Summary
Vi presenterer en protokoll for implementering av interferensrefleksjonsmikroskopi og total-intern-refleksjon-fluorescensmikroskopi for samtidig avbildning av dynamiske mikrotubuler og fluorescerende merkede mikrotubule-assosierte proteiner.
Abstract
Flere teknikker har blitt brukt for direkte visualisering av cytoskeletale filamenter og deres tilknyttede proteiner. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) mikroskopi har et høyt signal-til-bakgrunn-forhold, men det lider av fotobleaching og fotodamage av fluorescerende proteiner. Etikettfrie teknikker som interferensrefleksjonsmikroskopi (IRM) og interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT) omgår problemet med fotobleaching, men kan ikke lett visualisere enkeltmolekyler. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å kombinere IRM med et kommersielt TIRF-mikroskop for samtidig avbildning av mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer) og dynamiske mikrotubuler in vitro. Denne protokollen muliggjør høyhastighetsobservasjon av MAPer som samhandler med dynamiske mikrotubuler. Dette forbedrer eksisterende tofargede TIRF-oppsett ved å eliminere både behovet for mikrotubul merking og behovet for flere ekstra optiske komponenter, for eksempel en ekstra eksitasjonslaser. Begge kanalene er avbildet på samme kamerabrikke for å unngå problemer med bilderegistrering og bildesynkronisering. Dette oppsettet demonstreres ved å visualisere enkeltkinesinmolekyler som går på dynamiske mikrotubuler.
Introduction
Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) mikroskopi brukes vanligvis til visualisering av enkelt fluorescerende molekyler. Sammenlignet med epifluorescence-avbildning oppnår TIRF overlegen bakgrunnsundertrykking, noe som muliggjør lokalisering og sporing av enkeltfluoforer med høy oppløsning. Av denne grunn er TIRF den foretrukne metoden for å visualisere fluorescerende merket mikrotubule-assosierte proteiner og brukes ofte til å avbilde mikrotubuler 1,2.
For å undersøke reguleringen av mikrotubuledynamikk av MAPer, er det ofte nødvendig å avbilde både mikrotubuler og MAPer samtidig. De fleste eksisterende metoder for dette formålet er dyre eller lider av tekniske ulemper. Samtidig tofarget TIRF krever for eksempel to eksitasjonslasere og to kameraer. I tillegg til den høye prisen, utgjør behovet for separate kameraer rammesynkronisering og bilderegistreringsproblemer. Dette behovet kan omgås hvis en roterende filterkube brukes til fysisk å bytte mellom eksitasjonslasere i påfølgende rammer3. I et slikt oppsett kan en enkelt kamerabrikke brukes, og rammene veksler mellom bilder av mikrotubuler og MAPer. Denne teknikken er imidlertid begrenset av hastigheten på filterendringen, som vanligvis begrenser bildefrekvensen til mindre enn 0,5 bilder per sekund3 (fps). En slik bildefrekvens er utilstrekkelig til å løse raske dynamiske prosesser, for eksempel krymping av en mikrotubule som forekommer med en hastighet på opptil 500 nm / s, vandring av kinesin med en hastighet på størrelse med 800 nm / s, eller diffusjonen av et MAP som forekommer med diffusjonskoeffisienter over 0,3 μm2 / s4. Dette er spesielt problematisk når du sporer de relative posisjonene til to bevegelige mål i hver kanal, for eksempel posisjonen til et MAP i forhold til posisjonen til en bevegelig mikrotubulspiss5.
I tillegg til disse optiske begrensningene krever tofarget TIRF-mikroskopi at MAPer og mikrotubuler merkes med forskjellige fluoroforer hvis utslippsspektra er tilstrekkelig separert. Fluorescerende merking av tubulin kan endre mikrotubuldynamikk6, og fotobleaching av fluoroforer begrenser bildehastigheten7. På grunn av disse problemene er etikettfrie avbildningsteknikker utviklet for å visualisere mikrotubuler. Disse inkluderer interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)8,9, roterende-sammenhengende spredningsmikroskopi (ROCS)10, mikroskopi for romlig lysinterferens (SLIM)11 og interferensrefleksjonsmikroskopi (IRM)12,13. Disse teknikkene tillater rask etikettfri avbildning av mikrotubuler uten ulemper ved fluorescensavbildning, men de kan ikke brukes til å visualisere enkle MAPer.
