Summary
생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.
Abstract
백혈구 - 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.
Introduction
생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.
동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 넓은 국소 영역에 걸쳐 확산되는 가역적 진공을 통해 커버슬립에 대한 폐 표면의 느슨한 부착을 용이하게 하고, x, y 및 z 치수4에서의 이동을 제한하면서 폐를 확장시킨다. 진공은 셋업의 이미징 영역을 둘러싸는 채널을 통해 고르게 적용되고, 이미징 등급 커버슬립(4)을 향하는 얕은 원뿔형 영역으로 조직을 당긴다. 이 시청 창을 통해, 폐 미세 순환은 다양한 광학 이미징 양식을 사용하여 연구 될 수 있습니다.
폐 IVM은 다수의 미세순환 파라미터의 정량적 이미징을 가능하게 한다. 여기에는 백혈구 추적 속도 및 길이5, 적혈구 유속6 및 산소화7, 종양 전이8, 면역 세포 하위집단의 구별 9,10,11, 미세입자의 시각화 12, 폐포 역학13,14, 혈관 투과성15, 및 모세관 기능 16과 같은 측정이 포함됩니다. . 여기서 초점은 백혈구 모집 및 모세관 기능에 있습니다. 폐 미세순환에서 백혈구 모집의 개시는 백혈구와 내피 세포 사이의 일시적인 롤링 상호작용 및 확고한 접착 상호작용을 포함하며, 둘 다 염증 조건 하에서 증가된다16,17. 전형적으로, 압연은 오퍼레이터-정의된 기준선을 통과하는 백혈구의 수에 의해 정량화되는 반면, 부착은 내피(16) 상에서 움직이지 않는 백혈구의 수에 의해 정량화된다. 모세관 기능은 또한 염증 상태에서 영향을 받을 수 있으며, 종종 관류 감소를 초래합니다. 이는 적혈구 변형성(18)의 감소 및 병리학적 션트(19)를 초래하는 내피 세포에 의한 유도성 NO 신타제의 잡색발현을 포함하는 몇몇 인자에 기인할 수 있다. 전형적으로, 면적당 관류된 모세혈관의 응집체 길이는 측정되고 기능적 모세관 밀도(FCD)로서 보고된다.
폐에서 백혈구 모집을 실시간으로 연구하려면 형광 염료 또는 형광 표지 항체20으로 생물학적 표적을 표지해야합니다. 대안적으로, 리소자임 M-녹색 형광 단백질(LysM-GFP) 마우스와 같은 다양한 트랜스제닉 마우스 균주는 호중구21,22와 같은 특이적 면역 세포 서브세트를 이미지화하는데 이용될 수 있다. 형광 표지된 백혈구는 광역 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 여기 파장을 활용하고 방출된 형광을 검출하는 동시에 여기 파장의 검출을 차단함으로써 대조를 달성함으로써 라벨링된 물체를 강조한다.
뮤린 폐에서 백혈구 롤링, 접착 및 기능적 모세관 밀도의 정량화에 관한 기존 연구는 주로 수동 비디오 분석에 의존해 왔습니다. 이것은 피지(6,23)와 같은 오픈 소스 소프트웨어, CapImage12와 같은 독점 소프트웨어 또는 맞춤형 이미지 처리 시스템(24)을 통해 가능하게 된다. 반대로, 다양한 독점 소프트웨어 플랫폼(예를 들어, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph)은 이전에 언급한 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15를 포함하는 다양한 다른 생리학적 파라미터들의 자동화된 측정을 가능하게 한다.
