Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan användas för att studera leukocyt-endotelinteraktioner och kapillärperfusion i realtid. Detta protokoll beskriver metoder för att avbilda och kvantifiera dessa parametrar i lungmikrocirkulationen med hjälp av ett vakuumstabiliserat lungavbildningssystem.
Abstract
Intravital avbildning av leukocyt-endotelinteraktioner ger värdefulla insikter om immunmedierad sjukdom hos levande djur. Studien av akut lungskada (ALI)/akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS) och andra andningspatologier in vivo är svår på grund av den begränsade tillgängligheten och inneboende rörelseartefakterna i lungorna. Icke desto mindre har olika tillvägagångssätt utvecklats för att övervinna dessa utmaningar. Detta protokoll beskriver en metod för intravital fluorescensmikroskopi för att studera realtid leukocyt-endotelinteraktioner i lungmikrocirkulationen i en experimentell modell av ALI. Ett in vivo lungavbildningssystem och 3D-tryckt intravital mikroskopiplattform används för att säkra den sövda musen och stabilisera lungan samtidigt som den minimerar förvirrande lungskador. Efter beredning används widefield fluorescensmikroskopi för att studera leukocytadhesion, leukocytvalsning och kapillärfunktion. Medan protokollet som presenteras här fokuserar på avbildning i en akut modell av inflammatorisk lungsjukdom, kan det också anpassas för att studera andra patologiska och fysiologiska processer i lungan.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) är ett användbart bildverktyg för att visualisera och studera olika biofysiska processer in vivo. Lungan är mycket utmanande att avbilda in vivo på grund av dess slutna plats, vävnadens ömtåliga natur och rörelseartefakter inducerade av andning och hjärtslag 1,2. Olika intravitala mikroskopi (IVM) -inställningar har utvecklats för realtidsavbildning av leukocyt-endotelinteraktioner i lungmikrocirkulation för att övervinna dessa utmaningar. Sådana tillvägagångssätt är baserade på kirurgisk exponering och stabilisering av lungan för avbildning.
Djur förbereds vanligtvis för lung-IVM genom kirurgiska ingrepp. Först intuberas och ventileras djur, vilket möjliggör kirurgisk excision av ett bröstfönster och efterföljande ingrepp för att stabilisera lungan för avbildning. En teknik innebär att parenkymen limmas på ett glasöverdrag3, ett förfarande som riskerar betydande fysiskt trauma på den avbildade vävnaden. Mer avancerat är användningen av ett vakuumsystem för att stabilisera lungan under ett glasfönster4. Denna inställning underlättar lös vidhäftning av lungytan till täckglaset via ett reversibelt vakuum som sprids över ett stort lokalt område och expanderar lungan samtidigt som rörelsen i x-, y- och z-dimensionerna4 begränsas. Vakuumet appliceras jämnt genom en kanal som omger avbildningsområdet för installationen och drar vävnaden in i ett grunt koniskt område som vetter mot bildkvalitetsöverdrag4. Genom detta visningsfönster kan lungmikrocirkulationen studeras med hjälp av olika optiska avbildningsmetoder.
Lung IVM möjliggör kvantitativ avbildning av en mängd mikrocirkulationsparametrar. Dessa inkluderar mätningar såsom leukocytspårhastighet och längd5, flödeshastighetför röda blodkroppar 6 och syresättning7, tumörmetastaser8, skillnaden mellan immuncellsunderpopulationer 9,10,11, visualisering av mikropartiklar12, alveolär dynamik13,14, vaskulär permeabilitet15 och kapillärfunktion16 . Fokus här ligger på leukocytrekrytering och kapillärfunktion. Initiering av leukocytrekrytering i lungmikrocirkulationen involverar övergående rullande interaktioner och fasta liminteraktioner mellan leukocyter och endotelceller, som båda ökar under inflammatoriska tillstånd16,17. Typiskt kvantifieras rullning med antalet leukocyter som passerar en operatörsdefinierad referenslinje, medan vidhäftning kvantifieras av antalet leukocyter som är immobila på endotelet16. Kapillärfunktionen kan också påverkas i inflammatoriska tillstånd, vilket ofta resulterar i minskad perfusion. Detta kan hänföras till flera faktorer, inklusive en minskning av deformerbarheten av röda blodkroppar18 och varierat uttryck av inducerbart NO-syntas av endotelceller vilket resulterar i patologisk shunting19. Vanligtvis mäts och rapporteras den sammanlagda längden av perfuserade kapillärer per område som funktionell kapillärdensitet (FCD).
