Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan brukes til å studere leukocytt-endotelinteraksjoner og kapillær perfusjon i sanntid. Denne protokollen beskriver metoder for å avbilde og kvantifisere disse parametrene i lungemikrosirkulasjonen ved hjelp av et vakuumstabilisert lungeavbildningssystem.
Abstract
Intravital avbildning av leukocytt-endotelinteraksjoner gir verdifull innsikt i immunmediert sykdom hos levende dyr. Studien av akutt lungeskade (ALI)/akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og andre respiratoriske patologier in vivo er vanskelig på grunn av lungenes begrensede tilgjengelighet og iboende bevegelsesartefakter. Likevel er det utviklet ulike tilnærminger for å overvinne disse utfordringene. Denne protokollen beskriver en metode for intravital fluorescensmikroskopi for å studere sanntids leukocytt-endotelinteraksjoner i lungemikrosirkulasjonen i en eksperimentell modell av ALI. Et in vivo lungeavbildningssystem og 3D-trykt intravital mikroskopiplattform brukes til å sikre den bedøvede musen og stabilisere lungen samtidig som den forvirrende lungeskaden minimeres. Etter tilberedning brukes widefield fluorescensmikroskopi til å studere leukocyttadhesjon, leukocyttrulling og kapillærfunksjon. Mens protokollen som presenteres her fokuserer på avbildning i en akutt modell av inflammatorisk lungesykdom, kan den også tilpasses for å studere andre patologiske og fysiologiske prosesser i lungen.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et nyttig bildeverktøy for visualisering og studier av ulike biofysiske prosesser in vivo. Lungen er svært utfordrende å avbilde in vivo på grunn av sin lukkede plassering, vevets skjøre natur og bevegelsesartefakter indusert av åndedrett og hjerterytme 1,2. Ulike intravitale mikroskopi (IVM) oppsett er utviklet for sanntidsavbildning av leukocytt-endotelinteraksjoner i lungemikrosirkulasjon for å overvinne disse utfordringene. Slike tilnærminger er basert på kirurgisk eksponering og stabilisering av lungen for avbildning.
Dyr er vanligvis forberedt på lunge IVM ved kirurgiske prosedyrer. For det første blir dyr intubert og ventilert, noe som tillater kirurgisk eksisjon av et thoraxvindu og etterfølgende intervensjoner for å stabilisere lungen for avbildning. En teknikk innebærer å lime parenchyma på en glassdekslerlip3, en prosedyre som risikerer betydelige fysiske traumer for det avbildede vevet. Mer avansert er bruken av et vakuumsystem for å stabilisere lungen under et glassvindu4. Dette oppsettet letter løs overholdelse av lungeoverflaten til dekslene via et reversibel vakuum spredt over et stort lokalområde og utvider lungen samtidig som bevegelsen i x-, y- og z-dimensjonene4 begrenses. Vakuumet påføres jevnt gjennom en kanal rundt bildeområdet til oppsettet og trekker vevet inn i et grunt konisk område vendt mot bildekvalitetsdekslene4. Gjennom dette visningsvinduet kan lungemikrosirkulasjonen studeres ved hjelp av ulike optiske bildemodaliteter.
Lunge IVM muliggjør kvantitativ avbildning av en rekke mikrosirkulasjonsparametere. Disse inkluderer målinger som leukocyttsporhastighet og lengde5, rød blodcellestrømningshastighet6 og oksygenering7, tumormetastaser8, skillet mellom immuncelledelpopulasjoner 9,10,11, visualisering av mikropartikler12, alveolardynamikk13,14, vaskulær permeabilitet15 og kapillærfunksjon16 . Fokuset her er på leukocyttrekruttering og kapillærfunksjon. Initiering av leukocyttrekruttering i lungemikrosirkulasjonen innebærer forbigående rullende interaksjoner og faste liminteraksjoner mellom leukocytter og endotelceller, som begge økes under inflammatoriske forhold 16,17. Rullende kvantifiseres vanligvis av antall leukocytter som passerer en operatørdefinert referanselinje, mens vedheft kvantifiseres av antall leukocytter som er immobile påendotelet 16. Kapillærfunksjon kan også påvirkes i inflammatoriske tilstander, noe som ofte resulterer i redusert perfusjon. Dette kan tilskrives flere faktorer, inkludert en reduksjon av røde blodlegemers deformabilitet18 og variert uttrykk for inducible NO-syntase ved endotelceller som resulterer i patologisk shunting19. Vanligvis måles og rapporteres den samlede lengden på perfused kapillærer per område som funksjonell kapillærtetthet (FCD).