Av disse etikettfrie teknikkene skiller IRM seg ut for sine lave kostnader og beskjedne krav til instrumentering. Vi har nylig presentert en protokoll for å kombinere IRM med et kommersielt TIRF-mikroskop, slik at mikrotubuler og fluorescerende MAPer kan avbildes i vekslende rammer 3,13. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å endre dette oppsettet for samtidig å ta TIRF- og IRM-bilder samtidig på én enkelt kamerabrikke. Dette innebærer å legge til en billig strålesplitter i eksitasjonsbanen for samtidig å belyse prøven med en TIRF-laser og en IRM LED-lyskilde. En modifisert kommersiell bildesplitter brukes til å skille TIRF- og IRM-signalene og projisere dem på separate halvdeler av samme kamerabrikke. Vi bruker også et mikrofluidisk system som tillater rask utveksling av reagenser under avbildning. Denne protokollen beskriver hvordan dette oppsettet kan brukes til å avbildning av dynamiske mikrotubuler og MAPer. Apparatets evne demonstreres ved å presentere den første visualiseringen av kinesin-1 proteiner som går på krympende mikrotubuler, som fanges med en bildefrekvens på 10 s-1.
Protocol
1. Forberedelse av strømningskamre
MERK: Mikrofluidiske strømningskamre vil bli konstruert ved å følge mikrokanal av polydimetylsiloksan (PDMS) til et rengjort og funksjonalisert dekselglass. Mikrokanalene vil bli støpt i en mesterform.
-
Utarbeidelse av PDMS-kanaler
- Forbered rene og/eller funksjonaliserte dekselbriller med overflatekjemi som passer til den spesifikke analysen som blir avbildet.
MERK: For kinesinmotilitetsanalyser brukes piranha-rensede silaniserte dekselbriller. Disse er utarbeidet som beskrevet i Gell et. al.1 Alternativt er en enklere prosedyre å sonikere dekkbriller i isopropanol etterfulgt av metanol i 3x 20 min sykluser. - For å forberede en mesterform, kutt strimler av ensidig stasjonær tape til ønsket strømningskanalstørrelse. Fest strimlene til bunnen av en 10 cm Petri-tallerken, ordne dem side-til-side med minst 1 cm avstand mellom strimlene.
MERK: Hvis det er behov for nøyaktige kanaldimensjoner, kan formen fremstilles på silisiumskiver ved hjelp av fotolitografi14. - For å forberede PDMS-polymeren, kombiner herdemiddelet og baseelastomeren i et 1: 10 masseforhold. Bland i 2 min.
MERK: Dette blandingsforholdet kan varieres for å justere polymerens stivhet. Et høyere forhold mellom base og herdemiddel resulterer i en mykere polymer. - Degas blandingen i et vakuumkammer til alle bobler forsvinner.
- Hell blandingen på mesterformen i et ~ 0,5 cm tykt lag, pass på å unngå å lage bobler.
- Stek blandingen i en forvarmet ovn ved 70 °C i 40 minutter.
MERK: En lengre herdetid kan være nødvendig hvis PDMS-blokken er tykk (>1 cm). Fortsett oppvarmingen i trinn på 5 minutter til den er fullstendig herdet. - Klipp ut de strukturerte områdene av polymeren. Hull hull i hver ende av kanalen ved hjelp av en PDMS-stanser.
MERK: I denne protokollen er hulldiameteren satt til 0,75 mm og kan justeres i henhold til de nødvendige strømningshastighetene. PDMS-kanaler kan lagres i tørre omgivelser i lengre perioder, men bør rengjøres før bruk. - Rengjør den strukturerte siden av PDMS-blokken. Bruk stasjonær tape for å fjerne store partikler. Skyll med isopropanol og metanol. Gjenta disse skyllene 3x, skyll med ultrarent vann og føn overflaten.
- Plasma rengjør PDMS ved hjelp av oksygen eller luftplasma.
