Summary
Vi præsenterer en protokol til implementering af interferens-refleksionsmikroskopi og total-intern-refleksion-fluorescensmikroskopi til samtidig billeddannelse af dynamiske mikrotubuli og fluorescerende mærkede mikrotubuli-associerede proteiner.
Abstract
Flere teknikker er blevet anvendt til direkte visualisering af cytoskeletale filamenter og deres tilknyttede proteiner. Total-intern-refleksion-fluorescens (TIRF) mikroskopi har et højt signal-til-baggrund-forhold, men det lider af fotoblegning og fotoskade af de fluorescerende proteiner. Etiketfrie teknikker såsom interferensrefleksionsmikroskopi (IRM) og interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT) omgår problemet med fotoblegning, men kan ikke let visualisere enkeltmolekyler. Dette papir præsenterer en protokol til kombination af IRM med et kommercielt TIRF-mikroskop til samtidig billeddannelse af mikrotubuli-associerede proteiner (MAPs) og dynamiske mikrotubuli in vitro. Denne protokol giver mulighed for højhastighedsobservation af MAPs, der interagerer med dynamiske mikrotubuli. Dette forbedrer eksisterende tofarvede TIRF-opsætninger ved at eliminere både behovet for mikrotubuli-mærkning og behovet for flere yderligere optiske komponenter, såsom en anden excitationslaser. Begge kanaler er afbildet på den samme kamerachip for at undgå billedregistrering og billedsynkroniseringsproblemer. Denne opsætning demonstreres ved at visualisere enkelte kinesinmolekyler, der går på dynamiske mikrotubuli.
Introduction
Total-intern-refleksion-fluorescens (TIRF) mikroskopi anvendes almindeligvis til visualisering af enkelte fluorescerende molekyler. Sammenlignet med epifluorescensbilleddannelse opnår TIRF overlegen baggrundsundertrykkelse, hvilket giver mulighed for lokalisering og sporing af enkelte fluoroforer i høj opløsning. Af denne grund er TIRF den foretrukne metode til visualisering af fluorescerende mærkede mikrotubuli-associerede proteiner og bruges ofte til at afbilde mikrotubuli 1,2.
For at undersøge reguleringen af mikrotubuli dynamik af MAPs er det ofte nødvendigt at afbilde både mikrotubuli og MAPs samtidigt. De fleste eksisterende metoder til dette formål er dyre eller lider af tekniske ulemper. Samtidig tofarvet TIRF kræver for eksempel to excitationslasere og to kameraer. Ud over de høje omkostninger udgør behovet for separate kameraer problemer med rammesynkronisering og billedregistrering. Dette behov kan omgås, hvis en roterende filterterning bruges til fysisk at skifte mellem excitationslasere i på hinanden følgende rammer3. I en sådan opsætning kan en enkelt kamerachip bruges, og rammerne veksler mellem billeder af mikrotubuli og MAPs. Denne teknik er dog begrænset af filterskiftets hastighed, som typisk begrænser billedhastigheden til mindre end 0,5 billeder pr. Sekund3 (fps). En sådan billedhastighed er utilstrækkelig til at løse hurtige dynamiske processer, såsom krympning af en mikrotubuli, der forekommer med en hastighed på op til 500 nm / s, gang af et kinesin med en hastighed i størrelsesordenen 800 nm / s eller diffusion af en MAP, der forekommer med diffusionskoefficienter på over 0,3 μm2 / s4. Dette er især problematisk, når man sporer de relative positioner af to bevægelige mål i hver kanal, såsom placeringen af en MAP i forhold til positionen af en bevægelig mikrotubulispids5.
Ud over disse optiske begrænsninger kræver tofarvet TIRF-mikroskopi, at MAC'er og mikrotubuli mærkes med forskellige fluoroforer, hvis emissionsspektre er tilstrækkeligt adskilt. Fluorescerende mærkning af tubulin kan ændre mikrotubuli dynamik6, og fotoblegling af fluoroforer begrænser billeddannelseshastigheden7. På grund af disse problemer er der udviklet etiketfrie billeddannelsesteknikker til at visualisere mikrotubuli. Disse omfatter interferometrisk spredningsmikroskopi (iSCAT)8,9, roterende-sammenhængende-spredningsmikroskopi (ROCS)10, rumlig lysinterferensmikroskopi (SLIM)11 og interferensrefleksionsmikroskopi (IRM)12,13. Disse teknikker muliggør hurtig etiketfri billeddannelse af mikrotubuli uden ulemperne ved fluorescensbilleddannelse, men de kan ikke bruges til at visualisere enkelte MAPs.
