer med henholdsvis varmt Avanceret DMEM/F12 medium og endotelcellevækstmedium.
    3. Vaskemediet fjernes fra beholderne, og det erstattes med 1 ml sondesubstratopløsning, fremstillet i trin 8.2.1. Gennemfør chipsene med en høj strømningshastighed på 1.000 μL / h i 5 minutter, og opsuger både top- og bundudgangsreservoirer. Chipsene returneres til kulturmodulet og inkuberes i 1 time under den konstante strøm på 300 μL /h.
  3. Analyse af data
    1. Prøveindsamling til LCMS-analyse
      1. Aliquot 200 μL stopopløsning indeholdende acetonitril med 0,1% myresyre i formærkede 1,5 ml rør og læg dem på is. Sammensætningen af LCMS-stopopløsningen kan variere afhængigt af det substrat, der skal analyseres.
      2. Når 1 times behandling er afsluttet, skal du stoppe strømmen og bringe bakkerne tilbage til BSC. 100 μL spildevand opsamles fra det øverste udløbsreservoir, og det tilsættes til det tilsvarende rør indeholdende stopopløsningen (figur 2A). Anbring rørene straks på tøris. Prøverne opbevares ved -80 °C, inden de fortsætter med analysen.
      3. Ekstrakt og analyser prøver ved hjælp af enten HPLC- eller LC-MS/MS-teknikker, der overvåger dannelsen af metabolit-6β-hydroxytestosteron (6β-OH-T). CYP-enzymaktivitet kan udtrykkes som pmol/min/mg protein, hvor pmol refererer til mængden af metabolit (6β-OH-T), der dannes under reaktionen. Det samlede proteinindhold pr. chip (protein; mg) bestemmes ved at udføre et Bradford-assay som beskrevet i trin 8.3.2.
        Equation 1
        Fold-induktionsaktiviteten beregnes ved: CYP-aktivitet (induceret) / CYP-aktivitet (køretøj).
      4. Hvis der indsamles prøver til mRNA-analyse, se trin 8.3.3.
    2. Lysis af cellerne til proteinekspressionsanalyse
      BEMÆRK: Proteinekstraktion fra celler på chip udføres ved hjælp af en proteinlysisbuffer suppleret med protease- og fosfatasehæmmere (materialetabel). Ekstraheret protein kvantificeres derefter ved hjælp af Bradford-analysen og anvendes i downstream-analyse.
      1. Fjern chipsene fra bærbare moduler, og læg dem i en petriskål. Vask begge kanaler med 200 μL steril DPBS.
      2. Bloker bundkanalens udløb med en 200 μL filterpipettespids. Smør 50 μL af dissociationsopløsningen gennem bundkanalen og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
      3. Undersøg for at bekræfte fuldstændig løsrivelse af endotelcellerne. Pipetter op og ned 1-2 gange, og fjern dissociationsopløsningen fra kanalen. Gentag vask.
      4. Bloker den øverste kanaludgang med en 200 μL filterpipettespids. Smør 75 μL proteinlysisbuffer gennem den øverste kanal. Lad pipettespidsen være isat for at blokere det øverste kanalindløb og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur. Pipetter op og ned 5-10 gange, og saml cellelysaterne i et formærket 1,5 ml rør.
      5. Trin 8.3.2.4 gentages. indtil fuldstændig løsrivelse af celler er observeret. Cellelysaterne opsamles i det samme 1,5 ml rør, og de opbevares ved -80 °C indtil analyse.
      6. Ekstraher proteinfraktionen i henhold til standardmetoder og kvantificer det samlede protein ved hjælp af Bradford-analysen (Materialetabel).
    3. Lysis af cellerne til genekspressionsanalyse
      BEMÆRK: On-chip celle lysis til RNA-ekstraktion kan opnås ved anvendelse af en RNA-lysisbuffer suppleret med 0,1% 2-mercaptoethanol (materialetabel). Alternativt kan en phenolbaseret RNA-lysisbuffer anvendes, hvis der kræves høje udbytter af RNA af høj kvalitet, der er egnet til NGS- og mikroarrayanalyse.
      1. Følg trin 8.3.2.1 til 8.3.2.2 for at forberede tarmchip til lysis.
      2. Bloker udløbet af den øverste kanal ved hjælp af en 200 μL filterpipettespids. Perfuse 150 μL RNA lysis buffer gennem den øverste kanal. Lad pipettespidsen være sat i for at blokere indløbet til den øverste kanal. Inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur. Til lysis ved anvendelse af en phenolbaseret RNA-lysisbuffer anvendes 350 μL af reagenset.
      3. Pipetter op og ned 5-10 gange, og saml cellelysaterne i et præmærket 1,5 ml rør. Gentag trinnet med yderligere 150 μL RNA lysis buffer og saml. Cellelysaterne opbevares ved -80 °C indtil analyse. I tilfælde af efterfølgende RNA-sekventeringsanalyse skal du fortsætte med analysen inden for 1 måned efter lysning.
      4. Ekstraher total RNA fra cellelysaterne ved hjælp af et RNA-oprensningssæt.
      5. Omvendt transskribering til cDNA ved hjælp af et omvendt transkriptasesæt og udfør PCR i realtid ved hjælp af en PCR-cyklist i realtid og de relevante primere og buffer. Kvantificer resultaterne ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden .

9. Forstyrrelse af epitelbarrieren ved hjælp af proinflammatoriske cytokiner i tyktarmschip

BEMÆRK: Denne protokol beskriver forstyrrelse af tarmepitelbarrieren af cytokininterferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Cytokinet doseres i den nederste kanal af tyktarmschippen givet det basolaterale udtryk af IFNγ-receptoren på tarmepitelceller.  Den proinflammatoriske stimulus introduceres i chippen på kulturens dag 5, så snartP-appen er stabiliseret under 0,5 x 10-6 cm/s. Et lignende doseringsregime kan anvendes til andre proinflammatoriske cytokiner og barriereforstyrrende midler.

  1. Stimulering med IFNγ
    1. Der fremstilles en 100 μg/ml stamopløsning af IFNγ (Material Table of Materials) i sterilt cellekulturvand. Lageropløsningen opbevares ved -80 °C i løbet af eksperimentet. For hvert eksperiment skal du altid bruge et frisk lager af IFNγ og undgå mere end tre fryse- og optøningscyklusser.
    2. Der fremstilles IFNγ-doseringsopløsning ved fortynding af stamopløsning i afgasset endotelcellevækstmedium for at opnå en slutkoncentration på 10-100 ng/ml.
    3. Bring bakkerne til BSC, og fjern mediet fra bundkanalindløbsreservoirerne, og udskift det med 3 ml IFNγ-indeholdende medium. Opdater IFNγ-doseringsmediet dagligt.
    4. Placer bakkerne i kulturmodulet, og gennembor chipsene med en høj strømningshastighed på 1.000 μL/t i 5 minutter for at starte IFNγ-behandlingen. Skift strømningshastigheden tilbage til 60 μL/h, og fortsæt den fluidiske kultur.
  2. Analyse af data
    1. Vurdering af epitelbarrierefunktionen. Epitelets tilsyneladende permeabilitet (Papp) eller barrierefunktion kan måles på forskellige tidspunkter i kulturen efter behandling med IFNγ i spildevandsmediet i begge kanalers indløbs- og udløbsreservoirer. Det fluorescerende sporstof skal tilsættes til det øverste kanal organoidvækstmedium 4 timer før vurderingen afP-appen. Typisk anvendes 3 kDa Dextran Cascade Blue som fluorescerende sporstof og tilsættes i mediet 24 timer før.
      1. Sæt kulturmodulet på pause, og tag bakkerne med til BSC.
      2. Mærk og tilbered en 96-brønd sortvægget plade med 100 μL DPBS pr. Brønd. Ved hjælp af en 200 μL flerkanalspipette opsamles og tilsættes 50 μL spildevand fra alle reservoirerne til de respektive brønde (figur 2B).
      3. For at forberede standardkurven fortyndes mediet indeholdende 100 μg/ml 3 kDa dextran Cascade Blue 1:3 i DPBS. Udfør derefter serielle fortyndinger ved anvendelse af en tredobbelt fortynding af endotelcellevækstmedium i DPBS.
      4. Aflæs fluorescensen ved 375 nm excitering og 420 nm emission ved hjælp af en pladelæser. Brug de målte OD-værdier til at beregne tilsyneladende permeabilitet (P-app) som følger:
        Equation 2
    2. Immunofluorescensfarvning af celler på chip
      1. Vask med 200 μL DPBS for hver kanal tre gange.