MERK: I denne protokollen brukes 18 W luftplasma. - Plasser plasmarengjort PDMS på et passende rengjort dekselglass og varm på en kokeplate ved 80 °C i 15 minutter.
MERK: Epoksyharpiks kan påføres sidene av PDMS-blokken for bedre å feste den til dekkglasset. - Sett inn LDPE-slanger (low-density polyetylen) med riktig størrelse i hullene. Koble utløpsslangen til en 0,5 ml sprøyte.
MERK: I denne protokollen kobles rør med en indre diameter på 0,023 tommer til PDMS via en 0,025 i metalladapter med ytre diameter. - Strømningsløsninger inn i mikrokanallene ved å nedsenke innløpsrøret i løsningen og tegne det nødvendige volumet med sprøyten.
- Forbered rene og/eller funksjonaliserte dekselbriller med overflatekjemi som passer til den spesifikke analysen som blir avbildet.
2. Optisk oppsett
-
Modifikasjon av mikroskopet (figur 1)
- Endre et TIRF-mikroskop for å aktivere IRM-avbildning13. Bytt ut strålesplitteren 50/50 (Refleks (R)/Transmission (T)) som brukes i mikroskopets filterhjul med en 10/90 (R/T) bjelkesplitter.
- Sett inn en bildesplitter mellom kameraet og mikroskopet.
- Sett inn en 10/90 (R/T) strålesplitter i filterkuben på bildesplitteren. Plasser et 600 nm langpassfilter foran den reflekterte strålen og et passende fluorescensutslippsfilter foran den overførte strålen.
MERK: Beam splittere med forskjellige R / T-forhold kan brukes til å justere fraksjonene av IRM- og TIRF-utslippslyset som samles inn. - Juster bildesplitteren i henhold til produsentens spesifikasjoner for å skille TIRF- og IRM-signalene på kamerabrikken på en romlig avstand.
MERK: Romlig separasjon av signalene er nødvendig fordi TIRF-signalet til typiske fluoroforer er mye svakere enn IRM-signalet til en mikrotubul og ikke ville være påviselig hvis de to signalene ble overlagt.
3. Avbildning av dynamiske mikrotubuler og enkle Kinesinmolekyler
- Overflatefunksjonalisering og passivisering
- Flow BRB80 buffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, titrert til pH 7,8 med NaOH) inn i reaksjonskammeret.
- Strømningsantibiotinoppløsning fortynnet til 0,025 mg/ml i BRB80 og inkuber ved romtemperatur i 10 min.
- Vask kanalen med BRB80.
- Strømning i F-127-oppløsning (1% Pluronic F-127 (w/v) oppløst i BRB80 over natten) og inkuberes i minst 20 minutter for overflate passivasjon.
MERK: Hvis lettrengjorte dekselglass brukes i stedet for silaniserte dekselglass, passiviseres ved hjelp av 2 mg /ml kasein i BRB80 i >20 min ved romtemperatur. - Vask kanalen med BRB80.
- Forberedelse for avbildning
- Hvis temperaturkontroll er nødvendig, bruk en objektiv varmeapparat og sett den til riktig temperatur.
MERK: I denne protokollen utføres alle forsøkene ved 28 °C. - Plasser prøven på mikroskopstadiet og slå på epiilluminasjonslyskilden (>600 nm) for IRM-avbildning.
MERK: I denne protokollen brukes en hvit LED-lyskilde med et 600 nm langpassfilter. - Fokuser mikroskopet på prøveoverflaten. Se etter riktig fokusplan i nærheten av PDMS-løsningsgrensesnittet.
MERK: I IRM skal det vandige interiøret i kanalen virke mye lysere enn PDMS-polymeren. - Velg et synsfelt nær midten av kanalen.
- Forbered en løsning på 0,1 μm fluorescerende mikrober i BRB80 (tetthet: 109 perler /ml, tilsvarende en 200 ganger fortynning for perlene som brukes i denne protokollen).
- Strømning i minst ett kanalvolum av mikrobeadløsningen.
- Overvåk reaksjonen via IRM. Vent til mikrobeadene gradvis "lander" på overflaten. Når ønsket tetthet av mikrober oppnås, vask ut overskuddet med BRB80.
