Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63733
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 5, 6,7, 2,4, 1,2,4,8
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

Summary

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

Abstract

הדמיה תוך-ורידית של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל מציעה תובנות חשובות על מחלות בתיווך מערכת החיסון בבעלי חיים. המחקר של פגיעה חריפה בריאות (ALI)/תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופתולוגיות נשימתיות אחרות in vivo הוא קשה בשל הנגישות המוגבלת וממצאי התנועה המובנים של הריאות. עם זאת, פותחו גישות שונות כדי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל בזמן אמת במיקרו-סירקולציה ריאתית במודל ניסיוני של ALI. מערכת הדמיית ריאות in vivo ופלטפורמת מיקרוסקופיה תוך-ורידית מודפסת בתלת-ממד משמשות לאבטחת העכבר המרדים ולייצב את הריאה תוך מזעור פגיעה מבלבלת של הריאות. לאחר ההכנה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב משמשת לחקר הידבקות לויקוציטים, גלגול לויקוציטים ותפקוד נימי. בעוד שהפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בהדמיה במודל אקוטי של מחלת ריאות דלקתית, הוא עשוי להיות מותאם גם לחקר תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים אחרים בריאה.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) היא כלי הדמיה שימושי להדמיה וחקר של תהליכים ביופיזיים שונים in vivo. הריאה מאתגרת מאוד לצילום in vivo בשל מיקומה הסגור, האופי השברירי של הרקמה שלה וממצאי תנועה המושרים על ידי נשימה ודופק 1,2. תצורות מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) שונות פותחו להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-סירקולציה ריאתית כדי להתגבר על אתגרים אלה. גישות כאלה מבוססות על חשיפה כירורגית וייצוב של הריאה לצורך הדמיה.

בעלי חיים מוכנים בדרך כלל להפריה חוץ גופית של הריאות בהליכים כירורגיים. ראשית, בעלי חיים הם intubated ומאוורר, אשר מאפשר כריתה כירורגית של חלון בית החזה והתערבויות לאחר מכן כדי לייצב את הריאה להדמיה. טכניקה אחת כוללת הדבקת הפרנצ'ימה על כיסוי זכוכית3, הליך המסתכן בטראומה פיזית משמעותית לרקמה המצולמת. מתקדם יותר הוא השימוש במערכת ואקום לייצוב הריאה מתחת לחלון זכוכית4. מערך זה מאפשר היצמדות רופפת של פני הריאה לכיסוי באמצעות ואקום הפיך המתפשט על פני שטח מקומי גדול ומרחיב את הריאה תוך הגבלת התנועה בממדים x, y ו-z4. הוואקום מוחל באופן שווה דרך תעלה המקיפה את אזור ההדמיה של המערך ומושך את הרקמה לאזור חרוטי רדוד הפונה לכיסוי ברמת הדמיה4. דרך חלון צפייה זה, ניתן לחקור את המיקרו-סירקולציה של הריאות באמצעות שיטות הדמיה אופטיות שונות.

Lung IVM מאפשר הדמיה כמותית של מספר רב של פרמטרים מיקרו-מעגליים. אלה כוללים מדידות כגון מהירות ואורך מסלול לויקוציטים5, מהירות זרימת תאי דם אדומים6 וחמצון7, גרורות גידול8, הבחנה בין תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון 9,10,11, הדמיה של מיקרו-חלקיקים12, דינמיקה של נאדיות13,14, חדירות כלי דם15 ותפקוד נימי16 . ההתמקדות כאן היא בגיוס לויקוציטים ותפקוד נימי. התחלת גיוס לויקוציטים במיקרו-סירקולציה ריאתית כוללת אינטראקציות גלגול חולפות ואינטראקציות דבקות מוצקות בין לויקוציטים לתאי אנדותל, שניהם מוגברים בתנאים דלקתיים16,17. בדרך כלל, גלגול הוא כימות על ידי מספר לויקוציטים העוברים קו ייחוס המוגדר על ידי מפעיל, בעוד הידבקות מכמתת על ידי מספר לויקוציטים שאינם תנועה על האנדותל16. תפקוד נימי עשוי להיות מושפע גם במצבים דלקתיים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך ירידה בזלוף. ניתן לייחס זאת למספר גורמים, כולל הפחתה של עיוות תאי דם אדומים18 וביטוי מגוון של NO synthase inducible על ידי תאי אנדותל וכתוצאה מכך shunting פתולוגי19. בדרך כלל, האורך המצטבר של נימים מחוררים לכל אזור נמדד ומדווח כצפיפות נימי תפקודית (FCD).

חקר גיוס לויקוציטים בריאות בזמן אמת דורש תיוג מטרות ביולוגיות בצבעים פלואורסצנטיים או בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית20. לחלופין, ניתן להשתמש בזני עכברים מהונדסים שונים כגון lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) עכברים כדי לצלם תת-קבוצות ספציפיות של תאי מערכת החיסון כגון נויטרופילים21,22. לאחר מכן ניתן לדמיין את הלויקוציטים בעלי התווית הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב, מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית מולטיפוטונים. טכניקות אלה משיגות ניגודיות על ידי שימוש באורכי גל ספציפיים של עירור וגילוי פלואורסצנציה הנפלטת תוך חסימת זיהוי אורך הגל של העירור, ובכך מדגישות את האובייקט המסומן.