폐 IVM을 이용한 급성 폐 손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 병리학에 관한 중요한 관찰이 이루어졌습니다. ARDS는 내피 및 상피 장벽(25)의 기능장애로 인한 폐부종 및 폐포 손상을 포함하는 폐의 병리생리학적 과정의 숙주를 특징으로 한다. 뮤린 모델을 사용하여, 패혈증-유도된 ALI가 폐 환경에서의 면역 세포 밀매의 유의한 해로운 변화와 연관된다는 것이 밝혀졌다(26). 패혈증 유발 ALI를 가진 마우스의 모세혈관으로 모집된 호중구는 미세순환을 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 이로써 ALI26에서 저산소증이 증가하였다. 또한, IVM은 ARDS27의 발병 후 수리의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 폐 IVM은 또한 다양한 폐쇄성 폐 질환의 병리생리학적 변화를 이해하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 (CF) 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 같은 질병에서 점액 수송의 시각화는 점액 클리어런스28에 대한 신규 및 기존 치료법의 연구를 촉진시켰다. 이러한 조건하에서의 백혈구 밀매는또한 17 뿐만 아니라 분석되었다.
이 프로토콜은 Lamm et al.29 에 의해 초기에 기술된 접근법을 확장하여 기존의 형광 현미경을 사용하여 백혈구-내피 상호작용을 연구한다. 설명된 절차는 16.5 cm x 12.7 cm 금속 베이스, 미세 조작기 및 진공 이미징 윈도우를 포함하는 생체내 폐 영상 시스템을 채용한다(도 1). 이 시스템은 20cm x 23.5cm 3D 인쇄 플랫폼(보충 파일 1)에 장착되어 인공 호흡기 튜브 및 난방 패드에 안전하게 부착할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내에서 뮤린 폐 미세 순환의 재현 가능하고 정량화 가능한 이미징을 제공합니다. 수술 준비의 중요한 측면뿐만 아니라 진공 안정화 폐 영상 시스템의 적절한 활용이 자세히 설명된다. 마지막으로, ALI의 실험 모델은 염증과 관련된 변경된 백혈구 롤링, 백혈구 부착 및 모세관 관류의 대표적인 이미징 및 분석을 제공하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜의 사용은 급성 질환 상태 동안 폐 미세 순환의 병리 생리학적 변화에 대한 더 중요한 조사를 촉진해야한다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 절차는 Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA)의 사전 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
- 폐 이미징 시스템 : 창을 준비하려면 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상단에 얇은 진공 그리스를 투여하십시오. 깨끗한 8mm 유리 커버슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다.
- 광역 형광 현미경: 20x/0.40 장거리 대물렌즈와 프레임 속도가 25FPS인 흑백 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 장착된 기존의 광역 형광 현미경으로 이미징을 수행합니다. 530-550nm 대역통과 여기 필터를 적용하여 로다민-6G를 여기시키고 460-490nm 대역통과 필터를 적용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 여기시킵니다.
- 진공 시스템: 보충 그림 1과 같이 50-60mmHg 일정한 흡입을 제공할 수 있는 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 이미징 창을 연결합니다. 간단히 말해서, 이미징 윈도우를 1.0 mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 1.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 진공 플라스크 및 인라인 0.2 μm 필터를 통해 펌프에 연결한다.
- 인공 호흡기 : 작은 설치류 인공 호흡기를 설정하여 마우스의 체중을 기준으로 계산 된 속도와 부피로 압력 조절 환기를 제공하십시오. 실험 기간 동안 5cmH2O에서 양의 말단 내쉼 압력(PEEP)을 제공하고, 목표 압력을 20cmH2O로 설정한다.
- 마취제: 저유량 마취 전달 시스템을 사용하여 99.9% 이소플루란으로 5.0mL 주사기를 프라임화합니다. 폐가스 청소 시스템을 사용하여 외과 의사의 흡입 위험을 최소화하십시오.
2. 마취
- 20-25 g의 12주령 수컷 C57Bl/6 마우스를 마취 유도 챔버에 넣는다. 챔버를 단단히 닫은 상태에서 3 %의 농도와 500 mL / min의 유속으로 이소플루란 가스로 유도를 시작하십시오.
- 마우스가 마취되면 (느린 호흡 속도로 시각화), 삽관 스탠드로 옮기고 상부 절치를 교수형 봉합사에 고정시킵니다.