- Hvis temperaturkontroll er nødvendig, bruk en objektiv varmeapparat og sett den til riktig temperatur.
- Voksende biotinylert guanylyl 5'-α,β-metylendifosfonat (GMPCPP)-stabiliserte mikrotubulefrø
- I et sentrifugerør på 0,6 ml forbereder du 50 μL av en oppløsning som inneholder 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 og 2 μM biotinylert tubulin (5-10 % merking av stoichiometri) i BRB80.
MERK: Riktig merking av stoichiometri kan oppnås ved å kombinere biotinylert tubulin med umerket bovin tubulin i riktig forhold. - Inkuber oppløsningen på is i 5 min, og inkuber deretter ved 37 °C i 12,5 min.
MERK: Lengden på frøene kan styres ved å justere polymerisasjonstiden. - Stopp polymerisasjonen ved å tilsette 100 μL romtemperatur BRB80.
- Snurr ned oppløsningen i en ultracentrifuge ved romtemperatur (126 000 x g, 5 min). Kast supernatanten ved hjelp av en pipette for å fjerne upokalymerisert tubulin.
MERK: I denne protokollen brukes en luftdrevet ultrasenterifuge. - Tilsett 200 μL romtemperatur BRB80 i pelletsen. Resuspend pellet ved pipettering forsiktig, men grundig. Bruk en 200 μL pipette med en kuttet spiss for å redusere skjæringen av mikrotubulene.
- I et sentrifugerør på 0,6 ml forbereder du 50 μL av en oppløsning som inneholder 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl2 og 2 μM biotinylert tubulin (5-10 % merking av stoichiometri) i BRB80.
- Voksende dynamisk guanosin difosfat (BNP)-tubulin "utvidelser"
MERK: Frøene vil bli immobilisert på strømningskanalens antibiotinoverflate. Dynamiske GTP / BNP "utvidelser" vil bli dyrket fra enden av de immobiliserte frøene.- Fortynn frøene 20x i BRB80. Strømning de fortynnede frøene inn i reaksjonskammeret.
- Overvåk reaksjonen via IRM. Vent til frøene gradvis "lander" på overflaten og binder seg til den. Når ønsket tetthet av frø oppnås, vask ut overskuddet med BRB80.
- Forbered en mikrotubul forlengelsesblanding: 12 μM umerket tubulin, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT) i BRB80 buffer.
- Strømning i minst ett kanalvolum av forlengelsesblandingen. Påse at reaksjonstemperaturen er 28 °C.
- Vent til mikrotubulforlengelsene vokser fra frøene over tid.
MERK: Steady-state-lengden oppnås vanligvis på mindre enn 20 minutter. - Bruk de dynamiske mikrotubulene til avbildning. Tilsett og visualiser fluorescerende MAPer på mikrotubulene, som beskrevet i trinn 3.5 for kinesin-1.
MERK: Fordi mikrotubulene er overflatebundne, er de lett synlige av TIRF.
- Kinesin motility analyse
MERK: Dette trinnet beskriver en protokoll for visualisering av motile grønne fluorescerende proteiner (GFP)-merket kinesin-1 på krympende mikrotubuler. En avkortet rottekinesin-1-konstruksjon smeltet sammen til eGFP (rKin430-eGFP) ble uttrykt og renset, som beskrevet tidligere15,16.- Klargjør motilitetsbuffer: 1 mM ATP og 0,2 mg/ml kasein i BRB80.
- Fortynn kinesin-eGFP i motilitetsbuffer til 10 nM.
- Forbered en 2x oksygenoppfinnende løsning for å motvirke oksidativ fotobleaching (80 mM glukose, 80 mg / ml glukoseoksidase, 32 mg / ml katavelase, 0,2 mg / ml kasein, 20 mM DTT) supplert med 2 mM ATP.
- Kombiner 10 deler oksygenfanger, 9 deler BRB80 og 1 del av 10 nM kinesin-eGFP for en endelig kinesinkonsentrasjon på 0,5 nM.
MERK: Det totale volumet skal være minst 1,5 ganger større enn kanalvolumet. - Angi bildeinnstillingene på mikroskopprogramvaren.