מחקרים קיימים הנוגעים לכימות גלגול לויקוציטים, הידבקות וצפיפות נימים תפקודית בריאת מורין הסתמכו בעיקר על ניתוח וידאו ידני. זה מתאפשר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגוןFiji 6,23, תוכנה קניינית כגון CapImage12, או מערכות עיבוד תמונה מותאמות אישית24. לעומת זאת, פלטפורמות תוכנה קנייניות שונות (למשל, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) מאפשרות מדידה אוטומטית של מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כולל רבים מאלה שהוזכרו כאן קודם לכן 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

נעשו תצפיות חשובות לגבי הפתולוגיה של פגיעה חריפה בריאה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות IVM ריאה. ARDS מאופיין בשורה של תהליכים פתופיזיולוגיים בריאה, כולל בצקת ריאות ונזק נאדי הנגרם על ידי תפקוד לקוי של מחסום האנדותל והאפיתל25. באמצעות מודל מורין, נמצא כי ALI המושרה על ידי אלח דם קשור לשינויים מזיקים משמעותיים בסחר בתאי מערכת החיסון בסביבת הריאות26. נויטרופילים שגויסו לנימים של עכברים עם ALI המושרה על ידי אלח דם נמצאו כמעכבים מיקרו-סירקולציה, ובכך מגבירים את ההיפוקסיה ב-ALI26. בנוסף, IVM שימש כדי לקבל תובנות לגבי המנגנון הבסיסי של תיקון לאחר הופעת ARDS27. Lung IVM היה גם כלי רב ערך בהבנת שינויים פתופיזיולוגיים במחלות ריאה חסימתיות שונות. לדוגמה, הדמיה של הובלת ריר במחלות כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) אפשרה את המחקר של טיפולים חדשניים וקיימים לפינוי ריריות28. סחר בלוקוציטים בתנאים אלה נותח גםכן 17.

פרוטוקול זה מרחיב את הגישה שתוארה לראשונה על ידי Lamm et al.29 לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. הפרוצדורות המתוארות משתמשות במערכת הדמיית ריאות in vivo, הכוללת בסיס מתכת בגודל 16.5 ס"מ על 12.7 ס"מ, מיקרומניפולטור וחלון הדמיית ואקום (איור 1). המערכת מותקנת על פלטפורמה מודפסת תלת-ממדית בגודל 20 ס"מ על 23.5 ס"מ (קובץ משלים 1) כדי לספק חיבור מאובטח לצינורות האוורור ולמשטח החימום. שיטה זו מציעה הדמיה ניתנת לשחזור ולכימות של מיקרו-סירקולציה ריאתית של מורין in vivo. היבטים חשובים של ההכנה הכירורגית, כמו גם ניצול נכון של מערכת הדמיית ריאות מיוצבת ואקום מוסברים בפירוט. לבסוף, מודל ניסיוני של ALI משמש כדי לספק הדמיה ייצוגית וניתוח של גלגול לויקוציטים שהשתנה, הידבקות לויקוציטים וזלוף נימי הקשור לדלקת. השימוש בפרוטוקול זה אמור להקל על חקירות חשובות נוספות של שינויים פתופיזיולוגיים במיקרו-סירקולציה ריאתית במהלך מצבי מחלה חריפים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו באישור מראש של הוועדה של אוניברסיטת דלהאוזי למען חיות מעבדה (UCLA).

1. הכנה

  1. מערכת הדמיית ריאות: כדי להכין את החלון, תנו שכבה דקה של שומן ואקום לחלק העליון של הטבעת החיצונית תוך הימנעות מזיהום של תעלת הוואקום. מניחים כיסוי זכוכית נקי בקוטר 8 מ"מ על החלון ולוחצים בעדינות כלפי מטה כדי ליצור אטם.
  2. מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה: בצע הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי רחב שדה המצויד במטרה למרחק עבודה ארוך של 20x/0.40 ובמצלמת התקן מצומדת מטען בשחור-לבן (CCD) עם קצב פריימים של 25 FPS. החל מסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר כדי להעיר את Rhodamine-6G ומסנן פס פס של 460-490 ננומטר כדי להעיר פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC).
  3. מערכת ואקום: חברו את חלון ההדמיה למשאבת ואקום המצוידת במד לחץ דיגיטלי המסוגל לספק יניקה קבועה של 50-60 מ"מ כספית, כפי שמוצג בתרשים משלים 1. בקיצור, חברו את חלון ההדמיה למשאבה באמצעות צינורות פוליאתילן I.D. בקוטר 1.0 מ"מ, צינורות פוליאתילן I.0 ס"מ בקוטר 1.0 ס"מ, בקבוקון ואקום ומסנן 0.2 מיקרומטר מוטבע.
  4. מכונת הנשמה: הגדר מכונת הנשמה קטנה למכרסמים כדי לספק אוורור מבוקר לחץ בקצב ובנפח המחושבים על סמך משקל העכבר. ספק לחץ קצה-תפוגה חיובי (PEEP) ב-5 ס"מH2O למשך הניסוי, והגדר את לחץ המטרה ל-20 סמ"ק2O.
  5. חומר הרדמה: באמצעות מערכת העברת הרדמה בזרימה נמוכה, הכינו מזרק 5.0 מ"ל עם 99.9% איזופלורן. השתמש במערכת חיטוי גז פסולת כדי למזער את הסיכון לשאיפה על ידי המנתח.

