Summary
La microscopie à fluorescence intravitale peut être utilisée pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales et la perfusion capillaire en temps réel. Ce protocole décrit des méthodes pour imager et quantifier ces paramètres dans la microcirculation pulmonaire à l’aide d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide.
Abstract
L’imagerie intravitale des interactions leucocytaires-endothéliales offre des informations précieuses sur les maladies à médiation immunitaire chez les animaux vivants. L’étude des lésions pulmonaires aiguës (AIP)/syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et d’autres pathologies respiratoires in vivo est difficile en raison de l’accessibilité limitée et des artefacts de mouvement inhérents aux poumons. Néanmoins, diverses approches ont été développées pour surmonter ces défis. Ce protocole décrit une méthode de microscopie à fluorescence intravitale pour étudier en temps réel les interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire dans un modèle expérimental d’ALI. Un système d’imagerie pulmonaire in vivo et une plate-forme de microscopie intravitale imprimée en 3D sont utilisés pour sécuriser la souris anesthésiée et stabiliser le poumon tout en minimisant les lésions pulmonaires confondantes. Après la préparation, la microscopie à fluorescence à grand champ est utilisée pour étudier l’adhésion des leucocytes, le roulement des leucocytes et la fonction capillaire. Bien que le protocole présenté ici se concentre sur l’imagerie dans un modèle aigu de maladie pulmonaire inflammatoire, il peut également être adapté pour étudier d’autres processus pathologiques et physiologiques dans le poumon.
Introduction
La microscopie intravitale (MIV) est un outil d’imagerie utile pour visualiser et étudier divers processus biophysiques in vivo. Le poumon est très difficile à imager in vivo en raison de son emplacement fermé, de la nature fragile de ses tissus et des artefacts de mouvement induits par la respiration et le rythme cardiaque 1,2. Diverses configurations de microscopie intravitale (MIV) ont été développées pour l’imagerie en temps réel des interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire afin de surmonter ces défis. De telles approches sont basées sur l’exposition chirurgicale et la stabilisation du poumon pour l’imagerie.
Les animaux sont généralement préparés pour la MIV pulmonaire par des interventions chirurgicales. Tout d’abord, les animaux sont intubés et ventilés, ce qui permet l’excision chirurgicale d’une fenêtre thoracique et des interventions ultérieures pour stabiliser le poumon pour l’imagerie. Une technique consiste à coller le parenchyme sur un couvercle de verre3, une procédure qui risque de causer un traumatisme physique important au tissu imagé. Plus avancée est l’utilisation d’un système de vide pour stabiliser le poumon sous une fenêtre en verre4. Cette configuration facilite l’adhérence lâche de la surface du poumon au couvercle via un vide réversible réparti sur une grande zone locale et dilate le poumon tout en limitant le mouvement dans les dimensions x, y et z4. Le vide est appliqué uniformément à travers un canal entourant la zone d’imagerie de la configuration et tire le tissu dans une région conique peu profonde faisant face au couvercle4 de qualité d’imagerie. Grâce à cette fenêtre de visualisation, la microcirculation pulmonaire peut être étudiée à l’aide de diverses modalités d’imagerie optique.
La MIV pulmonaire permet l’imagerie quantitative d’une multitude de paramètres microcirculatoires. Il s’agit notamment de mesures telles que la vitesse et la longueur de la piste des leucocytes5, la vitessed’écoulement des globules rouges 6 et l’oxygénation7, les métastases tumorales8, la distinction des sous-populations de cellules immunitaires 9,10,11, la visualisation des microparticules12, la dynamique alvéolaire 13,14, la perméabilité vasculaire15 et la fonction capillaire16 . L’accent est mis ici sur le recrutement des leucocytes et la fonction capillaire. L’initiation du recrutement des leucocytes dans la microcirculation pulmonaire implique des interactions de roulement transitoires et des interactions adhésives fermes entre les leucocytes et les cellules endothéliales, qui sont toutes deux augmentées dans des conditions inflammatoires16,17. Typiquement, le laminage est quantifié par le nombre de leucocytes qui passent une ligne de référence définie par l’opérateur, tandis que l’adhérence est quantifiée par le nombre de leucocytes immobiles sur l’endothélium16. La fonction capillaire peut également être affectée dans les états inflammatoires, entraînant souvent une diminution de la perfusion. Cela peut être attribué à plusieurs facteurs, notamment une réduction de la déformabilité des globules rouges18 et l’expression panachée de la NO synthase inductible par les cellules endothéliales entraînant une dérivation pathologique19. En règle générale, la longueur agrégée des capillaires perfusés par zone est mesurée et rapportée en densité capillaire fonctionnelle (FCD).
L’étude du recrutement des leucocytes dans les poumons en temps réel nécessite de marquer des cibles biologiques avec des colorants fluorescents ou des anticorps marqués par fluorescence20. Alternativement, diverses souches de souris transgéniques telles que les souris lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) peuvent être utilisées pour imager des sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques tels que les neutrophiles21,22. Les leucocytes marqués par fluorescence peuvent ensuite être visualisés à l’aide de la microscopie à fluorescence à grand champ, de la microscopie confocale ou de la microscopie multiphotonique. Ces techniques permettent d’obtenir un contraste en utilisant des longueurs d’onde d’excitation spécifiques et en détectant la fluorescence émise tout en bloquant simultanément la détection de la longueur d’onde d’excitation, mettant ainsi en évidence l’objet étiqueté.
Les recherches existantes concernant la quantification du roulement des leucocytes, de l’adhérence et de la densité capillaire fonctionnelle dans le poumon murin reposent principalement sur l’analyse vidéo manuelle. Ceci est rendu possible grâce à des logiciels open source tels que Fiji 6,23, des logiciels propriétaires tels que CapImage12 ou des systèmes de traitement d’image sur mesure24. Inversement, diverses plates-formes logicielles propriétaires (par exemple, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permettent la mesure automatisée d’un large éventail d’autres paramètres physiologiques, y compris beaucoup de ceux mentionnés précédemment ici 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Des observations importantes ont été faites concernant la pathologie des lésions pulmonaires aiguës (AIP) et du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) à l’aide de la MIV pulmonaire. Le SDRA est caractérisé par une foule de processus physiopathologiques dans les poumons, y compris l’œdème pulmonaire et les dommages alvéolaires causés par un dysfonctionnement de l’endothélium et de la barrière épithéliale25. En utilisant un modèle murin, il a été constaté que la SA induite par la septicémie est associée à des changements préjudiciables importants dans le trafic de cellules immunitaires dans l’environnement pulmonaire26. Les neutrophiles recrutés dans les capillaires de souris atteintes d’ALI induite par la septicémie ont empêché la microcirculation, augmentant ainsi l’hypoxie dans l’ALI26. En outre, la MIV a été utilisée pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de réparation après l’apparition du SDRA27. La MIV pulmonaire a également été un outil précieux pour comprendre les changements physiopathologiques dans diverses maladies pulmonaires obstructives. Par exemple, la visualisation du transport du mucus dans des maladies telles que la fibrose kystique (FK) et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a facilité l’étude de traitements nouveaux et existants pour la clairance muqueuse28. Le trafic de leucocytes dans ces conditions a également été analysé17.
Ce protocole élargit l’approche initialement décrite par Lamm et al.29 pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Les procédures décrites utilisent un système d’imagerie pulmonaire in vivo , qui comprend une base métallique de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulateur et une fenêtre d’imagerie sous vide (Figure 1). Le système est monté sur une plate-forme imprimée en 3D de 20 cm x 23,5 cm (fichier supplémentaire 1) afin de fournir une fixation sécurisée pour le tube de ventilateur et le coussin chauffant. Cette méthode offre une imagerie reproductible et quantifiable de la microcirculation pulmonaire murine in vivo. Les aspects importants de la préparation chirurgicale ainsi que l’utilisation correcte d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide sont expliqués en détail. Enfin, un modèle expérimental d’ALI est utilisé pour fournir une imagerie et une analyse représentatives du roulage altéré des leucocytes, de l’adhésion des leucocytes et de la perfusion capillaire associée à l’inflammation. L’utilisation de ce protocole devrait faciliter d’autres recherches importantes sur les changements physiopathologiques de la microcirculation pulmonaire au cours des états pathologiques aigus.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées avec l’approbation préalable du Comité des animaux de laboratoire de l’Université Dalhousie (UCLA).
1. Préparation
- Système d’imagerie pulmonaire: Pour préparer la fenêtre, administrer une fine couche de graisse sous vide au sommet de l’anneau extérieur tout en évitant la contamination du canal de vide. Placez un couvercle en verre propre de 8 mm sur la fenêtre et appuyez doucement vers le bas pour créer un joint.
- Microscope à fluorescence à grand champ : Effectuez des images avec un microscope à fluorescence à grand champ conventionnel équipé d’un objectif à longue distance de travail 20x/0,40 et d’une caméra CCD (Charge-Coupled Device) noir et blanc avec une fréquence d’images de 25 FPS. Appliquez un filtre d’excitation passe-bande de 530-550 nm pour exciter la Rhodamine-6G et un filtre passe-bande de 460-490 nm pour exciter l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
- Système de vide : Connectez la fenêtre d’imagerie à une pompe à vide équipée d’un manomètre numérique capable de fournir une aspiration constante de 50 à 60 mmHg, comme illustré à la figure supplémentaire 1. En bref, connectez la fenêtre d’imagerie à la pompe à travers un tube en polyéthylène de 1,0 mm d’identification, un tube en polyéthylène de 1,0 cm d’identification, un flacon à vide et un filtre en ligne de 0,2 μm.
- Ventilateur : Réglez un petit ventilateur pour rongeurs afin de fournir une ventilation à pression contrôlée à un taux et un volume calculés en fonction du poids de la souris. Fournir une pression expiratoire positive (PEEP) à 5 cmH2O pendant toute la durée de l’expérience et régler la pression cible à 20 cmH2O.
- Anesthésique : À l’aide d’un système d’administration d’anesthésie à faible débit, amorcer une seringue de 5,0 mL avec 99,9 % d’isoflurane. Utilisez un système d’épuration des gaz résiduaires pour minimiser le risque d’inhalation par le chirurgien.
2. Anesthésie
- Placez une souris mâle C57Bl/6 de 20 à 25 g âgée de 12 semaines dans la chambre d’induction de l’anesthésie. Avec la chambre bien fermée, commencez l’induction avec du gaz isoflurane à une concentration de 3% et un débit de 500 mL / min.
- Une fois la souris anesthésiée (visualisée par un ralentissement de la respiration), transférez-la sur le support d’intubation et fixez les incisives supérieures à la suture suspendue.
- Serrez la suture pour fixer le museau à l’intérieur du cône du nez. Commencer l’écoulement du gaz à travers le cône de nez à une concentration de 2,5%.
- Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie par pincement des orteils avant de passer à l’étape suivante.
3. Intubation
- Faites pivoter le support de telle sorte que l’arrière du support et la face dorsale de la souris soient tournés vers le chirurgien.
- Passez l’extrémité d’un câble à fibre optique de 20 cm de long à travers une canule endotrachéale de 20 G et immergez la pointe dans la lidocaïne HCl (1%) pour faciliter le passage du câble à travers le larynx.
- À l’aide d’une pince émoussée, soulevez la mâchoire inférieure et déplacez la langue pour assurer un passage clair dans les voies respiratoires.
- Insérez un otoscope modifié (~60° de circonférence du spéculum enlevée) de sorte que les incisives supérieures s’insèrent dans l’espace du spéculum. Ajustez la portée et la position de la langue jusqu’à ce que l’épiglotte et les cordes vocales soient clairement visibles.
- Insérez le câble à fibre optique chargé de la canule endotrachéale à travers l’espace dans le spéculum et dans le larynx. À l’aide de petits mouvements circulaires, passez le câble à travers les cordes vocales et dans la trachée.
- Poussez la canule le long du câble à fibre optique, en passant entre les cordes vocales et dans la trachée.
4. Ventilation
- Récupérez la souris du support d’intubation et placez-la sur un coussin chauffant en position de décubitus latéral droit.
- Connectez la canule au tube du ventilateur et démarrez le ventilateur. Réduisez la concentration anesthésique à 1,5% et surveillez la profondeur en testant le réflexe de pédale. Si le réflexe persiste, augmentez progressivement la concentration jusqu’à 2%.
- Placez le gel lacrymal dans les yeux de la souris pour éviter le dessèchement.
- À l’aide de ruban adhésif médical, fixez la canule au museau. À l’aide d’un ruban d’étiquetage, fixez la patte avant droite au coussin chauffant à environ 9 heures. Étendez la patte postérieure gauche caudalement et fixez-la à la position de 6 heures environ.
- À l’aide d’un ruban en tissu, étirez légèrement la patte avant gauche jusqu’à la position de 12 heures et fixez l’autre extrémité de la bande au sommet de la plate-forme IVM comme illustré à la figure 2A (le maintien d’une légère tension facilite ici la thoracotomie ultérieure).
- Insérez une sonde de température rectale et fixez la sonde en la collant sur le coussin chauffant. Placez un oxymètre de pouls sur la patte arrière droite et fixez-le au coussin chauffant, en prenant soin de ne pas perturber la circulation.
- Une fois que la température est stable à 37,0 °C ± 0,1 °C, procédez à la thoracotomie.
5. Thoracotomie
- Stériliser le thorax et l’abdomen avec une lingette à 70% d’alcool. Appliquez une légère couche d’huile minérale pour humidifier les poils du côté gauche de la souris, du sternum à la colonne vertébrale et de l’épaule au bas de la cage thoracique.
- Avec des pinces contondantes et des ciseaux droits, faites une petite incision longitudinale près du bas de la cage thoracique pour exposer la couche musculaire sous-jacente.
- En vous déplaçant ventralement, utilisez une dissection émoussée pour séparer le tissu épithélial et adipeux de la couche musculaire. Cautériser tous les vaisseaux sanguins exposés. Une fois que le risque de perte de sang a été atténué, prolongez l’incision d’origine ventralement jusqu’au processus xiphoïde.
- Répétez ce processus dorsalement jusqu’à ~5 mm latéral à la colonne vertébrale.
- En vous déplaçant crâniennement, utilisez une dissection émoussée pour exposer la cage thoracique. Cautériser tous les vaisseaux sanguins exposés pour préserver la stabilité hémodynamique.
- Une fois que le risque de perte de sang a été atténué, étendez l’incision du processus xiphoïde à l’aisselle.
- Répétez ce processus sur la face dorsale de l’incision jusqu’à ~1 cm inférieur à l’oreille gauche.
- À l’aide d’une pince hémostatique, saisissez le tissu épithélial et adipeux disséqué et placez-le à l’écart de la zone chirurgicale (figure 2B).
- Injecter une solution de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) pour la visualisation des leucocytes et de fitC-albumine bovine (50 mg/mL; 1 mL/kg) pour la visualisation de la perfusion capillaire via la veine caudale.
- À l’aide d’une pince dentée, saisissez la côte immédiatement inférieure à la position de la base du poumon à l’inspiration finale et rétractez-vous légèrement pour éloigner la côte du poumon. Couper la côte pour induire un pneumothorax.
- Étendez l’incision latéralement le long du muscle intercostal dans les deux sens, en prenant soin de ne pas toucher la surface pulmonaire exposée.
- À l’aide d’une pince émoussée, saisissez la côte la plus haute suivante et rétractez-vous légèrement pour permettre au poumon de tomber loin de la paroi thoracique. Si le poumon ne se détache pas, appuyez légèrement sur la paroi thoracique contre le poumon pour que le poumon adhère à la plèvre sous-jacente et tombe ainsi plus facilement.
- Continuez l’incision d’origine ventralement jusqu’au sternum et crâniennement jusqu’à ce que le sommet du poumon soit exposé. Utilisez des applicateurs de coton et de la gaze pour atténuer tout saignement qui survient.
- Soulevez la cage thoracique pour exposer les vaisseaux sanguins intercostaux sur l’aspect dorsal de la cavité thoracique. En prenant soin de ne pas endommager le poumon, cautériser le vaisseau intercostal le plus inférieur près de la colonne vertébrale, puis couper la côte. En se déplaçant crâniennement et ventralement, répétez jusqu’à ce qu’une partie d’environ 1 cm x 1,5 cm de la cage thoracique soit excisée (figure 2C).
- Éliminer tout excès d’accumulation de liquide dans la cavité thoracique par action capillaire à l’aide de petites bandes de gaze.
- Lors de la microscopie, prévoyez environ 5 minutes pour que le liquide intrapleural se dissipe pour une interface plus sûre entre le poumon et la fenêtre d’imagerie.
6. Microscopie
- Allumez la pompe à vide et réglez la pression à ~50–60 mmHg.
- Transférez la plate-forme IVM à l’étape du microscope. Positionnez le poteau métallique et le micromanipulateur de manière à ce que la fenêtre d’imagerie soit directement au-dessus du poumon exposé et que le bras de la fenêtre s’approche du poumon à partir de la position de 3 heures environ.
- À l’aide du micromanipulateur, abaissez soigneusement la fenêtre d’imagerie jusqu’à ce qu’elle adhère à la surface pulmonaire et la stabilise (figure 3A).
- À l’aide de l’objectif 20x et du filtre d’excitation passe-bande 460-490 nm, identifiez une veinule pulmonaire en fonction du schéma convergent du flux sanguin. Centrez le navire dans le champ de vision et enregistrez 30 s de vidéo.
- Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
- Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq veinules pulmonaires aient été imagées.
- À l’aide du filtre d’excitation passe-bande de 460-490 nm, identifiez une artériole pulmonaire en fonction du schéma divergent du flux sanguin. Centrez le navire dans le champ de vision et enregistrez 30 s de vidéo.
- Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
- Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq artérioles pulmonaires aient été imagées.
- À l’aide du filtre d’excitation passe-bande de 460 à 490 nm, localisez une région d’alvéoles et de capillaires non recoupée par de plus grands vaisseaux et enregistrez 30 s de vidéo.
- Passez au filtre d’excitation passe-bande 530-550 nm et enregistrez 30 s de vidéo dans le même champ de vision.
- Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que cinq régions capillaires aient été imagées.
7. Protocole d’euthanasie et de nettoyage
- Retirez la plate-forme IVM de l’étage du microscope et ajustez l’administration d’isoflurane à 5% pendant 5 minutes pour euthanasier la souris.
- Pendant que vous attendez, jetez la vitre de couverture et déconnectez la fenêtre d’imagerie de la plate-forme. Nettoyez la fenêtre d’imagerie avec une petite brosse et utilisez une seringue de 30 G insérée dans le canal pour la rincer plusieurs fois avec de l’eau distillée. Ensuite, rincez avec de l’éthanol à 95% à l’aide de la pompe à vide.
- Après 5 minutes, arrêtez le ventilateur et assurez-vous d’une euthanasie complète par luxation cervicale.
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Representative Results
Pour illustrer les résultats réalisables grâce à ce protocole, une lésion pulmonaire aiguë (AIP) a été induite 6 heures avant l’imagerie à l’aide d’un modèle d’instillation intranasale de lipopolysaccharides bactériens (LPS). Brièvement, les souris (n = 3) ont été anesthésiées avec de l’isoflurane, et de petites gouttelettes de LPS de Pseudomonas aeruginosa dans une solution saline stérile (10 mg / mL) ont été pipetées dans le naris gauche à une dose de 5 mg / kg. Cela a été comparé à des souris naïves (n = 3; pas d’administration intranasale).
Lors de l’imagerie, une préparation chirurgicale réussie est identifiable par plusieurs facteurs. Le poumon doit être relativement stable avec une respiration provoquant des changements de cadre cycliques ne dépassant pas 25 μm. Les alvéoles doivent être clairement visibles et peuvent présenter une distension/contraction des marées. L’excitation par la lumière bleue (longueur d’onde de 450-490 nm) permettra de visualiser la directionnalité du flux sanguin, et il peut être possible de distinguer les globules rouges individuels (film supplémentaire 1, film supplémentaire 3 et film supplémentaire 5). Les leucocytes seront clairement identifiables lors de l’excitation par la lumière verte (longueur d’onde 530-560 nm, film supplémentaire 2, film supplémentaire 4 et film supplémentaire 6). Une fois l’imagerie terminée et le retrait de la fenêtre d’aspiration, il peut y avoir de légères ecchymoses à la surface du poumon, mais pas dans la zone imagée, comme le montre la figure 3B.
Plusieurs défis techniques peuvent nuire à la viabilité expérimentale. L’accumulation de sang à la surface des poumons compromettra la stabilisation du vide et peut même obstruer le canal. Pour éviter cela, une extrême prudence doit être exercée lors de chaque étape chirurgicale. Une pression de vide excessivement élevée peut endommager les poumons et affecter la microcirculation. Cela peut être identifiable par une stase alvéolaire ou des ecchymoses excessives sur la surface pulmonaire (Figure 3C) et peut être corrigé en réduisant la pression de la pompe à vide. De plus, des erreurs dans l’injection intraveineuse de fluorophore peuvent entraîner une mauvaise visualisation du trafic de leucocytes et du flux sanguin.
Une fois le protocole terminé, une analyse manuelle en aveugle a été effectuée à l’aide de Fiji21 d’une manière adaptée de la littérature précédente28. Cinq veinules, artérioles et régions capillaires d’intérêt (ROI) ont été analysées chez chaque animal. L’adhésion des leucocytes dans les veinules et les artérioles a été définie comme le nombre de cellules qui restent adhérées à l’endothélium vasculaire pendant 30 s d’observation par zone de surface endothéliale. Ceci est relayé dans les cellules/mm2. L’adhésion des leucocytes dans les capillaires a été définie comme le nombre de cellules dans le ROI qui restent adhérées à l’endothélium vasculaire pendant 30 s d’observation par zone totale analysée. Ceci est également relayé dans les cellules/mm2. Le roulement leucocytaire a été défini comme deux fois le nombre de cellules passant un point de référence dans le vaisseau au cours de la période d’observation de 30 s. Les leucocytes à écoulement libre ont été exclus en comparant la vitesse de passage avec celle du flux de globules rouges, et cela est relayé en cellules / min. Pour mesurer la perfusion microcirculatoire, la FCD a été définie comme la somme des longueurs des capillaires perfusés de globules rouges par zone d’observation. Ceci est relayé en cm/cm2. Chaque paramètre est indiqué comme une valeur moyenne pour chaque animal.
Une tendance commune au recrutement des leucocytes a été observée dans les veinules pulmonaires, avec une adhérence et un roulement accrus chez les souris traitées au LPS par rapport aux souris naïves (figures 4C, D). Cette tendance a été récapitulée par l’adhésion des leucocytes artériolaires, bien que les niveaux de laminage et d’adhérence aient été très variables dans le groupe naïf (figures 5C, D). Notamment, l’administration de LPS a entraîné une augmentation substantielle de l’adhésion des leucocytes dans les ROI capillaires pulmonaires (Figure 6C). Les souris LPS ont également démontré une réduction de la FCD par rapport aux souris naïves (Figure 7C). Ces effets au sein des capillaires pulmonaires sont cohérents avec la littérature antérieure identifiant des augmentations de cellules immunitaires par champ de vision et un dérangement de la perfusion capillaire normale suite à divers stimuli inflammatoires 4,5,16.
Figure 1 : Système d’imagerie pulmonaire. Le système de commande sur mesure comprend (1) une base en métal anodisé, (2) une fenêtre d’imagerie, (3) une entrée sous vide, (4) un micromanipulateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation chirurgicale. (A) La souris est fixée à la plate-forme IVM en position de décubitus latéral droit. (B) La cage thoracique est exposée à l’aide d’une dissection contondante pour préserver l’hémodynamique. (C) La thoracotomie est effectuée pour exposer le poumon gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stabilisation du vide. (A) L’application d’une fenêtre d’imagerie sous vide stabilise la surface pulmonaire. (B) L’utilisation de pressions de vide inférieures à 75 mmHg minimise les dommages aux poumons, en particulier dans la zone imagée. (C) Des pressions de vide plus élevées peuvent causer des ecchymoses importantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Trafic de leucocytes dans les veinules pulmonaires. L’excitation de la rhodamine 6G permet la visualisation des leucocytes adhérents et roulants. Les zones décrites représentent des portions analysées de l’endothélium vasculaire, comme le confirme l’excitation de la FITC-albumine chez des souris naïves et (B) traitées au LPS. (C,D) L’administration intranasale de LPS a un impact sur le roulement et l’adhésion des leucocytes dans les veinules pulmonaires. Les valeurs sont données sous forme de moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Trafic de leucocytes dans les artérioles pulmonaires. L’excitation de la rhodamine 6G permet la visualisation des leucocytes adhérents et roulants. Les zones décrites représentent des portions analysées de l’endothélium vasculaire, comme le confirme l’excitation de la FITC-albumine chez des souris naïves et (B) traitées au LPS. (C,D) L’administration intranasale de LPS a un impact sur le roulement et l’adhérence des leucocytes dans les artérioles pulmonaires. Les valeurs sont données sous forme de moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Leucocytes adhérents dans les capillaires pulmonaires. L’excitation de la rhodamine 6G permet la visualisation des leucocytes dans les ROI chez des souris naïves et (B) traitées au LPS. (C) L’administration intranasale de LPS a un impact sur l’adhésion des leucocytes chez les souris traitées au LPS. Les valeurs sont données sous forme de moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 7 : Fonction capillaire pulmonaire. L’excitation de la FITC-albumine permet de visualiser le flux sanguin capillaire dans les ROI chez les souris naïves et (B) traitées au LPS. (C) L’administration intranasale de LPS a un impact sur la FCD dans les capillaires pulmonaires. Les valeurs sont données sous forme de moyenne ± SD. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Fichier supplémentaire: Fichier pour la plate-forme IVM imprimable en 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 1 : Schéma du système de vide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Film supplémentaire 1: Exemple vidéo du flux sanguin dans la veinule pulmonaire. La flèche verte indique la direction du flux sanguin. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film supplémentaire 2: Exemple de vidéo du trafic de leucocytes dans la veinule pulmonaire. Les flèches rouges désignent les leucocytes adhérents à l’intérieur du vaisseau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film supplémentaire 3: Exemple vidéo du flux sanguin dans l’artériole pulmonaire. La flèche verte indique la direction du flux sanguin. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film supplémentaire 4: Exemple de vidéo du trafic de leucocytes dans l’artériole pulmonaire. Les flèches rouges désignent les leucocytes adhérents à l’intérieur d’un vaisseau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film supplémentaire 5: Exemple de vidéo du flux sanguin dans les capillaires pulmonaires. Les flèches vertes désignent plusieurs zones bien visualisées de capillaires perfusés de globules rouges. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film supplémentaire 6: Exemple de vidéo du trafic de leucocytes dans les capillaires pulmonaires. Les flèches rouges désignent les leucocytes adhérents dans le champ de vision. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
Le protocole présenté ici nécessite de la pratique et de l’attention à quelques étapes critiques. Tout d’abord, il est important de préparer la fenêtre d’imagerie avant d’initier l’intubation et la chirurgie. Utilisez une quantité minimale de graisse sous vide pour recouvrir l’anneau extérieur de la fenêtre d’imagerie, appliquez le verre de couverture et testez l’aspiration avec une goutte d’eau distillée. Préparer cela à l’avance empêchera le poumon exposé de se dessécher pendant la configuration sinon. Bien qu’il soit possible de rincer avec une solution saline chaude, cela peut risquer d’endommager le tissu pulmonaire fragile.
Après l’intubation, lors du transfert de la souris sur la plate-forme IVM, la canule peut parfois être déplacée. Pour éviter cela, pensez à attacher la canule aux dents de devant de la souris ou à la suturer à la peau autour de sa bouche. Si vous utilisez une ventilation à pression contrôlée, le volume courant doit être surveillé attentivement tout au long de la procédure. Il devrait rester stable à environ 0,20 mL, car des valeurs significativement plus faibles (par exemple, ~ 0,10 mL) peuvent indiquer une ventilation pulmonaire unique. Si cela se produit, une légère rétraction de la canule endotrachéale peut résoudre le problème. L’utilisation de l’anesthésie par inhalation (isoflurane) facilite le contrôle de la profondeur de l’anesthésie pendant que la souris est ventilée. D’autres moyens d’anesthésie (p. ex. kétamine/xylazine10,11 par voie intraveineuse) ont été utilisés par d’autres laboratoires, et chacun présente ses avantages et inconvénients respectifs.
Pendant la chirurgie, une dissection contondante est utilisée pour minimiser le risque de coupure des vaisseaux sanguins. Ceci est particulièrement important lors de la dissection du tissu adipeux épais et fortement vascularisé près de l’épaule. La résection de la cage thoracique nécessite à la fois rapidité et précision. La chaleur du cautérisateur est suffisamment intense pour brûler les poumons en cas d’utilisation excessive. Lors de la résection de la cage thoracique, il doit y avoir un espace vide entre le poumon et la paroi thoracique. Si le poumon adhère à la paroi thoracique, appuyer légèrement sur l’extérieur de la cage thoracique encouragera l’adhésion à la plèvre pariétale sous-jacente. Alternativement, utilisez une aiguille émoussée pour injecter une petite quantité de solution saline chaude entre le poumon et la cage thoracique pour faciliter la libération. Il est conseillé de positionner le bras de la fenêtre à 3 heures pour éviter toute pression indésirable sur les nervures pendant l’imagerie (Figure 3A). Il laissera également plus de dégagement entre le micromanipulateur et l’objectif du microscope, ce qui facilitera l’accès pour les manipulations. Lors de l’abaissement de la fenêtre d’imagerie, il est essentiel de cibler la région centrale du poumon, car le contact avec le bord entraînera une étanchéité inadéquate et un artefact de mouvement excessif pendant l’imagerie. En outre, plusieurs tentatives pour abaisser la fenêtre peuvent endommager le poumon. De même, les cycles de décollement et de restabilisation contribueront aux lésions pulmonaires et peuvent compromettre la précision expérimentale. Lorsqu’elle est effectuée correctement, cependant, la préparation présentée ici est suffisamment stable pour permettre une imagerie intravitale haute résolution avec un objectif 20x.
Un protocole de nettoyage rigoureux est nécessaire pour éviter la contamination et le blocage du canal d’aspiration à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie. L’utilisation d’une aiguille de 30 G immédiatement après les expériences pour rincer à plusieurs reprises avec de l’eau distillée est efficace pour éliminer la plupart des contaminants. Ceci est suivi d’un rinçage avec de l’éthanol concentré et d’un rinçage final avec de l’eau distillée avant de se rattacher à la conduite de vide pour éliminer l’humidité. L’utilisation d’acétone ou de détergents puissants peut suffire à résoudre les blocages graves, le cas échéant.
Notamment, ce protocole utilise une lecture plus élevée de la pression du vide par rapport à d’autres méthodes signalées 4,11, ce qui peut soulever des préoccupations quant aux dommages au tissu pulmonaire. Une distinction importante, cependant, est que le manomètre numérique utilisé ici ne mesure la pression qu’au niveau de la pompe à vide. Cette pression est délivrée par des tubes étroits et le canal extrêmement étroit de la fenêtre d’imagerie elle-même avant la distribution sur une plus grande surface du poumon. En tant que tel, aucune preuve de dommages à la région imagée n’a été observée dans ces expériences après des séances intravitales. De plus, les alvéoles imagées présentaient une distension et une contraction des marées, ce qui indique que ce phénomène physiologique n’a pas été perturbé de manière significative.
Malgré la popularité croissante de la MIV pulmonaire en tant qu’outil d’étude de la maladie in vivo, cette technique présente des limites. Tout d’abord, la nature invasive et terminale de la chirurgie induit un effet non négligeable sur l’état physiologique de la souris et limite la procédure à une seule séance d’imagerie. Cependant, il convient de noter que plusieurs approches longitudinales de MIV pulmonaire ont été développées30. Deuxièmement, l’utilisation de la ventilation mécanique peut induire un certain degré de lésion pulmonaire associée au ventilateur (VALI)31, bien que cela soit limité par la courte durée de la procédure. Troisièmement, le contact entre la plèvre viscérale et le couvercle en verre et l’application de pression sous vide peuvent entraîner une altération du flux sanguin microvasculaire. Enfin, la limite la plus importante de cette approche est peut-être que l’imagerie est limitée aux alvéoles sous-pléurales dans les régions pulmonaires non dépendantes, qui ne sont pas représentatives de l’ensemble du poumon32.
En résumé, ce protocole peut être utilisé pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales dans la microvascularisation pulmonaire en utilisant la microscopie à fluorescence intravitale. Bien que ces expériences utilisent une lésion pulmonaire induite par les endotoxines, un modèle aigu qui a été sélectionné sur la base de recherches antérieures, ce protocole peut également être adapté pour étudier d’autres processus pathologiques et physiologiques dans le poumon. En outre, le système d’imagerie pulmonaire utilisé ici est applicable à une gamme d’approches de microscopie, et la fenêtre d’imagerie est suffisamment grande pour accueillir des objectifs d’immersion dans l’huile à grande ouverture numérique. Ainsi, les procédures décrites devraient faciliter la poursuite des recherches sur l’impact de divers états pathologiques sur la microcirculation pulmonaire.
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Disclosures
Le Dr Kamala D. Patel est la présidente et cofondatrice de Luxidea, l’entreprise auprès de laquelle la fenêtre d’imagerie utilisée dans cette expérience a été achetée.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier la Dre Pina Colarusso, qui a fourni une expertise considérable dans l’édition et la révision de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
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