MERK: I denne protokollen spilles videoer inn med 10 bps med 100 ms eksponeringstid. Laserintensiteten er ~ 0,05 kW / cm2. - Begynn å forestille deg og strømning kinesinoppløsningen inn i kammeret.
- Når målingen er fullført, kan du spille inn en kort (~5 s) video der scenen sakte oversettes i en sirkulær eller lateral bevegelse. Bruk medianprojeksjonen av denne videoen som bakgrunnsbilde, og trekk den fra råmålene.
4. Bildebehandling og analyse
MERK: Bildebehandling ble utført ved hjelp av NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). En makro ble utviklet for å automatisere deling og justering av TIRF- og IRM-kanalene. Denne makroen krever at GaussFit_OnSpot plugin-modulen er installert (tilgjengelig på ImageJ-plugins-repositoriet).
- Fra bakgrunnsopptaket oppretter du en medianprojeksjon i ImageJ ved å klikke på Bilde | Stabler | Z-prosjekt.
- Trekk median bakgrunnsprojeksjon fra råbildedataene ved å klikke på Behandle | Bildekalkulator.
MERK: Sørg for å sjekke alternativet "32-biters (float) resultat". - For bilderegistrering velger du en samling mikrober i nærheten av mikrotubulen av interesse og bruker dem til å justere TIRF- og IRM-bildene.
- For hver perle i denne samlingen bruker du flerpunktsvalgverktøyet til å markere den omtrentlige plasseringen i TIRF-kanalen og deretter den tilsvarende plasseringen i IRM-kanalen.
MERK: Hvis det for eksempel er to perler (1 og 2), vil flerpunktsvalget ha fire punkter i følgende rekkefølge: (1) perle 1 i TIRF, (2) perle 1 i IRM, (3) perle 2 i TIRF, (4) perle 2 i IRM. - Kjør den medfølgende ImageJ-makroen (ImageSplitterRegistration.ijm).
MERK: Dette automatiserer følgende trinn: i) estimere senterplasseringen til hver perle ved å tilpasse seg en gaussisk; ii) for hver perle, databehandling av forskyvningsvektoren som skiller senteret i TIRF-kanalen fra midten i IRM-kanalen; iii) gjennomsnitt av denne forskyvningsvektoren på tvers av alle perler; iv) dele TIRF- og IRM-kanalene i separate bilder; v) oversette TIRF-bildet ved hjelp av den gjennomsnittlige forskyvningsvektoren beregnet i iii; vi) legge tirf- og IRM-bildene over i en flerkanals .tiff fil.
Representative Results
Det optiske oppsettet er skjematisert i figur 1. Både IRM-belysning og TIRF-eksitasjonslys rettes mot bakåpningen til målet (100x, NA: 1,49) via en 10/90 (R / T) bjelkesplitter (BS1). Det avgitte signalet passerer gjennom samme strålesplitter (BS1) og reflekteres til bildesplitteren via et speil (M1). Komponentene i bildesplitteren (med stiplede linjer i figur 1) skiller IRM- og TIRF-signalene via en 90/10 (R/T) strålesplitter (BS2) sammen med passende spektralfiltre. Til slutt projiseres de delte bildene på kamerabrikken for visualisering. Justeringen av bildesplitteren er slik at TIRF- og IRM-signalene projiseres på separate halvdeler av brikken.
I et godt justert mikroskop skal kamerabildet vise et halvt delt bilde, som vist i figur 2. Overflatebundne mikrotubuler skal være lett synlige i IRM-kanal13, og fluorescerende kinesin skal være synlig i TIRF-kanalen.
Mikrobeadene som brukes til å justere og registrere de to kanalene, vises som lyse flekker i TIRF-bildene og mørke flekker i IRM-bildene. Selv om perlene er synlige i rådataene, forbedrer bakgrunnsdeltrekk kontrasten betydelig (figur 2). Bakgrunnsbildet som brukes til subtraksjonen er den tidsmessige medianen til en video som er tatt opp med et bevegelig stadium. Som beskrevet i protokollen, ble bildejustering utført ved å velge en samling perler nær området av interesse og utføre den medfølgende makroen (imageSplitterRegistration.ijm). Makroen tilpasser punktene til gaussianere og justerer bildene ved å minimere den gjennomsnittlige avstanden mellom midtpunktene i anfallene i hver kanal. Denne prosessen er representert i figur 2, som viser en god justering av fluorescerende mikrober (grønn i TIRF-kanalen, svart i IRM-kanalen).
Til slutt demonstreres mulighetene til dette samtidige bildeoppsettet ved å observere enkeltkinesinmolekyler som går mot de krympende endene av mikrotubuler. Figur 3 viser en kymografi av eGFP-merkede kinesinmolekyler (grønne) som går på en krympende mikrotubule (grå). Også presentert er en serie øyeblikksbilder fra innspillingen som kymografen ble generert fra.
Figur 1: Skjematisk representasjon av det optiske oppsettet for samtidig IRM- og TIRF-avbildning av kinesinmotilitet. Epiilluminasjon fra en LED-lyskilde passerer gjennom blendermembranen og når strålesplitteren (BS1) 10/90 (R/T). Bjelkesplitteren reflekterer delvis det røde IRM-belysningslyset og 488 nm TIRF-eksitasjonslyset opp til målet om å belyse prøven. Signalet fra prøven samles inn av samme målsetting og rettes mot bildedelingsenheten der IRM- og TIRF-bilder skilles romlig med 90/10 (R/T) strålesplitteren (BS2). Signalene filtreres deretter spektralt før de når kamerabrikken. Forkortelser: IRM = interferensrefleksjonsmikroskopi; TIRF = total-intern refleksjon-fluorescens; LED = lysdiode; ITIRF = TIRF belysning; IGFP = GFP fluorescens; Jeginc = IRM belysning; Jegref = spredt lys ved glass / vann grensesnittet; Jegscat = spredt lys fra mikrotubulen; IRM = IRM-signal (interferens av Iref og Iscat); R/T = reflektert/overført; LP600: langpassfilter (600 nm); DM = dikroisk speil; BS1 og BS2 = bjelkesplittere 1 og 2; M1, M2, M3, M4 = speil; BP535/50 = båndpass (535/50 nm); GFP = grønt fluorescerende protein; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-metylendifosfonat; BNP = guanosin difosfat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Subtraksjon i bakgrunnen og bildejustering. BILDENE TIRF (venstre halvdel) og IRM (høyre halvdel) vises samtidig på to halvdeler av samme kamerabrikke (kamerabilde). Temporal median bakgrunnsdeltrekk øker kontrasten til perlene (bakgrunnsbilde), som ser mørkt ut i IRM og lyst i TIRF-bilder. IRM- og TIRF-bilder justeres etter oversettelse (til høyre) basert på lokalisering av utvalgte perler (hvite rektangler). Skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kymograf og øyeblikksbilder av Kinesins' bevegelse under mikrotubulkrymping. Kymografien (til venstre) viser eGFP-kinesin-1 (grønn) som går mot plussenden av mikrotubulen (mørkegrå). Øyeblikksbilder fra de tilsvarende tidsseriene vises (til høyre). Hvite piler viser enkeltkinesin-1 molekyler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
ImageSplitterRegistration File: Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Å studere regulering av mikrotubuledynamikk ved mikrotubule-assosierte proteiner (MAPer) krever ofte samtidig avbildning av mikrotubuler og MAPer. Fluorescensmikroskopiteknikker som TIRF brukes vanligvis til dette formålet. Imidlertid er de begrenset av ulempene ved fluorescensavbildning, som inkluderer fotobleaching, fotodamage og behovet for fluoroformerking. Etikettfrie metoder, for eksempel IRM, er egnet for visualisering av mikrotubuler, men er ikke i stand til å avbilde enkle fluoroforer. Denne protokollen kombinerer etikettfri IRM-avbildning og TIRF-mikroskopi for samtidig avbildning av dynamiske mikrotubuler og MAPer.
IRM-oppsettet bruker en LED-belysningskilde filtrert til >600 nm, mens TIRF-oppsettet bruker en 488 nm laser. Vi brukte en billig platestrålesplitter for å reflektere belysningslyset på prøven og overføre det oppsamlede signalet til detektoren (figur 1). En strålesplitter med 10% refleks og 90% overføring ble valgt for å minimere tapet av enkeltmolekylsignalet. 90% tap i belysningslysintensiteten kompenseres ved å øke kraften til belysningslaseren og LED-lampen.