Att studera leukocytrekrytering i lungorna i realtid kräver märkning av biologiska mål med fluorescerande färgämnen eller fluorescerande märkta antikroppar20. Alternativt kan olika transgena musstammar såsom lysozym M-gröna fluorescerande protein (LysM-GFP) möss användas för att avbilda specifika immuncellsundergrupper såsom neutrofiler21,22. De fluorescerande märkta leukocyterna kan sedan visualiseras med hjälp av widefield fluorescensmikroskopi, konfokalmikroskopi eller multifotonmikroskopi. Dessa tekniker uppnår kontrast genom att använda specifika excitationsvåglängder och detektera utsänd fluorescens samtidigt som de blockerar detekteringen av excitationsvåglängden och därmed markerar det märkta objektet.
Befintlig forskning om kvantifiering av leukocytvalsning, vidhäftning och funktionell kapillärdensitet i den murina lungan har främst förlitat sig på manuell videoanalys. Detta möjliggörs genom programvara med öppen källkod som Fiji 6,23, proprietär programvara som CapImage12 eller skräddarsydda bildbehandlingssystem24. Omvänt möjliggör olika proprietära mjukvaruplattformar (t.ex. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatiserad mätning av ett brett spektrum av andra fysiologiska parametrar, inklusive många av de som tidigare nämnts här 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Viktiga observationer har gjorts avseende patologin för akut lungskada (ALI) och akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS) med hjälp av lung-IVM. ARDS kännetecknas av en mängd patofysiologiska processer i lungan, inklusive lungödem och alveolära skador orsakade av dysfunktion i endotelet och epitelbarriären25. Med hjälp av en murinmodell har det visat sig att sepsisinducerad ALI är associerad med signifikanta skadliga förändringar i immuncellshandel i lungmiljön26. Neutrofiler som rekryterades till kapillärerna hos möss med sepsisinducerad ALI visade sig hindra mikrocirkulationen och därmed öka hypoxi i ALI26. Dessutom har IVM använts för att få insikter i den underliggande reparationsmekanismen efter starten av ARDS27. Lung-IVM har också varit ett värdefullt verktyg för att förstå patofysiologiska förändringar vid olika obstruktiva lungsjukdomar. Till exempel har visualisering av slemtransport vid sjukdomar som cystisk fibros (CF) och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) underlättat studien av nya och befintliga behandlingar för slemhinnor28. Leukocythandel under dessa förhållanden har också analyserats17.
Detta protokoll utökar det tillvägagångssätt som ursprungligen beskrevs av Lamm et al.29 för att studera leukocyt-endotelinteraktioner med användning av konventionell fluorescensmikroskopi. De beskrivna procedurerna använder ett in vivo lungavbildningssystem, som inkluderar ett 16,5 cm x 12,7 cm metallbas-, mikromanipulator- och vakuumavbildningsfönster (figur 1). Systemet är monterat i en 20 cm x 23,5 cm 3D-tryckt plattform (tilläggsfil 1) för att ge säker fastsättning för ventilatorslangen och värmedynan. Denna metod erbjuder reproducerbar och kvantifierbar avbildning av murin lungmikrocirkulation in vivo. Viktiga aspekter av den kirurgiska beredningen samt korrekt användning av ett vakuumstabiliserat lungavbildningssystem förklaras i detalj. Slutligen används en experimentell modell av ALI för att tillhandahålla representativ avbildning och analys av förändrad leukocytrullning, leukocytadhesion och kapillärperfusion associerad med inflammation. Användningen av detta protokoll bör underlätta ytterligare viktiga undersökningar av patofysiologiska förändringar i lungmikrocirkulationen under akuta sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs här utfördes med förhandsgodkännande av Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).