2. הרדמה

  1. מקם עכבר C57Bl/6 זכר בן 20-25 גרם בן 12 שבועות בתא האינדוקציה להרדמה. כאשר התא סגור היטב, התחילו באינדוקציה עם גז איזופלורן בריכוז של 3% ובקצב זרימה של 500 מ"ל לדקה.
  2. לאחר שהעכבר מורדם (דמיינו על ידי האטה בקצב הנשימה), העבירו אותו למעמד האינטובציה והצמידו את החותכים העליונים לתפר התלוי.
  3. הידקו את התפר כדי לאבטח את החוטם בתוך חרוט האף. התחילו את זרימת הגז דרך חרוט האף בריכוז של 2.5%.
  4. אשרו עומק הרדמה הולם באמצעות צביטה בבוהן לפני שתעברו לשלב הבא.

3. אינטובציה

  1. סובבו את המעמד כך שגב המעמד והצד הגבי של העכבר יפנו לכיוון המנתח.
  2. מעבירים את קצהו של כבל סיבים אופטיים באורך 20 ס"מ דרך צינורית אנדוטרכאלית של 20 גרם ומטביעים את הקצה בלידוקאין HCl (1%) כדי להקל על מעבר הכבל דרך הגרון.
  3. באמצעות מלקחיים קהים, הרימו את הלסת התחתונה והזיזו את הלשון כדי לספק מעבר ברור לתוך דרכי הנשימה.
  4. הכנס אוטוסקופ שונה (~60° מהיקף הספקולום הוסר) כך שהחותכות העליונות יתאימו לרווח בספקולום. התאימו את ההיקף ואת מיקום הלשון עד שהאפיגלוטיס, ומיתרי הקול נראים בבירור.
  5. הכנס את כבל הסיבים האופטיים הטעון בצינורית האנדו-טרכאלית דרך הרווח בספקולום ולתוך הגרון. באמצעות תנועות מעגליות קטנות, מעבירים את הכבל דרך מיתרי הקול ולתוך קנה הנשימה.
  6. דוחפים את הצינורית לאורך כבל הסיבים האופטיים, ועוברים בין מיתרי הקול לקנה הנשימה.

4. אוורור

  1. שלף את העכבר מעמדת האינטובציה והנח אותו על כרית חימום במצב דקוביטוס לרוחב ימין.
  2. חברו את הצינורית לצינורות הנשמה והפעילו את מכונת ההנשמה. הפחיתו את ריכוז ההרדמה ל-1.5% ונטרו את העומק על ידי בדיקת רפלקס הדוושה. אם הרפלקס נמשך, הגדל את הריכוז בהדרגה עד לרמה של עד 2%.
  3. מניחים ג'ל דמעות בעיני העכבר כדי למנוע ייבוש.
  4. באמצעות סרט רפואי, אבטח את הצינורית לחוטם. באמצעות סרט תיוג, הדק את המצח הימני למשטח החימום בערך, במיקום השעה 9. הרחיבו את הכפה האחורית השמאלית באופן קשוח ובטוחו בערך בשעה 6.
  5. באמצעות סרט בד, מתחו קלות את המצח השמאלי למצב השעה 12 והצמידו את הקצה השני של הקלטת לחלק העליון של פלטפורמת ה-IVM כפי שמוצג באיור 2A (שמירה על מתח קל כאן מקלה על כריתת החזה שלאחר מכן).
  6. הכנס בדיקת טמפרטורה רקטלית ואבטח את הגשושית על ידי הצמדתה למשטח החימום. מניחים אוקסימטר דופק על הכפה האחורית הימנית ומהדקים את כרית החימום, תוך הקפדה שלא לשבש את זרימת הדם.
  7. ברגע שהטמפרטורה יציבה ב 37°C ± 0.1 °C (66 °F), המשך לבצע את בית החזה.