Spektral separasjon av signalene ble oppnådd ved hjelp av en 90/10 (R / T) stråle splitter og to spektralfiltre (langpass 600 nm for IRM og båndpass 535/50 nm for TIRF). De spektralt separerte IRM- og TIRF-signalene projiseres på to halvdeler av en enkelt kamerabrikke ved hjelp av en bildesplitterenhet. Bruken av en 90/10 strålesplitter ofrer 90% av IRM-signalet, men dette kompenseres ved å øke intensiteten til LED-belysningskilden. Et dikroisk speil kan også brukes her for å skille IRM- og TIRF-signalene mer effektivt. Fluorescerende mikrober som er inkludert i analysene muliggjør nøyaktig justering av TIRF- og IRM-bildene og fungerer som en referanse for å fokusere målet.
Det mest kritiske optiske elementet i denne protokollen er det høye målet for numerisk blenderåpning (NA). Dette er viktig ikke bare for å oppnå total intern refleksjon, men også for å maksimere innsamlingseffektiviteten og bildekontrasten. Kvaliteten på de oppnådde bildene avhenger også av rensligheten av glassoverflaten og oppkjøpet av et klart bakgrunnsbilde for å korrigere for ikke-enhetlig belysning og fjerne statiske funksjoner. For IRM-avbildning anbefaler vi at du bruker langbølgelengdebelysning (>600 nm) for å minimere fotodamasje av mikrotubuler og proteiner. Dette er spesielt viktig hvis en hvit LED-lyskilde brukes, i så fall bør et langpassfilter inkluderes for å fjerne UV-lys.
Denne protokollen muliggjør etikettfri, høyhastighetsavbildning av dynamiske mikrotubuler og samtidig høyoppløselig visualisering av fluorescerende MAPer17. Sammenlignet med filterkubevekslingsteknikken, som veksler mellom å ta bilder av mikrotubuler og MAPer, er dette oppsettet i stand til mye høyere bildefrekvens fordi det ikke avhenger av den fysiske rotasjonen av en filterkube. Sammenlignet med tofargede TIRF-avbildningsteknikker, bruker denne teknikken et mindre krevende optisk oppsett og omgår behovet for fluoroformerking av mikrotubuler. De viktigste begrensningene i dette oppsettet skyldes TIRF-avbildningen av MAPene; bildefrekvensen er begrenset av eksponeringstiden til en fluorofor, og fotobleaching av fluoroforer er fortsatt en mulighet. Ikke desto mindre forbedrer denne protokollen eksisterende teknikker fordi den bare bruker TIRF når det er nødvendig (dvs. for å visualisere MAPer, men ikke mikrotubuler) og oppnår høyest mulig hastighet innenfor TIRFs grenser. Ytterligere forbedringer er bare mulig hvis både mikrotubulene og MAP-ene visualiseres via en interferometrisk teknikk, men dette krever merking av MAPer med metallnanopartikler, som har sine begrensninger og eksperimentelle utfordringer.
For å demonstrere evnene til denne teknikken visualiserte vi samtidig to raske dynamiske prosesser via IRM og TIRF: krympingen av en mikrotubule og vandringen av et fluorescerende kinesinmolekyl. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å visualisere rask diffusjon av spastin på krympende mikrotubuler5. Utover denne applikasjonen til MAPs og mikrotubuler, kan denne protokollen brukes til å visualisere enkle fluorescerende molekyler samtidig med enhver makromolekylær struktur som er massiv nok til å visualiseres via IRM, for eksempel en cellemembran eller aktinfilament.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Thierry Emonets laboratorium for å dele renromsutstyr. Vi takker Yin-Wei Kuo for å ha forberedt den rensede eGFP-kinesinen som ble brukt i denne studien. Y.T. anerkjenner støtten fra Alexander von Humboldt Foundation gjennom Feodor Lynen Research Fellowship. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01 GM139337 (til J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P.
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A.
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