Af disse etiketfrie teknikker skiller IRM sig ud for sine lave omkostninger og sine beskedne krav til instrumentering. Vi har for nylig præsenteret en protokol til kombination af IRM med et kommercielt TIRF-mikroskop, der gør det muligt at afbilde mikrotubuli og fluorescerende MAPs i skiftende rammer 3,13. Dette papir præsenterer en protokol til ændring af denne opsætning til samtidig optagelse af TIRF- og IRM-billeder på en enkelt kamerachip. Dette indebærer tilføjelse af en billig strålesplitter i excitationsstien for samtidig at belyse prøven med en TIRF-laser og en IRM LED-lyskilde. En modificeret kommerciel billedsplitter bruges til spektralt at adskille TIRF- og IRM-signalerne og projicere dem på separate halvdele af den samme kamerachip. Vi anvender også et mikrofluidisk system, der muliggør hurtig udveksling af reagenser under billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan denne opsætning kan bruges til at afbilde dynamiske mikrotubuli og MAT'er. Apparatets evne demonstreres ved at præsentere den første visualisering af kinesin-1-proteiner, der går på krympende mikrotubuli, som fanges med en billedhastighed på 10 s-1.
Protocol
1. Forberedelse af flowkamre
BEMÆRK: Mikrofluidiske flowkamre vil blive konstrueret ved at klæbe polydimethylsiloxan (PDMS) mikrokanaler til et renset og funktionaliseret dækglas. Mikrokanalerne vil blive støbt i en masterform.
-
Forberedelse af PDMS-kanaler
- Forbered rensede og/eller funktionaliserede dækglas med overfladekemi, der passer til det specifikke assay, der afbildes.
BEMÆRK: Til kinesinmotilitetsassays anvendes piranha-rensede silaniserede dækglas. Disse fremstilles som beskrevet i Gell et. al.1 Alternativt er en enklere procedure at sonikere dækbriller i isopropanol efterfulgt af methanol i 3x 20 minutters cyklusser. - For at forberede en masterform skal du skære strimler af ensidigt stationært tape til den ønskede strømningskanalstørrelse. Hold strimlerne til bunden af en 10 cm petriskål, og arranger dem fra side til side med mindst 1 cm afstand mellem strimlerne.
BEMÆRK: Hvis der kræves præcise kanaldimensioner, kan formen fremstilles på siliciumskiver ved hjælp af fotolitografi14. - For at fremstille PDMS-polymeren kombineres hærdningsmidlet og baseelastomeren i et masseforhold på 1:10. Bland i 2 min.
BEMÆRK: Dette blandingsforhold kan varieres for at indstille polymerens stivhed. Et højere forhold mellem base og hærdningsmiddel resulterer i en blødere polymer. - Afgas blandingen i et vakuumkammer, indtil alle bobler forsvinder.
- Hæld blandingen på masterformen i et ~ 0,5 cm tykt lag, og pas på at undgå at skabe bobler.
- Bag blandingen i en forvarmet ovn ved 70 °C i 40 min.
BEMÆRK: En længere hærdningstid kan være påkrævet, hvis PDMS-blokken er tyk (>1 cm). Fortsæt opvarmningen i trin på 5 minutter, indtil den er helt hærdet. - Skær de strukturerede områder af polymeren ud. Stans huller i hver ende af kanalen ved hjælp af en PDMS-puncher.
BEMÆRK: I denne protokol er huldiameteren indstillet til 0,75 mm og kan justeres i henhold til de krævede strømningshastigheder. PDMS-kanaler kan opbevares i tørre miljøer i længere perioder, men bør rengøres inden brug. - Rengør den strukturerede side af PDMS-blokken. Brug stationær tape til at fjerne store partikler. Skyl med isopropanol og derefter methanol. Gentag disse skylninger 3x, skyl med ultrarent vand, og føntør overfladen.