5. תורקוטומיה

  1. לעקר את בית החזה והבטן עם 70% אלכוהול לנגב. יש למרוח שכבה בהירה של שמן מינרלי כדי להרטיב את השיער בצד שמאל של העכבר - מעצם החזה אל עמוד השדרה ומהכתף לתחתית הצלעות.
  2. עם מלקחיים קהים ומספריים ישרים, בצע חתך אורכי קטן ליד תחתית בית החזה כדי לחשוף את שכבת השריר הבסיסית.
  3. בתנועה גחונית, השתמש בדיסקציה קהה כדי להפריד בין רקמת האפיתל לרקמת השומן משכבת השריר. תזהו את כל כלי הדם החשופים. לאחר הפחתת הסיכון לאיבוד דם, האריכו את החתך המקורי בגחון עד לתהליך ה-xiphoid.
  4. חזור על תהליך זה באופן דורסני עד ~ 5 מ"מ רוחבי לעמוד החוליות.
  5. בתנועה מטורפת, השתמשו בניתוח קהה כדי לחשוף את כלוב הצלעות. צמצם את כל כלי הדם החשופים כדי לשמור על יציבות המודינמית.
  6. לאחר הפחתת הסיכון לאיבוד דם, הרחיבו את החתך מתהליך ה-xiphoid ועד לבית השחי.
  7. חזור על תהליך זה בצד הגבי של החתך עד כ-1 ס"מ נחות לאוזן שמאל.
  8. באמצעות מלקחיים המוסטטיים, תפסו את רקמת האפיתל והשומן המנותקת והתמקמו הרחק מהאזור הכירורגי (איור 2B).
  9. הזריקו תמיסה של רודמין-6G (0.5 מ"ג/מ"ל; 1.5 מ"ל/ק"ג) להדמיה של לויקוציטים ו-FITC-אלבומין בקר (50 מ"ג/מ"ל; 1 מ"ל/ק"ג) להדמיה של פרפוזיה נימית דרך וריד הזנב.
  10. באמצעות מלקחיים משוננים, תופסים את הצלע מיד נחותה ממיקום בסיס הריאה בהשראה הסופית ונסוגים מעט כדי למשוך את הצלע הרחק מהריאה. חותכים את הצלע כדי לגרום לפנאומוטורקס.
  11. יש להרחיב את החתך לרוחב לאורך השריר הבין-קוסטלי בשני הכיוונים, תוך הקפדה שלא לגעת במשטח הריאה החשוף.
  12. באמצעות מלקחיים קהים, תפסו את הצלע הגבוהה הבאה ונסוגו מעט כדי לאפשר לריאה ליפול מדופן בית החזה. אם הריאה אינה מתנתקת, לחץ קלות על דופן בית החזה כנגד הריאה כדי לגרום לריאה להיצמד לצדר הבסיסי ובכך ליפול בקלות רבה יותר.
  13. ממשיכים את החתך המקורי בגחון עד לעצם החזה ולקרונלי עד לחשיפת פסגת הריאה. השתמש באפליקטורים מכותנה ובגזה כדי להחליש כל דימום שעולה.
  14. הרם את בית החזה כדי לחשוף כלי דם בין-כוכביים על ההיבט הגבי של חלל בית החזה. תוך הקפדה שלא לפגוע בריאה, לצרוב את כלי הדם האינטרקוסטלי הנחות ביותר ליד עמוד השדרה, ולאחר מכן לחתוך את הצלע. בתנועה קרניאלית וגחונית, חזרו על הפעולה עד לכריתת חלק של כ-1 ס"מ על 1.5 ס"מ של הצלעות (איור 2C).
  15. הסר כל הצטברות נוזלים עודפת בחלל בית החזה באמצעות פעולה נימית באמצעות רצועות קטנות של גזה.
  16. תוך כדי המשך למיקרוסקופיה, אפשרו כ-5 דקות לפיזור הנוזל התוך-פלורלי לקבלת ממשק בטוח יותר בין הריאה לחלון ההדמיה.

6. מיקרוסקופיה

  1. הפעילו את משאבת הוואקום והתאימו את הלחץ ל-50-60 מ"מ כספית.
  2. העבר את פלטפורמת ה- IVM לשלב המיקרוסקופ. מקם את עמוד המתכת והמיקרומניפולטור כך שחלון ההדמיה יהיה ישירות מעל הריאה החשופה וזרוע החלון מתקרבת לריאה ממצב השעה 3 בערך.
  3. באמצעות המיקרומניפולטור, הנמיכו בזהירות את חלון ההדמיה עד שהוא נצמד למשטח הריאה ומייצב אותו (איור 3A).
  4. באמצעות המטרה 20x ומסנן העירור של פס פס 460-490 ננומטר, זהה זן ריאתי המבוסס על התבנית המתכנסת של זרימת הדם. מרכזים את כלי השיט בשדה הראייה ומקליטים 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על הצעד הקודם עד שצולמו חמישה זנים ריאתיים.
  5. באמצעות מסנן עירור פס פס של 460-490 ננומטר, זהה עורק ריאתי המבוסס על התבנית המסתעפת של זרימת הדם. מרכזים את כלי השיט בשדה הראייה ומקליטים 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על השלב הקודם עד שצולמו חמישה עורקי ריאות.
  6. באמצעות מסנן עירור פס פס 460-490 ננומטר, אתר אזור של נאדיות ונימים שאינם מצטלבים על ידי כלי שיט גדולים יותר ורושם 30 שניות של וידאו.
    1. עבור למסנן עירור פס פס של 530-550 ננומטר והקליט 30 שניות של וידאו באותו שדה ראייה.
    2. חזור על השלב הקודם עד להצטלם חמישה אזורים נימיים.

