Summary
Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.
Abstract
Intravitale beeldvorming van leukocyten-endotheelinteracties biedt waardevolle inzichten in immuungemedieerde ziekten bij levende dieren. De studie van acute longbeschadiging (ALI) / acute respiratory distress syndrome (ARDS) en andere respiratoire pathologieën in vivo is moeilijk vanwege de beperkte toegankelijkheid en inherente bewegingsartefacten van de longen. Niettemin zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld om deze uitdagingen het hoofd te bieden. Dit protocol beschrijft een methode voor intravitale fluorescentiemicroscopie om real-time leukocyten-endotheelinteracties in de pulmonale microcirculatie te bestuderen in een experimenteel model van ALI. Een in vivo longbeeldvormingssysteem en een 3D-geprint intravitaal microscopieplatform worden gebruikt om de verdoofde muis te beveiligen en de long te stabiliseren, terwijl verstorend longletsel wordt geminimaliseerd. Na voorbereiding wordt widefield fluorescentiemicroscopie gebruikt om leukocytenadhesie, leukocytenrollen en capillaire functie te bestuderen. Hoewel het hier gepresenteerde protocol zich richt op beeldvorming in een acuut model van inflammatoire longziekte, kan het ook worden aangepast om andere pathologische en fysiologische processen in de long te bestuderen.
Introduction
Intravitale microscopie (IVM) is een nuttig beeldvormingsinstrument voor het visualiseren en bestuderen van verschillende biofysische processen in vivo. De long is zeer uitdagend om in vivo in beeld te brengen vanwege de ingesloten locatie, de fragiele aard van het weefsel en bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag 1,2. Verschillende intravitale microscopie (IVM) opstellingen zijn ontwikkeld voor real-time beeldvorming van leukocyt-endotheel interacties in pulmonale microcirculatie om deze uitdagingen te overwinnen. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op het chirurgisch blootstellen en stabiliseren van de long voor beeldvorming.
Dieren worden meestal voorbereid op long IVM door chirurgische ingrepen. Ten eerste worden dieren geïntubeerd en beademd, wat chirurgische excisie van een thoracale venster en daaropvolgende interventies mogelijk maakt om de long te stabiliseren voor beeldvorming. Eén techniek omvat het lijmen van het parenchym op een glazen afdekplaat3, een procedure die een aanzienlijk fysiek trauma aan het afgebeelde weefsel riskeert. Geavanceerder is het gebruik van een vacuümsysteem om de long te stabiliseren onder een glazen venster4. Deze opstelling vergemakkelijkt de losse hechting van het longoppervlak aan de coverslip via een omkeerbaar vacuüm verspreid over een groot lokaal gebied en breidt de long uit terwijl de beweging in x-, y- en z-dimensies4 nog steeds wordt beperkt. Het vacuüm wordt gelijkmatig aangebracht door een kanaal rond het beeldvormende gebied van de opstelling en trekt het weefsel in een ondiep conisch gebied tegenover de imaging-grade coverslip4. Via dit kijkvenster kan de longmicrocirculatie worden bestudeerd met behulp van verschillende optische beeldvormingsmodaliteiten.
Long IVM maakt kwantitatieve beeldvorming van een veelheid aan microcirculatieparameters mogelijk. Deze omvatten metingen zoals leukocytenspoorsnelheid en -lengte5, rode bloedcelstroomsnelheid6 en oxygenatie7, tumormetastasen8, het onderscheid van immuuncelsubpopulaties 9,10,11, visualisatie van microdeeltjes12, alveolaire dynamica13,14, vasculaire permeabiliteit15 en capillaire functie16 . De focus ligt hier op leukocytenrekrutering en capillaire functie. Initiatie van leukocytenrekrutering in de pulmonale microcirculatie omvat voorbijgaande rollende interacties en stevige kleefinteracties tussen leukocyten en endotheelcellen, die beide verhoogd zijn onder ontstekingsomstandigheden 16,17. Typisch wordt rollen gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat een door de operator gedefinieerde referentielijn passeert, terwijl de adhesie wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat onbeweeglijk is op het endotheel16. Capillaire functie kan ook worden beïnvloed in inflammatoire toestanden, vaak resulterend in verminderde perfusie. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder een vermindering van de vervormbaarheid van rode bloedcellen18 en bonte expressie van induceerbare NO-synthase door endotheelcellen, resulterend in pathologische rangering19. Doorgaans wordt de totale lengte van geperfuseerde haarvaten per gebied gemeten en gerapporteerd als functionele capillaire dichtheid (FCD).