- Plasma rengør PDMS ved hjælp af ilt eller luftplasma.
BEMÆRK: I denne protokol anvendes 18 W luftplasma. - Anbring den plasmarensede PDMS på et passende rengjort dækglas og opvarm på en kogeplade ved 80 °C i 15 minutter.
BEMÆRK: Epoxyharpiks kan påføres siderne af PDMS-blokken for bedre at klæbe den til dækglasset. - Indsæt LDPE-slanger (low-density polyethylen) i hullerne i passende størrelse. Tilslut udløbsslangen til en 0,5 ml sprøjte.
BEMÆRK: I denne protokol er rør med en indvendig diameter på 0,023 in forbundet til PDMS via en 0,025 i metaladapter med udvendig diameter. - Flowopløsninger ind i mikrokanalerne ved at nedsænke indløbsrøret i opløsningen og tegne det krævede volumen med sprøjten.
- Forbered rensede og/eller funktionaliserede dækglas med overfladekemi, der passer til det specifikke assay, der afbildes.
2. Optisk opsætning
-
Ændring af mikroskopet (figur 1)
- Rediger et TIRF-mikroskop for at aktivere IRM-billeddannelse13. Udskift strålesplitteren 50/50 (Reflectance (R)/Transmission (T)), der anvendes i mikroskopets filterhjul, med en 10/90 (R/T) strålesplitter.
- Indsæt en billedsplitter mellem kameraet og mikroskopet.
- I filterkuben på billedsplitteren skal du indsætte en 10/90 (R/T) strålesplitter. Anbring et 600 nm langpasfilter foran den reflekterede stråle og et passende fluorescensemissionsfilter foran den transmitterede stråle.
BEMÆRK: Strålesplittere med forskellige R/T-forhold kan bruges til at indstille de brøkdele af IRM- og TIRF-emissionslyset, der opsamles. - Juster billedsplitteren i henhold til producentens specifikationer for rumligt at adskille TIRF- og IRM-signalerne på kamerachippen.
BEMÆRK: Rumlig adskillelse af signalerne er påkrævet, fordi TIRF-signalet for typiske fluoroforer er meget svagere end IRM-signalet fra en mikrotubuli og ikke ville kunne detekteres, hvis de to signaler blev overlejret.
3. Billeddannelse af dynamiske mikrotubuli og enkelte Kinesinmolekyler
- Overfladefunktionalisering og passivering
- Flow BRB80-buffer (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mMMgCl2, titreret til pH 7,8 med NaOH) ind i reaktionskammeret.
- Flowantibiotinopløsning fortyndet til 0,025 mg/ml i BRB80 og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Vask kanalen med BRB80.
- Flow i F-127-opløsning (1 % Pluronic F-127 (w/v) opløst i BRB80 natten over) og inkuber i mindst 20 minutter til overfladepassivering.
BEMÆRK: Hvis der anvendes letrensede dækglas i stedet for silaniserede dækglas, skal du passivisere med 2 mg/ml kasein i BRB80 i >20 minutter ved stuetemperatur. - Vask kanalen med BRB80.
- Forberedelse til billeddannelse
- Hvis der kræves temperaturregulering, skal du bruge en objektiv varmelegeme og indstille den til den korrekte temperatur.
BEMÆRK: I denne protokol udføres alle eksperimenterne ved 28 °C. - Placer prøven på mikroskopstadiet, og tænd epiilluminationslyskilden (>600 nm) til IRM-billeddannelse.
BEMÆRK: I denne protokol bruges en hvid LED-lyskilde med et 600 nm langpasfilter. - Fokuser mikroskopet på prøveoverfladen. Kig efter det korrekte brændplan i nærheden af PDMS-løsningsgrænsefladen.
BEMÆRK: I IRM skal kanalens vandige indre fremstå meget lysere end PDMS-polymeren. - Vælg et synsfelt nær midten af kanalen.
- Der fremstilles en opløsning af 0,1 μm fluorescerende mikroperler i BRB80 (massesitet: 109 perler/ml, svarende til en 200 gange fortynding for de perler, der anvendes i denne protokol).
- Flow i mindst ét kanalvolumen af mikroperleopløsningen.
- Overvåg reaktionen via IRM. Vent på, at mikroperlerne gradvist "lander" på overfladen. Når den ønskede tæthed af mikroperler er opnået, vaskes overskydende ud med BRB80.