Å studere leukocyttrekruttering i lungene i sanntid krever merking av biologiske mål med fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende merkede antistoffer20. Alternativt kan ulike transgene musestammer som lysozyme M-grønn fluorescerende protein (LysM-GFP) mus brukes til å bildespesifikke immuncelleundergrupper som nøytrofiler21,22. De fluorescerende merkede leukocyttene kan deretter visualiseres ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi, konfettisk mikroskopi eller multifotonmikroskopi. Disse teknikkene oppnår kontrast ved å bruke spesifikke eksitasjonsbølgelengder og oppdage avgitt fluorescens samtidig som de blokkerer påvisning av eksitasjonsbølgelengden, og dermed fremhever det merkede objektet.
Eksisterende forskning om kvantifisering av leukocyttrulling, vedheft og funksjonell kapillærtetthet i murin lungen har hovedsakelig stolt på manuell videoanalyse. Dette er mulig gjennom programvare med åpen kildekode, for eksempel Fiji 6,23, proprietær programvare som CapImage12 eller skreddersydde bildebehandlingssystemer24. På den annen side muliggjør ulike proprietære programvareplattformer (f.eks. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatisert måling av et bredt spekter av andre fysiologiske parametere, inkludert mange av de som tidligere er nevnt her 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Det er gjort viktige observasjoner vedrørende patologien til akutt lungeskade (ALI) og akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) ved bruk av lunge IVM. ARDS er preget av en rekke patofysiologiske prosesser i lungen, inkludert lungeødem og alveolarskader forårsaket av dysfunksjon av endotelet og epitelbarrieren25. Ved hjelp av en murinmodell har det blitt funnet at sepsisindusert ALI er forbundet med betydelige skadelige endringer i immuncellehandel i lungemiljøet26. Nøytrofiler rekruttert til kapillærene til mus med sepsisindusert ALI ble funnet å hindre mikrosirkulasjon, og dermed øke hypoksi i ALI26. I tillegg har IVM blitt brukt til å få innsikt i den underliggende reparasjonsmekanismen etter utbruddet av ARDS27. Lunge IVM har også vært et verdifullt verktøy for å forstå patofysiologiske endringer i ulike obstruktive lungesykdommer. For eksempel har visualisering av slimtransport i sykdommer som cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) lagt til rette for studiet av nye og eksisterende behandlinger for slimete clearance28. Leukocytthandel under disse forholdene har også blitt analysert i tilleggtil 17.
Denne protokollen utvider tilnærmingen som opprinnelig ble beskrevet av Lamm et al.29 for å studere leukocytt-endotelinteraksjoner ved hjelp av konvensjonell fluorescensmikroskopi. De beskrevne prosedyrene benytter et in vivo lungeavbildningssystem, som inkluderer et metallbase på 16,5 cm x 12,7 cm, mikromanipulator og vakuumavbildningsvindu (figur 1). Systemet er montert i en 20 cm x 23,5 cm 3D-trykt plattform (tilleggsfil 1) for å gi sikkert feste til ventilatorslangen og varmeputen. Denne metoden gir reproduserbar og kvantifiserbar avbildning av murin lungemikrosirkulasjon in vivo. Viktige aspekter ved det kirurgiske preparatet samt riktig utnyttelse av et vakuumstabilisert lungeavbildningssystem forklares i detalj. Til slutt brukes en eksperimentell modell av ALI til å gi representativ avbildning og analyse av endret leukocyttrulling, leukocyttadhesjon og kapillær perfusjon forbundet med betennelse. Bruken av denne protokollen bør legge til rette for ytterligere viktige undersøkelser av patofysiologiske endringer i lungemikrosirkulasjonen under akutte sykdomstilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene beskrevet her ble utført med forhåndsgodkjenning av Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).