Het bestuderen van leukocytenrekrutering in de longen in realtime vereist het labelen van biologische doelen met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen20. Als alternatief kunnen verschillende transgene muizenstammen zoals lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) muizen worden gebruikt om specifieke immuuncelsubsets zoals neutrofielen21,22 in beeld te brengen. De fluorescerend gelabelde leukocyten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie, confocale microscopie of multifotonenmicroscopie. Deze technieken bereiken contrast door gebruik te maken van specifieke excitatiegolflengten en uitgezonden fluorescentie te detecteren, terwijl tegelijkertijd de detectie van de excitatiegolflengte wordt geblokkeerd, waardoor het gelabelde object wordt gemarkeerd.
Bestaand onderzoek naar de kwantificering van leukocytenrollen, adhesie en functionele capillaire dichtheid in de muizenlong is voornamelijk gebaseerd op handmatige video-analyse. Dit wordt mogelijk gemaakt door open-source software zoals Fiji 6,23, propriëtaire software zoals CapImage12, of op maat gemaakte beeldverwerkingssystemen24. Omgekeerd maken verschillende eigen softwareplatforms (bijv. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) geautomatiseerde meting mogelijk van een breed scala aan andere fysiologische parameters, waaronder veel van de eerder hier genoemde 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Er zijn belangrijke observaties gedaan met betrekking tot de pathologie van acuut longletsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) met behulp van long IVM. ARDS wordt gekenmerkt door een groot aantal pathofysiologische processen in de longen, waaronder longoedeem en alveolaire schade veroorzaakt door disfunctie van het endotheel en de epitheliale barrière25. Met behulp van een muizenmodel is gebleken dat sepsis-geïnduceerde ALI geassocieerd is met significante schadelijke veranderingen in de handel in immuuncellen in de longomgeving26. Neutrofielen die werden gerekruteerd voor de haarvaten van muizen met sepsis-geïnduceerde ALI bleken de microcirculatie te belemmeren, waardoor hypoxie in ALI26 toenam. Daarnaast is IVM gebruikt om inzicht te krijgen in het onderliggende reparatiemechanisme na het begin van ARDS27. Long IVM is ook een waardevol hulpmiddel geweest bij het begrijpen van pathofysiologische veranderingen in verschillende obstructieve longziekten. Visualisatie van slijmtransport bij ziekten zoals cystic fibrosis (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD) heeft bijvoorbeeld de studie van nieuwe en bestaande behandelingen voor slijmklaringvergemakkelijkt 28. Leukocytenhandel onder deze omstandigheden is ook geanalyseerd17.
Dit protocol borduurt voort op de aanpak die oorspronkelijk werd beschreven door Lamm et al.29 om leukocyten-endotheelinteracties te bestuderen met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. De beschreven procedures maken gebruik van een in vivo longbeeldvormingssysteem, dat een metalen basis van 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulator en vacuümbeeldvormingsvenster omvat (figuur 1). Het systeem is gemonteerd in een 20 cm x 23,5 cm 3D-geprint platform (Supplemental File 1) om een veilige bevestiging voor de ventilatorbuis en het verwarmingskussen te bieden. Deze methode biedt reproduceerbare en kwantificeerbare beeldvorming van murine pulmonale microcirculatie in vivo. Belangrijke aspecten van de chirurgische voorbereiding en het juiste gebruik van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem worden in detail uitgelegd. Ten slotte wordt een experimenteel model van ALI gebruikt om representatieve beeldvorming en analyse te bieden van veranderde leukocytenrollen, leukocytenadhesie en capillaire perfusie geassocieerd met ontsteking. Het gebruik van dit protocol moet verder belangrijk onderzoek naar pathofysiologische veranderingen in de pulmonale microcirculatie tijdens acute ziektetoestanden vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van de Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).
1. Voorbereiding
- Longbeeldvormingssysteem: Om het venster voor te bereiden, dient u een dunne laag vacuümvet toe aan de bovenkant van de buitenste ring terwijl verontreiniging van het vacuümkanaal wordt vermeden. Plaats een schone glazen afdekplaat van 8 mm op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te creëren.
