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Immunology and Infection

वैक्यूम-स्थिर इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके प्रायोगिक तीव्र फेफड़ों की चोट में फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन के इंट्रावाइटल वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63733
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 5, 6,7, 2,4, 1,2,4,8
1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

Summary

इंट्रावाइटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग वास्तविक समय में ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन और केशिका छिड़काव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल वैक्यूम-स्थिर फेफड़ों इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन में इन मापदंडों की छवि और मात्रा निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन की इंट्रावाइटल इमेजिंग जीवित जानवरों में प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोग में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) और विवो में अन्य श्वसन विकृतियों का अध्ययन फेफड़ों की सीमित पहुंच और अंतर्निहित गति कलाकृतियों के कारण मुश्किल है। बहरहाल, इन चुनौतियों से पार पाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। यह प्रोटोकॉल एएलआई के एक प्रयोगात्मक मॉडल में फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन में वास्तविक समय ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इंट्रावाइटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एक इन विवो फेफड़े इमेजिंग सिस्टम और 3-डी मुद्रित इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग संवेदनाहारी माउस को सुरक्षित करने और फेफड़ों की चोट को कम करते हुए फेफड़ों को स्थिर करने के लिए किया जाता है। तैयारी के बाद, वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग ल्यूकोसाइट आसंजन, ल्यूकोसाइट रोलिंग और केशिका समारोह का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। जबकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल भड़काऊ फेफड़ों की बीमारी के एक तीव्र मॉडल में इमेजिंग पर केंद्रित है, इसे फेफड़ों में अन्य रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) विवो में विभिन्न बायोफिजिकल प्रक्रियाओं की कल्पना और अध्ययन के लिए एक उपयोगी इमेजिंग उपकरण है। फेफड़े अपने संलग्न स्थान, इसके ऊतक की नाजुक प्रकृति, और श्वसन और दिल की धड़कन 1,2 से प्रेरित गति कलाकृतियों के कारण विवो में छवि के लिए अत्यधिक चुनौतीपूर्ण है। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन में ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए विभिन्न इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) सेटअप विकसित किए गए हैं। इस तरह के दृष्टिकोण शल्य चिकित्सा से उजागर करने और इमेजिंग के लिए फेफड़ों को स्थिर करने पर आधारित हैं।

जानवर आमतौर पर सर्जिकल प्रक्रियाओं द्वारा फेफड़ों के आईवीएम के लिए तैयार होते हैं। सबसे पहले, जानवरों को इंटुबैटेड और हवादार किया जाता है, जो इमेजिंग के लिए फेफड़ों को स्थिर करने के लिए वक्ष यी खिड़की के सर्जिकल छांटना और बाद के हस्तक्षेप की अनुमति देता है। एक तकनीक में एक ग्लास कवरस्लिप3 पर पैरेन्काइमा को चिपकाना शामिल है, एक प्रक्रिया जो इमेज किए गए ऊतक को महत्वपूर्ण शारीरिक आघात का जोखिम उठाती है। अधिक उन्नत एक ग्लास विंडो के तहत फेफड़ों को स्थिर करने के लिए वैक्यूम सिस्टम का उपयोगहै 4. यह सेटअप एक बड़े स्थानीय क्षेत्र में फैले एक प्रतिवर्ती वैक्यूम के माध्यम से कवरस्लिप में फेफड़ों की सतह के ढीले पालन की सुविधा प्रदान करता है और फेफड़ों का विस्तार करता है जबकि अभी भी एक्स, वाई और जेड आयाम 4 में आंदोलन को सीमित करताहै। वैक्यूम सेटअप के इमेजिंग क्षेत्र के आसपास एक चैनल के माध्यम से समान रूप से लागू किया जाता है और ऊतक को इमेजिंग-ग्रेड कवरस्लिप 4 का सामना करने वाले उथले शंक्वाकार क्षेत्र में खींचताहै। इस देखने की खिड़की के माध्यम से, फेफड़ों के माइक्रोसर्कुलेशन का अध्ययन विभिन्न ऑप्टिकल इमेजिंग तौर-तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।

फेफड़े आईवीएम माइक्रोसर्कुलेटरी मापदंडों की एक भीड़ की मात्रात्मक इमेजिंग को सक्षम बनाता है। इनमें ल्यूकोसाइट ट्रैक गति और लंबाई5, लाल रक्त कोशिका प्रवाह वेग6 और ऑक्सीजन7, ट्यूमर मेटास्टेसिस8, प्रतिरक्षा कोशिका उप-जनसंख्या का भेद 9,10,11, सूक्ष्म कणों का दृश्य 12, वायुकोशीय गतिशीलता13,14, संवहनी पारगम्यता 15, और केशिका फ़ंक्शन16 जैसे माप शामिलहैं। . यहां ल्यूकोसाइट भर्ती और केशिका समारोह पर ध्यान केंद्रित किया गया है। फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन में ल्यूकोसाइट भर्ती की दीक्षा में ल्यूकोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच क्षणिक रोलिंग इंटरैक्शन और फर्म चिपकने वाला इंटरैक्शन शामिल है, जिनमें से दोनों भड़काऊ स्थितियों16,17 के तहत बढ़ जाते हैं। आमतौर पर, रोलिंग को ल्यूकोसाइट्स की संख्या से निर्धारित किया जाता है जो एक ऑपरेटर-परिभाषित संदर्भ रेखा को पास करते हैं, जबकि आसंजन को ल्यूकोसाइट्स की संख्या से निर्धारित किया जाता है जो एंडोथेलियम16 पर स्थिर होते हैं। भड़काऊ राज्यों में केशिका समारोह भी प्रभावित हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर छिड़काव में कमी आती है। यह कई कारकों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जिसमें लाल रक्त कोशिका विकृति18 की कमी और एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा प्रेरक नो सिंथेज़ की विविध अभिव्यक्ति शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल शंटिंग19 होता है। आमतौर पर, प्रति क्षेत्र सुगंधित केशिकाओं की कुल लंबाई को मापा जाता है और कार्यात्मक केशिका घनत्व (एफसीडी) के रूप में रिपोर्ट किया जाता है।