- 봉합사를 조여서 코 콘 안쪽에 주둥이를 고정시킵니다. 2.5 %의 농도로 코 콘을 통한 가스 흐름을 시작합니다.
- 다음 단계로 이동하기 전에 발가락 꼬집음을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.
3. 삽관
- 마우스의 스탠드 뒷면과 등쪽이 외과 의사를 향하도록 스탠드를 회전시킵니다.
- 20cm 길이의 광섬유 케이블의 끝을 20G 기관내 캐뉼라를 통해 통과시키고 팁을 Lidocaine HCl (1 %)에 담그면 후두를 통한 케이블 통과가 용이합니다.
- 무딘 포셉을 사용하여 아래턱을 들어 올리고 혀를 대체하여 호흡기로 명확한 통로를 제공합니다.
- 상부 절치가 검경의 틈새 내에 맞도록 수정 된 이토스코프 (~ 60 ° 사경 둘레 제거)를 삽입하십시오. epiglottis와 성대가 명확하게 보일 때까지 범위와 혀 위치를 조정하십시오.
- 기관내 캐뉼라가 장착된 광섬유 케이블을 검경의 틈새를 통해 후두에 삽입합니다. 작은 원형 움직임을 사용하여 케이블을 성대를 통과시켜 기관으로 전달하십시오.
- 광섬유 케이블을 따라 캐뉼라를 밀어 성대 사이와 기관으로 통과시킵니다.
4. 환기
- 삽관 스탠드에서 마우스를 회수하여 오른쪽 측면 욕창 위치의 가열 패드에 놓습니다.
- 캐뉼라를 인공 호흡기 튜브에 연결하고 인공 호흡기를 시작하십시오. 마취 농도를 1.5 %로 줄이고 페달 반사를 테스트하여 깊이를 모니터링하십시오. 반사가 지속되면 농도를 점진적으로 2 %까지 높입니다.
- 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 눈물 젤을 놓습니다.
- 의료용 테이프를 사용하여 캐뉼라를 주둥이에 고정하십시오. 라벨링 테이프를 사용하여 오른쪽 앞발을 대략 9시 위치에 가열 패드에 고정하십시오. 왼쪽 뒷발을 구불구불 뻗어 대략 6시 위치에 고정하십시오.
- 천 테이프를 사용하여 왼쪽 앞발을 12시 위치로 가볍게 스트레칭하고 그림 2A와 같이 테이프의 다른 쪽 끝을 IVM 플랫폼의 상단에 고정합니다 (여기에 약간의 장력을 유지하면 후속 흉부 절제술이 용이 해집니다).
- 직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에 테이핑하여 프로브를 고정하십시오. 오른쪽 뒷발에 맥박 산소 포화도 측정기를 놓고 가열 패드에 고정하여 순환을 방해하지 않도록주의하십시오.
- 일단 온도가 37.0°C ± 0.1°C에서 안정되면, 흉부 절제술을 진행한다.
5. 흉부 절제술
- 70 % 알코올 닦음으로 흉부와 복부를 살균하십시오. 미네랄 오일의 가벼운 코트를 발라서 흉골에서 척추 기둥으로, 어깨에서 흉곽 바닥까지 마우스의 왼쪽에있는 머리카락을 적셔줍니다.
- 무딘 포셉과 직선 가위로 흉곽 바닥 근처에 작은 세로 절개를 만들어 기본 근육층을 노출시킵니다.
- 심실로 이동하면 무딘 해부를 사용하여 상피 및 지방 조직을 근육층에서 분리하십시오. 노출 된 혈관을 소작하십시오. 혈액 손실의 위험이 완화되면 xiphoid 과정까지 원래의 절개를 심실로 연장하십시오.
- 척추 기둥에 ~ 5mm 측면이 될 때까지이 과정을 기숙사로 반복하십시오.
- 두개골로 움직이면 무딘 해부를 사용하여 흉곽을 노출시킵니다. 혈역학적 안정성을 보존하기 위해 노출된 혈관을 소작하십시오.