      2. Smør 200 μL af den fikserende opløsning (4% PFA i DPBS) i hver kanal. Inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
      3. Vasketrin 9.2.2.1 gentages. På dette tidspunkt kan vaskede chips opbevares i op til 7 dage ved 4 °C.
      4. Permeabiliser cellerne ved hjælp af 200 μL permeabiliseringsopløsning (0,1% Triton-X 100 i 10% normalt æselserum (NDS) i DPBS) for hver kanal. Inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Vasketrin 9.2.2.1 gentages.
      5. Bloker cellerne på chippen ved hjælp af 200 μL blokeringsopløsning (10% NDS i DPBS) for hver kanal. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
      6. Fortynd de primære antistoffer i antistofopløsning (5% NDS i DPBS) som følger: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epitel tæt krydsmarkør), anti-Occludin (1:100, epitel tæt krydsmarkør), anti-Claudin 4 (1:100, epitel tæt krydsmarkør), anti-E-cadherin (1:100, epitelial klæbende krydsmarkør (Materialetabel). 200 μL af den primære antistofopløsning gennem hver kanal inkuberes natten over ved 4 °C. Vasketrin 9.2.2.1 gentages.
      7. Fortynd de sekundære antistoffer i antistofopløsning (1:300, 5% NDS i DPBS). Smør 200 μL af denne opløsning gennem hver kanal og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Vasketrin 9.2.2.1 gentages. Om ønsket kan phalloidin, en cytoskeletal markør, tilsættes til den sekundære antistofopløsning.
      8. Der fremstilles en 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) opløsning i DPBS og anvendes til at gennemtrænge 200 μL gennem hver kanal. Inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Gentag vasketrinnet. På dette tidspunkt kan farvede chips opbevares i op til 14 dage ved 4 ° C.
    3. Vurdering af Kaspase 3 kavalergang
      1. Den samlede mængde protein i epitelceller isoleres og kvantificeres som beskrevet i trin 8.3.2. Vasketrin 8.3.2.1 udelades. Prøverne fortyndes med DPBS til en slutkoncentration på 400 μg/ml.
      2. Kvantificer niveauerne af total og spaltet caspase 3 ved hjælp af caspase 3 detektionssæt efter producentens protokol.
    4. Vurdering af proinflammatorisk cytokinsekretion
      1. Brug spildevandet opsamlet fra udløbet af begge kanaler i tyktarmschippen til at kvantificere udskillede proinflammatoriske cytokiner i akut fase efter protokoller fra producenten. Udfør en 5 gange fortynding for V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit og en dobbelt fortynding for V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1D opsummerer tidslinjen for tarmchipkulturen og illustrerer tarmendotelcellerne og organoiderne før og ved såning på chippen. Desuden demonstrerer det de forskellige morfologiske forskelle mellem tolvfingertarmen og tyktarmschips, fremhævet af tilstedeværelsen af de villi-lignende formationer i tolvfingertarmen og repræsentativ for tyndtarmsarkitekturen.