- Hvis der kræves temperaturregulering, skal du bruge en objektiv varmelegeme og indstille den til den korrekte temperatur.
- Dyrkning af biotinylerede guanylyl 5'-α,β-methylendiphosphonat (GMPCPP)-stabiliserede mikrotubuli frø
- I et 0,6 ml centrifugerør fremstilles 50 μL af en opløsning indeholdende 1 mM GMPCPP, 1 mMMgCl2 og 2 μM biotinyleret tubulin (5-10% mærkning af støkiometri) i BRB80.
BEMÆRK: Den korrekte mærkning støkiometri kan opnås ved at kombinere biotinyleret tubulin med høj densitet med umærket kvægtubulin i det korrekte forhold. - Inkuber opløsningen på is i 5 minutter, og inkuber derefter ved 37 °C i 12,5 min.
BEMÆRK: Frøets længde kan styres ved at indstille polymerisationstiden. - Polymerisationen stoppes ved at tilsætte 100 μL stuetemperatur BRB80.
- Opløsningen drejes ned i en ultracentrifuge ved stuetemperatur (126.000 x g, 5 min). Kassér supernatanten ved hjælp af en pipette for at fjerne upolymeriseret tubulin.
BEMÆRK: I denne protokol anvendes en luftdrevet ultracentrifuge. - Tilsæt 200 μL stuetemperatur BRB80 til pelleten. Resuspend pillen ved at pipettere forsigtigt, men grundigt. Brug en 200 μL pipette med en skåret spids for at reducere forskydningen af mikrotubuli.
- I et 0,6 ml centrifugerør fremstilles 50 μL af en opløsning indeholdende 1 mM GMPCPP, 1 mMMgCl2 og 2 μM biotinyleret tubulin (5-10% mærkning af støkiometri) i BRB80.
- Voksende dynamisk guanosindiphosphat (BNP)-tubulin "udvidelser"
BEMÆRK: Frøene vil blive immobiliseret på antibiotinoverfladen af strømningskanalen. Dynamiske GTP /BNP "udvidelser" vil blive dyrket fra enderne af de immobiliserede frø.- Fortynd frøene 20x i BRB80. Flyd de fortyndede frø ind i reaktionskammeret.
- Overvåg reaktionen via IRM. Vent på, at frøene gradvist "lander" på overfladen og binder sig til det. Når den ønskede tæthed af frø er opnået, vaskes overskuddet ud med BRB80.
- Forbered en mikrotubuli forlængelsesblanding: 12 μM umærket tubulin, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT) i BRB80 buffer.
- Flow i mindst et kanalvolumen af forlængelsesblandingen. Det sikres, at reaktionstemperaturen er 28 °C.
- Vent på, at mikrotubuliudvidelserne vokser fra frøene over tid.
BEMÆRK: Steady-state-længden opnås normalt på mindre end 20 minutter. - Brug de dynamiske mikrotubuli til billeddannelse. Tilsæt og visualiser fluorescerende MAPs på mikrotubuli, som beskrevet i trin 3.5 for kinesin-1.
BEMÆRK: Fordi mikrotubuli er overfladebundne, er de let synlige af TIRF.
- Kinesin motilitet assay
BEMÆRK: Dette trin beskriver en protokol til visualisering af bevægeligt grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket kinesin-1 på krympende mikrotubuli. En afkortet rottekinesin-1-konstruktion smeltet sammen med eGFP (rKin430-eGFP) blev udtrykt og renset, som tidligere beskrevet15,16.- Forbered motilitetsbuffer: 1 mM ATP og 0,2 mg /ml kasein i BRB80.
- Fortynd kinesin-eGFP i motilitetsbuffer til 10 nM.
- Forbered en 2x oxygen scavenger-opløsning for at modvirke oxidativ fotoblegning (80 mM glucose, 80 mg / ml glucoseoxidase, 32 mg / ml katalase, 0,2 mg / ml kasein, 20 mM DTT) suppleret med 2 mM ATP.
- Kombiner 10 dele oxygen scavenger, 9 dele BRB80 og 1 del af 10 nM kinesin-eGFP for en endelig kinesinkoncentration på 0,5 nM.