7. המתת חסד ופרוטוקול ניקוי

  1. הסר את פלטפורמת ה- IVM משלב המיקרוסקופ והתאם את אספקת האיזופלורן ל -5% למשך 5 דקות כדי להרדים את העכבר.
  2. בזמן ההמתנה, השליכו את זכוכית הכיסוי ונתקו את חלון ההדמיה מהרציף. נקו את חלון ההדמיה עם מברשת קטנה והשתמשו במזרק 30 גרם המוחדר לתעלה כדי לשטוף אותו מספר פעמים במים מזוקקים. לאחר מכן, יש לשטוף עם 95% אתנול באמצעות משאבת הוואקום.
  3. לאחר שחלפו 5 דקות, עצרו את מכונת ההנשמה והבטיחו המתת חסד מלאה באמצעות פריקה של צוואר הרחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את התוצאות הניתנות להשגה באמצעות פרוטוקול זה, נגרמה פגיעה חריפה בריאה (ALI) 6 שעות לפני ההדמיה באמצעות מודל של החדרת ליפופוליסכריד חיידקי תוך-ורידי (LPS). בקצרה, עכברים (n = 3) הורדמו עם איזופלורן, וטיפות קטנות של LPS מ - Pseudomonas aeruginosa במי מלח סטריליים (10 מ"ג / מ"ל) הוכנסו לתוך הנריס השמאלי במינון של 5 מ"ג / ק"ג. זאת בהשוואה לעכברים תמימים (n = 3; ללא ניהול תוך-גולגולתי).

עם ההדמיה, הכנה כירורגית מוצלחת ניתנת לזיהוי על ידי מספר גורמים. הריאה צריכה להיות יציבה יחסית עם נשימה הגורמת להסטות מסגרת מחזוריות שאינן עולות על 25 מיקרומטר. הנאדיות צריכות להיות גלויות בבירור ועשויות להפגין התנפחות/התכווצות גאות ושפל. עירור על ידי אור כחול (אורך גל של 450-490 ננומטר) יאפשר הדמיה של כיווניות זרימת הדם, וייתכן שניתן יהיה להבחין בין תאי דם אדומים בודדים (סרט משלים 1, סרט משלים 3 וסרט משלים 5). לויקוציטים יהיו ניתנים לזיהוי ברור עם עירור על ידי אור ירוק (אורך גל של 530-560 ננומטר, סרט משלים 2, סרט משלים 4 וסרט משלים 6). לאחר השלמת ההדמיה וההסרה של חלון היניקה, ייתכנו שטפי דם קלים במשטח הריאה, אם כי לא בתוך האזור המצולם, כפי שמוצג באיור 3B.

מספר אתגרים טכניים עלולים להפריע לכדאיות הניסוי. הצטברות של דם על פני הריאה תפגע בייצוב הוואקום ואף עלולה לסתום את התעלה. כדי להימנע מכך, יש לנקוט משנה זהירות במהלך כל שלב כירורגי. לחץ ואקום גבוה מדי עלול לפגוע בריאה ולהשפיע על מיקרו-סירקולציה. ניתן לזהות זאת על ידי קיפאון נאדי או שטפי דם מוגזמים על פני השטח הריאתיים (איור 3C) וניתן לתקן זאת על ידי הפחתת הלחץ ממשאבת הוואקום. כמו כן, טעויות בהזרקת פלואורופור תוך ורידית עלולות להוביל להדמיה לקויה של סחר בלוקוציטים וזרימת דם.

לאחר השלמת הפרוטוקול, בוצע ניתוח ידני עיוור באמצעות פיג'י21 באופן שהותאם מהספרות הקודמת28. חמישה זנים, עורקים ואזורים נימיים בעלי עניין (ROIs) נותחו מכל חיה. הידבקות לויקוציטים בלולים ובעורקים הוגדרה כמספר התאים שנותרו דבוקים לאנדותל כלי הדם במהלך 30 שניות של תצפית לכל אזור של משטח האנדותל. זה מועבר בתאים/מ"מ2. הידבקות לויקוציטים בנימים הוגדרה כמספר התאים בתוך ROI שנותרו דבוקים לאנדותל הווסקולרי במהלך 30 שניות של תצפית לכל שטח כולל שנותח. זה מועבר גם בתאים/מ"מ2. גלגול לויקוציטים הוגדר כמספר כפול ממספר התאים העוברים נקודת ייחוס בכלי במהלך תקופת התצפית של 30 שניות. לויקוציטים הזורמים בחופשיות לא נכללו על ידי השוואת מהירות המעבר לזו של זרימת תאי הדם האדומים, וזה מועבר בתאים/דקות. כדי למדוד פרפוזיה מיקרו-סירקולטורית, FCD הוגדר כסכום האורכים של נימים מנוקבים בתאי דם אדומים לכל אזור תצפית. זה מועבר בס"מ/ס"מ2. כל פרמטר מדווח כערך ממוצע עבור כל חיה.