Figur 3A,B viser fold CYP3A4 induktionsresponser i tolvfingertarmen chip fra tre forskellige organoid donorer. Chipsene blev udsat for 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timer og blev brugt til at vurdere mRNA-niveauerne (A) og/eller cyp450-enzymets foldkatalytiske aktivitet (B). Øgede niveauer af testosteronmetabolit, 6β-hydroxytestosteron (6β-OH-T), i overensstemmelse med den forhøjede CYP3A4 mRNA-genekspression blev observeret i tolvfingertarmschippen udsat for RIF og VD3, hvilket indikerer passende induktionsrespons på tværs af alle tre testede donorer. Midlerne ± SEM på n = 3 biologisk uafhængige chips er vist.

Figur 4 viser de repræsentative resultater for modellering af det utætte tarmsyndrom i tyktarmschippen, herunder (A, C) ændringer i epitelcellemorfologi og tæt forbindelsesintegritet, (B) fald i barrierefunktionen, (D) induktion af apoptose og (E) øget cytokinsekretion som reaktion på IFNγ-behandlingen.

Figur 4A viser repræsentative brightfield-billeder af det kontrol- og IFNγ-behandlede (50 ng/ml, 48 h) epitelmonolag i tyktarmschippen. Chipsene blev fjernet fra kulturmodulet, og epitelmorfologien blev vurderet under mikroskopet dagligt. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et brightfield mikroskop og et 10x mål. Kolonchips behandlet med IFNγ viser en kompromitteret cellemorfologi og tab af det søjleformede epitel.

Figur 4B viser et repræsentativt resultat af det tilsyneladende permeabilitetsassay udført på tyktarmschips dyrket under baselinebetingelser eller ved stimulering med IFNγ. 3 kDa Dextran Cascade Blue tracer blev tilsat til det øverste kanalreservoir til en slutkoncentration på 100 μg/ml. IFNγ i en slutkoncentration på 50 ng/ml blev doseret i den nederste kanal på kulturdagen 5. Chips blev perfunderet ved 60 ml / t. Dernæst blev medierne indsamlet dagligt (op til dag 72 timer efter eksponering) fra indløbs- og udløbsreservoirer i både de øverste og nederste kanaler. 50 μL af hver prøve blev indsamlet, behandlet som beskrevet i trin 9.2.1 i protokollen og undersøgt for fluorescens ved 375-420 nm ved hjælp af en pladelæser. En signifikant stigning i epitel paracellulær permeabilitet blev observeret efter 48 timers IFNγ-stimulering.

Figur 4C viser repræsentative immunfluorescerende billeder af epiteltætheden (Zonula Occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) og tilhængere (E-cadherin) kryds i kontrol og IFNγ-behandlede (50 ng / ml, 48 h) kolonchip. Chipsene blev fikseret med 4% Paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved stuetemperatur og viderebehandlet som beskrevet i trin 9.2.2 i protokollen. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et konfokalt mikroskop og 20x langdistancemål og behandlet ved hjælp af Fiji version 2.0 i henhold til standardprotokoller. Behandling med IFNγ udløser forskydning af ZO-1 og Claudin-4 og internalisering af Occludin og E-cadherin, som det fremgår af det øgede cytoplasmatiske signal.

Figur 4D repræsenterer tidsforløbet for Caspase 3-spaltning i tyktarmschip som reaktion på 50 ng / ml IFNγ, der indikerer apoptoseaktivering. Epitelceller blev lyset på chipsene, og proteinprøver blev oprenset efter standardmetoder. Det intracellulære indhold af den totale og spaltede Caspase 3 blev målt som beskrevet i trin 9.2.3 i protokollen. IFNγ inducerer aktivering af apoptose, som beskrevet tidligere29, i kolonepitelcellerne dyrket på chippen efter 48 timers stimulering.