- Widefield Fluorescentie microscoop: Voer beelden uit met een conventionele widefield fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x/ 0,40 lange werkafstandsobjectief en een zwart-wit charge-coupled device (CCD) camera met een framesnelheid van 25 FPS. Pas een 530-550 nm bandpass excitatiefilter toe om Rhodamine-6G te exciteren en een 460-490 nm bandpass filter om fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) te exciteren.
- Vacuümsysteem: Sluit het beeldvenster aan op een vacuümpomp die is uitgerust met een digitale manometer die een constante zuigkracht van 50-60 mmHg kan bieden, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1. Kortom, sluit het beeldvenster aan op de pomp via 1,0 mm I.D. polyethyleenbuizen, 1,0 cm I.D. polyethyleenbuizen, een vacuümkolf en een inline 0,2 μm filter.
- Ventilator: Stel een kleine knaagdierventilator in om drukgestuurde ventilatie te bieden met een snelheid en volume die worden berekend op basis van het gewicht van de muis. Zorg voor een positieve eind-expiratoire druk (PEEP) bij 5 cmH2O voor de duur van het experiment en stel de doeldruk in op 20 cmH2O.
- Verdovingsmiddel: Gebruik een low-flow anesthesieafgiftesysteem en prime een spuit van 5,0 ml met 99,9% isofluraan. Gebruik een afvalgasopruimsysteem om het risico op inademing door de chirurg te minimaliseren.
2. Anesthesie
- Plaats een 20-25 g 12 weken oude mannelijke C57Bl/6 muis in de anesthesie inductiekamer. Met de kamer goed gesloten, begint inductie met isofluraangas in een concentratie van 3% en een stroomsnelheid van 500 ml / min.
- Zodra de muis is verdoofd (gevisualiseerd door vertraagde ademhalingsfrequentie), brengt u deze over naar de intubatiestandaard en bevestigt u de bovenste snijtanden aan de hangende hechting.
- Span de hechting aan om de snuit in de neuskegel vast te zetten. Begin met de gasstroom door de neuskegel in een concentratie van 2,5%.
- Bevestig voldoende diepte van de anesthesie via teenknijpen voordat u naar de volgende stap gaat.
3. Intubatie
- Draai de standaard zodanig dat de achterkant van de standaard en de dorsale kant van de muis naar de chirurg gericht zijn.
- Laat de punt van een glasvezelkabel van 20 cm lang door een endotracheale canule van 20 G lopen en dompel de punt onder in Lidocaïne HCl (1%) om de doorgang van de kabel door het strottenhoofd te vergemakkelijken.
- Gebruik een stompe tang om de onderkaak op te tillen en de tong te verplaatsen om een duidelijke doorgang naar de luchtwegen te bieden.
- Plaats een gemodificeerde otoscoop (~ 60 ° speculumomtrek verwijderd) zodat de bovenste snijtanden binnen de opening in het speculum passen. Pas de scope en tongpositie aan totdat de epiglottis en stembanden duidelijk zichtbaar zijn.
- Steek de glasvezelkabel geladen met de endotracheale canule door de opening in het speculum en in het strottenhoofd. Gebruik kleine cirkelvormige bewegingen om de kabel door de stembanden en in de luchtpijp te laten lopen.
- Duw de canule langs de glasvezelkabel en passeer tussen de stembanden en in de luchtpijp.
4. Ventilatie
- Haal de muis uit de intubatiestandaard en plaats hem op een verwarmingskussen in de juiste laterale decubituspositie.
- Sluit de canule aan op de ventilatorslang en start de ventilator. Verlaag de verdovingsconcentratie tot 1,5% en controleer de diepte door te testen op pedaalreflex. Als de reflex aanhoudt, verhoog dan de concentratie stapsgewijs tot wel 2%.
- Plaats de traangel in de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen.
- Bevestig de canule met behulp van medische tape aan de snuit. Bevestig met behulp van labeling tape de juiste voorzaag aan het verwarmingskussen op ongeveer de 9 uur positie. Strek de linker achterpoot dicht en zet vast op, ongeveer, de positie van 6 uur.
- Rek met behulp van een doektape de linker voorpoot lichtjes uit tot de positie van 12 uur en bevestig het andere uiteinde van de tape aan de bovenkant van het IVM-platform, zoals weergegeven in figuur 2A (het handhaven van een lichte spanning hier vergemakkelijkt de daaropvolgende thoracotomie).