מגמה נפוצה של גיוס לויקוציטים נצפתה אצל זנים ריאתיים, עם הידבקות מוגברת וגלגול בעכברים שטופלו ב-LPS לעומת עכברים תמימים (איורים 4C,D). מגמה זו הוסכמה על ידי הידבקות לויקוציטים עורקית, אם כי שתי רמות הגלגול וההדבקה היו משתנות מאוד בקבוצה הנאיבית (איורים 5C,D). יש לציין כי מתן LPS הביא לעלייה משמעותית בהידבקות לויקוציטים ב-ROIs נימיים ריאתיים (איור 6C). עכברי LPS גם הדגימו FCD מופחת לעומת עכברים תמימים (איור 7C). השפעות אלה בתוך נימים ריאתיים עולות בקנה אחד עם ספרות קודמת שזיהתה עלייה בתאי מערכת החיסון לכל שדה ראייה והתדרדרות של פרפוזיה תקינה של נימים בעקבות גירויים דלקתיים שונים 4,5,16.

Figure 1
איור 1: מערכת הדמיית ריאות. מערכת הזמנה מותאמת אישית כוללת (1) בסיס מתכת אנודייז, (2) חלון הדמיה, (3) כניסת ואקום, (4) מיקרומניפולטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הכנה כירורגית. (A) העכבר מאובטח לפלטפורמת ה-IVM בתנוחת הדקוביטוס הצידית הימנית. (B) צלעות נחשפות באמצעות דיסקציה קהה כדי לשמר את ההמודינמיקה. (C) תורקוטומיה מבוצעת כדי לחשוף את הריאה השמאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ייצוב ואקום. (B) ניצול לחצי ואקום מתחת ל-75 מ"מ כספית ממזער את הנזק לריאה, במיוחד באזור התמונה. (C) לחצי ואקום גבוהים יותר עלולים לגרום לחבלות משמעותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סחר בלוקוציטים בצמחי ריאות. עירור של רודמין 6G מאפשר הדמיה של לויקוציטים דבקים ומתגלגלים. אזורים מתוארים מייצגים חלקים מנותחים של אנדותל כלי דם כפי שאושרו על ידי עירור של FITC-אלבומין ב-(A) עכברים נאיביים ו-(B) שטופלו ב-LPS. (ג,ד) מתן LPS תוך-גולגולתי משפיע על גלגול לויקוציטים והידבקות בצמחי ריאות. הערכים ניתנים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: סחר בלוקוציטים בעורקי ריאות. עירור של רודמין 6G מאפשר הדמיה של לויקוציטים דבקים ומתגלגלים. אזורים מתוארים מייצגים חלקים מנותחים של אנדותל כלי דם כפי שאושרו על ידי עירור של FITC-אלבומין ב-(A) עכברים נאיביים ו-(B) שטופלו ב-LPS. (ג,ד) מתן LPS תוך-ורידי משפיע על גלגול לויקוציטים והידבקות בעורקי ריאות. הערכים ניתנים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: לויקוציטים חסידיים בנימים ריאתיים. עירור של רודמין 6G מאפשר הדמיה של לויקוציטים בתוך ROIs ב-(A) עכברים תמימים ו-(B) שטופלו ב-LPS. (C) מתן LPS תוך-ורידי משפיע על הידבקות לויקוציטים בעכברים שטופלו ב-LPS. הערכים ניתנים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: תפקוד נימי ריאתי. עירור של FITC-אלבומין מאפשר הדמיה של זרימת דם נימית בתוך ROIs ב-(A) עכברים נאיביים ו-(B) שטופלו ב-LPS. (C) מתן LPS תוך-ורידי משפיע על FCD בנימים ריאתיים. הערכים ניתנים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים: קובץ לפלטפורמת IVM הניתנת להדפסה בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 1: דיאגרמה של מערכת הוואקום. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 1: סרטון לדוגמה של זרימת הדם בזן הריאתי. החץ הירוק מציין את כיוון זרימת הדם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 2: סרטון לדוגמה של סחר בלוקוציטים בזן הריאתי. חצים אדומים מציינים לויקוציטים דביקים בתוך כלי השיט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 3: סרטון לדוגמה של זרימת הדם בעורק הריאתי. החץ הירוק מציין את כיוון זרימת הדם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 4: סרטון לדוגמה של סחר בלוקוציטים בעורקי ריאות. חצים אדומים מציינים לויקוציטים דביקים בתוך כלי שיט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 5: סרטון לדוגמה של זרימת הדם בנימים ריאתיים. חיצים ירוקים מציינים כמה אזורים בעלי דמיון טוב של נימים מחוררים בתאי דם אדומים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט משלים 6: סרטון לדוגמה של סחר בלוקוציטים בנימים ריאתיים. חצים אדומים מציינים לויקוציטים דביקים בשדה הראייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן דורש תרגול ותשומת לב לכמה שלבים קריטיים. ראשית, חשוב להכין את חלון ההדמיה לפני תחילת האינטובינציה והניתוח. השתמשו בכמות מינימלית של שומן ואקום כדי לצפות את הטבעת החיצונית של חלון ההדמיה, למרוח את זכוכית הכיסוי ולבדוק את היניקה עם טיפת מים מזוקקים. הכנה זו מראש תמנע מהריאה החשופה להתייבש במהלך ההתקנה אחרת. אמנם ניתן לשטוף במי מלח חמים, אך פעולה זו עלולה להסתכן בפגיעה ברקמת הריאה השברירית.