1. Forberedelse
- Lungeavbildningssystem: For å forberede vinduet, administrer et tynt lag med vakuumfett til toppen av den ytre ringen samtidig som du unngår forurensning av vakuumkanalen. Sett en ren 8 mm glassdeksler på vinduet og trykk forsiktig ned for å lage en forsegling.
- Widefield Fluorescence Microscope: Utfør avbildning med et konvensjonelt widefield fluorescensmikroskop utstyrt med et 20x / 0,40 langt arbeidsavstandsmål og et svart-hvitt ladekoblet enhetskamera (CCD) med en bildefrekvens på 25 FPS. Påfør et 530-550 nm bandpass eksitasjonsfilter for å begeistre Rhodamine-6G og et 460-490 nm bandpassfilter for å begeistre Fluorescein Isothiocyanate (FITC).
- Vakuumsystem: Koble bildevinduet til en vakuumpumpe utstyrt med en digital trykkmåler som er i stand til å gi 50-60 mmHg konstant sugekraft, som vist i supplerende figur 1. Kort sagt, koble bildevinduet til pumpen gjennom 1,0 mm I.D. polyetylenrør, 1,0 cm I.D. polyetylenrør, en vakuumflaske og et innebygd 0,2 μm filter.
- Ventilator: Still inn en liten gnagerventilator for å gi trykkkontrollert ventilasjon med en hastighet og volum beregnet basert på musens vekt. Gi et positivt sluttutløpstrykk (PEEP) ved 5 cmH2O så lenge eksperimentet varer, og sett måltrykket til 20 cmH2O.
- Bedøvelse: Bruk et lavstrøms anestesileveringssystem, prime en 5,0 ml sprøyte med 99,9% isofluran. Bruk et avfallsgassoppfinnende system for å minimere risikoen for innånding av kirurgen.
2. Anestesi
- Plasser en 20-25 g 12 uker gammel mannlig C57Bl/ 6 mus i anestesiinduksjonskammeret. Med kammeret sikkert lukket, begynn induksjon med isoflurangass i en konsentrasjon på 3% og en strømningshastighet på 500 ml / min.
- Når musen er bedøvet (visualisert av langsom respirasjonshastighet), overfør den til intubasjonsstativet og fest de øvre snittene til hengende sutur.
- Stram suturen for å feste snuten inne i nesekjeglen. Begynn gassstrømmen gjennom nesekjeglen i en konsentrasjon på 2,5%.
- Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi via tåklemme før du går til neste trinn.
3. Intubasjon
- Roter stativet slik at baksiden av stativet og dorsalsiden av musen vender mot kirurgen.
- Før spissen av en 20 cm lang fiberoptisk kabel gjennom en 20 G endotrakeal kanyle og senk spissen i Lidocaine HCl (1%) for å lette passasjen av kabelen gjennom strupehodet.
- Bruk stumpe tang, løft underkjeven og fortreng tungen for å gi klar passasje inn i luftveiene.
- Sett inn et modifisert otoskop (~60° av spekulumomkrets fjernet) slik at de øvre snittene passer innenfor gapet i spekulumet. Juster omfangs- og tungeposisjonen til epiglottiene og stemmebåndene er godt synlige.
- Sett den fiberoptiske kabelen lastet med endotrakealkanylen gjennom gapet i spekulumet og inn i strupehodet. Bruk små sirkulære bevegelser, før kabelen gjennom stemmebåndene og inn i luftrøret.
- Skyv kanylen langs fiberoptisk kabel, passerer mellom stemmebåndene og inn i luftrøret.
4. Ventilasjon
- Hent musen fra intubasjonsstativet og legg den på en varmepute i høyre lateral decubitus-posisjon.