1. Förberedelse
- Lungavbildningssystem: För att förbereda fönstret, administrera ett tunt lager vakuumfett till toppen av den yttre ringen samtidigt som du undviker kontaminering av vakuumkanalen. Placera ett rent 8 mm glasskydd på fönstret och tryck försiktigt ner för att skapa en tätning.
- Widefield Fluorescensmikroskop: Utför avbildning med ett konventionellt widefield fluorescensmikroskop utrustat med ett 20x / 0,40 långt arbetsavståndsmål och en svartvit laddningskopplad enhet (CCD) kamera med en bildhastighet på 25 FPS. Applicera ett 530-550 nm bandpass excitationsfilter för att excitera Rhodamine-6G och ett 460-490 nm bandpassfilter för att excitera Fluorescein Isothiocyanate (FITC).
- Vakuumsystem: Anslut bildfönstret till en vakuumpump utrustad med en digital tryckmätare som kan ge 50-60 mmHg konstant sug, som visas i kompletterande figur 1. Kort sagt, anslut bildfönstret till pumpen genom 1,0 mm I.D. polyetenrör, 1,0 cm ID polyetenslang, en vakuumkolv och ett inline 0,2 μm filter.
- Ventilator: Ställ in en liten gnagarventilator för att ge tryckstyrd ventilation med en hastighet och volym beräknad baserat på musens vikt. Ge ett positivt end-expiratoriskt tryck (PEEP) vid 5 cmH2Ounder hela experimentet och ställ in måltrycket till 20 cmH2O.
- Bedövningsmedel: Använd ett lågflödesanestesileveranssystem, primera en 5,0 ml spruta med 99,9% isofluran. Använd ett system för rensning av avgaser för att minimera risken för inandning av kirurgen.
2. Anestesi
- Placera en 20-25 g 12 veckor gammal manlig C57Bl/6 mus i anestesiinduktionskammaren. Med kammaren ordentligt stängd, börja induktionen med isoflurangas i en koncentration av 3% och en flödeshastighet på 500 ml / min.
- När musen har sövts (visualiseras av långsammare andningshastighet), överför den till intubationsstället och säkra de övre snittarna till den hängande suturen.
- Dra åt suturen för att säkra nosen inuti noskonen. Börja gasflödet genom näskonen i en koncentration av 2,5%.
- Bekräfta tillräckligt anestesidjup via tånyp innan du går vidare till nästa steg.
3. Intubation
- Vrid stativet så att baksidan av stativet och ryggsidan av musen vetter mot kirurgen.
- För spetsen på en 20 cm lång fiberoptisk kabel genom en 20 G endotrakeal kanyl och sänk ner spetsen i Lidocaine HCl (1%) för att underlätta kabelns passage genom struphuvudet.
- Använd trubbiga pincett, lyft underkäken och förskjut tungan för att ge tydlig passage in i luftvägarna.
- Sätt i ett modifierat otoskop (~ 60 ° spekulumomkrets borttagen) så att de övre framtänderna passar in i gapet i spekulumet. Justera omfattningen och tungpositionen tills epiglottis och stämband är tydligt synliga.
- Sätt i den fiberoptiska kabeln laddad med endotrakeal kanyl genom gapet i spekulumet och in i struphuvudet. Använd små cirkulära rörelser och för kabeln genom stämbanden och in i luftstrupen.
- Tryck kanylen längs den fiberoptiska kabeln, passera mellan stämbanden och in i luftstrupen.
4. Ventilation
- Hämta musen från intubationsstället och placera den på en värmedyna i rätt lateral decubitusposition.