לאחר אינטובציה, בעת העברת העכבר לפלטפורמת IVM, הצינורית עלולה להיעקר מדי פעם. כדי למנוע זאת, שקול לקשור את הצינורית לשיניים הקדמיות של העכבר או לתפור אותה לעור סביב פיו. אם משתמשים באוורור מבוקר לחץ, יש לעקוב בקפידה אחר נפח הגאות והשפל לאורך כל ההליך. הוא אמור להישאר יציב על כ-0.20 מ"ל, שכן ערכים נמוכים משמעותית (למשל, כ-0.10 מ"ל) עשויים להצביע על אוורור ריאה בודד. אם זה קורה, נסיגה קלה של הצינורית האנדו-טרכאלית עשויה לפתור את הבעיה. השימוש בהרדמה נדיפה (איזופלורן) מקל על שליטה בעומק ההרדמה בזמן שהעכבר מאוורר. אמצעי הרדמה אחרים (למשל, קטמין/קסילאזין10,11 תוך ורידי) הופעלו על ידי מעבדות אחרות, וכל אחת מהן נושאת את היתרונות והחסרונות שלה.

במהלך הניתוח, נעשה שימוש בניתוח קהה כדי למזער את הסיכון לניתוק כלי הדם. יש לכך חשיבות מיוחדת כאשר מנתחים את רקמת השומן העבה והסקולרית בכבדות ליד הכתף. כריתה של הצלעות דורשת גם מהירות וגם דיוק. החום מן cauterizer הוא אינטנסיבי מספיק כדי לשרוף את הריאה אם נעשה שימוש מוגזם. בעת כריתת הצלעות, צריך להיות חלל ריק בין הריאה לדופן בית החזה. אם הריאה נצמדת לדופן בית החזה, לחיצה קלה כלפי מטה על החלק החיצוני של כלוב הצלעות תעודד היצמדות לצדר הקודקוד הבסיסי. לחלופין, השתמשו במחט קהה כדי להזריק כמות קטנה של מי מלח חמים בין הריאה לצלעות כדי להקל על השחרור. מומלץ למקם את זרוע החלון בתנוחת השעה 3 כדי למנוע לחץ לא רצוי על הצלעות במהלך ההדמיה (איור 3A). זה גם ישאיר יותר מרווח בין המיקרומניפולטור לבין מטרת המיקרוסקופ, ויאפשר גישה קלה יותר למניפולציות. בעת הורדת חלון ההדמיה, חשוב להתמקד באזור המרכזי של הריאה, שכן מגע עם הקצה יגרום לחותם לקוי ולממצא תנועה מופרז במהלך ההדמיה. כמו כן, ניסיונות מרובים להנמיך את החלון עלולים לפגוע בריאה. כמו כן, מחזורים של ניתוק וייצוב מחדש יתרמו לפגיעה בריאה ועלולים לפגוע בדיוק הניסויי. עם זאת, כאשר היא מבוצעת בצורה נכונה, ההכנה המוצגת כאן יציבה מספיק כדי לאפשר הדמיה תוך-לוויטלית ברזולוציה גבוהה עם מטרה של פי 20.

פרוטוקול ניקוי קפדני נחוץ כדי למנוע זיהום וחסימה של תעלת הוואקום בתוך חלון ההדמיה. שימוש במחט של 30 גרם מיד לאחר ניסויים לשטיפה חוזרת ונשנית במים מזוקקים יעיל להסרת רוב המזהמים. לאחר מכן יש שטיפה עם אתנול מרוכז וסומק סופי עם מים מזוקקים לפני חיבור מחדש לקו הוואקום כדי להסיר לחות. שימוש באצטון או בחומרי ניקוי חזקים עשוי להיות מספיק כדי לפתור חסימות חמורות, אם הן מתרחשות.

יש לציין כי פרוטוקול זה משתמש בקריאה גבוהה יותר של לחץ ואקום לעומת כמה שיטות אחרות שדווחו 4,11, והדבר עשוי להעלות חששות לפגיעה ברקמת הריאה. הבחנה חשובה, עם זאת, היא שהמד הדיגיטלי המשמש כאן מודד לחץ רק במשאבת הוואקום. לחץ זה מועבר דרך צינורות צרים והתעלה הצרה ביותר של חלון ההדמיה עצמו לפני ההפצה על פני שטח פנים גדול יותר של הריאה. לפיכך, לא נצפתה עדות לפגיעה באזור המצולם בניסויים אלה לאחר מפגשים תוך-ורידיים. יתר על כן, הנאדיות המצולמות הפגינו התנפחות והתכווצות גאות ושפל, מה שמעיד על כך שתופעה פיזיולוגית זו לא הופרעה באופן משמעותי.