BEMÆRK: Den samlede lydstyrke skal være mindst 1,5 gange større end kanalvolumenet. - Indstil billedbehandlingsindstillingerne på mikroskopsoftwaren.
BEMÆRK: I denne protokol optages videoer ved 10 fps med 100 ms eksponeringstid. Laserintensiteten er ~0,05 kW/cm2. - Begynd billeddannelse og flyd kinesinopløsningen ind i kammeret.
- Når målingen er afsluttet, skal du optage en kort (~ 5 s) video, hvor scenen langsomt oversættes i en cirkulær eller lateral bevægelse. Brug medianprojektionen af denne video som baggrundsbillede, og træk den fra de rå målinger.
4. Billedbehandling og analyse
BEMÆRK: Billedbehandlingen blev udført ved hjælp af NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). En makro blev udviklet til at automatisere opdeling og justering af TIRF- og IRM-kanalerne. Denne makro kræver, at GaussFit_OnSpot-pluginet installeres (tilgængeligt på ImageJ-plugins-lageret).
- Fra baggrundsoptagelsen skal du oprette en medianprojektion i ImageJ ved at klikke på Image | Stakke | Z-projekt.
- Træk medianbaggrundsprojektionen fra de rå billeddata ved at klikke på Proces | Billedberegner.
BEMÆRK: Sørg for at kontrollere indstillingen "32-bit (float) result". - Til billedregistrering skal du vælge en samling mikroperler nær mikrotubuli af interesse og bruge dem til at justere TIRF- og IRM-billederne.
- For hver perle i denne samling skal du bruge multipunktsmarkeringsværktøjet til at markere den omtrentlige placering i TIRF-kanalen og derefter den tilsvarende placering i IRM-kanalen.
BEMÆRK: Hvis der f.eks. er to perler (1 og 2), vil flerpunktsvalget have fire punkter i følgende rækkefølge: (1) perle 1 i TIRF, (2) perle 1 i IRM, (3) perle 2 i TIRF, (4) perle 2 i IRM. - Kør den medfølgende ImageJ-makro (ImageSplitterRegistration.ijm).
BEMÆRK: Dette automatiserer følgende trin: i) estimering af den midterste placering af hver perle ved at montere på en gaussisk; ii) for hver perle beregning af forskydningsvektoren, der adskiller midten i TIRF-kanalen fra midten i IRM-kanalen; iii) gennemsnit af denne forskydningsvektor på tværs af alle perler; iv) opdeling af TIRF- og IRM-kanalerne i separate billeder v) oversættelse af TIRF-billedet med den gennemsnitlige forskydningsvektor beregnet i iii vi) overlejring af TIRF- og IRM-billederne i en multikanals .tiff-fil.
Representative Results
Den optiske opsætning er skematiseret i figur 1. Både IRM-belysning og TIRF-excitationslys ledes til målets bageste blænde (100x, NA: 1,49) via en 10/90 (R / T) strålesplitter (BS1). Det udsendte signal passerer gennem den samme strålesplitter (BS1) og reflekteres til billedsplitteren via et spejl (M1). Komponenterne i billedsplitteren (omgivet af stiplede linjer i figur 1) adskiller IRM- og TIRF-signalerne via en 90/10 (R/T) strålesplitter (BS2) sammen med passende spektralfiltre. Endelig projiceres de opdelte billeder på kamerachippen til visualisering. Justeringen af billedsplitteren er sådan, at TIRF- og IRM-signalerne projiceres på separate halvdele af chippen.
I et veljusteret mikroskop skal kamerabilledet vise et halvvejs delt billede, som vist i figur 2. Overfladebundne mikrotubuli bør være let synlige i IRM-kanal13, og fluorescerende kinesin bør være synligt i TIRF-kanalen.
De mikroperler, der bruges til at justere og registrere de to kanaler, fremstår som lyse pletter i TIRF-billederne og mørke pletter i IRM-billederne. Selvom perlerne er synlige i de rå data, forbedrer baggrundssubtraktion kontrasten betydeligt (figur 2). Baggrundsbilledet, der bruges til subtraktionen, er den tidsmæssige median af en video optaget med et bevægeligt stadium. Som beskrevet i protokollen blev billedjustering udført ved at vælge en samling perler nær interesseområdet og udføre den medfølgende makro (imageSplitterRegistration.ijm). Makroen passer til punkterne til gausserne og justerer billederne ved at minimere den gennemsnitlige afstand mellem midterpunkterne på pasformerne i hver kanal. Denne proces er repræsenteret i figur 2, som viser en god justering af de fluorescerende mikroperler (grøn i TIRF-kanalen, sort i IRM-kanalen).