वास्तविक समय में फेफड़ों में ल्यूकोसाइट भर्ती का अध्ययन करने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों या फ्लोरोसेंट-लेबल वाले एंटीबॉडी20 के साथ जैविक लक्ष्यों को लेबल करने की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, विभिन्न ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों जैसे लाइसोजाइम एम-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एलवाईएसएम-जीएफपी) चूहों का उपयोग विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका सबसेट जैसे न्यूट्रोफिल21,22 की छवि के लिए किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट-लेबल ल्यूकोसाइट्स को तब वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। ये तकनीकें विशिष्ट उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का पता लगाकर विपरीत प्राप्त करती हैं, जबकि एक साथ उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का पता लगाने को अवरुद्ध करती हैं, इस प्रकार लेबल वाली वस्तु को उजागर करती हैं।

म्यूरिन फेफड़ों में ल्यूकोसाइट रोलिंग, आसंजन और कार्यात्मक केशिका घनत्व की मात्रा का ठहराव से संबंधित मौजूदा शोध मुख्य रूप से मैनुअल वीडियो विश्लेषण पर निर्भर है। यह ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर जैसे फिजी 6,23, मालिकाना सॉफ़्टवेयर जैसे कैपइमेज 12, या कस्टम-निर्मित इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम24 के माध्यम से संभव बनाया गयाहै। इसके विपरीत, विभिन्न मालिकाना सॉफ्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म (जैसे, एनआईएस तत्व, इमारिस, वोलोसिटी, मेटामॉर्फ) अन्य शारीरिक मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला के स्वचालित माप को सक्षम करते हैं, जिनमें से कई पहले यहां 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15 का उल्लेख किया गया है।

फेफड़ों के आईवीएम का उपयोग करके तीव्र फेफड़ों की चोट (एएलआई) और तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) की विकृति के बारे में महत्वपूर्ण टिप्पणियां की गई हैं। एआरडीएस फेफड़ों में पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं के एक मेजबान की विशेषता है, जिसमें एंडोथेलियम और उपकला बाधा25 की शिथिलता के कारण फुफ्फुसीय एडिमा और वायुकोशीय क्षति शामिल है। एक म्यूरिन मॉडल का उपयोग करते हुए, यह पाया गया है कि सेप्सिस-प्रेरित एएलआई फेफड़ों के वातावरण में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी में महत्वपूर्ण हानिकारक परिवर्तनों से जुड़ा हुआ है26. सेप्सिस-प्रेरित एएलआई के साथ चूहों की केशिकाओं में भर्ती न्यूट्रोफिल को माइक्रोसर्कुलेशन में बाधा डालने के लिए पाया गया, जिससे एएलआई26 में हाइपोक्सिया बढ़ गया। इसके अतिरिक्त, आईआरडीएस27 की शुरुआत के बाद मरम्मत के अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आईवीएम का उपयोग किया गया है। फेफड़े आईवीएम विभिन्न अवरोधक फेफड़ों के रोगों में पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों को समझने में भी एक मूल्यवान उपकरण रहा है। उदाहरण के लिए, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) जैसी बीमारियों में बलगम परिवहन के दृश्य ने श्लेष्म निकासी 28 के लिए उपन्यास और मौजूदाउपचारों के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है। इन स्थितियों के तहत ल्यूकोसाइट तस्करी का विश्लेषण भी किया गया है17.

यह प्रोटोकॉल पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए लैम एट अल .29 द्वारा शुरू में वर्णित दृष्टिकोण पर फैलता है। वर्णित प्रक्रियाएं एक विवो फेफड़ों इमेजिंग सिस्टम को नियोजित करती हैं, जिसमें 16.5 सेमी x 12.7 सेमी धातु आधार, माइक्रोमैनिपुलेटर और वैक्यूम इमेजिंग विंडो (चित्रा 1) शामिल है। वेंटिलेटर ट्यूबिंग और हीटिंग पैड के लिए सुरक्षित लगाव प्रदान करने के लिए सिस्टम को 20 सेमी x 23.5 सेमी 3-डी मुद्रित प्लेटफ़ॉर्म (पूरक फ़ाइल 1) में रखा गया है। यह विधि विवो में म्यूरिन फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक इमेजिंग प्रदान करती है। सर्जिकल तैयारी के महत्वपूर्ण पहलुओं के साथ-साथ वैक्यूम-स्थिर फेफड़ों की इमेजिंग प्रणाली के उचित उपयोग को विस्तार से समझाया गया है। अंत में, एएलआई के एक प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग प्रतिनिधि इमेजिंग और सूजन से जुड़े परिवर्तित ल्यूकोसाइट रोलिंग, ल्यूकोसाइट आसंजन और केशिका छिड़काव के विश्लेषण प्रदान करने के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के उपयोग से तीव्र रोग राज्यों के दौरान फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन में पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों में आगे महत्वपूर्ण जांच की सुविधा मिलनी चाहिए।

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Protocol

यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला पशुओं पर डलहौजी विश्वविद्यालय समिति (यूसीएलए) द्वारा पूर्व अनुमोदन के साथ किया गया था।