- Koble kanylen til ventilatorslangen og start ventilatoren. Reduser bedøvelseskonsentrasjonen til 1,5% og overvåk dybden ved å teste for pedal refleks. Hvis refleksen vedvarer, øker konsentrasjonen trinnvis til så høyt som 2%.
- Plasser tåregel i musens øyne for å forhindre tørking.
- Bruk medisinsk tape, sikre kanylen til snuten. Ved hjelp av merkingstape fester du riktig forpaws til varmeputen ved ca. klokken 9. Utvid venstre bakpote årsaksmessig og sikre ved omtrent klokken 6.
- Bruk en kluttape til å strekke venstre forpaws lett til 12-stilling og fest den andre enden av båndet til toppen av IVM-plattformen som vist i figur 2A (opprettholdelse av liten spenning her letter påfølgende thoraxotomi).
- Sett inn en rektal temperatursonde og fest sonden ved å tappe den til varmeputen. Plasser et pulsoksymeter på høyre bakpote og fest til varmeputen, pass på at du ikke forstyrrer sirkulasjonen.
- Når temperaturen er stabil ved 37,0 °C ± 0,1 °C, fortsetter du å utføre thoraxotomien.
5. Thoracotomy
- Steriliser thorax og mage med en 70% alkoholserviett. Påfør et lett lag mineralolje for å dempe håret på venstre side av musen fra brystbenet til vertebrale kolonnen og fra skulderen til bunnen av ribbeina.
- Med stumpe tang og rett saks, gjør et lite langsgående snitt nær bunnen av ribcage for å eksponere det underliggende muskellaget.
- Flytte ventrally, bruk stump disseksjon for å skille epitelial og fettvev fra muskellaget. Cauterize alle eksponerte blodårer. Når risikoen for blodtap er redusert, forlenge den opprinnelige snitt ventrally til xiphoid prosessen.
- Gjenta denne prosessen dorsalt til ~ 5 mm lateral til vertebrale kolonnen.
- Beveger seg kranialt, bruk stump disseksjon for å eksponere ribbeburet. Cauterize eventuelle eksponerte blodkar for å bevare hemodynamisk stabilitet.
- Når risikoen for blodtap er redusert, forlenge snittet fra xiphoid prosessen til axilla.
- Gjenta denne prosessen på dorsalsiden av snittet til ~ 1 cm dårligere enn venstre øre.
- Bruk hemostatiske tang, ta tak i det dissekerte epitel- og fettvevet og plasser det kirurgiske området (figur 2B).
- Injiser en løsning av Rhodamine-6G (0,5 mg/ml; 1,5 ml/kg) for visualisering av leukocytter og Bovine FITC-albumin (50 mg/ml; 1 ml/kg) for visualisering av kapillær perfusjon via halevenen.
- Ved hjelp av tannede tang, ta tak i ribben umiddelbart dårligere enn lungens posisjon ved end-inspirasjon og trekk litt tilbake for å trekke ribben bort fra lungen. Klipp ribben for å indusere en pneumothorax.
- Utvid snittet sideveis langs intercostalmuskelen i begge retninger, pass på at du ikke berører den eksponerte lungeoverflaten.
- Bruk stumpe tang, ta tak i den nest høyeste ribben og trekk deg litt tilbake slik at lungen kan falle bort fra brystveggen. Hvis lungen ikke løsner, trykk brystveggen lett mot lungen for å få lungen til å holde seg til den underliggende pleuraen og dermed falle lettere bort.
- Fortsett det opprinnelige snittet ventrally til brystbenet og kranialt til toppen av lungen er utsatt. Bruk bomullsapplikatorer og gasbind for å dempe blødninger som oppstår.
- Løft ribbeina for å eksponere intercostal blodkar på dorsalaspektet av thoracic hulrommet. Pass på at du ikke skader lungen, cauterize det mest dårligere intercostal fartøyet nær ryggsøylen, og kutt deretter ribben. Bevege seg kranialt og ventralt, gjenta til en ca. 1 cm x 1,5 cm del av ribbeina er utskilt (figur 2C).
- Fjern overflødig væskeakkumulering i thoracic hulrommet via kapillær virkning ved hjelp av små strimler av gasbind.