Endelig demonstreres mulighederne i denne samtidige billeddannelsesopsætning ved at observere enkelte kinesinmolekyler, der går mod de krympende ender af mikrotubuli. Figur 3 viser en kymograf af eGFP-mærkede kinesinmolekyler (grøn), der går på en krympende mikrotubuli (grå). Også præsenteret er en række snapshots fra optagelsen, hvorfra kymografen blev genereret.
Figur 1: Skematisk gengivelse af den optiske opsætning til samtidig IRM- og TIRF-billeddannelse af kinesinmotilitet. Epiillumination fra en LED-lyskilde passerer gennem blændemembranen og når 10/90 (R / T) strålesplitteren (BS1). Strålesplitteren reflekterer delvist det røde IRM-belysningslys, og 488 nm TIRF-excitationslyset lyser op til målet om at belyse prøven. Signalet fra prøven opsamles af det samme mål og ledes til billedopdelingsenheden, hvor IRM- og TIRF-billeder er rumligt adskilt af 90/10 (R / T) strålesplitteren (BS2). Signalerne filtreres derefter spektralt, inden de når kamerachippen. Forkortelser: IRM = interferensrefleksionsmikroskopi; TIRF = total-intern-refleksion-fluorescens; LED = lysemitterende diode; ITIRF = TIRF belysning; IGFP = GFP fluorescens; Iinc = IRM belysning; Iref = spredt lys ved glas / vand-grænsefladen; Iscat = spredt lys fra mikrotubuli; IIRM = IRM-signal (Interferens af Iref og Iscat); R/T = reflekteret/transmitteret LP600: langpasfilter (600 nm); DM = dikroisk spejl; BS1 og BS2 = strålesplittere 1 og 2; M1, M2, M3, M4 = spejle; BP535/50 = båndpas (535/50 nm); GFP = grønt fluorescerende protein; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-methylediphosphonat; BNP = guanosindiphosphat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Baggrundssubtraktion og billedjustering. TIRF- (venstre halvdel) og IRM-billederne (højre halvdel) vises samtidigt på to halvdele af den samme kamerachip (kamerabillede). Tidsmæssig median baggrundssubtraktion øger kontrasten mellem perlerne (baggrundssubtraheret billede), som ser mørke ud i IRM og lyse i TIRF-billeder. IRM- og TIRF-billeder justeres ved oversættelse (højre) baseret på lokalisering af udvalgte perler (hvide rektangler). Skalastænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kymograf og snapshots af Kinesins bevægelse under mikrotubuli krympning. Kymografen (til venstre) viser eGFP-kinesin-1 (grøn), der går mod plusenden af mikrotubuli (mørkegrå). Snapshots fra den tilsvarende tidsserie vises (til højre). Hvide pile viser enkelt kinesin-1 molekyler. Klik her for at se en større version af denne figur.
ImageSplitterRegistration File: Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
At studere reguleringen af mikrotubuli dynamik af mikrotubuli-associerede proteiner (MAPs) kræver ofte samtidig billeddannelse af mikrotubuli og MAPs. Fluorescensmikroskopiteknikker som TIRF anvendes typisk til dette formål. De er dog begrænset af ulemperne ved fluorescensbilleddannelse, som omfatter fotoblege, fotoskader og behovet for fluoroformærkning. Etiketfrie metoder, såsom IRM, er egnede til visualisering af mikrotubuli, men er ikke i stand til at afbilde enkelte fluoroforer. Denne protokol kombinerer etiketfri IRM-billeddannelse og TIRF-mikroskopi til samtidig billeddannelse af dynamiske mikrotubuli og MAT'er.