1. तैयारी

  1. फेफड़े इमेजिंग सिस्टम: खिड़की तैयार करने के लिए, वैक्यूम चैनल के संदूषण से परहेज करते हुए बाहरी अंगूठी के शीर्ष पर वैक्यूम ग्रीस की एक पतली परत का प्रशासन करें। खिड़की पर एक साफ 8 मिमी ग्लास कवरस्लिप रखें और सील बनाने के लिए धीरे-धीरे दबाएं।
  2. वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप: 20x / 0.40 लंबी दूरी के उद्देश्य और 25 एफपीएस की फ्रेम-दर के साथ एक काले और सफेद चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे के साथ लगे पारंपरिक वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग करें। रोडामाइन -6 जी को उत्तेजित करने के लिए 530-550 एनएम बैंडपास उत्तेजना फ़िल्टर और फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) को उत्तेजित करने के लिए 460-490 एनएम बैंडपास फिल्टर लागू करें।
  3. वैक्यूम सिस्टम: इमेजिंग विंडो को 50-60 मिमीएचजी निरंतर चूषण प्रदान करने में सक्षम डिजिटल दबाव गेज के साथ लगे वैक्यूम पंप से कनेक्ट करें, जैसा कि पूरक चित्रा 1 में दिखाया गया है। संक्षेप में, इमेजिंग विंडो को 1.0 मिमी आईडी पॉलीथीन ट्यूबिंग, 1.0 सेमी आईडी पॉलीथीन ट्यूबिंग, एक वैक्यूम फ्लास्क और एक इनलाइन 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से पंप से कनेक्ट करें।
  4. वेंटिलेटर: माउस के वजन के आधार पर गणना की गई दर और मात्रा पर दबाव-नियंत्रित वेंटिलेशन प्रदान करने के लिए एक छोटा कृंतक वेंटिलेटर सेट करें। प्रयोग की अवधि के लिए 5 सेमीएच2ओ पर एक सकारात्मक अंत-समाप्ति दबाव (पीईईपी) प्रदान करें, और लक्ष्य दबाव को 20 सेमीएच2ओ पर सेट करें।
  5. संवेदनाहारी: कम प्रवाह संज्ञाहरण वितरण प्रणाली का उपयोग करके, 99.9% आइसोफ्लूरेन के साथ 5.0 एमएल सिरिंज को प्राइम करें। सर्जन द्वारा साँस लेने के जोखिम को कम करने के लिए अपशिष्ट गैस मैला ढोने की प्रणाली का उपयोग करें।

2. संज्ञाहरण

  1. संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में एक 20-25 ग्राम 12 सप्ताह पुराने पुरुष सी 57 बीएल / कक्ष को सुरक्षित रूप से बंद करने के साथ, 3% की एकाग्रता और 500 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर आइसोफ्लूरेन गैस के साथ प्रेरण शुरू करें।
  2. एक बार माउस संवेदनाहारी (धीमी श्वसन दर द्वारा कल्पना की जाती है), इसे इंटुबैषेण स्टैंड में स्थानांतरित करें और ऊपरी कृन्तकों को फांसी सिवनी में सुरक्षित करें।
  3. नाक शंकु के अंदर थूथन को सुरक्षित करने के लिए सिवनी को कस लें। 2.5% की एकाग्रता पर नाक शंकु के माध्यम से गैस प्रवाह शुरू करें।
  4. अगले चरण में जाने से पहले पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि करें।

3. इंटुबैषेण

  1. खड़े इस तरह से घुमाएँ कि खड़े के पीछे और सर्जन की ओर माउस चेहरे के पृष्ठीय पक्ष।
  2. 20 ग्राम एंडोट्रेचियल प्रवेशनी के माध्यम से फाइबर ऑप्टिक केबल की 20 सेमी लंबाई की नोक पास करें और स्वरयंत्र के माध्यम से केबल के पारित होने की सुविधा के लिए लिडोकेन एचसीएल (1%) में टिप को डुबोएं।
  3. कुंद संदंश का उपयोग करके, निचले जबड़े को उठाएं और श्वसन पथ में स्पष्ट मार्ग प्रदान करने के लिए जीभ को विस्थापित करें।
  4. एक संशोधित ओटोस्कोप डालें (~ 60 ° स्पेकुलम परिधि को हटा दिया गया) जैसे कि ऊपरी कृंतक स्पेकुलम में अंतराल के भीतर फिट होते हैं। एपिग्लोटिस तक गुंजाइश और जीभ की स्थिति को समायोजित करें, और मुखर डोरियां स्पष्ट रूप से दिखाई देती हैं।
  5. स्पेकुलम में अंतराल के माध्यम से और स्वरयंत्र में एंडोट्रैचियल प्रवेशनी के साथ लोड फाइबर ऑप्टिक केबल डालें। छोटे परिपत्र आंदोलनों का उपयोग करके, मुखर डोरियों के माध्यम से और श्वासनली में केबल पास करें।
  6. फाइबर ऑप्टिक केबल के साथ प्रवेशनी को धक्का दें, मुखर डोरियों के बीच और श्वासनली में गुजरें।

4. वेंटिलेशन

  1. इंटुबैषेण स्टैंड से माउस को पुनः प्राप्त करें और इसे सही पार्श्व डिक्यूबिटस स्थिति में हीटिंग पैड पर रखें।
  2. प्रवेशनी को वेंटिलेटर ट्यूबिंग से कनेक्ट करें और वेंटिलेटर शुरू करें। 1.5% करने के लिए संवेदनाहारी एकाग्रता को कम करने और पेडल पलटा के लिए परीक्षण करके गहराई की निगरानी। यदि पलटा बनी रहती है, तो एकाग्रता को वृद्धिशील रूप से 2% तक बढ़ाएं।
  3. सूखने से रोकने के लिए माउस की आंखों में आंसू जेल रखें।
  4. चिकित्सा टेप का उपयोग करके, प्रवेशनी को थूथन में सुरक्षित करें। लेबलिंग टेप का उपयोग करके, हीटिंग पैड पर सही फोरपाव को सुरक्षित करें, लगभग 9 बजे की स्थिति। बाएं हिंद पंजा का विस्तार करें और लगभग 6 बजे की स्थिति में सुरक्षित करें।
  5. एक कपड़ा टेप का उपयोग करके, हल्के ढंग से बाएं अग्रभाग को 12 बजे की स्थिति में फैलाएं और टेप के दूसरे छोर को आईवीएम प्लेटफॉर्म के शीर्ष पर सुरक्षित करें जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है (यहां मामूली तनाव बनाए रखने से बाद में थोरैकोटॉमी की सुविधा मिलती है)।
  6. एक मलाशय तापमान जांच डालें और हीटिंग पैड पर टैप करके जांच को सुरक्षित करें। दाहिने हिंद पंजे पर एक पल्स ऑक्सीमीटर रखें और हीटिंग पैड को सुरक्षित रखें, ध्यान रखें कि परिसंचरण को बाधित न करें।
  7. एक बार जब तापमान 37.0 डिग्री सेल्सियस ± 0.1 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हो जाता है, तो थोरैकोटॉमी करने के लिए आगे बढ़ें।