- 혈액 손실의 위험이 완화되면 xiphoid 과정에서 겨드랑이로 절개를 확장하십시오.
- 왼쪽 귀보다 ~ 1cm 정도 열등해질 때까지 절개의 등쪽에서이 과정을 반복하십시오.
- 지혈 포셉을 사용하여 해부된 상피 및 지방 조직을 잡고 수술 부위를 깨끗하게 만듭니다(그림 2B).
- 백혈구의 시각화를 위해 Rhodamine-6G (0.5 mg / mL; 1.5 mL / kg) 용액을 주입하고 꼬리 정맥을 통한 모세관 관류의 시각화를 위해 소 FITC 알부민 (50 mg / mL, 1 mL / kg)을 주입하십시오.
- 이빨이 달린 포셉을 사용하여 갈비뼈를 끝에서 폐 기저부의 위치보다 즉시 열등하게 잡고 약간 후퇴하여 갈비뼈를 폐에서 떼어냅니다. 기흉을 유도하기 위해 갈비뼈를 자르십시오.
- 늑간 근육을 따라 양쪽으로 절개를 옆으로 연장하여 노출 된 폐 표면에 닿지 않도록주의하십시오.
- 무딘 포셉을 사용하여 다음으로 높은 갈비뼈를 잡고 약간 후퇴하여 폐가 가슴 벽에서 떨어지도록하십시오. 폐가 분리되지 않으면 흉벽을 폐에 가볍게 눌러 폐가 하부 흉막에 달라 붙게하여 더 쉽게 떨어집니다.
- 흉골이 나타날 때까지 심실로 원래의 절개를 계속하고 폐의 정점이 노출 될 때까지 두개골로 계속하십시오. 면화 도포기와 거즈를 사용하여 발생하는 출혈을 감쇠시킵니다.
- 흉곽을 들어 올려 흉강의 등쪽 측면에 늑간 혈관을 노출시킵니다. 폐를 손상시키지 않도록주의하고, 척추 기둥 근처에서 가장 열등한 늑간 혈관을 소작 한 다음 갈비뼈를 자릅니다. 두개골 및 심실로 이동하면서 흉곽의 약 1cm x 1.5cm 부분이 절제될 때까지 반복한다(그림 2C).
- 거즈의 작은 스트립을 사용하여 모세관 작용을 통해 흉강에 축적 된 과도한 체액을 제거하십시오.
- 현미경 검사를 진행하는 동안 흉막 내 유체가 폐와 이미징 창 사이에보다 안전한 인터페이스를 위해 소산되도록 ~ 5 분 정도 허용하십시오.
6. 현미경 검사
- 진공 펌프를 켜고 압력을 ~ 50-60 mmHg로 조정하십시오.
- IVM 플랫폼을 현미경 단계로 전송하십시오. 이미징 창이 노출된 폐 바로 위에 있고 창 암이 대략 3시 위치에서 폐에 접근하도록 금속 포스트와 미세 조작기를 배치합니다.
- 미세 조작기를 사용하여 이미징 창이 폐 표면에 부착되고 안정화될 때까지 조심스럽게 낮춥니다(그림 3A).
- 20x 대물 및 460-490 nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 혈류의 수렴 패턴을 기반으로 폐 정맥을 식별합니다. 시야에 선박을 집중시키고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.
- 530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.
- 다섯 개의 폐 정맥이 이미징 될 때까지 이전 단계를 반복하십시오.
- 460-490 nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 혈류의 발산 패턴을 기반으로 폐 세동맥을 확인합니다. 시야에 선박을 집중시키고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.
- 530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.
- 다섯 개의 폐 세동맥이 이미징 될 때까지 이전 단계를 반복하십시오.
- 460-490nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 더 큰 혈관에 의해 교차되지 않는 폐포 및 모세 혈관의 영역을 찾고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.
- 530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.
- 다섯 개의 모세관 영역이 이미징될 때까지 이전 단계를 반복합니다.
7. 안락사 및 청소 프로토콜
- 현미경 단계로부터 IVM 플랫폼을 제거하고, 이소플루란 전달을 5분 동안 5%로 조정하여 마우스를 안락사시켰다.
- 기다리는 동안 커버 글래스를 버리고 플랫폼에서 이미징 창을 분리하십시오. 작은 브러시로 이미징 창을 청소하고 채널에 삽입 된 30G 주사기를 사용하여 증류수로 여러 번 플러시하십시오. 그런 다음, 진공 펌프를 사용하여 95% 에탄올로 플러싱한다.
- 5 분이 경과 한 후 인공 호흡기를 멈추고 자궁 경부 탈구를 통해 완전한 안락사를 보장하십시오.
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Representative Results
이 프로토콜을 통해 달성가능한 결과를 예시하기 위해, 급성 폐 손상 (ALI)은 비강 내 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) 점적의 모델을 사용하여 이미징하기 전에 6 h 동안 유도되었다. 간단히 말해서, 마우스 (n = 3)는 이소플루란으로 마취되었고, 멸균 식염수 (10 mg / mL)의 슈도모나스 aeruginosa 의 LPS의 작은 물방울을 5 mg / kg의 용량으로 왼쪽 나리스에 피펫팅했습니다. 이를 순진한 마우스와 비교하였다 (n=3; 비내 투여 없음).
이미징시 성공적인 수술 준비는 여러 가지 요인으로 식별 할 수 있습니다. 폐는 25 μm 이하의 순환 프레임 시프트를 일으키는 호흡으로 비교적 안정적이어야합니다. 폐포는 명확하게 볼 수 있어야하며 갯벌 팽만감 / 수축을 나타낼 수 있습니다. 청색광 (450-490 nm 파장)에 의한 여기는 혈류 방향성의 시각화를 허용하며, 개별 적혈구 (보충 영화 1, 보충 영화 3 및 보충 영화 5)를 구별 할 수 있습니다. 백혈구는 녹색 빛 (530-560 nm 파장, 보충 영화 2, 보충 영화 4 및 보충 영화 6)에 의한 자극시 명확하게 식별 될 것입니다. 이미징 및 흡입 윈도우의 제거 완료 후, 도 3B에 도시된 바와 같이, 영상화된 영역 내에는 없더라도 폐 표면의 약간의 타박상이 있을 수 있다.
몇 가지 기술적 과제가 실험적 생존력을 방해할 수 있습니다. 폐 표면에 혈액이 축적되면 진공 안정화가 손상되고 채널이 막힐 수도 있습니다. 이를 피하려면 각 수술 단계에서 극도의주의를 기울여야합니다. 지나치게 높은 진공 압력은 폐를 손상시키고 미세 순환에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 폐포 정체 또는 폐 표면의 과도한 타박상으로 식별 할 수 있으며 (그림 3C) 진공 펌프의 압력을 줄임으로써 해결할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 정맥 내 형광단 주사의 오류는 백혈구 밀매 및 혈류의 가난한 시각화로 이어질 수 있습니다.
프로토콜의 완료 후, 블라인드 수동 분석은 이전 문헌28로부터 적응된 방식으로 피지21을 사용하여 수행되었다. 다섯 개의 정맥, 세동맥 및 관심 있는 모세관 영역(ROIs)을 각 동물로부터 분석하였다. 정맥 및 세동맥에서의 백혈구 부착은 내피 표면의 면적당 관찰의 30 s 동안 혈관 내피에 부착되어 남아있는 세포의 수로 정의되었다. 이것은 셀 / mm 2에서 중계됩니다. 모세혈관에서의 백혈구 부착은 총 분석 면적당 30 s의 관찰 동안 혈관 내피에 부착되어 남아 있는 ROI 내 세포의 수로서 정의되었다. 이것은 또한 셀 / mm 2에서 중계됩니다. 백혈구 압연은 30s 관찰 기간 동안 용기 내에서 기준점을 통과하는 세포 수의 두 배로 정의되었다. 자유롭게 흐르는 백혈구는 통과 속도와 적혈구 흐름의 속도를 비교하여 제외되었으며, 이는 세포 / 분으로 중계됩니다. 미세순환 관류를 측정하기 위해, FCD는 관찰 영역 당 적혈구-관류 모세혈관의 길이의 합으로 정의되었다. 이것은 cm / cm2로 릴레이됩니다. 각 파라미터는 각 동물에 대한 평균값으로 보고됩니다.
백혈구 모집의 일반적인 경향은 폐 정맥에서 관찰되었으며, LPS 처리 마우스에서 순진한 마우스에 비해 접착 및 롤링이 증가했다 (그림 4C, D). 이러한 경향은 동맥 백혈구 부착에 의해 되풀이되었지만, 압연 및 부착의 두 수준 모두 순진한 그룹에서 매우 가변적이었다 (그림 5C, D). 주목할 만하게, LPS 투여는 폐 모세관 ROIs에서 백혈구 부착의 실질적인 증가를 가져왔다 (도 6C). LPS 마우스는 또한 순진한 마우스에 비해 감소된 FCD를 입증하였다(도 7C). 폐모세혈관 내의 이러한 효과는 다양한 염증 자극 4,5,16에 따른 시야당 면역 세포의 증가 및 정상 모세관 관류의 혼란을 확인하는 이전 문헌과 일치한다.
그림 1: 폐 영상 시스템. 주문 주문 시스템은 (1) 양극 산화 처리된 금속 베이스, (2) 이미징 윈도우, (3) 진공 유입구, (4) 미세 조작기를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 수술 준비 . (A) 마우스는 오른쪽 측면 욕창 위치에서 IVM 플랫폼에 고정된다. (B) 흉곽은 혈역학을 보존하기 위해 둔한 해부를 사용하여 노출된다. (C) 흉부 절제술은 왼쪽 폐를 노출시키기 위해 수행된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 진공 안정화. (A) 진공 이미징 창의 적용은 폐 표면을 안정화시킵니다. (B) 75mmHg 미만의 진공 압력을 활용하면 폐, 특히 영상화된 영역 내에서 폐의 손상을 최소화할 수 있습니다. (C) 진공 압력이 높을수록 상당한 타박상이 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 폐 정맥에서의 백혈구 밀매. 로다민 6G의 여기는 부착성 및 롤링 백혈구의 시각화를 허용합니다. 윤곽이 그려진 영역은 (A) 순진한 및 (B) LPS 처리된 마우스에서 FITC-알부민의 여기 에 의해 확인된 바와 같이 혈관 내피의 분석된 부분을 나타낸다. (C,D) 비강 내 LPS 투여는 폐 정맥의 백혈구 압연 및 부착에 영향을 미칩니다. 값은 SD± 평균으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 폐 세동맥에서 백혈구 밀매. 로다민 6G의 여기는 부착성 및 롤링 백혈구의 시각화를 허용합니다. 윤곽이 그려진 영역은 (A) 순진한 및 (B) LPS 처리된 마우스에서 FITC-알부민의 여기 에 의해 확인된 바와 같이 혈관 내피의 분석된 부분을 나타낸다. (C,D) 비강 내 LPS 투여는 폐 세동맥의 백혈구 압연 및 부착에 영향을 미칩니다. 값은 SD± 평균으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 폐 모세혈관에서 부착성 백혈구. 로다민 6G의 여기는 (A) 순진한 및 (B) LPS 처리 마우스에서 ROI 내의 백혈구의 시각화를 허용합니다. (C) 비강 내 LPS 투여는 LPS 처리된 마우스에서 백혈구 부착에 영향을 미친다. 값은 SD± 평균으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 폐 모세관 기능. FITC-알부민의 여기 (A) 순진한 및 (B) LPS 처리 마우스에서 ROI 내의 모세관 혈류의 시각화를 허용합니다. (C) 비강 내 LPS 투여는 폐 모세혈관에서 FCD에 영향을 미친다. 값은 SD± 평균으로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 : 3D 인쇄 가능한 IVM 플랫폼을위한 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 진공 시스템의 다이어그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 1 : 폐 정맥의 혈류 샘플 비디오. 녹색 화살표는 혈류의 방향을 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 2 : 폐 정맥에서 백혈구 밀매의 샘플 비디오. 빨간색 화살표는 혈관 내의 부착성 백혈구를 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 3 : 폐 동맥의 혈류에 대한 샘플 비디오. 녹색 화살표는 혈류의 방향을 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 4 : 폐 동맥에서 백혈구 밀매의 샘플 비디오. 빨간색 화살표는 혈관 내의 부착성 백혈구를 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 5 : 폐 모세 혈관의 혈류 샘플 비디오. 녹색 화살표는 적혈구 관류 모세 혈관의 몇 가지 잘 시각화 된 영역을 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 영화 6 : 폐 모세 혈관에서 백혈구 밀매의 샘플 비디오. 빨간색 화살표는 시야 내에서 부착성 백혈구를 나타냅니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따뜻한 식염수로 씻어 낼 수는 있지만 그렇게하면 깨지기 쉬운 폐 조직이 손상 될 위험이 있습니다.
삽관 후, 마우스를 IVM 플랫폼으로 옮기는 동안, 캐뉼러는 때때로 변위될 수 있다. 이를 방지하려면 캐뉼라를 마우스의 앞니에 묶거나 입 주위의 피부에 봉합하는 것을 고려하십시오. 압력 조절 환기를 사용하는 경우 절차 전반에 걸쳐 조력량을주의 깊게 모니터링해야합니다. 약 0.20 mL에서 일정하게 유지되어야하며, 상당히 낮은 값 (예 : ~ 0.10 mL)은 단일 폐 환기를 나타낼 수 있습니다. 이 경우 기관내 캐뉼라를 약간 철회하면 문제가 해결 될 수 있습니다. 흡입제 마취 (이소플루란)의 사용은 마우스가 환기되는 동안 마취 깊이의 조절을 용이하게합니다. 다른 마취 수단 (예 : 정맥 내 케타민 / 자일라진10,11)은 다른 실험실에서 사용되어 왔으며 각각은 각각의 장점과 단점을 가지고 있습니다.
수술 중에는 혈관이 절단 될 위험을 최소화하기 위해 무딘 해부가 사용됩니다. 이것은 어깨 근처의 두껍고 심하게 혈관화 된 지방 조직을 해부 할 때 특히 중요합니다. 흉곽의 절제술은 속도와 정확성을 모두 필요로합니다. 소작기의 열은 과도하게 사용하면 폐를 태울 정도로 강렬합니다. 흉곽을 절제할 때 폐와 흉벽 사이에 빈 공간이 있어야합니다. 폐가 흉벽에 달라 붙으면 흉곽 케이지 바깥쪽을 가볍게 누르면 기저 정수리 흉막에 대한 접착이 촉진됩니다. 또는 둔탁한 바늘을 사용하여 방출을 용이하게하기 위해 폐와 흉곽 사이에 소량의 따뜻한 식염수를 주입하십시오. 창 암을 3시 위치에 놓으면 이미징 중에 갈비뼈에 원치 않는 압력이 가해지지 않도록 하는 것이 좋습니다(그림 3A). 또한 현미경 조작기와 현미경 목표 사이에 더 많은 여유 공간을 남겨 두어 조작에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 이미징 윈도우를 낮출 때, 가장자리와의 접촉이 이미징 동안 부적절한 밀봉 및 과도한 모션 아티팩트를 초래할 것이기 때문에 폐의 중앙 영역을 표적으로 하는 것이 중요하다. 또한 창을 낮추려는 여러 번 시도하면 폐가 손상 될 수 있습니다. 마찬가지로, 분리 및 재안정화의 사이클은 폐 손상에 기여하고 실험적 정확성을 손상시킬 수 있습니다. 그러나 올바르게 수행 될 때, 여기에 제시된 준비는 20x 목표의 고해상도 생체 내 이미징을 가능하게하기에 충분히 안정적입니다.
이미징 창 내의 진공 채널의 오염 및 막힘을 방지하기 위해 엄격한 청소 프로토콜이 필요합니다. 실험 직후에 30 G 바늘을 사용하여 증류수로 반복적으로 플러시하는 것이 대부분의 오염 물질을 제거하는 데 효과적입니다. 이것은 농축 된 에탄올로 플러시하고 수분을 제거하기 위해 진공 라인에 다시 부착하기 전에 증류수로 최종 플러시합니다. 아세톤 또는 강한 세제를 사용하는 것은 심각한 막힘이 발생할 경우 해결하기에 적절할 수 있습니다.
특히, 이 프로토콜은 다른 보고된 방법들(4,11)에 비해 더 높은 진공 압력의 판독값을 이용하며, 이것은 폐 조직의 손상에 대한 우려를 제기할 수 있다. 그러나 중요한 차이점은 여기에 사용 된 디지털 게이지는 진공 펌프에서만 압력을 측정한다는 것입니다. 이 압력은 폐의 더 큰 표면적에 걸쳐 분포하기 전에 좁은 튜브와 이미징 윈도우 자체의 매우 좁은 채널을 통해 전달됩니다. 이와 같이, 영상화된 영역에 대한 손상의 증거는 생체내 세션 이후의 이들 실험에서 관찰되지 않았다. 또한, 영상화 된 폐포는 갯벌 팽창과 수축을 나타 냈으며,이 생리 학적 현상이 크게 중단되지 않았 음을 나타냅니다.
생체 내에서 질병을 연구하기위한 도구로서 폐 IVM의 인기가 높아지고 있음에도 불구하고,이 기술에는 한계가 있습니다. 첫째, 수술의 침습적 및 말단 특성은 마우스의 생리적 상태에 무시할 수 없는 효과를 유도하고 절차를 단일 이미징 세션으로 제한한다. 그러나, 몇몇 종방향 폐 IVM 접근법이 개발되었다는 점에 유의해야 한다(30). 둘째, 기계적 환기의 사용은 인공호흡기 관련 폐 손상(VALI)31의 정도를 유도할 수 있지만, 이는 절차의 짧은 기간에 의해 제한된다. 셋째, 내장 흉막과 유리 커버슬립 사이의 접촉과 진공 압력의 적용은 미세 혈관 혈류의 변화를 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 아마도 이 접근법의 가장 중요한 한계는 영상화가 전체 폐(32)를 대표하지 않는 비의존성 폐 영역에서 흉막하 폐포로 제한된다는 것이다.
요약하면, 이 프로토콜은 생체내 형광 현미경을 사용하여 폐 미세혈관구조에서 백혈구-내피 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 이러한 실험은 이전의 연구를 기반으로 선택된 급성 모델인 내독소-유도 폐 손상을 사용하지만, 이 프로토콜은 또한 폐의 다른 병리학적 및 생리학적 과정을 연구하기 위해 적용될 수 있다. 또한, 여기에 채택된 폐 영상 시스템은 다양한 현미경 접근법에 적용 가능하며, 이미징 윈도우는 높은 수치 개구부 오일 침지 목표를 수용하기에 충분히 크다. 따라서, 기술된 절차는 폐 미세순환에 대한 다양한 질병 상태의 영향에 대한 추가의 연구를 용이하게 한다.
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Disclosures
Kamala D. Patel 박사는 Luxidea의 사장이자 공동 설립자이며,이 실험에서 활용 된 이미징 창을 구입 한 기업입니다.
Acknowledgments
저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
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