- Mens du går videre til mikroskopi, la ~ 5 min for intrapleural væske forsvinne for et sikrere grensesnitt mellom lungen og bildevinduet.
6. Mikroskopi
- Slå på vakuumpumpen og juster trykket til ~50–60 mmHg.
- Overfør IVM-plattformen til mikroskopstadiet. Plasser metallstolpen og mikromanipulatoren slik at bildevinduet er rett over den eksponerte lungen og vindusarmen nærmer seg lungen fra omtrent klokken 3.
- Bruk mikromanipulatoren til å senke bildevinduet forsiktig til det fester seg og stabiliserer lungeoverflaten (figur 3A).
- Ved hjelp av 20x målet og 460-490 NM bandpass eksitasjon filter, identifisere en lunge venule basert på konvergent mønster av blodstrømmen. Sentrer fartøyet i synsfeltet og ta opp 30 s video.
- Bytt til 530-550 nm bandpass eksitasjonsfilter og ta opp 30 s video i samme synsfelt.
- Gjenta det forrige trinnet til fem lunge venuler er avbildet.
- Ved hjelp av 460-490 nm bandpass eksitasjonsfilter, identifiser en lungearteriole basert på det divergerende mønsteret av blodstrøm. Sentrer fartøyet i synsfeltet og ta opp 30 s video.
- Bytt til 530-550 nm bandpass eksitasjonsfilter og ta opp 30 s video i samme synsfelt.
- Gjenta det forrige trinnet til fem lungearterioler er avbildet.
- Ved hjelp av 460-490 nm bandpass eksitasjonsfilter, finn en region av alveoli og kapillærer som ikke krysses av større fartøy og ta opp 30 s video.
- Bytt til 530-550 nm bandpass eksitasjonsfilter og ta opp 30 s video i samme synsfelt.
- Gjenta det forrige trinnet til fem kapillære områder er avbildet.
7. Eutanasi og rengjøringsprotokoll
- Fjern IVM-plattformen fra mikroskopstadiet og juster isofluranleveringen til 5% i 5 min for å avlive musen.
- Mens du venter, kast dekselglasset og koble bildevinduet fra plattformen. Rengjør bildevinduet med en liten børste og bruk en 30 G sprøyte satt inn i kanalen for å skylle den flere ganger med destillert vann. Skyll deretter med 95% etanol ved hjelp av vakuumpumpen.
- Etter 5 min har gått, stopp respiratoren, og sørg for fullstendig eutanasi via cervical dislokasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere resultatene som kan oppnås gjennom denne protokollen, ble akutt lungeskade (ALI) indusert 6 timer før avbildning ved hjelp av en modell av intranasal bakteriell lipopolysakkarid (LPS) instillasjon. Kort sagt ble mus (n = 3) bedøvet med isofluran, og små dråper LPS fra Pseudomonas aeruginosa i steril saltvann (10 mg / ml) ble pipettert inn i venstre naris i en dose på 5 mg / kg. Dette ble sammenlignet med naive mus (n = 3; ingen intranasal administrering).
Ved avbildning er et vellykket kirurgisk preparat identifiserbart av flere faktorer. Lungen skal være relativt stabil med åndedrett som forårsaker sykliske rammehifts ikke større enn 25 μm. Alveoli skal være godt synlig og kan vise tidevannsdistensjon/sammentrekning. Eksitasjon med blått lys (450-490 nm bølgelengde) vil tillate visualisering av blodstrømsretningalitet, og det kan være mulig å skille mellom individuelle røde blodlegemer (Supplemental Movie 1, Supplemental Movie 3 og Supplemental Movie 5). Leukocytter vil være tydelig identifiserbare ved eksitasjon med grønt lys (530-560 nm bølgelengde, Supplemental Movie 2, Supplemental Movie 4 og Supplemental Movie 6). Etter ferdigstillelse av avbildning og fjerning av sugevinduet kan det være små blåmerker på lungeoverflaten, men ikke innenfor det avbildede området, som vist i figur 3B.