5. थोरैकोटॉमी

  1. 70% अल्कोहल वाइप के साथ वक्ष और पेट को निष्फल करें। उरोस्थि से कशेरुक स्तंभ तक और कंधे से रिबकेज के नीचे तक माउस के बाईं ओर बालों को गीला करने के लिए खनिज तेल का एक हल्का कोट लागू करें।
  2. कुंद संदंश और सीधे कैंची के साथ, अंतर्निहित मांसपेशियों की परत को उजागर करने के लिए रिबकेज के तल के पास एक छोटा अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं।
  3. उदर रूप से आगे बढ़ते हुए, मांसपेशियों की परत से उपकला और वसा ऊतक को अलग करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें। किसी भी उजागर रक्त वाहिकाओं को कॉटराइज़ करें। एक बार रक्त की हानि के जोखिम को कम करने के बाद, एक्सिफोइड प्रक्रिया तक मूल चीरा का विस्तार करें।
  4. कशेरुक स्तंभ के लिए ~ 5 मिमी पार्श्व तक इस प्रक्रिया को पृष्ठीय रूप से दोहराएं।
  5. कपाल रूप से आगे बढ़ते हुए, रिब पिंजरे को उजागर करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें। हेमोडायनामिक स्थिरता को संरक्षित करने के लिए किसी भी उजागर रक्त वाहिकाओं को कॉटराइज़ करें।
  6. एक बार रक्त की हानि के जोखिम को कम करने के बाद, एक्सिला तक एक्सीफॉइड प्रक्रिया से चीरा बढ़ाएं।
  7. चीरा के पृष्ठीय पक्ष पर इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि ~ 1 सेमी बाएं कान से नीच न हो।
  8. हेमोस्टैटिक संदंश का उपयोग करके, विच्छेदित उपकला और वसा ऊतक को समझें और सर्जिकल क्षेत्र (चित्रा 2 बी) से स्पष्ट जगह।
  9. पूंछ नस के माध्यम से केशिका छिड़काव के दृश्य के लिए ल्यूकोसाइट्स और बोवाइन एफआईटीसी-एल्बुमिन (50 मिलीग्राम / एमएल; 1 एमएल / किग्रा) के दृश्य के लिए रोडामाइन -6 जी (0.5 मिलीग्राम / एमएल; 1.5 एमएल / किग्रा) का एक समाधान इंजेक्ट करें।
  10. दांतेदार संदंश का उपयोग करके, अंत-प्रेरणा पर फेफड़ों के आधार की स्थिति से तुरंत नीच पसली को समझें और पसली को फेफड़ों से दूर खींचने के लिए थोड़ा पीछे हट जाएं। न्यूमोथोरैक्स को प्रेरित करने के लिए रिब को काटें।
  11. दोनों दिशाओं में इंटरकोस्टल मांसपेशियों के साथ चीरा का विस्तार करें, ध्यान रखें कि उजागर फेफड़ों की सतह को न छुएं।
  12. कुंद संदंश का उपयोग करके, अगली उच्चतम पसली को समझें और फेफड़ों को छाती की दीवार से दूर गिरने की अनुमति देने के लिए थोड़ा पीछे हट जाएं। यदि फेफड़े अलग नहीं होते हैं, तो फेफड़ों के खिलाफ छाती की दीवार को हल्के से दबाएं ताकि फेफड़े अंतर्निहित फुस्फुस का पालन कर सकें और इस प्रकार अधिक आसानी से गिर जाएं।
  13. उरोस्थि तक मूल चीरा वेंट्रली जारी रखें और फेफड़ों के शीर्ष को उजागर होने तक कपाल रूप से जारी रखें। उत्पन्न होने वाले किसी भी रक्तस्राव को कम करने के लिए कपास आवेदकों और धुंध का उपयोग करें।
  14. वक्ष गुहा के पृष्ठीय पहलू पर इंटरकोस्टल रक्त वाहिकाओं को उजागर करने के लिए रिबकेज उठाएं। फेफड़ों को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखना, रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के पास सबसे अवर इंटरकोस्टल पोत को काटना, और फिर रिब को काटना। कपाल और उदर रूप से आगे बढ़ते हुए, रिबकेज के लगभग 1 सेमी x 1.5 सेमी हिस्से तक दोहराएं (चित्रा 2 सी)।
  15. धुंध के छोटे स्ट्रिप्स का उपयोग करके केशिका कार्रवाई के माध्यम से वक्ष गुहा में किसी भी अतिरिक्त द्रव संचय को हटा दें।
  16. माइक्रोस्कोपी के लिए आगे बढ़ते समय, फेफड़ों और इमेजिंग विंडो के बीच अधिक सुरक्षित इंटरफ़ेस के लिए फैलने के लिए इंट्राप्लुरल तरल पदार्थ के लिए ~ 5 मिनट की अनुमति दें।

6. माइक्रोस्कोपी

  1. वैक्यूम पंप चालू करें और दबाव को ~ 50-60 मिमीएचजी में समायोजित करें।
  2. माइक्रोस्कोप चरण में आईवीएम प्लेटफ़ॉर्म स्थानांतरित करें। धातु पोस्ट और माइक्रोमैनिपुलेटर को इस तरह रखें कि इमेजिंग विंडो सीधे उजागर फेफड़े के ऊपर हो और खिड़की की बांह फेफड़ों तक पहुंचती है, लगभग, 3 बजे की स्थिति।
  3. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, इमेजिंग विंडो को ध्यान से कम करें जब तक कि यह फेफड़ों की सतह (चित्रा 3 ए) का पालन और स्थिर न हो जाए।
  4. 20x उद्देश्य और 460-490 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके, रक्त प्रवाह के अभिसरण पैटर्न के आधार पर एक फुफ्फुसीय शिरापरक की पहचान करें। देखने के क्षेत्र में पोत को केंद्र में रखें और 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करें।
    1. 530-550 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर पर स्विच करें और देखने के एक ही क्षेत्र में 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करें।
    2. पिछले चरण को दोहराएं जब तक कि पांच फुफ्फुसीय शिराओं को चित्रित नहीं किया जाता है।
  5. 460-490 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके, रक्त प्रवाह के विचलन पैटर्न के आधार पर एक फुफ्फुसीय धमनी की पहचान करें। देखने के क्षेत्र में पोत को केंद्र में रखें और 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करें।
    1. 530-550 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर पर स्विच करें और देखने के एक ही क्षेत्र में 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करें।
    2. पिछले चरण को दोहराएं जब तक कि पांच फुफ्फुसीय धमनियों को चित्रित नहीं किया जाता है।
  6. 460-490 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके, एल्वियोली और केशिकाओं के एक क्षेत्र का पता लगाएं जो बड़े जहाजों द्वारा प्रतिच्छेदित नहीं हैं और 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करते हैं।
    1. 530-550 एनएम बैंडपास उत्तेजना फिल्टर पर स्विच करें और देखने के एक ही क्षेत्र में 30 एस वीडियो रिकॉर्ड करें।
    2. पिछले चरण को दोहराएं जब तक कि पांच केशिका क्षेत्रों को चित्रित नहीं किया जाता है।

7. इच्छामृत्यु और सफाई प्रोटोकॉल

  1. माइक्रोस्कोप चरण से आईवीएम मंच निकालें और माउस इच्छामृत्यु करने के लिए 5 मिनट के लिए 5% करने के लिए आइसोफ्लूरेन वितरण समायोजित करें।
  2. प्रतीक्षा करते समय, कवर ग्लास को त्यागें और प्लेटफ़ॉर्म से इमेजिंग विंडो को डिस्कनेक्ट करें। एक छोटे ब्रश के साथ इमेजिंग विंडो को साफ करें और आसुत जल के साथ कई बार फ्लश करने के लिए चैनल में डाली गई 30 ग्राम सिरिंज का उपयोग करें। फिर, वैक्यूम पंप का उपयोग करके 95% इथेनॉल के साथ फ्लश करें।
  3. 5 मिनट बीत जाने के बाद, वेंटिलेटर को रोकें, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से पूर्ण इच्छामृत्यु सुनिश्चित करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त परिणामों को चित्रित करने के लिए, तीव्र फेफड़ों की चोट (एएलआई) को इंट्रानेसल बैक्टीरियल लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) इंस्टिलेशन के मॉडल का उपयोग करके इमेजिंग से 6 घंटे पहले प्रेरित किया गया था। संक्षेप में, चूहों (एन = 3) को आइसोफ्लूरेन के साथ संवेदनाहारी किया गया था, और बाँझ खारा (10 मिलीग्राम / एमएल) में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा से एलपीएस की छोटी बूंदों को 5 मिलीग्राम / इसकी तुलना भोले चूहों (एन = 3; कोई इंट्रानेसल प्रशासन) से की गई थी।

इमेजिंग पर, एक सफल सर्जिकल तैयारी कई कारकों द्वारा पहचानी जाती है। फेफड़े को श्वसन के साथ अपेक्षाकृत स्थिर होना चाहिए जिससे चक्रीय फ्रेमशिफ्ट 25 μm से अधिक नहीं होते हैं। एल्वियोली स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए और ज्वारीय फैलाव / संकुचन प्रदर्शित कर सकता है। नीली रोशनी (450-490 एनएम तरंग दैर्ध्य) द्वारा उत्तेजना रक्त प्रवाह दिशात्मकता के दृश्य की अनुमति देगी, और व्यक्तिगत लाल रक्त कोशिकाओं (पूरक मूवी 1, पूरक मूवी 3, और पूरक मूवी 5) को अलग करना संभव हो सकता है। हरी रोशनी (530-560 एनएम तरंग दैर्ध्य, पूरक मूवी 2, पूरक मूवी 4, और पूरक मूवी 6) द्वारा उत्तेजना पर ल्यूकोसाइट्स स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य होंगे। इमेजिंग के पूरा होने और चूषण खिड़की को हटाने के बाद, फेफड़ों की सतह की मामूली चोट लग सकती है, हालांकि इमेज किए गए क्षेत्र के भीतर नहीं, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।

कई तकनीकी चुनौतियां प्रयोगात्मक व्यवहार्यता में हस्तक्षेप कर सकती हैं। फेफड़ों की सतह पर रक्त का संचय वैक्यूम स्थिरीकरण से समझौता करेगा और चैनल को भी रोक सकता है। इससे बचने के लिए, प्रत्येक सर्जिकल चरण के दौरान अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए। अत्यधिक उच्च वैक्यूम दबाव फेफड़ों को नुकसान पहुंचा सकता है और माइक्रोसर्कुलेशन को प्रभावित कर सकता है। यह वायुकोशीय ठहराव या फुफ्फुसीय सतह (चित्रा 3 सी) पर अत्यधिक चोट लगने से पहचाना जा सकता है और वैक्यूम पंप से दबाव को कम करके ठीक किया जा सकता है। साथ ही, अंतःशिरा फ्लोरोफोर इंजेक्शन में त्रुटियों से ल्यूकोसाइट तस्करी और रक्त प्रवाह के खराब दृश्य हो सकते हैं।

प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद, पिछले साहित्य28 से अनुकूलित तरीके से फिजी21 का उपयोग करके अंधा मैनुअल विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक जानवर से पांच शिराएं, धमनियां और केशिका क्षेत्र-ब्याज (आरओआई) का विश्लेषण किया गया था। वेन्यूल्स और धमनियों में ल्यूकोसाइट आसंजन को उन कोशिकाओं की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था जो एंडोथेलियल सतह के प्रति क्षेत्र में 30 एस अवलोकन के दौरान संवहनी एंडोथेलियम का पालन करते हैं। यह कोशिकाओं /मिमी2 में रिले किया जाता है। केशिकाओं में ल्यूकोसाइट आसंजन को आरओआई के भीतर कोशिकाओं की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था जो कुल विश्लेषण क्षेत्र प्रति अवलोकन के 30 एस के दौरान संवहनी एंडोथेलियम का पालन करते हैं। यह कोशिकाओं /मिमी2 में भी रिले किया जाता है। ल्यूकोसाइट रोलिंग को 30 एस अवलोकन अवधि के दौरान पोत में एक संदर्भ बिंदु से गुजरने वाली कोशिकाओं की संख्या से दोगुनी संख्या के रूप में परिभाषित किया गया था। मुक्त बहने वाले ल्यूकोसाइट्स को लाल रक्त कोशिका प्रवाह के साथ पारित होने की गति की तुलना करके बाहर रखा गया था, और यह कोशिकाओं / माइक्रोसर्कुलेटरी छिड़काव को मापने के लिए, एफसीडी को प्रति अवलोकन क्षेत्र में लाल रक्त कोशिका-सुगंधित केशिकाओं की लंबाई के योग के रूप में परिभाषित किया गया था। यह सेमी /सेमी2 में रिले किया जाता है। प्रत्येक पैरामीटर को प्रत्येक जानवर के लिए एक औसत मूल्य के रूप में रिपोर्ट किया जाता है।

फुफ्फुसीय शिराओं में ल्यूकोसाइट भर्ती की एक आम प्रवृत्ति देखी गई, जिसमें एलपीएस-उपचारित चूहों बनाम भोले लोगों (आंकड़े 4 सी, डी) में आसंजन और रोलिंग में वृद्धि हुई। इस प्रवृत्ति को धमनी ल्यूकोसाइट आसंजन द्वारा दोहराया गया था, हालांकि रोलिंग और आसंजन के दोनों स्तर भोले समूह (आंकड़े 5 सी, डी) में अत्यधिक परिवर्तनशील थे। विशेष रूप से, एलपीएस प्रशासन के परिणामस्वरूप फुफ्फुसीय केशिका आरओआई (चित्रा 6 सी) में ल्यूकोसाइट आसंजन में पर्याप्त वृद्धि हुई। एलपीएस चूहों ने भोले चूहों (चित्रा 7 सी) बनाम कम एफसीडी का भी प्रदर्शन किया। फुफ्फुसीय केशिकाओं के भीतर ये प्रभाव पिछले साहित्य के अनुरूप हैं जो विभिन्न भड़काऊ उत्तेजनाओं 4,5,16 के बाद सामान्य केशिका छिड़काव के दृश्य और विकृति के प्रति क्षेत्र प्रतिरक्षा कोशिकाओं में वृद्धि की पहचान करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: फेफड़े इमेजिंग सिस्टम। कस्टम-ऑर्डर सिस्टम में (1) एक एनोडाइज्ड मेटल बेस, (2) इमेजिंग विंडो, (3) वैक्यूम इनलेट, (4) माइक्रोमैनिपुलेटर शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सर्जिकल तैयारी (ए) माउस सही पार्श्व डिक्यूबिटस स्थिति में आईवीएम मंच के लिए सुरक्षित है। (बी) हेमोडायनामिक्स को संरक्षित करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करके रिबकेज को उजागर किया जाता है। (सी) थोरैकोटॉमी बाएं फेफड़े को उजागर करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: वैक्यूम स्थिरीकरण( ए) वैक्यूम इमेजिंग विंडो का आवेदन फुफ्फुसीय सतह को स्थिर करता है। (बी) 75 मिमीएचजी से नीचे वैक्यूम दबाव का उपयोग फेफड़ों को नुकसान को कम करता है, विशेष रूप से इमेज किए गए क्षेत्र के भीतर। (सी) उच्च वैक्यूम दबाव महत्वपूर्ण चोट का कारण बन सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: फुफ्फुसीय शिराओं में ल्यूकोसाइट तस्करी। रोडामाइन 6 जी की उत्तेजना अनुयायी और रोलिंग ल्यूकोसाइट्स के दृश्य की अनुमति देती है। उल्लिखित क्षेत्र संवहनी एंडोथेलियम के विश्लेषण किए गए हिस्सों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसा कि (ए) भोले और (बी) एलपीएस-उपचारित चूहों में एफआईटीसी-एल्बुमिन की उत्तेजना द्वारा पुष्टि की जाती है। (सी, डी) इंट्रानेसल एलपीएस प्रशासन फुफ्फुसीय शिराओं में ल्यूकोसाइट रोलिंग और आसंजन को प्रभावित करता है। मान एसडी ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: फुफ्फुसीय धमनियों में ल्यूकोसाइट तस्करी। रोडामाइन 6 जी की उत्तेजना अनुयायी और रोलिंग ल्यूकोसाइट्स के दृश्य की अनुमति देती है। उल्लिखित क्षेत्र संवहनी एंडोथेलियम के विश्लेषण किए गए हिस्सों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसा कि (ए) भोले और (बी) एलपीएस-उपचारित चूहों में एफआईटीसी-एल्बुमिन की उत्तेजना द्वारा पुष्टि की जाती है। (सी, डी) इंट्रानेसल एलपीएस प्रशासन फुफ्फुसीय धमनियों में ल्यूकोसाइट रोलिंग और आसंजन को प्रभावित करता है। मान एसडी ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: फुफ्फुसीय केशिकाओं में अनुयायी ल्यूकोसाइट्स। रोडामाइन 6 जी की उत्तेजना (ए) भोले और (बी) एलपीएस-उपचारित चूहों में आरओआई के भीतर ल्यूकोसाइट्स के दृश्य की अनुमति देती है। (सी) इंट्रानेसल एलपीएस प्रशासन एलपीएस-उपचारित चूहों में ल्यूकोसाइट आसंजन को प्रभावित करता है। मान एसडी ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: फुफ्फुसीय केशिका समारोह। एफआईटीसी-एल्बुमिन की उत्तेजना (ए) भोले और (बी) एलपीएस-उपचारित चूहों में आरओआई के भीतर केशिका रक्त प्रवाह के दृश्य की अनुमति देती है। (सी) इंट्रानेसल एलपीएस प्रशासन फुफ्फुसीय केशिकाओं में एफसीडी को प्रभावित करता है। मान एसडी ± माध्य के रूप में दिए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: 3 डी प्रिंट करने योग्य आईवीएम प्लेटफ़ॉर्म के लिए फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: वैक्यूम प्रणाली का आरेख। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक मूवी 1: फुफ्फुसीय शिरापरक में रक्त प्रवाह का नमूना वीडियो। हरा तीर रक्त प्रवाह की दिशा को दर्शाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 2: फुफ्फुसीय शिरापरक में ल्यूकोसाइट तस्करी का नमूना वीडियो। लाल तीर पोत के भीतर अनुयायी ल्यूकोसाइट्स को दर्शाते हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 3: फुफ्फुसीय धमनी में रक्त प्रवाह का नमूना वीडियो। हरा तीर रक्त प्रवाह की दिशा को दर्शाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 4: फुफ्फुसीय धमनी में ल्यूकोसाइट तस्करी का नमूना वीडियो। लाल तीर एक पोत के भीतर अनुयायी ल्यूकोसाइट्स को दर्शाते हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 5: फुफ्फुसीय केशिकाओं में रक्त प्रवाह का नमूना वीडियो। हरे तीर लाल रक्त कोशिका-सुगंधित केशिकाओं के कई अच्छी तरह से कल्पना किए गए क्षेत्रों को दर्शाते हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 6: फुफ्फुसीय केशिकाओं में ल्यूकोसाइट तस्करी का नमूना वीडियो। लाल तीर देखने के क्षेत्र के भीतर अनुयायी ल्यूकोसाइट्स को दर्शाते हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर अभ्यास और ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, इंटुबैषेण और सर्जरी शुरू करने से पहले इमेजिंग विंडो तैयार करना महत्वपूर्ण है। इमेजिंग विंडो की बाहरी अंगूठी को कोट करने, कवर ग्लास लागू करने और आसुत जल की एक बूंद के साथ चूषण का परीक्षण करने के लिए वैक्यूम ग्रीस की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें। इसे पहले से तैयार करने से उजागर फेफड़ों को सेटअप के दौरान सूखने से रोका जा सकेगा अन्यथा। जबकि गर्म खारा के साथ फ्लश करना संभव है, ऐसा करने से नाजुक फुफ्फुसीय ऊतक को नुकसान पहुंचने का खतरा हो सकता है।

इंटुबैषेण के बाद, माउस को आईवीएम प्लेटफ़ॉर्म पर स्थानांतरित करते समय, प्रवेशनी कभी-कभी विस्थापित हो सकती है। इसे रोकने के लिए, प्रवेशनी को माउस के सामने के दांतों से बांधने या इसे अपने मुंह के चारों ओर की त्वचा पर टांका लगाने पर विचार करें। यदि दबाव-नियंत्रित वेंटिलेशन का उपयोग कर रहे हैं, तो पूरी प्रक्रिया में ज्वारीय मात्रा की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। यह लगभग 0.20 एमएल पर स्थिर रहना चाहिए, क्योंकि काफी कम मूल्य (जैसे, ~ 0.10 एमएल) एकल फेफड़ों के वेंटिलेशन का संकेत दे सकते हैं। यदि ऐसा होता है, तो एंडोट्रेचियल प्रवेशनी को थोड़ा वापस लेने से समस्या हल हो सकती है। इनहेलेंट संज्ञाहरण (आइसोफ्लूरेन) का उपयोग संवेदनाहारी गहराई के नियंत्रण की सुविधा प्रदान करता है जबकि माउस हवादार होता है। संज्ञाहरण के अन्य साधनों (जैसे, अंतःशिरा केटामाइन / ज़ाइलाज़िन10,11) को अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा नियोजित किया गया है, और प्रत्येक अपने संबंधित फायदे और कमियां ले जाते हैं।

सर्जरी के दौरान, रक्त वाहिकाओं को तोड़ने के जोखिम को कम करने के लिए कुंद विच्छेदन नियोजित किया जाता है। कंधे के पास मोटी और भारी संवहनी वसा ऊतक को विच्छेदन करते समय इसका विशेष महत्व है। रिबकेज के लकीर को गति और सटीकता दोनों की आवश्यकता होती है। कॉटेराइज़र से गर्मी फेफड़ों को जलाने के लिए पर्याप्त तीव्र होती है यदि अत्यधिक उपयोग किया जाता है। रिबकेज को काटते समय, फेफड़े और छाती की दीवार के बीच खाली जगह होनी चाहिए। यदि फेफड़े छाती की दीवार का पालन करता है, तो रिब पिंजरे के बाहर हल्के ढंग से दबाने से अंतर्निहित पार्श्विका फुस्फुस के आसंजन को प्रोत्साहित किया जाएगा। वैकल्पिक रूप से, रिलीज की सुविधा के लिए फेफड़ों और रिबकेज के बीच गर्म खारा की एक छोटी मात्रा को इंजेक्ट करने के लिए एक कुंद सुई का उपयोग करें। इमेजिंग (चित्रा 3 ए) के दौरान पसलियों पर अवांछित दबाव से बचने के लिए 3 बजे की स्थिति में खिड़की हाथ की स्थिति की सलाह दी जाती है। यह माइक्रोमैनिपुलेटर और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के बीच अधिक निकासी भी छोड़ देगा, जिससे जोड़तोड़ के लिए आसान पहुंच की अनुमति मिलेगी। इमेजिंग विंडो को कम करते समय, फेफड़ों के मध्य क्षेत्र को लक्षित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि किनारे के संपर्क के परिणामस्वरूप इमेजिंग के दौरान अपर्याप्त सील और अत्यधिक गति विरूपण साक्ष्य होगा। इसके अलावा, खिड़की को कम करने के कई प्रयास फेफड़ों को नुकसान पहुंचा सकते हैं। इसी तरह, टुकड़ी और पुन: स्थिरीकरण के चक्र फेफड़ों की चोट में योगदान देंगे और प्रयोगात्मक सटीकता से समझौता कर सकते हैं। जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, हालांकि, यहां प्रस्तुत तैयारी 20x उद्देश्य के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्रावाइटल इमेजिंग को सक्षम करने के लिए पर्याप्त स्थिर है।

इमेजिंग विंडो के भीतर वैक्यूम चैनल के संदूषण और रुकावट को रोकने के लिए एक कठोर सफाई प्रोटोकॉल आवश्यक है। आसुत जल के साथ बार-बार फ्लश करने के लिए प्रयोगों के तुरंत बाद 30 जी सुई का उपयोग करना अधिकांश दूषित पदार्थों को हटाने के लिए प्रभावी है। इसके बाद केंद्रित इथेनॉल के साथ फ्लश और नमी को हटाने के लिए वैक्यूम लाइन पर फिर से जुड़ने से पहले आसुत जल के साथ एक अंतिम फ्लश होता है। एसीटोन या मजबूत डिटर्जेंट का उपयोग गंभीर रुकावटों को हल करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, क्या उन्हें होना चाहिए।

विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल कुछ अन्य रिपोर्ट किए गए तरीकों 4,11 बनाम वैक्यूम दबाव के उच्च रीडआउट को नियोजित करता है, और यह फेफड़ों के ऊतकों को नुकसान की चिंताओं को बढ़ा सकता है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यहां उपयोग किया जाने वाला डिजिटल गेज केवल वैक्यूम पंप पर दबाव को मापता है। यह दबाव संकीर्ण टयूबिंग और फेफड़ों के एक बड़े सतह क्षेत्र पर वितरण से पहले इमेजिंग विंडो के बेहद संकीर्ण चैनल के माध्यम से वितरित किया जाता है। इस प्रकार, इंट्रावाइटल सत्रों के बाद इन प्रयोगों में इमेज किए गए क्षेत्र को नुकसान का कोई सबूत नहीं देखा गया था। इसके अलावा, इमेज किए गए एल्वियोली ने ज्वारीय फैलाव और संकुचन का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि यह शारीरिक घटना काफी बाधित नहीं हुई थी।

विवो में बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में फेफड़ों के आईवीएम की बढ़ती लोकप्रियता के बावजूद, इस तकनीक की सीमाएं हैं। सबसे पहले, सर्जरी की आक्रामक और टर्मिनल प्रकृति माउस की शारीरिक स्थिति पर एक गैर-नगण्य प्रभाव को प्रेरित करती है और प्रक्रिया को एक एकल इमेजिंग सत्र तक सीमित करती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कई अनुदैर्ध्य फेफड़े आईवीएम दृष्टिकोण30 विकसित किए गए हैं। दूसरा, यांत्रिक वेंटिलेशन का उपयोग वेंटिलेटर से जुड़े फेफड़ों की चोट (वीएएलआई) 31 की डिग्री को प्रेरित कर सकता है, हालांकि यह प्रक्रिया की छोटी अवधि तक सीमित है। तीसरा, आंत फुस्फुस और ग्लास कवरस्लिप और वैक्यूम दबाव के आवेदन के बीच संपर्क के परिणामस्वरूप परिवर्तित माइक्रोवास्कुलर रक्त प्रवाह हो सकता है। अंत में, शायद इस दृष्टिकोण की सबसे महत्वपूर्ण सीमा यह है कि इमेजिंग गैर-निर्भर फुफ्फुसीय क्षेत्रों में सबप्लूरल एल्वियोली तक सीमित है, जो पूरे फेफड़े32 के प्रतिनिधि नहीं हैं।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग इंट्रावाइटल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फुफ्फुसीय माइक्रोवास्कुलचर में ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि ये प्रयोग एंडोटॉक्सिन-प्रेरित फेफड़ों की चोट को नियोजित करते हैं, एक तीव्र मॉडल जिसे पिछले शोध के आधार पर चुना गया था, इस प्रोटोकॉल को फेफड़ों में अन्य रोग और शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां नियोजित फेफड़े इमेजिंग सिस्टम माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला पर लागू होता है, और इमेजिंग विंडो उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल-विसर्जन उद्देश्यों को समायोजित करने के लिए काफी बड़ी है। इस प्रकार, वर्णित प्रक्रियाओं को फुफ्फुसीय माइक्रोसर्कुलेशन पर विभिन्न रोग राज्यों के प्रभाव में आगे के शोध की सुविधा प्रदान करनी चाहिए।

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Disclosures

डॉ कमला डी पटेल लक्सिडिया की अध्यक्ष और सह-संस्थापक हैं, जिस उद्यम से इस प्रयोग में उपयोग की गई इमेजिंग विंडो खरीदी गई थी।

Acknowledgments

लेखक डॉ पिना कोलारुसो को धन्यवाद देना चाहते हैं, जिन्होंने इस पांडुलिपि के संपादन और संशोधन में महत्वपूर्ण विशेषज्ञता प्रदान की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use Becton, Dickinson and Company 309659 1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm RWD Life Science Co. F12002-12 Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate Sigma-Aldrich A9771-1G FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v Canadian Custom Packaging Company 80002455 Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter Canopus 00631069602029 Digital video converter
B/W - CCD - Camera Horn Imaging BC-71 Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit Fine Science Tools 18010-00 Cauterizer
C57BL/6 Mice Charles River Laboratories International C57BL/6NCrl C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators Puritan 806-WC Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip Warner Instruments 64-0701 Glass coverslip
Digital Pressure Gauge ITM Instruments Inc. DG2551L0NAM02L0IM&V Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope Dr. Mom Otoscopes 1001 Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol Commercial Alcohols P016EA95 95% ethanol
Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11 Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape Fisher Scientific 1590110 Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump Cole-Parmer Canada Company ZA-07061-40 Vacuum pump
Hartman Hemostats Fine Science Tools 13003-10 Hemostatic forceps
High Vacuum Grease Dow Corning DC976VF Vacuum grease
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2 Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL Teligent Canada 0121AD01 Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard Luxidea, Inc. IMCH-0001 Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil Teva Canada 00485802 Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit Kent Scientific Corporation ETI-MSE Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope Leica Microsystems 10 450 022 Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective Leica Microsystems 566035 20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2" AMD-Ritmed A2101-CH Gauze
Optixcare Eye Lube Plus Aventix 5914322 Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer Prusa Research PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI 3D printer
Oxygen, Compressed Linde Canada Inc. Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) Becton, Dickinson and Company 305106 30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL Cole-Parmer Canada Company 5340-2L Vacuum flask
Rhodamine 6 G Sigma-Aldrich 252433 Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" Primed PM5-630709 Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD Dow Corning 602-205 1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01, SS-04-module Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth World Precision Instruments 501216 Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) 3M 7000002795 Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. Grainger Canada USSZUSA-HT3314 1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm Cole-Parmer Canada Company 6720-5002 Inline 0.2µm filter

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 182
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Hall, S., Faridi, S., Euodia, I., Tanner, S., Chojnacki, A. K., Patel, K. D., Zhou, J., Lehmann, C. Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System. J. Vis. Exp. (182), e63733, doi:10.3791/63733 (2022).

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