Figur 4E viser tidsforløbet for cytokinets sekretion fra tyktarmschippen ved stimulering med 50 ng / ml IFNγ. 200 μL spildevandsmedier blev indsamlet dagligt fra udløbsreservoirerne i både top- og bundkanaler. Spildevandsprøver blev opbevaret ved -80 °C og 24 timer, før analysen blev optøet natten over ved 4 °C. Cytokinniveauerne i chipkulturmediet blev vurderet ved hjælp af Meso Scale Discovery-teknologi som beskrevet i trin 9.2.4 i protokollen. IFNγ inducerede en polariseret sekretion af proinflammatoriske molekyler i tyktarmschippen, som vist ved den basolaterale sekretion af vaskulær celleadhæsionsprotein 1 (VCAM-1) og interleukin 6 (IL-6) og apikal sekretion af intercellulært adhæsionsmolekyle 1 (ICAM-1) og serumamyloidprotein A (SAA). Serumniveauer af de opløselige former for VCAM-1, ICAM-1, IL-6 og SAA anvendes i kliniske laboratorier som indikator for inflammation30,31.

Figure 1
Figur 1: Etablering af tarmchippen15,16. (A) Skematisk af chipaktivering og belægning. Kort fortalt placeres chipsene i en chipholder, perfunderes med ER1-opløsning og aktiveres under UV-lys. Derefter vaskes chipsene med ER2 og DPBS. Endelig er chipsene belagt med en iskold ECM-opløsning, der er specifik for hver celletype, og inkuberes natten over ved 37 ° C. (B) Skematisk, der viser processen med at indføre organoider i chippen. Organoider overføres fra 24-brøndpladen til et konisk rør og inkuberes på is i nærværelse af BMM-dissociationsopløsningen for at genvinde organoider fra den opløselige BMM. Organoid suspension centrifugeres derefter og evalueres for tilstedeværelsen af opløselige BMM-rester. Hvis et gennemsigtigt lag af BMM stadig er synligt over cellepillen, skal processen gentages. Hvis der observeres en veldefineret pellet uden synlige gelrester, dissocieres organoider enzymatisk og indføres i chippens øverste kanal (blå). Chippens bundkanal (magenta) er podet med vævsspecifikke mikrovaskulære endotelceller. (C) Skematisk, der viser forbindelsen mellem chipsene og kulturmodulet, som understøtter medieflow og cyklisk peristaltiklignende strækning. Grundingscyklussen muliggør generering af cellekulturmediumdråberne over chipportene og i slutningen af de bærbare modulmodstande. Dette sikrer oprettelsen af væske-væske-grænsefladen mellem chippen og det bærbare modul, hvilket letter chippen, der glider ind i modulet og deres sikre forbindelse. Til sidst placeres de bærbare moduler i bakker, og bakker indsættes i kulturmodulet. (D) Eksperimentel tidslinje, der fremhæver de vigtigste skridt til etablering af den biopsiafledte tarmchipplatform, herunder tolvfingertarmen og tyktarmschippen. Brightfield-billeder illustrerer endotel- og organoidafledte celler på dag 0, før og efter såning i chippen, samt dannelsen af sammenløbs- og 3D-epitelvæv på dag 8 af chipkulturen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Opsamling af spildevandsmedier fra tarmchippen. (A) Skematisk afbildning af opsamling af medieudløb fra det bærbare modul. Medier opsamles fra udløbsreservoirerne i den øverste og nederste kanal og opbevares ved -80 °C indtil yderligere ELISA- eller LC-MS/LC-MS/MS-analyse. (B) Skematisk, der viser opsamlingen af spildevandsprøver ved hjælp af en multikanalpipette og deres overførsel til en 96-brønd sortvægget plade til downstream-vurdering af epitel tilsyneladende permeabilitet (Papp). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: CYP3A4 induktion i tolvfingertarmen chip15. (A) Induktion af CYP3A4 mRNA niveauer i tolvfingertarmen chip ved 48 timers eksponering for 20 μM RIF og 100 nM VD3. Gennemsnitlig ± SEM, N = 3 chips /tilstand / donor, Tovejs ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001 (sammenlignet på tværs af DMSO-kontroller). (B) Induktion af CYP3A4-aktivitet i tolvfingertarmschippen eksponeret for prototypiske induktorer som vurderet ved LC-MS/MS-kvantificering af probesubstratmetabolit: 6β-hydroxytestosteron. En signifikant stigning i CYP3A4-aktivitet blev observeret i tolvfingertarmschippen behandlet med 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timer. Middel ± SEM, N = 3 chips/tilstand/donor, Tovejs ANOVA, Tukeys post hoc test, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Forstyrrelse af epitelbarrieren i tyktarmschippen ved hjælp af IFNγ16. (A) Brightfield-billeder, der viser epitelcellernes morfologi under baselinebetingelser og ved stimulering med 50 ng / ml IFNγ i 48 timer. Skalabjælke: 100 μm. (B) Tilsyneladende permeabilitet af epitelbarrieren til 3 kDa Dextran i løbet af en 72 timers stimulering med 50 ng / ml IFNγ. Gennemsnitlig ± 95% CI, N = 5-9 chips/tilstand, Tovejs ANOVA, Tukeys post hoc test, ****p < 0,0001. (C) Immunofluorescensbilleder, der viser forstyrrelsen af epiteltætheden og klæbende kryds ved stimulering med 50 ng / ml IFNγ i 48 timer. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (rød) tætte kryds, E-cadherin (rød) klæber kryds, Occludin (rød) tætte kryds, Claudin-4 (rød) tætte kryds, 4 ′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (blå) kerner. Skala bar: 50 μm. (D) Induktion af Caspase 3 spaltning i tyktarmschip ved behandling med 50 ng / ml IFNγ. Fire forskellige tidspunkter blev vurderet på tværs af 72 timers eksponering. Middel ± 95% CI, N = 3-6 chips/ tilstand, Tovejs ANOVA, Tukeys post hoc test, ****p < 0,0001. (E) Øget sekretion af cytokiner: Vaskulær celleadhæsionsprotein 1 (VCAM-1) og Interleukin 6 (IL-6) i den nederste kanal og Intercellulært vedhæftningsmolekyle 1 (ICAM-1) og serumamyloidprotein A (SAA) i det øverste kanaludløbsmedie i løbet af en 72 timers stimulering af tyktarmschippen med 50 ng / ml IFNγ. Middel ± 95% CI, N = 3 chips/ tilstand, Tovejs ANOVA, Tukeys post hoc test, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinationen af organ-on-a-chip-teknologi og tarmorganoider giver løfte om nøjagtig modellering af human tarmfysiologi og patofysiologi. Her giver vi en enkel og robust trin-for-trin protokol (skitseret i figur 1) til etablering af tarmchippen indeholdende biopsiafledt tyndtarms- eller koloneepitelim og intestinale mikrovaskulære endotelceller, der er dyrket i en mikrofluidisk enhed. Denne chipbaserede simulering af den menneskelige tarm inkorporerer fysiologiske, luminale og vaskulære strømme og peristaltiklignende bevægelser. Derudover beskriver vi procedurer til vurdering af kritiske tarmfunktioner, såsom lægemiddelmetabolisme i tolvfingertarmen og barrierefunktion i tyktarmschippen.

For at rekapitulere epitel-endotelcellulære interaktioner, som er afgørende for vedligeholdelsen af tarmhomeostase og derfor den nøjagtige modellering af tarmvæv på chip, er det afgørende at etablere funktionelle og intakte cellemonolag på begge sider af PDMS-membranen. Det første skridt mod vellykket chipsåning er kemisk aktivering af PDMS-overfladen, der muliggør udvikling af en stabil forbindelse mellem PDMS-overfladen og ECM-proteiner. Forkert aktivering kan hæmme fastgørelsen af celler og resultere i dannelsen af ufuldstændige cellulære monolag. Aktiveringsopløsningen skal fremstilles frisk, da den er lysfølsom og tilbøjelig til nedbrydning. Under UV-aktivering og efterfølgende ECM-belægning er det vigtigt at sikre en jævn fordeling af reagenser inden for hver kanal. Den specifikke sammensætning og koncentration af opløsninger, der anvendes til at belægge de øverste og nederste kanaler, er optimeret til at passe til behovene i henholdsvis epitel- og endotelcellerne. Hvis der kræves ændringer i tarmchippens cellulære sammensætning, skal ECM-betingelserne muligvis optimeres for at opnå optimale resultater.