Flere tekniske utfordringer kan forstyrre eksperimentell levedyktighet. Opphopning av blod på lungeoverflaten vil kompromittere vakuumstabilisering og kan til og med tette kanalen. For å unngå dette, bør det utvises ekstrem forsiktighet under hvert kirurgiske trinn. For høyt vakuumtrykk kan skade lungen og påvirke mikrosirkulasjonen. Dette kan identifiseres ved alveolarstasis eller overdreven blåmerker på lungeoverflaten (figur 3C) og kan løses ved å redusere trykket fra vakuumpumpen. I tillegg kan feil i intravenøs fluoroforinjeksjon føre til dårlig visualisering av leukocytthandel og blodstrøm.
Etter ferdigstillelse av protokollen ble blindet manuell analyse utført ved hjelp av Fiji21 på en måte tilpasset fra forrige litteratur28. Fem venuler, arterioler og kapillære interesseregioner (ROIer) ble analysert fra hvert dyr. Leukocyttadhesjon i venuler og arterioler ble definert som antall celler som forblir festet til det vaskulære endotelet under 30 s observasjon per område av endoteloverflate. Dette videreformidles i celler/mm2. Leukocyttadhesjon i kapillærer ble definert som antall celler i avkastning som forblir festet til det vaskulære endotelet i løpet av 30 s observasjon per totalt analysert område. Dette videreformidles også i celler/mm2. Leukocyttrulling ble definert som dobbelt så mange celler som passerte et referansepunkt i fartøyet i løpet av 30-tallets observasjonsperiode. Frittflytende leukocytter ble utelukket ved å sammenligne hastigheten på passasjen med den røde blodlegemen, og dette videresendes i celler / min. For å måle mikrosirkulasjonsperfusjon ble FCD definert som summen av lengdene på røde blodlegemer perfused kapillærer per observasjonsområde. Dette videresendes i cm/cm2. Hver parameter rapporteres som en gjennomsnittsverdi for hvert dyr.
En vanlig trend med leukocyttrekruttering ble observert i lunge venuler, med økt formaning og rulling i LPS-behandlede mus versus naive (figur 4C, D). Denne trenden ble rekapitulert av arteriolar leukocyttadhesjon, selv om begge nivåene av rullende og vedheft var svært variable i den naive gruppen (figur 5C,D). Spesielt resulterte LPS-administrasjonen i en betydelig økning i leukocyttadhesjon i lungekapillære ROIer (figur 6C). LPS-mus viste også redusert FCD versus naive mus (figur 7C). Disse effektene i lunge kapillærene er i samsvar med tidligere litteratur identifisere økning i immunceller per synsfelt og derangement av normal kapillær perfusjon etter ulike inflammatoriske stimuli 4,5,16.
Figur 1: Lungeavbildningssystem. Custom-order system inkluderer (1) en anodisert metallbase, (2) bildevindu, (3) vakuuminntak, (4) mikromanipulator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kirurgisk tilberedning. (A) Musen festes til IVM-plattformen i høyre lateral decubitus-posisjon. (B) Ribcage utsettes ved hjelp av stump disseksjon for å bevare hemodynamikk. (C) Thoracotomy utføres for å eksponere venstre lunge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vakuumstabilisering. (A) Påføring av vakuumavbildningsvindu stabiliserer lungeoverflaten. (B) Bruk av vakuumtrykk under 75 mmHg minimerer skade på lungen, spesielt innenfor det avbildet området. (C) Høyere vakuumtrykk kan forårsake betydelige blåmerker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Leukocytthandel i lunge venules. Eksitasjon av rhodamin 6G tillater visualisering av tilhenger og rullende leukocytter. Skisserte områder representerer analyserte deler av vaskulært endotel som bekreftet ved eksitasjon av FITC-albumin hos (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C,D) Intranasal LPS-administrasjon påvirker leukocyttrulling og forheft i lunge venuler. Verdier er gitt som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Leukocytthandel i lungearterioler. Eksitasjon av rhodamin 6G tillater visualisering av tilhenger og rullende leukocytter. Skisserte områder representerer analyserte deler av vaskulært endotel som bekreftet ved eksitasjon av FITC-albumin hos (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C,D) Intranasal LPS-administrasjon påvirker leukocyttrulling og vedheft i lungearterioler. Verdier er gitt som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Tilhenger leukocytter i lungekapiller. Eksitasjon av rhodamin 6G tillater visualisering av leukocytter innen ROIer i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C) Intranasal LPS-administrasjon påvirker leukocyttadhesjon hos LPS-behandlede mus. Verdier er gitt som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Lunge kapillærfunksjon. Eksitasjon av FITC-albumin tillater visualisering av kapillær blodstrøm i ROIer i (A) naive og (B) LPS-behandlede mus. (C) Intranasal LPS-administrasjon påvirker FCD i lunge kapillærer. Verdier er gitt som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil: Fil for 3D-utskrivbar IVM-plattform. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 1: Diagram over vakuumsystemet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende film 1: Prøvevideo av blodstrøm i lunge venule. Den grønne pilen angir retningen på blodstrømmen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplemental Movie 2: Eksempelvideo av leukocytthandel i lunge venule. Røde piler betegner tilhenger leukocytter i fartøyet. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplerende film 3: Prøvevideo av blodstrøm i lungearteriolen. Den grønne pilen angir retningen på blodstrømmen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplemental Movie 4: Eksempelvideo av leukocytthandel i lungearteriole. Røde piler betegner tilhenger leukocytter i et fartøy. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplerende film 5: Prøv video av blodstrømmen i lungekapillærer. Grønne piler betegner flere godt visualiserte områder med røde blodcelle-perfused kapillærer. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Supplemental Movie 6: Eksempelvideo av leukocytthandel i lungekapiller. Røde piler betegner tilhenger leukocytter innen synsfeltet. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her krever øvelse og oppmerksomhet på noen få kritiske trinn. For det første er det viktig å forberede bildevinduet før initiering av intubasjon og kirurgi. Bruk en minimal mengde vakuumfett til å belegge den ytre ringen i bildevinduet, påfør dekkglasset og testsuging med en dråpe destillert vann. Å forberede dette på forhånd vil forhindre at den eksponerte lungen tørker ut under oppsettet ellers. Selv om det er mulig å skylle med varm saltvann, kan dette risikere å skade det skjøre lungevevet.
Etter intubasjon, mens du overfører musen til IVM-plattformen, kan kanylen av og til bli forskjøvet. For å forhindre dette, bør du vurdere å knytte kanylen til musens fortenner eller suturere den til huden rundt munnen. Ved bruk av trykkstyrt ventilasjon bør tidevannsvolumet overvåkes nøye gjennom hele prosedyren. Den skal holde seg stabil på ca. 0,20 ml, da betydelig lavere verdier (f.eks. ~0,10 ml) kan indikere enkel lungeventilasjon. Hvis dette skjer, kan litt tilbaketrekking av endotrakealkanylen løse problemet. Bruken av inhalantbedøvelse (isofluran) letter kontroll av bedøvelsesdybde mens musen ventileres. Andre anestesimidler (f.eks. intravenøs ketamin/xylazin10,11) har blitt brukt av andre laboratorier, og hver har sine respektive fordeler og ulemper.
Under operasjonen brukes stump disseksjon for å minimere risikoen for å kutte blodårene. Dette er spesielt viktig når du dissekerer det tykke og tungt vaskulære fettvevet nær skulderen. Reseksjon av ribbeina krever både hastighet og nøyaktighet. Varmen fra cauterizer er intens nok til å brenne lungen hvis den brukes for mye. Når du resecting ribbeina, bør det være tom plass mellom lungen og brystveggen. Hvis lungen fester seg til brystveggen, vil lett trykk ned på utsiden av ribbeburet oppmuntre til vedheft til den underliggende parietal pleura. Alternativt kan du bruke en stump nål for å injisere en liten mengde varm saltvann mellom lungen og ribbeina for å lette frigjøringen. Plassering av vindusarmen ved 3-tiden anbefales å unngå uønsket trykk på ribbeina under avbildning (figur 3A). Det vil også etterlate mer klaring mellom mikromanipulatoren og mikroskopmålet, noe som gir enklere tilgang for manipulasjoner. Når du senker bildevinduet, er det viktig å målrette den sentrale delen av lungen, da kontakt med kanten vil resultere i en utilstrekkelig forsegling og overdreven bevegelsesartefakt under avbildning. Flere forsøk på å senke vinduet kan også skade lungen. På samme måte vil sykluser med løsrivelse og restabilisering bidra til lungeskade og kan kompromittere eksperimentell nøyaktighet. Når det utføres riktig, er imidlertid preparatet som presenteres her stabilt nok til å muliggjøre høyoppløselig intravital avbildning med et 20x mål.
En streng rengjøringsprotokoll er nødvendig for å forhindre forurensning og blokkering av vakuumkanalen i bildevinduet. Bruk av en 30 G nål umiddelbart etter eksperimenter for gjentatte ganger å skylle med destillert vann er effektivt for fjerning av de fleste forurensninger. Dette etterfølges av en flush med konsentrert etanol og en siste flush med destillert vann før du fester til vakuumlinjen for å fjerne fuktighet. Bruk av aceton eller sterke vaskemidler kan være tilstrekkelig til å løse alvorlige blokkeringer, hvis de oppstår.
Spesielt bruker denne protokollen en høyere avlesning av vakuumtrykk kontra noen andre rapporterte metoder 4,11, og dette kan øke bekymringene for skade på lungevev. Et viktig skille er imidlertid at den digitale måleren som brukes her, bare måler trykk ved vakuumpumpen. Dette trykket leveres gjennom smale rør og den ekstremt smale kanalen til selve bildevinduet før fordeling over et større overflateareal i lungen. Som sådan ble det ikke observert tegn på skade på den avbildede regionen i disse forsøkene etter intravitale økter. Videre viste avbildet alveoli tidevannsdistensjon og sammentrekning, noe som indikerer at dette fysiologiske fenomenet ikke ble betydelig forstyrret.
Til tross for den økende populariteten til lunge IVM som et verktøy for å studere sykdom in vivo, er det begrensninger i denne teknikken. For det første induserer operasjonens invasive og terminale natur en ikke-ubetydelig effekt på musens fysiologiske tilstand og begrenser prosedyren til en enkelt bildeøkt. Det skal imidlertid bemerkes at flere langsgående lunge IVM-tilnærminger er utviklet30. For det andre kan bruk av mekanisk ventilasjon indusere en grad av respirator-assosiert lungeskade (VALI)31, selv om dette er begrenset av den korte varigheten av prosedyren. For det tredje kan kontakt mellom visceral pleura og glassdeksler og påføring av vakuumtrykk føre til endret mikrovaskulær blodstrøm. Til slutt, kanskje den viktigste begrensningen av denne tilnærmingen er at avbildning er begrenset til subpleural alveol i ikke-avhengige lungeregioner, som ikke er representative for helelungen 32.
Oppsummert kan denne protokollen brukes til å studere leukocytt-endotelinteraksjoner i lungemikrovaskulaturen ved hjelp av intravital fluorescensmikroskopi. Mens disse eksperimentene bruker endotoksinindusert lungeskade, en akutt modell som ble valgt ut basert på tidligere forskning, kan denne protokollen også tilpasses for å studere andre patologiske og fysiologiske prosesser i lungen. Videre gjelder lungeavbildningssystemet som brukes her for en rekke mikroskopitilnærminger, og bildevinduet er stort nok til å imøtekomme høye numeriske blenderåpningsolje-nedsenkningsmål. De beskrevne prosedyrene bør derfor legge til rette for videre forskning på virkningen av ulike sykdomstilstander på lungemikrosirkulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Kamala D. Patel er president og medgrunnlegger av Luxidea, bedriften som bildevinduet som ble brukt i dette eksperimentet ble kjøpt fra.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. Pina Colarusso, som ga betydelig kompetanse innen redigering og revidering av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