למרות הפופולריות הגוברת של IVM ריאות ככלי לחקר מחלות in vivo, ישנן מגבלות לטכניקה זו. ראשית, האופי הפולשני והסופי של הניתוח גורם להשפעה לא זניחה על מצבו הפיזיולוגי של העכבר ומגביל את ההליך לסשן הדמיה יחיד. עם זאת, יש לציין כי מספר גישות IVM של ריאות אורכיות פותחו30. שנית, השימוש באוורור מכני עלול לגרום לדרגה מסוימת של פגיעה בריאה הקשורה למכונת הנשמה (VALI)31, אם כי הדבר מוגבל על ידי משך הזמן הקצר של ההליך. שלישית, מגע בין הצדר הקרבי לבין כיסוי הזכוכית ויישום לחץ הוואקום עלול לגרום לשינוי בזרימת הדם המיקרו-וסקולרית. לבסוף, אולי המגבלה המשמעותית ביותר של גישה זו היא שהדמיה מוגבלת לנאדיות תת-פלורליות באזורים ריאתיים שאינם תלויים, שאינם מייצגים את הריאה כולה32.

לסיכום, פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-וסקולטורה ריאתית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית. בעוד שניסויים אלה משתמשים בפגיעה ריאה הנגרמת על ידי אנדוטוקסין, מודל אקוטי שנבחר על סמך מחקרים קודמים, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם גם לחקר תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים אחרים בריאה. יתר על כן, מערכת הדמיית הריאות המופעלת כאן ישימה למגוון גישות מיקרוסקופיה, וחלון ההדמיה גדול מספיק כדי להתאים למטרות טבילת שמן צמצם מספרית גבוהה. לפיכך, ההליכים המתוארים צריכים להקל על מחקר נוסף על ההשפעה של מצבי מחלה שונים על מיקרו-סירקולציה ריאתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר קמאלה ד. פאטל היא הנשיאה והמייסדת השותפה של Luxidea, הארגון שממנו נרכש חלון ההדמיה ששימש בניסוי זה.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר פינה קולארוסו, שסיפקה מומחיות משמעותית בעריכה ובתיקון של כתב יד זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use Becton, Dickinson and Company 309659 1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm RWD Life Science Co. F12002-12 Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate Sigma-Aldrich A9771-1G FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v Canadian Custom Packaging Company 80002455 Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter Canopus 00631069602029 Digital video converter
B/W - CCD - Camera Horn Imaging BC-71 Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit Fine Science Tools 18010-00 Cauterizer
C57BL/6 Mice Charles River Laboratories International C57BL/6NCrl C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators Puritan 806-WC Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip Warner Instruments 64-0701 Glass coverslip
Digital Pressure Gauge ITM Instruments Inc. DG2551L0NAM02L0IM&V Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope Dr. Mom Otoscopes 1001 Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol Commercial Alcohols P016EA95 95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11 Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape Fisher Scientific 1590110 Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump Cole-Parmer Canada Company ZA-07061-40 Vacuum pump
Hartman Hemostats Fine Science Tools 13003-10 Hemostatic forceps
High Vacuum Grease Dow Corning DC976VF Vacuum grease
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2 Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL Teligent Canada 0121AD01 Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard Luxidea, Inc. IMCH-0001 Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil Teva Canada 00485802 Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit Kent Scientific Corporation ETI-MSE Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope Leica Microsystems 10 450 022 Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective Leica Microsystems 566035 20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2" AMD-Ritmed A2101-CH Gauze
Optixcare Eye Lube Plus Aventix 5914322 Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer Prusa Research PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI 3D printer
Oxygen, Compressed Linde Canada Inc. Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) Becton, Dickinson and Company 305106 30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL Cole-Parmer Canada Company 5340-2L Vacuum flask
Rhodamine 6 G Sigma-Aldrich 252433 Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" Primed PM5-630709 Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD Dow Corning 602-205 1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01, SS-04-module Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth World Precision Instruments 501216 Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) 3M 7000002795 Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. Grainger Canada USSZUSA-HT3314 1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm Cole-Parmer Canada Company 6720-5002 Inline 0.2µm filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
  2. Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
  3. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  4. Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
  5. Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
  6. Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
  7. Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
  8. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
  9. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  10. Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
  11. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  12. Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
  13. Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
  14. Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
  15. Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
  16. Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
  17. Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
  18. Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
  19. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  20. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  21. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  22. Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  25. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  26. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
  27. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  28. Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
  29. Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  30. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  31. Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
  32. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 182
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hall, S., Faridi, S., Euodia, I.,… More

Hall, S., Faridi, S., Euodia, I., Tanner, S., Chojnacki, A. K., Patel, K. D., Zhou, J., Lehmann, C. Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System. J. Vis. Exp. (182), e63733, doi:10.3791/63733 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter