Summary
Прижизненная флуоресцентная микроскопия может быть использована для изучения лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий и капиллярной перфузии в режиме реального времени. Этот протокол описывает методы изображения и количественной оценки этих параметров в легочной микроциркуляции с использованием вакуум-стабилизированной системы визуализации легких.
Abstract
Прижизненная визуализация взаимодействий лейкоцитов и эндотелия дает ценную информацию об иммуноопосредованных заболеваниях у живых животных. Изучение острого повреждения легких (АЛИ)/острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) и других респираторных патологий in vivo затруднено из-за ограниченной доступности и присущих легким артефактов движения. Тем не менее для преодоления этих проблем были разработаны различные подходы. Данный протокол описывает метод прижизненной флуоресцентной микроскопии для изучения в реальном времени лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в легочной микроциркуляции в экспериментальной модели ALI. Система визуализации легких in vivo и 3D-печатная платформа прижизненной микроскопии используются для защиты анестезированной мыши и стабилизации легкого, сводя к минимуму запутанное повреждение легких. После подготовки широкоугольная флуоресцентная микроскопия используется для изучения адгезии лейкоцитов, катания лейкоцитов и функции капилляров. Хотя протокол, представленный здесь, фокусируется на визуализации в острой модели воспалительного заболевания легких, он также может быть адаптирован для изучения других патологических и физиологических процессов в легких.
Introduction
Прижизненная микроскопия (IVM) является полезным инструментом визуализации для визуализации и изучения различных биофизических процессов in vivo. Легкое очень сложно изобразить in vivo из-за его закрытого расположения, хрупкой природы его ткани и артефактов движения, вызванных дыханием и сердцебиением 1,2. Различные установки прижизненной микроскопии (IVM) были разработаны для визуализации в режиме реального времени взаимодействий лейкоцитов и эндотелия в микроциркуляции легких для преодоления этих проблем. Такие подходы основаны на хирургическом обнажении и стабилизации легких для визуализации.
Животные обычно готовятся к IVM легких хирургическими процедурами. Во-первых, животных интубируют и вентилируют, что позволяет хирургическое иссечение грудного окна и последующие вмешательства для стабилизации легкого для визуализации. Один из методов включает в себя приклеивание паренхимы на стеклянную крышку3, процедуру, которая рискует значительной физической травмой изображенной ткани. Более продвинутым является использование вакуумной системы для стабилизации легких под стеклянным окном4. Эта установка облегчает свободное прилипание поверхности легкого к покровному листу через обратимый вакуум, распределенный по большой локальной области, и расширяет легкое, в то же время ограничивая движение в размерах x, y и z4. Вакуум применяется равномерно через канал, окружающий область визуализации установки, и втягивает ткань в неглубокую коническую область, обращенную к крышке4 класса визуализации. Через это смотровое окно микроциркуляция легких может быть изучена с использованием различных оптических методов визуализации.
IVM легких позволяет проводить количественную визуализацию множества микроциркуляторных параметров. К ним относятся такие измерения, как скорость и длина трека лейкоцитов5, скорость кровотока эритроцитов6 и оксигенация7, метастазы опухоли8, различие субпопуляций иммунных клеток 9,10,11, визуализация микрочастиц12, альвеолярная динамика13,14, проницаемость сосудов15 и капиллярная функция16 . Основное внимание здесь уделяется рекрутированию лейкоцитов и функции капилляров. Начало рекрутирования лейкоцитов в легочной микроциркуляции включает в себя преходящие скользящие взаимодействия и твердые адгезивные взаимодействия между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, оба из которых увеличиваются в воспалительных состояниях16,17. Как правило, прокатка количественно определяется количеством лейкоцитов, которые проходят определенную оператором контрольную линию, в то время как адгезия количественно определяется количеством лейкоцитов, которые неподвижны на эндотелии16. Капиллярная функция также может быть затронута в воспалительных состояниях, что часто приводит к снижению перфузии. Это можно объяснить несколькими факторами, включая снижение деформируемости эритроцитов18 и пеструю экспрессию индуцируемой NO-синтазы эндотелиальными клетками, что приводит к патологическому шунтированию19. Как правило, совокупная длина перфузированных капилляров на площадь измеряется и сообщается как функциональная плотность капилляров (FCD).
Изучение рекрутирования лейкоцитов в легких в режиме реального времени требует маркировки биологических мишеней флуоресцентными красителями или флуоресцентно-мечеными антителами20. Альтернативно, различные трансгенные мышиные штаммы, такие как лизоцим M-зеленого флуоресцентного белка (LysM-GFP) мышей, могут быть использованы для изображения специфических подмножеств иммунных клеток, таких как нейтрофилы21,22. Флуоресцентно меченые лейкоциты затем могут быть визуализированы с использованием широкоугольной флуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии или многофотонной микроскопии. Эти методы достигают контраста, используя определенные длины волн возбуждения и обнаруживая излучаемую флуоресценцию, одновременно блокируя обнаружение длины волны возбуждения, тем самым выделяя меченый объект.
Существующие исследования, касающиеся количественной оценки катания лейкоцитов, адгезии и функциональной плотности капилляров в легких мышей, опирались в основном на ручной видеоанализ. Это стало возможным благодаря программному обеспечению с открытым исходным кодом, такому как Fiji 6,23, проприетарному программному обеспечению, такому как CapImage12, или индивидуальным системам обработки изображений24. И наоборот, различные проприетарные программные платформы (например, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) позволяют автоматически измерять широкий спектр других физиологических параметров, включая многие из ранее упомянутых здесь 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Важные наблюдения были сделаны относительно патологии острого повреждения легких (АЛИ) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) с использованием ЛВМ легких. ОРДС характеризуется множеством патофизиологических процессов в легких, включая отек легких и повреждение альвеоляров, вызванное дисфункцией эндотелия и эпителиального барьера25. Используя мышиную модель, было обнаружено, что АЛИ, индуцированный сепсисом, связан со значительными пагубными изменениями в торговле иммунными клетками в легочной среде26. Было обнаружено, что нейтрофилы, набранные в капилляры мышей с ALI, вызванным сепсисом, препятствуют микроциркуляции, тем самым увеличивая гипоксию в ALI26. Кроме того, IVM был использован для получения информации о базовом механизме восстановления после начала ARDS27. IVM легких также был ценным инструментом в понимании патофизиологических изменений при различных обструктивных заболеваниях легких. Например, визуализация транспорта слизи при таких заболеваниях, как муковисцидоз (МВ) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), облегчила изучение новых и существующих методов лечения клиренса слизи28. Также проанализирован оборот лейкоцитов в этих условиях17.
Этот протокол расширяет подход, первоначально описанный Lamm et al.29 для изучения лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий с использованием обычной флуоресцентной микроскопии. В описанных процедурах используется система визуализации легких in vivo , которая включает в себя металлическую основу размером 16,5 см х 12,7 см, микроманипулятор и вакуумное окно визуализации (рисунок 1). Система смонтирована в 3D-печатной платформе размером 20 см х 23,5 см (дополнительный файл 1) для обеспечения надежного крепления для трубки вентилятора и грелки. Этот метод предлагает воспроизводимую и поддающуюся количественной оценке визуализацию микроциркуляции легких мышей in vivo. Подробно объясняются важные аспекты хирургической подготовки, а также правильное использование вакуумно-стабилизированной системы визуализации легких. Наконец, экспериментальная модель ALI используется для обеспечения репрезентативной визуализации и анализа измененного катания лейкоцитов, адгезии лейкоцитов и капиллярной перфузии, связанной с воспалением. Использование этого протокола должно способствовать дальнейшим важным исследованиям патофизиологических изменений в микроциркуляции легких во время острых болезненных состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные здесь, были выполнены с предварительного одобрения Комитета по лабораторным животным Университета Далхаузи (UCLA).
1. Подготовка
- Система визуализации легких: Чтобы подготовить окно, введите тонкий слой вакуумной смазки в верхнюю часть наружного кольца, избегая загрязнения вакуумного канала. Поместите на окно чистую стеклянную крышку диаметром 8 мм и осторожно надавите вниз, чтобы создать уплотнение.
- Широкоугольный флуоресцентный микроскоп: Выполняйте визуализацию с помощью обычного широкоугольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом на большом рабочем расстоянии 20x /0,40 и черно-белой камерой с зарядовой связью (CCD) с частотой кадров 25 кадров в секунду. Примените полосовой фильтр возбуждения 530-550 нм для возбуждения родамина-6G и полосовой фильтр 460-490 нм для возбуждения изотиоцианата флуоресцеина (FITC).
- Вакуумная система: Подключите окно визуализации к вакуумному насосу, оснащенному цифровым манометром, способным обеспечить постоянное всасывание 50-60 мм рт.ст., как показано на дополнительном рисунке 1. Короче говоря, подключите окно визуализации к насосу через полиэтиленовую трубку 1,0 мм I.D., полиэтиленовую трубку 1,0 см I.D., вакуумную колбу и встроенный фильтр 0,2 мкм.
- Вентилятор: Установите небольшой вентилятор для грызунов для обеспечения вентиляции под давлением со скоростью и объемом, рассчитанными на основе веса мыши. Обеспечить положительное давление в конце выдоха (PEEP) при 5 смН2О на время эксперимента и установить целевое давление на уровне 20 смН2О.
- Анестетик: Используя систему доставки анестезии с низким потоком, заправьте шприц объемом 5,0 мл 99,9% изофлурана. Используйте систему очистки отработанных газов, чтобы свести к минимуму риск вдыхания хирургом.
2. Анестезия
- Поместите 20-25 г 12-недельного самца мыши C57Bl/6 в индукционную камеру анестезии. Когда камера надежно закрыта, начните индукцию с газообразного изофлурана в концентрации 3% и скорости потока 500 мл/мин.
- После того, как мышь обезболивается (визуализируется замедленной скоростью дыхания), перенесите ее на подставку для интубации и закрепите верхние резцы на подвесном шве.
- Затяните шов, чтобы закрепить морду внутри носового конуса. Начинают поток газа через носовой конус в концентрации 2,5%.
- Подтвердите адекватную глубину анестезии с помощью защемления пальцев ног, прежде чем переходить к следующему этапу.
3. Интубация
- Поверните подставку так, чтобы задняя часть подставки и спинная сторона мыши повернулись лицом к хирургу.
- Пропустите наконечник волоконно-оптического кабеля длиной 20 см через эндотрахеальную канюлю весом 20 Г и погрузите наконечник в Лидокаин HCl (1%), чтобы облегчить прохождение кабеля через гортань.
- Используя тупые щипцы, поднимите нижнюю челюсть и сдвиньте язык, чтобы обеспечить свободный проход в дыхательные пути.
- Вставьте модифицированный отоскоп (~ 60° окружности зеркала удалено) таким образом, чтобы верхние резцы помещались в зазор в зеркале. Отрегулируйте прицел и положение языка до тех пор, пока не появится надгортанник, а голосовые связки не станут хорошо видны.
- Вставьте волоконно-оптический кабель, нагруженный эндотрахеальной канюлей, через зазор в зеркале и в гортань. Используя небольшие круговые движения, пропустите кабель через голосовые связки и в трахею.
- Протолкните канюлю по волоконно-оптическому кабелю, проходя между голосовыми связками и в трахею.
4. Вентиляция
- Извлеките мышь из подставки для интубации и поместите ее на грелку в правом боковом пролежневом положении.
- Подключите канюлю к трубке вентилятора и запустите вентилятор. Уменьшите концентрацию анестетика до 1,5% и контролируйте глубину, проверив на педальный рефлекс. Если рефлекс сохраняется, увеличивайте концентрацию постепенно до 2%.
- Поместите слезный гель в глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание.
- Используя медицинскую ленту, прикрепите канюлю к морде. С помощью этикетировочной ленты закрепите правую переднюю опору на грелке примерно в положении «9 часов». Вытяните левую заднюю лапу каудально и закрепите, приблизительно, в положении «6 часов».
- Используя тканевую ленту, слегка растяните левую переднюю опору до положения «12 часов» и закрепите другой конец ленты в верхней части платформы IVM, как показано на рисунке 2А (сохранение небольшого натяжения здесь облегчает последующую торакотомию).
- Вставьте ректальный датчик температуры и закрепите его, приклеив его к грелке. Поместите пульсоксиметр на правую заднюю лапу и прикрепите к грелке, следя за тем, чтобы не нарушить кровообращение.
- Как только температура стабилизируется при 37,0 °C ± 0,1 °C, приступайте к выполнению торакотомии.
5. Торакотомия
- Стерилизуйте грудную клетку и живот 70% спиртовой салфеткой. Нанесите легкий слой минерального масла, чтобы смочить волосы с левой стороны мыши — от грудины до позвоночного столба и от плеча до нижней части грудной клетки.
- Тупыми щипцами и прямыми ножницами сделайте небольшой продольный разрез возле дна грудной клетки, чтобы обнажить нижележащий мышечный слой.
- Двигаясь вентрально, используйте тупое рассечение, чтобы отделить эпителиальную и жировую ткань от мышечного слоя. Прижигайте любые открытые кровеносные сосуды. После того, как риск кровопотери был смягчен, продлите исходный разрез вентрально до тех пор, пока не наступит мечевидный отросток.
- Повторяют этот процесс до тех пор, пока ~5 мм не пройдет сбоку от позвоночного столба.
- Двигаясь краниально, используйте тупое рассечение, чтобы обнажить грудную клетку. Прижигайте любые открытые кровеносные сосуды для сохранения гемодинамической стабильности.
- Как только риск кровопотери будет уменьшен, расширьте разрез от мечевидного отростка до подмышечной впадины.
- Повторяют этот процесс на спинной стороне разреза до ~1 см ниже левого уха.
- Используя гемостатические щипцы, захватите рассеченную эпителиальную и жировую ткань и поместите подальше от хирургической области (рисунок 2B).
- Вводят раствор родамина-6G (0,5 мг/мл; 1,5 мл/кг) для визуализации лейкоцитов и бычьего FITC-альбумина (50 мг/мл; 1 мл/кг) для визуализации перфузии капилляров через хвостовую вену.
- Используя зубчатые щипцы, захватите ребро сразу же ниже положения основания легкого на конце вдоха и слегка втяните, чтобы оттянуть ребро от легкого. Отрежьте ребро, чтобы вызвать пневмоторакс.
- Вытяните разрез в боковом направлении вдоль межреберной мышцы в обоих направлениях, следя за тем, чтобы не коснуться открытой поверхности легкого.
- Используя тупые щипцы, захватите следующее самое высокое ребро и слегка втяните, чтобы позволить легкому отпасть от грудной стенки. Если легкое не отделяется, слегка прижмите стенку грудной клетки к легкому, чтобы заставить легкое прилипнуть к нижележащей плевре и, таким образом, легче отпасть.
- Продолжайте исходный разрез вентрально до грудины и черепно до тех пор, пока верхушка легкого не будет открыта. Используйте хлопковые аппликаторы и марлю, чтобы ослабить любое кровотечение, которое возникает.
- Поднимите грудную клетку, чтобы обнажить межреберные кровеносные сосуды на дорсальном аспекте грудной полости. Заботясь о том, чтобы не повредить легкое, прижигают самый нижний межреберный сосуд рядом с позвоночным столбом, а затем перерезают ребро. Двигаясь черепно и вентрально, повторяйте до тех пор, пока часть грудной клетки размером примерно 1 см х 1,5 см не будет иссечена (рисунок 2C).
- Удалите все избыточные скопления жидкости в грудной полости с помощью капиллярного действия, используя небольшие полоски марли.
- Приступая к микроскопии, дайте ~ 5 мин для интраплевральной жидкости рассеяться для более безопасного интерфейса между легким и окном визуализации.
6. Микроскопия
- Включите вакуумный насос и отрегулируйте давление до ~50–60 мм рт.ст.
- Перенесите платформу IVM на ступень микроскопа. Расположите металлический столб и микроманипулятор таким образом, чтобы окно визуализации находилось непосредственно над открытым легким, а оконный рычаг приближался к легкому примерно из положения «3 часа».
- Используя микроманипулятор, осторожно опустите окно визуализации, пока оно не прилипнет и не стабилизирует поверхность легких (рисунок 3А).
- Используя объектив 20x и полосовой фильтр возбуждения 460-490 нм, определите легочную вену на основе конвергентной картины кровотока. Центрируйте судно в поле зрения и записывайте 30 с видео.
- Переключитесь на полосовой фильтр возбуждения 530-550 нм и запишите 30 с видео в том же поле зрения.
- Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока не будут сфотографированы пять легочных венул.
- Используя полосовой фильтр возбуждения 460-490 нм, определите легочную артериолу на основе дивергентной картины кровотока. Центрируйте судно в поле зрения и записывайте 30 с видео.
- Переключитесь на полосовой фильтр возбуждения 530-550 нм и запишите 30 с видео в том же поле зрения.
- Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока не будут сфотографированы пять легочных артериол.
- Используя полосовой фильтр возбуждения 460-490 нм, найдите область альвеол и капилляров, не пересекаемую более крупными сосудами, и запишите 30 с видео.
- Переключитесь на полосовой фильтр возбуждения 530-550 нм и запишите 30 с видео в том же поле зрения.
- Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока не будут сфотографированы пять капиллярных областей.
7. Протокол эвтаназии и очистки
- Извлеките платформу IVM со сцены микроскопа и отрегулируйте доставку изофлурана до 5% в течение 5 минут, чтобы усыпить мышь.
- Во время ожидания отбросьте защитное стекло и отсоедините окно изображения от платформы. Очистите окно визуализации небольшой щеткой и используйте шприц весом 30 г, вставленный в канал, чтобы промыть его несколько раз дистиллированной водой. Затем промыть 95% этанолом с помощью вакуумного насоса.
- По истечении 5 минут остановите аппарат ИВЛ и обеспечьте полную эвтаназию через вывих шейки матки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать результаты, достижимые с помощью этого протокола, острое повреждение легких (ALI) было индуцировано за 6 ч до визуализации с использованием модели интраназальной инстилляции бактериального липополисахарида (ЛПС). Вкратце, мышей (n = 3) анестезировали изофлураном, а небольшие капли ЛПС из Pseudomonas aeruginosa в стерильном физиологическом растворе (10 мг/мл) пипетировали в левый нарис в дозировке 5 мг/кг. Это сравнивали с наивными мышами (n = 3; без интраназального введения).
После визуализации успешная хирургическая подготовка идентифицируется по нескольким факторам. Легкое должно быть относительно стабильным с дыханием, вызывающим циклические сдвиги кадров не более 25 мкм. Альвеолы должны быть хорошо видны и могут проявлять приливное растяжение/сокращение. Возбуждение синим светом (длина волны 450-490 нм) позволит визуализировать направленность кровотока, и можно будет различать отдельные красные кровяные клетки (Дополнительный фильм 1, Дополнительный фильм 3 и Дополнительный фильм 5). Лейкоциты будут четко идентифицированы при возбуждении зеленым светом (длина волны 530-560 нм, дополнительный фильм 2, дополнительный фильм 4 и дополнительный фильм 6). После завершения визуализации и удаления всасывающего окна могут возникнуть незначительные синяки поверхности легких, хотя и не в пределах изображенной области, как показано на рисунке 3B.
Некоторые технические проблемы могут помешать экспериментальной жизнеспособности. Накопление крови на поверхности легких поставит под угрозу стабилизацию вакуума и может даже закупорить канал. Чтобы избежать этого, следует проявлять крайнюю осторожность во время каждого хирургического этапа. Чрезмерно высокое вакуумное давление может повредить легкие и повлиять на микроциркуляцию. Это может быть идентифицировано альвеолярным застоем или чрезмерными синяками на поверхности легких (рисунок 3C) и может быть исправлено путем снижения давления от вакуумного насоса. Кроме того, ошибки при внутривенном введении флуорофора могут привести к плохой визуализации трафика лейкоцитов и кровотока.
После завершения протокола слепой ручной анализ проводился с использованием Фиджи21 способом, адаптированным из предыдущей литературы28. Пять венул, артериол и капиллярных областей, представляющих интерес (ROI), были проанализированы у каждого животного. Адгезия лейкоцитов в венулах и артериолах определялась как количество клеток, которые остаются прилипшими к эндотелию сосудов в течение 30 с наблюдения на площадь эндотелиальной поверхности. Это передается в ячейках/мм2. Адгезия лейкоцитов в капиллярах определялась как количество клеток в пределах ROI, которые остаются прилипшими к эндотелию сосудов в течение 30 с наблюдения на общую анализируемую область. Это также передается в ячейках/мм2. Перекачка лейкоцитов определялась как удвоенное количество клеток, проходящих контрольную точку в сосуде в течение 30-х годов периода наблюдения. Свободно текущие лейкоциты были исключены путем сравнения скорости прохождения с скоростью кровотока эритроцитов, и это передается в клетках / мин. Для измерения микроциркуляторной перфузии FCD был определен как сумма длин капилляров, перфузированных эритроцитами, на область наблюдения. Это передается в см/см2. Каждый параметр сообщается как среднее значение для каждого животного.
Общая тенденция рекрутирования лейкоцитов наблюдалась в легочных венулах, с повышенной адгезией и катанием у мышей, получавших ЛПС, по сравнению с наивными (рисунки 4C, D). Эта тенденция была повторена артериолярной лейкоцитарной адгезией, хотя как уровни прокатки, так и адгезии были сильно изменчивы в наивной группе (рисунки 5C, D). Примечательно, что введение ЛПС привело к существенному увеличению адгезии лейкоцитов в легочных капиллярных ROI (рисунок 6C). Мыши LPS также продемонстрировали снижение FCD по сравнению с наивными мышами (рисунок 7C). Эти эффекты в легочных капиллярах согласуются с предыдущей литературой, определяющей увеличение иммунных клеток в зависимости от поля зрения и нарушение нормальной капиллярной перфузии после различных воспалительных стимулов 4,5,16.
Рисунок 1: Система визуализации легких. Система по индивидуальному заказу включает в себя (1) анодированную металлическую основу, (2) окно визуализации, (3) вакуумный вход, (4) микроманипулятор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Хирургическая подготовка. (А) Мышь закреплена на платформе IVM в правом боковом пролежневом положении. (B) Грудную клетку обнажают с помощью тупого рассечения для сохранения гемодинамики. (C) Торакотомия проводится для обнажения левого легкого. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Вакуумная стабилизация. (А) Применение вакуумного окна визуализации стабилизирует легочную поверхность. (B) Использование вакуумного давления ниже 75 мм рт.ст. сводит к минимуму повреждение легких, особенно в пределах изображенной области. (C) Более высокое вакуумное давление может привести к значительным синякам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Незаконный оборот лейкоцитов в легочных венулах. Возбуждение родамина 6G позволяет визуализировать адгезивные и катящиеся лейкоциты. Очерченные области представляют собой проанализированные участки эндотелия сосудов, подтвержденные возбуждением FITC-альбумина у (A) наивных и (B) обработанных LPS мышей. (С,Г) Интраназальное введение ЛПС влияет на перекатывание и адгезию лейкоцитов в легочных венулах. Значения приведены как средние ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Незаконный оборот лейкоцитов в легочных артериолах. Возбуждение родамина 6G позволяет визуализировать адгезивные и катящиеся лейкоциты. Очерченные области представляют собой проанализированные участки эндотелия сосудов, подтвержденные возбуждением FITC-альбумина у (A) наивных и (B) обработанных LPS мышей. (С,Г) Интраназальное введение ЛПС влияет на перекатывание и адгезию лейкоцитов в легочных артериолах. Значения приведены как средние ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Адгезивные лейкоциты в легочных капиллярах. Возбуждение родамина 6G позволяет визуализировать лейкоциты в пределах ROI у (A) наивных и (B) обработанных LPS мышей. (C) Интраназальное введение ЛПС влияет на адгезию лейкоцитов у мышей, получавших ЛПС. Значения приведены как средние ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Функция легочного капилляра. Возбуждение FITC-альбумина позволяет визуализировать капиллярный кровоток в пределах ROI у (A) наивных и (B) обработанных LPS мышей. (C) Интраназальное введение ЛПС влияет на FCD в легочных капиллярах. Значения приведены как средние ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл: Файл для 3D-печатной платформы IVM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 1: Схема вакуумной системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный фильм 1: Образец видео кровотока в легочной венуле. Зеленая стрелка обозначает направление кровотока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 2: Образец видео о незаконном перемещении лейкоцитов в легочной венуле. Красные стрелки обозначают адгезивные лейкоциты внутри сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 3: Образец видео кровотока в легочной артериоле. Зеленая стрелка обозначает направление кровотока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 4: Образец видео о незаконном перемещении лейкоцитов в легочной артериоле. Красные стрелки обозначают адгезивные лейкоциты внутри сосуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 5: Образец видео кровотока в легочных капиллярах. Зеленые стрелки обозначают несколько хорошо визуализированных участков капилляров, перфузированных эритроцитами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный фильм 6: Образец видео о незаконном обороте лейкоцитов в легочных капиллярах. Красные стрелки обозначают адгезивные лейкоциты в поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол требует практики и внимания к нескольким критическим шагам. Во-первых, важно подготовить окно визуализации до начала интубации и операции. Используйте минимальное количество вакуумной смазки для покрытия наружного кольца окна визуализации, нанесите покровное стекло и испытайте всасывание каплей дистиллированной воды. Подготовка этого заранее предотвратит высыхание открытого легкого во время установки. Хотя можно промыть теплым физиологическим раствором, это может привести к повреждению хрупкой легочной ткани.
После интубации, при переносе мыши на платформу IVM, канюля может иногда смещаться. Чтобы предотвратить это, подумайте о том, чтобы привязать канюлю к передним зубам мыши или пришить ее к коже вокруг рта. При использовании вентиляции с контролируемым давлением, дыхательный объем следует тщательно контролировать на протяжении всей процедуры. Он должен оставаться стабильным на уровне приблизительно 0,20 мл, так как значительно более низкие значения (например, ~0,10 мл) могут указывать на однократную вентиляцию легких. Если это происходит, слегка втягивание эндотрахеальной канюли может решить проблему. Использование ингаляционной анестезии (изофлурана) облегчает контроль глубины анестезии во время вентиляции мыши. Другие средства анестезии (например, внутривенное введение кетамина/ксилазина10,11) использовались другими лабораториями, и каждое из них имеет свои соответствующие преимущества и недостатки.
Во время операции используется тупое рассечение, чтобы свести к минимуму риск разрыва кровеносных сосудов. Это имеет особое значение при рассечении толстой и сильно васкуляризированной жировой ткани вблизи плеча. Резекция грудной клетки требует как скорости, так и точности. Тепло от прижигателя достаточно интенсивно, чтобы сжечь легкое при чрезмерном использовании. При резецировании грудной клетки между легким и грудной стенкой должно быть пустое пространство. Если легкое прилипает к стенке грудной клетки, легкое надавливание на внешнюю сторону грудной клетки будет стимулировать спайку с нижележащей теменной плеврой. В качестве альтернативы, используйте тупую иглу для введения небольшого количества теплого физиологического раствора между легким и грудной клеткой, чтобы облегчить высвобождение. Рекомендуется размещать кронштейн окна в положении «3 часа», чтобы избежать нежелательного давления на ребра во время визуализации (рисунок 3А). Это также оставит больший зазор между микроманипулятором и объективом микроскопа, что облегчит доступ для манипуляций. При опускании окна визуализации крайне важно нацеливаться на центральную область легкого, так как контакт с краем приведет к неадекватному уплотнению и чрезмерному артефакту движения во время визуализации. Также многократные попытки опустить окно могут повредить легкое. Аналогичным образом, циклы отслоения и повторной стабилизации будут способствовать повреждению легких и могут поставить под угрозу экспериментальную точность. Однако при правильном выполнении препарат, представленный здесь, достаточно стабилен, чтобы обеспечить прижизненную визуализацию с высоким разрешением с целью 20x.
Строгий протокол очистки необходим для предотвращения загрязнения и закупорки вакуумного канала в окне визуализации. Использование иглы весом 30 г сразу после экспериментов для многократного промывки дистиллированной водой эффективно для удаления большинства загрязняющих веществ. За этим следует промывка концентрированным этанолом и окончательная промывка дистиллированной водой перед повторным подключением к вакуумной линии для удаления влаги. Использование ацетона или сильных моющих средств может быть достаточным для устранения серьезных закупорок, если они возникают.
Примечательно, что этот протокол использует более высокое считывание вакуумного давления по сравнению с некоторыми другими сообщенными методами 4,11, и это может вызвать опасения по поводу повреждения легочной ткани. Важным отличием, однако, является то, что цифровой манометр, используемый здесь, измеряет давление только в вакуумном насосе. Это давление подается через узкую трубку и чрезвычайно узкий канал самого окна визуализации перед распределением по большей площади поверхности легкого. Таким образом, в этих экспериментах после прижизненных сеансов не наблюдалось никаких доказательств повреждения изображенной области. Кроме того, изображенные альвеолы демонстрировали приливное растяжение и сокращение, что указывает на то, что это физиологическое явление не было значительно нарушено.
Несмотря на растущую популярность IVM легких как инструмента для изучения заболевания in vivo, существуют ограничения этой методики. Во-первых, инвазивный и терминальный характер операции вызывает непренебрежительное влияние на физиологическое состояние мыши и ограничивает процедуру одним сеансом визуализации. Однако следует отметить, что было разработано несколько продольных подходов IVM легких30. Во-вторых, использование искусственной вентиляции легких может вызвать определенную степень повреждения легких, связанного с вентилятором (VALI)31, хотя это ограничено короткой продолжительностью процедуры. В-третьих, контакт между висцеральной плеврой и стеклянным покровом и применение вакуумного давления могут привести к изменению микрососудистого кровотока. Наконец, возможно, наиболее существенным ограничением этого подхода является то, что визуализация ограничена субплевральными альвеолами в независимых легочных областях, которые не являются репрезентативными для всего легкого32.
Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения взаимодействия лейкоцитов и эндотелия в легочном микроциркуляторном русле с использованием прижизненной флуоресцентной микроскопии. Хотя в этих экспериментах используется эндотоксин-индуцированное повреждение легких, острая модель, которая была выбрана на основе предыдущих исследований, этот протокол также может быть адаптирован для изучения других патологических и физиологических процессов в легких. Кроме того, используемая здесь система визуализации легких применима к целому ряду подходов к микроскопии, а окно визуализации достаточно велико, чтобы вместить цели масляного погружения с высокой числовой апертурой. Таким образом, описанные процедуры должны способствовать дальнейшим исследованиям влияния различных болезненных состояний на легочную микроциркуляцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Камала Д. Патель является президентом и соучредителем Luxidea, предприятия, у которого было приобретено окно визуализации, используемое в этом эксперименте.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Пину Коларуссо, которая предоставила значительный опыт в редактировании и редактировании этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
References
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J.