- Anslut kanylen till ventilatorslangen och starta ventilatorn. Minska bedövningskoncentrationen till 1,5% och övervaka djupet genom att testa för pedalreflex. Om reflexen kvarstår, öka koncentrationen stegvis till så hög som 2%.
- Placera tårgel i musens ögon för att förhindra torkning.
- Använd medicinsk tejp och säkra kanylen till nosen. Använd märkningstejp och fäst rätt framgavel till värmedynan vid ungefär klockan 9. Förläng den vänstra baktassen kaudalt och säkra vid ungefär klockan 6.
- Använd en tygtejp och sträck lätt den vänstra framkroppen till klockan 12 och fäst den andra änden av tejpen till toppen av IVM-plattformen som visas i figur 2A (att bibehålla en liten spänning här underlättar efterföljande torakotomi).
- Sätt i en rektal temperatursond och säkra sonden genom att tejpa fast den på värmedynan. Placera en pulsoximeter på höger baktass och säkra till värmedynan, var noga med att inte störa cirkulationen.
- När temperaturen är stabil vid 37,0 °C ± 0,1 °C, fortsätt att utföra torakotomi.
5. Torakotomi
- Sterilisera bröstkorgen och buken med en 70% alkoholtork. Applicera ett lätt lager mineralolja för att dämpa håret på vänster sida av musen - från bröstbenet till ryggraden och från axeln till botten av bröstkorgen.
- Med trubbiga pincett och rak sax, gör ett litet längsgående snitt nära botten av bröstkorgen för att exponera det underliggande muskelskiktet.
- Flytta ventralt, använd trubbig dissektion för att separera epitel- och fettvävnaden från muskelskiktet. Cauterize alla exponerade blodkärl. När risken för blodförlust har mildrats, förläng det ursprungliga snittet ventralt tills xiphoidprocessen.
- Upprepa denna process dorsalt tills ~ 5 mm i sidled till ryggraden.
- Rör dig kranialt, använd trubbig dissektion för att exponera ribbburet. Cauterize alla exponerade blodkärl för att bevara hemodynamisk stabilitet.
- När risken för blodförlust har mildrats, förläng snittet från xiphoid-processen till axillan.
- Upprepa denna process på snittets ryggsida tills ~ 1 cm är sämre än vänster öra.
- Använd hemostatiska pincett, ta tag i den dissekerade epitel- och fettvävnaden och placera den fria från det kirurgiska området (figur 2B).
- Injicera en lösning av Rhodamine-6G (0,5 mg/ml; 1,5 ml/kg) för visualisering av leukocyter och bovint FITC-albumin (50 mg/ml; 1 ml/kg) för visualisering av kapillärperfusion via svansvenen.
- Använd tandade pincett, ta tag i revbenet omedelbart sämre än lungans bas vid ändinspiration och dra tillbaka något för att dra revbenet bort från lungan. Skär revbenet för att inducera en pneumotorax.
- Förläng snittet i sidled längs den interkostala muskeln i båda riktningarna, var noga med att inte röra vid den exponerade lungytan.
- Använd trubbiga pincett, ta tag i nästa högsta revben och dra tillbaka något så att lungan kan falla bort från bröstväggen. Om lungan inte lossnar, tryck bröstväggen lätt mot lungan för att få lungan att fästa vid den underliggande lungsäcken och därmed lättare falla bort.
- Fortsätt det ursprungliga snittet ventralt tills bröstbenet och kranialt tills lungans topp är exponerad. Använd bomullsapplikatorer och gasväv för att dämpa eventuella blödningar som uppstår.
- Höj bröstkorgen för att exponera interkostala blodkärl på dorsala aspekten av brösthålan. Var försiktig så att du inte skadar lungan, cauterize det mest underlägsna interkostala kärlet nära ryggraden och skär sedan revbenet. Rör dig kranialt och ventralt, upprepa tills en cirka 1 cm x 1,5 cm del av bröstkorgen skärs ut (figur 2C).
- Ta bort överflödig vätskeansamling i brösthålan via kapillärverkan med små remsor av gasväv.
- Medan du fortsätter till mikroskopi, låt ~ 5 min för intrapleural vätska att försvinna för ett säkrare gränssnitt mellan lungan och bildfönstret.
6. Mikroskopi
- Slå på vakuumpumpen och justera trycket till ~50–60 mmHg.
- Överför IVM-plattformen till mikroskopsteget. Placera metallstolpen och mikromanipulatorn så att bildfönstret är direkt ovanför den exponerade lungan och fönsterarmen närmar sig lungan från ungefär klockan 3.
- Använd mikromanipulatorn och sänk försiktigt bildfönstret tills det fäster vid och stabiliserar lungytan (figur 3A).
- Med hjälp av 20x-målet och 460-490 nm bandpass excitationsfiltret, identifiera en lungvenule baserat på det konvergenta mönstret för blodflödet. Centrera fartyget i synfältet och spela in 30 s video.
- Byt till 530-550 nm bandpass excitationsfilter och spela in 30 s video i samma synfält.
- Upprepa föregående steg tills fem lungvenuler har avbildats.
- Använd 460-490 nm bandpass excitationsfiltret, identifiera en lungarteriole baserat på det divergerande mönstret av blodflödet. Centrera fartyget i synfältet och spela in 30 s video.
- Byt till 530-550 nm bandpass excitationsfilter och spela in 30 s video i samma synfält.
- Upprepa föregående steg tills fem lungartärer har avbildats.
- Använd 460-490 nm bandpass excitationsfilter, lokalisera ett område av alveoler och kapillärer som inte skärs av större kärl och spela in 30 s video.
- Byt till 530-550 nm bandpass excitationsfilter och spela in 30 s video i samma synfält.
- Upprepa föregående steg tills fem kapillärregioner har avbildats.
7. Dödshjälp och rengöringsprotokoll
- Ta bort IVM-plattformen från mikroskopsteget och justera isoflurantillförseln till 5% i 5 minuter för att avliva musen.
- Medan du väntar, kassera täckglaset och koppla bort bildfönstret från plattformen. Rengör bildfönstret med en liten borste och använd en 30 G spruta som sätts in i kanalen för att spola den flera gånger med destillerat vatten. Spola sedan med 95% etanol med vakuumpumpen.
- Efter 5 min har gått, stoppa ventilatorn och säkerställ fullständig eutanasi via cervikal dislokation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera resultat som kan uppnås genom detta protokoll inducerades akut lungskada (ALI) 6 timmar före avbildning med hjälp av en modell av intranasal bakteriell lipopolysackarid (LPS) instillation. I korthet bedövades möss (n = 3) med isofluran och små droppar LPS från Pseudomonas aeruginosa i steril saltlösning (10 mg/ml) pipetterades in i vänster naris i en dos av 5 mg/kg. Detta jämfördes med naiva möss (n = 3; ingen intranasal administrering).
Vid avbildning kan ett framgångsrikt kirurgiskt preparat identifieras av flera faktorer. Lungan bör vara relativt stabil med andning som orsakar cykliska ramförskjutningar som inte är större än 25 μm. Alveoler ska vara tydligt synliga och kan uppvisa tidvattendistension/sammandragning. Excitation med blått ljus (450-490 nm våglängd) möjliggör visualisering av blodflödets riktning, och det kan vara möjligt att skilja enskilda röda blodkroppar (Kompletterande film 1, Kompletterande film 3 och Kompletterande film 5). Leukocyter kommer att vara tydligt identifierbara vid excitation med grönt ljus (530-560 nm våglängd, Kompletterande film 2, Kompletterande film 4 och Kompletterande film 6). Efter avslutad avbildning och avlägsnande av sugfönstret kan det finnas små blåmärken på lungytan, men inte inom det avbildade området, som visas i figur 3B.