Efter ECM-belægning er det vigtigt at så HIMEC'er ved høj cellesåningstæthed (8 x 106 celler / ml) for at opnå et komplet og homogent monolag på undersiden af PDMS-membranen. Hvis der ikke opnås fuld cellesammenløb, sammenløb, anbefales det yderligere at øge densiteten af endotelcellesuspensionen under såning eller at forsinke såning af organoidfragmenter i chippens øverste kanal, indtil HIMEC'er bliver fuldt sammenflydende. Anvendelse af fragmenterede organoider, snarere end suspension af enkeltceller opnået gennem enzymatisk fordøjelse af organoider, blev tidligere vist at forbedre succesen og reproducerbarheden af tarmmonolagsdannelsen i tarmchippen14. Derfor anbefales det kraftigt at overvåge organoidfordøjelsesprocessen nøje for at sikre den optimale inkubationstid med enzymet, hvilket resulterer i organoidfragmenter sammensat af omkring 10-30 celler (40-100 μm i størrelse). Utilstrækkelig dissociation kan resultere i reformation af den cystiske organoidstruktur i de mikrofluidiske chips i stedet for det ønskede monolag. Derudover er det afgørende at undgå overdreven organoid dissociation i enkeltceller, der kan føre til nedsat celleoverlevelse, genopretning og manglende dannelse af sammenflydende monolag i chippen.

Inkorporering af væskestrøm (forskydningsspænding) og cyklisk belastning i tarmchipkulturen, understøttet ved hjælp af kulturmodulet, har vist sig at forbedre dannelsen af den funktionelle tarmbarriere og fremme den spontane udvikling af epitelvævets 3D-arkitektur13. Men når man udfører mikrofluidiske eksperimenter med brugen af organer-på-chips, er det afgørende at forvarme og afgasse cellekulturmediet før brug for at undgå dannelse af mikrobobler i kanalerne, hvilket kan føre til cellulær stress eller endda løsrivelse fra membranen.

Udover de specifikke anvendelser, der er vist her, kan tarmchipmodellen bruges til at løse en række videnskabelige spørgsmål, fra grundvidenskab til opdagelse og test af nye lægemidler eller lægemiddelleveringsteknologier. Det kan lette undersøgelser af human tarmudvikling, stamcellemodning og epitelcellefunktion; især i forbindelse med evaluering af mekanikernes rolle i tarmvævets vækst og homeostase. Nylige opdagelser afslørede, at dynamisk ligevægt i det sunde tarmepitelatel er afhængig af dets evne til præcist at koordinere forskellige kræfter, der definerer krypt-villi-arkitektur, opdele celletyper, direkte cellemigration og regulere celleidentitet, proliferation og død i rum og tid32. Tarmchippen giver mulighed for bedre at belyse samspillet mellem mekaniske kræfter (f.eks. Spænding eller forskydningsspænding), celleskæbne og funktion til at besvare nogle af mange fascinerende spørgsmål, der forbliver inden for det nye felt af tarmmekanobiologi. Desuden kan det give mulighed for undersøgelser af sensing og tarmtransportprocesser takket være tilstedeværelsen af hormonudskillende enteroendokrine celler og korrekt lokalisering af forskellige næringstransportører15,16. Tarmchipmodellen kan også modificeres til at inkorporere immunceller såvel som kommensale eller patogene mikroorganismer til undersøgelser af tarminflammatoriske lidelser, værtspatogen og værtsmikrobiominteraktioner samt til præcist at forudsige off-target toksiciteter af immuno-onkologiske produkter, som tidligere vist 17,20,33,34,35.