- Plaats een rectale temperatuursonde en bevestig de sonde door deze op het verwarmingskussen te plakken. Plaats een pulsoximeter op de rechter achterpoot en bevestig aan het verwarmingskussen, zorg ervoor dat de bloedsomloop niet wordt verstoord.
- Zodra de temperatuur stabiel is op 37,0 °C ± 0,1 °C, voert u de thoracotomie uit.
5. Thoracotomie
- Steriliseer de thorax en de buik met een alcoholdoekje van 70%. Breng een lichte laag minerale olie aan om het haar aan de linkerkant van de muis te bevochtigen - van het borstbeen tot de wervelkolom en van de schouder tot de onderkant van de ribbenkast.
- Maak met een stompe tang en een rechte schaar een kleine longitudinale incisie aan de onderkant van de ribbenkast om de onderliggende spierlaag bloot te leggen.
- Beweeg ventraal, gebruik stompe dissectie om het epitheliale en vetweefsel van de spierlaag te scheiden. Cauteriseer alle blootgestelde bloedvaten. Zodra het risico op bloedverlies is beperkt, verlengt u de oorspronkelijke incisie ventraal tot het xiphoid-proces.
- Herhaal dit proces dorsaal tot ~5 mm lateraal aan de wervelkolom.
- Beweeg craniaal, gebruik stompe dissectie om de ribbenkast bloot te leggen. Cauteriseer alle blootgestelde bloedvaten om de hemodynamische stabiliteit te behouden.
- Zodra het risico op bloedverlies is beperkt, breidt u de incisie uit van het xiphoid-proces naar de oksel.
- Herhaal dit proces aan de dorsale kant van de incisie tot ~ 1 cm inferieur aan het linkeroor.
- Pak met behulp van een hemostatische tang het ontleedde epitheel- en vetweefsel vast en plaats het operatiegebied vrij (figuur 2B).
- Injecteer een oplossing van Rhodamine-6G (0,5 mg / ml; 1,5 ml / kg) voor visualisatie van leukocyten en Bovine FITC-albumine (50 mg / ml; 1 ml / kg) voor visualisatie van capillaire perfusie via de staartader.
- Gebruik een getande tang om de rib onmiddellijk inferieur aan de positie van de basis van de long te grijpen bij eindinspiratie en trek je lichtjes terug om de rib weg te trekken van de long. Snijd de rib af om een pneumothorax te induceren.
- Verleng de incisie lateraal langs de intercostale spier in beide richtingen en zorg ervoor dat u het blootgestelde longoppervlak niet aanraakt.
- Gebruik een stompe tang, pak de op een na hoogste rib vast en trek je iets terug om de long weg te laten vallen van de borstwand. Als de long niet loslaat, druk de borstwand dan lichtjes tegen de long om ervoor te zorgen dat de long zich hecht aan het onderliggende borstvlies en dus gemakkelijker wegvalt.
- Ga door met de oorspronkelijke incisie ventraal tot het borstbeen en craniaal totdat de top van de long wordt blootgesteld. Gebruik katoenen applicators en gaas om eventuele bloedingen te verzachten.
- Verhoog de ribbenkast om intercostale bloedvaten op het dorsale aspect van de thoracale holte bloot te leggen. Zorg ervoor dat u de long niet beschadigt, dichtschroei het meest inferieure intercostale vat in de buurt van de wervelkolom en snijd vervolgens de rib door. Beweeg craniaal en ventraal, herhaal dit totdat een gedeelte van ongeveer 1 cm x 1,5 cm van de ribbenkast is weggesneden (figuur 2C).
- Verwijder overtollig vochtophoping in de thoracale holte via capillaire werking met behulp van kleine reepjes gaas.
- Terwijl u overgaat tot microscopie, wacht u ~ 5 minuten voor intrapleurale vloeistof om te dissiperen voor een veiligere interface tussen de long en het beeldvormingsvenster.
6. Microscopie
- Schakel de vacuümpomp in en stel de druk in op ~50-60 mmHg.
- Breng het IVM-platform over naar de microscoopfase. Plaats de metalen paal en micromanipulator zodanig dat het beeldvenster zich direct boven de blootgestelde long bevindt en de raamarm de long nadert vanaf, ongeveer, de positie van 3 uur.
- Gebruik de micromanipulator om het beeldvormingsvenster voorzichtig te laten zakken totdat het zich hecht aan het longoppervlak en het stabiliseert (figuur 3A).
- Met behulp van het 20x-objectief en het 460-490 nm bandpass excitatiefilter, identificeer een pulmonale venule op basis van het convergente patroon van de bloedstroom. Centreer het schip in het gezichtsveld en neem 30 s video op.
- Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
- Herhaal de vorige stap totdat vijf pulmonale venules in beeld zijn gebracht.
- Met behulp van het 460-490 nm bandpass excitatiefilter, identificeer een pulmonale arteriole op basis van het divergente patroon van de bloedstroom. Centreer het schip in het gezichtsveld en neem 30 s video op.
- Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
- Herhaal de vorige stap totdat vijf pulmonale arteriolen in beeld zijn gebracht.
- Lokaliseer met behulp van het 460-490 nm bandpass excitatiefilter een gebied van longblaasjes en haarvaten dat niet wordt doorsneden door grotere vaten en neem 30 s video op.
- Schakel over naar het 530-550 nm bandpass excitatiefilter en neem 30 s video op in hetzelfde gezichtsveld.
- Herhaal de vorige stap totdat vijf capillaire gebieden zijn afgebeeld.
7. Euthanasie- en schoonmaakprotocol
- Verwijder het IVM-platform uit de microscoopfase en pas de isofluraanafgifte gedurende 5 minuten aan op 5% om de muis te euthanaseren.
- Gooi tijdens het wachten het afdekglas weg en koppel het beeldvenster los van het platform. Reinig het beeldvenster met een kleine borstel en gebruik een spuit van 30 G die in het kanaal is ingebracht om het meerdere keren met gedestilleerd water te spoelen. Spoel vervolgens met 95% ethanol met behulp van de vacuümpomp.
- Nadat 5 minuten zijn verstreken, stopt u met de beademingsmachine en zorgt u voor volledige euthanasie via cervicale dislocatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de resultaten te illustreren die via dit protocol kunnen worden bereikt, werd acuut longletsel (ALI) geïnduceerd 6 uur voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een model van intranasale bacteriële lipopolysaccharide (LPS) instillatie. In het kort werden muizen (n = 3) verdoofd met isofluraan en kleine druppeltjes LPS van Pseudomonas aeruginosa in steriele zoutoplossing (10 mg / ml) werden in de linker naris gepipetteerd in een dosering van 5 mg / kg. Dit werd vergeleken met naïeve muizen (n = 3; geen intranasale toediening).
Bij beeldvorming is een succesvol chirurgisch preparaat identificeerbaar door verschillende factoren. De long moet relatief stabiel zijn met ademhaling die cyclische frameshifts veroorzaakt die niet groter zijn dan 25 μm. Longblaasjes moeten duidelijk zichtbaar zijn en kunnen getijdenzwelling/samentrekking vertonen. Excitatie door blauw licht (450-490 nm golflengte) zal visualisatie van de directionaliteit van de bloedstroom mogelijk maken, en het kan mogelijk zijn om individuele rode bloedcellen te onderscheiden (Aanvullende film 1, Aanvullende film 3 en Aanvullende film 5). Leukocyten zullen duidelijk herkenbaar zijn bij excitatie door groen licht (530-560 nm golflengte, Aanvullende film 2, Aanvullende film 4 en Aanvullende film 6). Na voltooiing van de beeldvorming en verwijdering van het zuigvenster kan er sprake zijn van lichte kneuzingen van het longoppervlak, hoewel niet binnen het afgebeelde gebied, zoals weergegeven in figuur 3B.
Verschillende technische uitdagingen kunnen de experimentele levensvatbaarheid verstoren. Ophoping van bloed op het longoppervlak zal de vacuümstabilisatie in gevaar brengen en kan zelfs het kanaal verstoppen. Om dit te voorkomen, moet uiterste voorzichtigheid worden betracht tijdens elke chirurgische stap. Een te hoge vacuümdruk kan de longen beschadigen en de microcirculatie beïnvloeden. Dit kan worden geïdentificeerd door alveolaire stasis of overmatige blauwe plekken op het longoppervlak (figuur 3C) en kan worden verholpen door de druk van de vacuümpomp te verlagen. Ook kunnen fouten in intraveneuze fluorofoorinjectie leiden tot een slechte visualisatie van leukocytenhandel en bloedstroom.
Na voltooiing van het protocol werd geblindeerde handmatige analyse uitgevoerd met Fiji21 op een manier die is aangepast aan de eerdere literatuur28. Vijf venules, arteriolen en capillaire regio's-van-belang (ROIs) werden geanalyseerd van elk dier. Leukocytenadhesie in venules en arteriolen werd gedefinieerd als het aantal cellen dat aan het vasculaire endotheel blijft kleven gedurende 30 s observatie per gebied van endotheeloppervlak. Dit wordt doorgegeven in cellen/mm2. Leukocytenadhesie in haarvaten werd gedefinieerd als het aantal cellen binnen ROI dat gedurende 30 s observatie per totaal geanalyseerd gebied aan het vasculaire endotheel blijft kleven. Dit wordt ook doorgegeven in cellen/mm2. Leukocytenwalsen werd gedefinieerd als tweemaal het aantal cellen dat een referentiepunt in het vat passeerde tijdens de observatieperiode van 30 s. Vrij stromende leukocyten werden uitgesloten door de snelheid van passage te vergelijken met die van de rode bloedcelstroom, en dit wordt doorgegeven in cellen / min. Om microcirculatoire perfusie te meten, werd FCD gedefinieerd als de som van de lengtes van door rode bloedcellen doordrenkte haarvaten perobservatiegebied. Dit wordt doorgegeven in cm/cm2. Elke parameter wordt gerapporteerd als een gemiddelde waarde voor elk dier.
Een veel voorkomende trend van leukocytenrekrutering werd waargenomen in pulmonale venules, met verhoogde adhesie en rollen bij met LPS behandelde muizen versus naïeve muizen (figuren 4C, D). Deze trend werd samengevat door de adhesie van arteriolar leukocyten, hoewel zowel de niveaus van rollen als de adhesie zeer variabel waren in de naïeve groep (figuren 5C, D). Met name lps-toediening resulteerde in een aanzienlijke toename van leukocytenadhesie in pulmonale capillaire ROIs (figuur 6C). LPS-muizen vertoonden ook een verminderde FCD versus naïeve muizen (figuur 7C). Deze effecten in de pulmonale haarvaten komen overeen met eerdere literatuur die toenames van immuuncellen per gezichtsveld en verstoring van normale capillaire perfusie na verschillende ontstekingsprikkels identificeert 4,5,16.
Figuur 1: Longbeeldvormingssysteem. Aangepast bestelsysteem omvat (1) een geanodiseerde metalen basis, (2) beeldvenster, (3) vacuüminlaat, (4) micromanipulator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische voorbereiding. (A) Muis wordt bevestigd aan het IVM-platform in de rechter laterale decubituspositie. (B) Ribbenkast wordt blootgesteld met behulp van stompe dissectie om de hemodynamiek te behouden. (C) Thoracotomie wordt uitgevoerd om de linkerlong bloot te leggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vacuümstabilisatie. (A) Toepassing van vacuümbeeldvormingsvenster stabiliseert het longoppervlak. (B) Het gebruik van vacuümdrukken onder 75 mmHg minimaliseert schade aan de longen, met name binnen het afgebeelde gebied. (C) Hogere vacuümdrukken kunnen aanzienlijke blauwe plekken veroorzaken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Leukocytenhandel in pulmonale venules. Excitatie van rhodamine 6G maakt visualisatie van adherente en rollende leukocyten mogelijk. Geschetste gebieden vertegenwoordigen geanalyseerde delen van vasculair endotheel zoals bevestigd door excitatie van FITC-albumine bij (A) naïeve en (B) lps-behandelde muizen. (C,D) Intranasale LPS-toediening beïnvloedt het rollen van leukocyten en de adhesie in pulmonale venules. Waarden worden gegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Leukocytenhandel in pulmonale arteriolen. Excitatie van rhodamine 6G maakt visualisatie van adherente en rollende leukocyten mogelijk. Geschetste gebieden vertegenwoordigen geanalyseerde delen van vasculair endotheel zoals bevestigd door excitatie van FITC-albumine bij (A) naïeve en (B) lps-behandelde muizen. (C,D) Intranasale LPS-toediening beïnvloedt het rollen van leukocyten en de adhesie in pulmonale arteriolen. Waarden worden gegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Adherente leukocyten in pulmonale haarvaten. Excitatie van rhodamine 6G maakt visualisatie van leukocyten binnen ROIs mogelijk bij (A) naïeve en (B) LPS-behandelde muizen. (C) Intranasale LPS-toediening heeft invloed op de hechting van leukocyten bij met LPS behandelde muizen. Waarden worden gegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Pulmonale capillaire functie. Excitatie van FITC-albumine maakt visualisatie van capillaire bloedstroom binnen ROIs mogelijk bij (A) naïeve en (B) LPS-behandelde muizen. (C) Intranasale LPS-toediening heeft invloed op FCD in pulmonale haarvaten. Waarden worden gegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand: bestand voor 3D-printbaar IVM-platform. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Diagram van het vacuümsysteem. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 1: Voorbeeldvideo van de bloedstroom in de longvenule. De groene pijl geeft de richting van de bloedstroom aan. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende film 2: Voorbeeldvideo van leukocytenhandel in de pulmonale venule. Rode pijlen duiden op aanhangende leukocyten in het vat. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende film 3: Voorbeeldvideo van de bloedstroom in de pulmonale arteriole. De groene pijl geeft de richting van de bloedstroom aan. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende film 4: Voorbeeldvideo van leukocytenhandel in pulmonale arteriole. Rode pijlen duiden op aanhangende leukocyten in een vat. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende film 5: Voorbeeldvideo van de bloedstroom in pulmonale haarvaten. Groene pijlen geven verschillende goed gevisualiseerde gebieden van met rode bloedcellen doordrenkte haarvaten aan. Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullende film 6: Voorbeeldvideo van leukocytenhandel in pulmonale haarvaten. Rode pijlen duiden op adherente leukocyten binnen het gezichtsveld. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol vereist oefening en aandacht voor een paar kritieke stappen. Ten eerste is het belangrijk om het beeldvormingsvenster voor te bereiden voordat de intubatie en operatie worden gestart. Gebruik een minimale hoeveelheid vacuümvet om de buitenste ring van het beeldvenster te coaten, breng het afdekglas aan en test de zuigkracht met een druppel gedestilleerd water. Door dit van tevoren voor te bereiden, voorkomt u dat de blootgestelde long tijdens de installatie uitdroogt. Hoewel het mogelijk is om te spoelen met een warme zoutoplossing, kan dit het risico lopen het fragiele longweefsel te beschadigen.
Na intubatie, tijdens het overbrengen van de muis naar het IVM-platform, kan de canule af en toe worden verplaatst. Om dit te voorkomen, kunt u overwegen de canule aan de voortanden van de muis te binden of aan de huid rond zijn mond te hechten. Bij gebruik van drukgestuurde ventilatie moet het getijdenvolume gedurende de hele procedure zorgvuldig worden gecontroleerd. Het moet stabiel blijven op ongeveer 0,20 ml, omdat aanzienlijk lagere waarden (bijv. ~ 0,10 ml) kunnen wijzen op enkele longventilatie. Als dit gebeurt, kan het enigszins intrekken van de endotracheale canule het probleem oplossen. Het gebruik van inhalatie-anesthesie (isofluraan) vergemakkelijkt de controle van de anesthetische diepte terwijl de muis wordt geventileerd. Andere middelen voor anesthesie (bijv. intraveneuze ketamine/xylazine 10,11) zijn gebruikt door andere laboratoria en hebben elk hun respectieve voor- en nadelen.
Tijdens de operatie wordt stompe dissectie gebruikt om het risico op het afsnijden van bloedvaten te minimaliseren. Dit is met name van belang bij het ontleden van het dikke en zwaar gevasculariseerde vetweefsel in de buurt van de schouder. Resectie van de ribbenkast vereist zowel snelheid als nauwkeurigheid. De warmte van de cauterizer is intens genoeg om de long te verbranden bij overmatig gebruik. Bij het reseceren van de ribbenkast moet er lege ruimte zijn tussen de long en de borstwand. Als de long zich aan de borstwand hecht, zal licht drukken op de buitenkant van de ribbenkast de hechting aan het onderliggende pariëtale borstvlies bevorderen. U kunt ook een stompe naald gebruiken om een kleine hoeveelheid warme zoutoplossing tussen de long en de ribbenkast te injecteren om de afgifte te vergemakkelijken. Het plaatsen van de raamarm op de positie van 3 uur wordt geadviseerd om ongewenste druk op de ribben tijdens de beeldvorming te voorkomen (figuur 3A). Het laat ook meer ruimte tussen de micromanipulator en het microscoopdoel, waardoor manipulaties gemakkelijker toegankelijk zijn. Bij het verlagen van het beeldvormingsvenster is het van cruciaal belang om het centrale deel van de long te richten, omdat contact met de rand zal resulteren in een ontoereikende afdichting en overmatige bewegingsartefacten tijdens de beeldvorming. Ook kunnen meerdere pogingen om het raam te laten zakken de long beschadigen. Evenzo zullen cycli van onthechting en herstabilisatie bijdragen aan longletsel en de experimentele nauwkeurigheid in gevaar brengen. Wanneer het echter correct wordt uitgevoerd, is het hier gepresenteerde preparaat stabiel genoeg om intravitale beeldvorming met hoge resolutie met een 20x-objectief mogelijk te maken.
Een rigoureus reinigingsprotocol is noodzakelijk om vervuiling en verstopping van het vacuümkanaal in het beeldvenster te voorkomen. Het gebruik van een naald van 30 G onmiddellijk na experimenten om herhaaldelijk te spoelen met gedestilleerd water is effectief voor het verwijderen van de meeste verontreinigingen. Dit wordt gevolgd door een spoeling met geconcentreerde ethanol en een laatste spoeling met gedestilleerd water voordat het opnieuw aan de vacuümleiding wordt bevestigd om vocht te verwijderen. Het gebruik van aceton of sterke detergentia kan voldoende zijn om ernstige verstoppingen op te lossen, mochten deze zich voordoen.
Met name dit protocol maakt gebruik van een hogere uitlezing van vacuümdruk in vergelijking met sommige andere gerapporteerde methoden 4,11, en dit kan bezorgdheid oproepen over schade aan longweefsel. Een belangrijk onderscheid is echter dat de hier gebruikte digitale meter alleen de druk meet bij de vacuümpomp. Deze druk wordt geleverd door smalle buizen en het extreem smalle kanaal van het beeldvormingsvenster zelf voorafgaand aan distributie over een groter oppervlak van de long. Als zodanig werd er geen bewijs van schade aan het afgebeelde gebied waargenomen in deze experimenten na intravitale sessies. Bovendien vertoonden afgebeelde longblaasjes getijdenuitzetting en contractie, wat aangeeft dat dit fysiologische fenomeen niet significant verstoord was.
Ondanks de toenemende populariteit van long IVM als hulpmiddel voor het bestuderen van ziekten in vivo, zijn er beperkingen aan deze techniek. Ten eerste induceert de invasieve en terminale aard van de operatie een niet-verwaarloosbaar effect op de fysiologische toestand van de muis en beperkt de procedure tot een enkele beeldvormingssessie. Er moet echter worden opgemerkt dat er verschillende longitudinale long IVM-benaderingen zijn ontwikkeld30. Ten tweede kan het gebruik van mechanische ventilatie een mate van beademingsgerelateerd longletsel (VALI)31 veroorzaken, hoewel dit wordt beperkt door de korte duur van de procedure. Ten derde kan contact tussen het viscerale borstvlies en de glazen afdekkingslip en de toepassing van vacuümdruk resulteren in een veranderde microvasculaire bloedstroom. Ten slotte is misschien wel de belangrijkste beperking van deze benadering dat beeldvorming beperkt is tot subpleurale longblaasjes in niet-afhankelijke pulmonale regio's, die niet representatief zijn voor de gehele long32.
Samenvattend kan dit protocol worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties in de pulmonale microvasculatuur te bestuderen met behulp van intravitale fluorescentiemicroscopie. Hoewel deze experimenten gebruik maken van endotoxine-geïnduceerd longletsel, een acuut model dat werd geselecteerd op basis van eerder onderzoek, kan dit protocol ook worden aangepast om andere pathologische en fysiologische processen in de long te bestuderen. Bovendien is het longbeeldvormingssysteem dat hier wordt gebruikt van toepassing op een reeks microscopiebenaderingen en is het beeldvormingsvenster groot genoeg om olie-onderdompelingsdoelstellingen met een hoog numeriek diafragma te accommoderen. De beschreven procedures moeten dus verder onderzoek naar de impact van verschillende ziektetoestanden op de pulmonale microcirculatie vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Kamala D. Patel is de president en mede-oprichter van Luxidea, de onderneming waarvan het beeldvenster dat in dit experiment werd gebruikt, werd gekocht.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Pina Colarusso bedanken, die aanzienlijke expertise heeft geleverd bij het redigeren en herzien van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