IRM-opsætningen anvender en LED-belysningskilde, der er filtreret til >600 nm, mens TIRF-opsætningen bruger en 488 nm laser. Vi brugte en billig pladestrålesplitter til at reflektere belysningslyset på prøven og sende det indsamlede signal til detektoren (figur 1). En strålesplitter med 10% refleksion og 90% transmission blev valgt for at minimere tabet af enkeltmolekylesignalet. 90% tab i belysningslysintensiteten kompenseres ved at øge lysstyrken af belysningslaseren og LED'en.
Spektral adskillelse af signalerne blev opnået ved hjælp af en 90/10 (R / T) strålesplitter og to spektralfiltre (langpas 600 nm for IRM og båndpas 535/50 nm for TIRF). De spektralt adskilte IRM- og TIRF-signaler projiceres på to halvdele af en enkelt kamerachip ved hjælp af en billedsplitterenhed. Brugen af en 90/10 strålesplitter ofrer 90% af IRM-signalet, men dette kompenseres ved at øge intensiteten af LED-belysningskilden. Et dikroisk spejl kan også bruges her til at adskille IRM- og TIRF-signalerne mere effektivt. Fluorescerende mikroperler, der er inkluderet i analyserne, muliggør nøjagtig justering af TIRF- og IRM-billederne og tjener som reference til fokusering af målet.
Det mest kritiske optiske element i denne protokol er målet om høj numerisk blænde (NA). Dette er vigtigt ikke kun for at opnå total intern refleksion, men også for at maksimere indsamlingseffektiviteten og billedkontrasten. Kvaliteten af de opnåede billeder afhænger også af renheden af glasoverfladen og erhvervelsen af et klart baggrundsbillede for at korrigere for uensartet belysning og fjerne statiske funktioner. Til IRM-billeddannelse anbefaler vi at bruge langbølgelængdebelysning (>600 nm) for at minimere fotoskader af mikrotubuli og proteiner. Dette er især vigtigt, hvis der anvendes en hvid LED-lyskilde, i hvilket tilfælde et langpasfilter skal inkluderes for at fjerne UV-lys.
Denne protokol giver mulighed for etiketfri, højhastighedsbilleddannelse af dynamiske mikrotubuli og samtidig visualisering i høj opløsning af fluorescerende MAPs17. Sammenlignet med filterkubekoblingsteknikken, der veksler mellem at tage billeder af mikrotubuli og MAPs, er denne opsætning i stand til meget højere billedhastigheder, fordi den ikke afhænger af den fysiske rotation af en filterterning. Sammenlignet med tofarvede TIRF-billeddannelsesteknikker anvender denne teknik en mindre krævende optisk opsætning og omgår behovet for fluoroformærkning af mikrotubuli. De primære begrænsninger ved denne opsætning skyldes TIRF-billeddannelsen af MAPs; billedhastigheden er begrænset af eksponeringstiden for en fluorofor, og fotoblebning af fluoroforer er fortsat en mulighed. Ikke desto mindre forbedrer denne protokol eksisterende teknikker, fordi den kun bruger TIRF, når det er nødvendigt (dvs. for at visualisere MAPs, men ikke mikrotubuli) og opnår den højest mulige hastighed inden for rammerne af TIRF. Yderligere forbedringer er kun mulige, hvis både mikrotubuli og MAPs visualiseres via en interferometrisk teknik, men det kræver mærkning af MAPs med metalnanopartikler, hvilket har sine begrænsninger og eksperimentelle udfordringer.
For at demonstrere mulighederne i denne teknik visualiserede vi samtidig to hurtige dynamiske processer via IRM og TIRF: krympningen af en mikrotubuli og vandringen af et fluorescerende kinesinmolekyle. Denne teknik er tidligere blevet anvendt til at visualisere den hurtige diffusion af spastin på krympende mikrotubuli5. Ud over denne anvendelse på MAPs og mikrotubuli kan denne protokol bruges til at visualisere enkelte fluorescerende molekyler samtidigt med enhver makromolekylær struktur, der er massiv nok til at blive visualiseret via IRM, såsom en cellemembran eller actinfilament.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Thierry Emonets laboratorium for at dele renrumsudstyr. Vi takker Yin-Wei Kuo for at forberede det rensede eGFP-kinesin, der anvendes i denne undersøgelse. Y.T. anerkender støtten fra Alexander von Humboldt Foundation gennem Feodor Lynen Research Fellowship. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R01 GM139337 (til J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