Flera tekniska utmaningar kan störa experimentell livskraft. Ackumulering av blod på lungytan kommer att äventyra vakuumstabilisering och kan till och med täppa till kanalen. För att undvika detta bör extrem försiktighet iakttas under varje kirurgiskt steg. Alltför högt vakuumtryck kan skada lungan och påverka mikrocirkulationen. Detta kan identifieras genom alveolär stasis eller kraftiga blåmärken på lungytan (figur 3C) och kan åtgärdas genom att minska trycket från vakuumpumpen. Dessutom kan fel i intravenös fluoroforinjektion leda till dålig visualisering av leukocythandel och blodflöde.
Efter slutförandet av protokollet utfördes blindad manuell analys med hjälp av Fiji21 på ett sätt som anpassats från den tidigare litteraturen28. Fem venules, arterioler och kapillärregioner av intresse (ROI) analyserades från varje djur. Leukocytadhesion i venuler och arterioler definierades som antalet celler som förblir vidhäftade till det vaskulära endotelet under 30 s observation per område av endotelytan. Detta vidarebefordras i celler/mm2. Leukocytadhesion i kapillärer definierades som antalet celler inom ROI som förblir vidhäftade till det vaskulära endotelet under 30 s observation per totalt analyserat område. Detta vidarebefordras också i celler/mm2. Leukocytrullning definierades som dubbelt så många celler som passerar en referenspunkt i kärlet under observationsperioden på 30 s. Fritt flytande leukocyter uteslöts genom att jämföra passagehastigheten med flödet av röda blodkroppar, och detta vidarebefordras i celler/min. För att mäta mikrocirkulationsperfusion definierades FCD som summan av längderna av röda blodkroppar per infunderade kapillärer per observationsområde. Detta vidarebefordras i cm/cm2. Varje parameter rapporteras som ett medelvärde för varje djur.
En vanlig trend för leukocytrekrytering observerades hos lungvenuler, med ökad vidhäftning och rullning hos LPS-behandlade möss jämfört med naiva (figur 4C, D). Denna trend rekapitulerades av arteriolära leukocytadhesion, även om både nivåer av rullning och vidhäftning var mycket varierande i den naiva gruppen (figur 5C,D). I synnerhet resulterade LPS-administrering i en betydande ökning av leukocytadhesionen i lungkapillär-ROI (figur 6C). LPS-möss visade också en minskad FCD jämfört med naiva möss (figur 7C). Dessa effekter inom lungkapillärerna överensstämmer med tidigare litteratur som identifierar ökningar av immunceller per synfält och störning av normal kapillärperfusion efter olika inflammatoriska stimuli 4,5,16.
Figur 1: Lungavbildningssystem. Anpassat ordersystem inkluderar (1) en anodiserad metallbas, (2) bildfönster, (3) vakuuminlopp, (4) mikromanipulator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Musen är fäst vid IVM-plattformen i rätt lateral decubitusposition. (B) Bröstkorgen exponeras med trubbig dissektion för att bevara hemodynamiken. (C) Torakotomi utförs för att exponera vänster lunga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Vakuumstabilisering( A) Applicering av vakuumavbildningsfönster stabiliserar lungytan. (B) Användning av vakuumtryck under 75 mmHg minimerar skador på lungan, särskilt inom det avbildade området. (C) Högre vakuumtryck kan orsaka betydande blåmärken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Leukocythandel med lungvenuler. Excitation av rhodamin 6G möjliggör visualisering av vidhäftande och rullande leukocyter. Skisserade områden representerar analyserade delar av vaskulärt endotel som bekräftats genom excitering av FITC-albumin i (A) naiva och (B) LPS-behandlade möss. (C,D) Intranasal LPS-administrering påverkar leukocytrullning och vidhäftning i lungvenuler. Värden anges som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Leukocythandel med lungartärer. Excitation av rhodamin 6G möjliggör visualisering av vidhäftande och rullande leukocyter. Skisserade områden representerar analyserade delar av vaskulärt endotel som bekräftats genom excitering av FITC-albumin i (A) naiva och (B) LPS-behandlade möss. (C,D) Intranasal LPS-administrering påverkar leukocytrullning och vidhäftning i lungartärer. Värden anges som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Vidhäftande leukocyter i lungkapillärer. Excitation av rhodamin 6G möjliggör visualisering av leukocyter inom ROI i (A) naiva och (B) LPS-behandlade möss. (C) Intranasal LPS-administrering påverkar leukocytadhesionen hos LPS-behandlade möss. Värden anges som medelvärde ± SD . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Lungkapillärfunktion. Excitation av FITC-albumin möjliggör visualisering av kapillärt blodflöde inom ROI hos (A) naiva och (B) LPS-behandlade möss. (C) Intranasal LPS-administrering påverkar FCD i lungkapillärer. Värden anges som medelvärde ± SD . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil: Fil för 3D-utskrivbar IVM-plattform. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 1: Diagram över vakuumsystemet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande film 1: Provvideo av blodflödet i lungvenulen. Den gröna pilen betecknar blodflödets riktning. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 2: Provvideo av leukocythandel i lungvenule. Röda pilar betecknar vidhäftande leukocyter i kärlet. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 3: Provvideo av blodflödet i lungartären. Den gröna pilen betecknar blodflödets riktning. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 4: Provvideo av leukocythandel med lungartär. Röda pilar betecknar vidhäftande leukocyter i ett kärl. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 5: Provvideo av blodflödet i lungkapillärer. Gröna pilar betecknar flera väl visualiserade områden med röda blodkroppar perfuserade kapillärer. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Kompletterande film 6: Provvideo av leukocythandel i lungkapillärer. Röda pilar betecknar vidhäftande leukocyter inom synfältet. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här kräver övning och uppmärksamhet på några kritiska steg. För det första är det viktigt att förbereda bildfönstret innan intubation och operation påbörjas. Använd en minimal mängd vakuumfett för att belägga bildfönstrets yttre ring, applicera täckglaset och provsug med en droppe destillerat vatten. Att förbereda detta i förväg förhindrar att den exponerade lungan torkar ut under installationen annars. Även om det är möjligt att spola med varm saltlösning, kan det riskera att skada den bräckliga lungvävnaden.
Efter intubation, medan du överför musen till IVM-plattformen, kan kanylen ibland bli förskjuten. För att förhindra detta, överväg att binda kanylen till musens framtänder eller suturera den till huden runt munnen. Vid användning av tryckstyrd ventilation bör tidvattenvolymen övervakas noggrant under hela proceduren. Den bör förbli stabil vid cirka 0,20 ml, eftersom betydligt lägre värden (t.ex. ~ 0,10 ml) kan indikera enkel lungventilation. Om detta inträffar kan problemet lösas något om du drar tillbaka endotrakeal kanyl. Användningen av inhalationsanestesi (isofluran) underlättar kontrollen av anestesidjupet medan musen ventileras. Andra anestesimedel (t.ex. intravenöst ketamin/xylazin10,11) har använts av andra laboratorier, och var och en har sina respektive fördelar och nackdelar.
Under operationen används trubbig dissektion för att minimera risken för att blodkärlen skärs av. Detta är av särskild betydelse vid dissekering av den tjocka och kraftigt vaskulära fettvävnaden nära axeln. Resektion av bröstkorgen kräver både hastighet och noggrannhet. Värmen från cauterizern är tillräckligt intensiv för att bränna lungan om den används för mycket. Vid resektering av bröstkorgen bör det finnas tomt utrymme mellan lungan och bröstväggen. Om lungan fäster vid bröstväggen, kommer lätt att trycka ner på utsidan av bröstkorgen att uppmuntra vidhäftning till den underliggande parietala pleuraen. Alternativt kan du använda en trubbig nål för att injicera en liten mängd varm saltlösning mellan lungan och bröstkorgen för att underlätta frisättningen. Att placera fönsterarmen i läget klockan 3 rekommenderas för att undvika oönskat tryck på revbenen under avbildning (figur 3A). Det kommer också att lämna mer utrymme mellan mikromanipulatorn och mikroskopmålet, vilket möjliggör enklare åtkomst för manipulationer. När du sänker bildfönstret är det viktigt att rikta in sig på den centrala delen av lungan eftersom kontakt med kanten kommer att resultera i en otillräcklig tätning och överdriven rörelseartefakt under avbildning. Flera försök att sänka fönstret kan också skada lungan. På samma sätt kommer cykler av frigöring och återstabilisering att bidra till lungskada och kan äventyra experimentell noggrannhet. När den utförs korrekt är dock preparatet som presenteras här tillräckligt stabilt för att möjliggöra högupplöst intravital avbildning med ett 20x mål.
Ett rigoröst rengöringsprotokoll är nödvändigt för att förhindra kontaminering och blockering av vakuumkanalen i bildfönstret. Att använda en 30 G nål omedelbart efter experiment för att upprepade gånger spola med destillerat vatten är effektivt för att avlägsna de flesta föroreningar. Detta följs av en spolning med koncentrerad etanol och en slutlig spolning med destillerat vatten innan den sätts fast på vakuumledningen igen för att avlägsna fukt. Användning av aceton eller starka rengöringsmedel kan vara tillräckligt för att lösa allvarliga blockeringar, om de skulle uppstå.
I synnerhet använder detta protokoll en högre avläsning av vakuumtrycket jämfört med vissa andra rapporterade metoder 4,11, och detta kan ge upphov till oro för skador på lungvävnad. En viktig skillnad är dock att den digitala mätaren som används här endast mäter trycket vid vakuumpumpen. Detta tryck levereras genom smala slangar och den extremt smala kanalen i själva bildfönstret före fördelning över en större yta av lungan. Som sådan observerades inga tecken på skador på den avbildade regionen i dessa experiment efter intravitala sessioner. Dessutom uppvisade avbildade alveoler tidvattendistension och sammandragning, vilket indikerar att detta fysiologiska fenomen inte stördes signifikant.
Trots den ökande populariteten hos lung-IVM som ett verktyg för att studera sjukdom in vivo finns det begränsningar för denna teknik. För det första inducerar operationens invasiva och terminala natur en icke försumbar effekt på musens fysiologiska tillstånd och begränsar proceduren till en enda bildsession. Det bör dock noteras att flera longitudinella lung-IVM-metoder har utvecklats30. För det andra kan användningen av mekanisk ventilation framkalla en grad av ventilatorrelaterad lungskada (VALI)31, även om detta begränsas av procedurens korta varaktighet. För det tredje kan kontakt mellan den viscerala pleura och glasöverdrag och applicering av vakuumtryck resultera i förändrat mikrovaskulärt blodflöde. Slutligen är den kanske viktigaste begränsningen av detta tillvägagångssätt att avbildning är begränsad till subpleurala alveoler i icke-beroende lungregioner, som inte är representativa för hela lungan32.
Sammanfattningsvis kan detta protokoll användas för att studera leukocyt-endotelinteraktioner i lungmikrovaskulaturen med användning av intravital fluorescensmikroskopi. Medan dessa experiment använder endotoxininducerad lungskada, en akut modell som valdes baserat på tidigare forskning, kan detta protokoll också anpassas för att studera andra patologiska och fysiologiska processer i lungan. Dessutom är lungavbildningssystemet som används här tillämpligt på en rad mikroskopimetoder, och bildfönstret är tillräckligt stort för att rymma oljedykningsmål med hög numerisk bländare. Således bör de beskrivna förfarandena underlätta ytterligare forskning om effekterna av olika sjukdomstillstånd på lungmikrocirkulationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Kamala D. Patel är president och medgrundare av Luxidea, företaget från vilket bildfönstret som användes i detta experiment köptes.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Pina Colarusso, som tillhandahöll betydande expertis i redigering och revidering av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