Derudover kan brugen af kliniske biopsiprøver fra personer med specifikke genotypiske og fænotypiske egenskaber muliggøre analyse af patientspecifikke sygdomsmekanismer samt respons på terapier og derved bidrage til at fremme personlig medicin i fremtiden.

Den største begrænsning ved denne metode er, at fragmenter fra et stort antal organoider (~ 60-80) er nødvendige for at danne et sammenflydende tarmepitel på hver chip. Dette skyldes, at organoidfragmenter kræver såning med høj densitet for at sikre, at et tilstrækkeligt antal tarmstamceller er til stede for at understøtte den proliferative ekspansion af monolaget og etableringen af en 3D-vævsarkitektur. Et fuldt differentieret tarmepitel på en chip besidder alle de vigtigste tarmepitelcelletyper (absorberende enterocytter, Paneth-celler, bægerceller og enteroendokrine celler) og transkriptionsprofil, der ligner in vivo-modstykket . Den nuværende model mangler dog stadig andre vigtige komponenter i den levende tarm, herunder tarmfibroblaster, residente immunceller (fx makrofager, intraepiteliale lymfocytter og dendritiske celler) og det enteriske nervesystem.

Selvom disse er potentielle ulemper, har tidligere undersøgelser vist, at kraften i Organ-on-a-Chip-teknologitilgangen ligger i dens evne til at efterligne den strukturelle og funktionelle kompleksitet af menneskelige organer ved gradvist at integrere forskellige komponenter i in vivo-væv og deres mikromiljø en efter en36,37. Denne syntetiske biologiske tilgang til in vitro vævsteknik giver en måde at studere bidraget fra individuelle cellulære og molekylære komponenter til fysiologiske og patofysiologiske reaktioner på organniveau på forskellige niveauer af systemkompleksitet. Desuden giver det mulighed for, at den biokemiske, genetiske og mikroskopiske analyse af de interagerende væv udføres individuelt og i realtid og får indsigt i, hvordan intercellulære signaler og vævsvævsinteraktioner bidrager til specifik adfærd på organniveau. Et andet bemærkelsesværdigt kendetegn ved tarmchipteknologi er alsidighed. Præcis kontrol over mikromiljøelementer muliggør finjustering af mediestrømningshastigheder og belastningsparametre for at reproducere naturlige kræfter, der opleves af celler i menneskekroppen, såsom forskydningsspændingen, der registreres af endotelcellerne udsat for blodgennemstrømning og tarmvævets cykliske peristaltiske bevægelser. Desuden muliggør synergistisk teknik af organoider og organer-på-chips oprettelse af vaskulariserede organer-på-chips, der repræsenterer forskellige regioner af tarmvæv, der kunne være flydende forbundet med hinanden for at studere fysiologiske interaktioner mellem tyndtarmen og tyktarmen. Således mener vi, at tarmchippen repræsenterer en overlegen model af tarmepitelet og kan hjælpe med at implementere 3R'erne (reduktion, raffinement og erstatning) -princippet i grundvidenskaben såvel som i den prækliniske og lovgivningsmæssige opsætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi og Magdalena Kasendra er nuværende eller tidligere ansatte i Emulate Inc. og kan have egenkapital. Emulate Inc. er det firma, der fremstiller organchipenhederne og har offentliggjort patenter, der er relevante for det arbejde, der er angivet i denne artikel.

Acknowledgments

Vi takker professor Mark Donowitz for at levere de intestinale biopsiafledte organoider og Brett Clair for at designe de videnskabelige illustrationer af chip-, bærbar- og kulturmodulet. Alle de øvrige videnskabelige illustrationer blev genereret ved hjælp af BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Tags

Bioengineering udgave 183
Kombination af humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi til modellering af tarmregionsspecifik funktionalitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter