Summary
本議定書は、実験室におけるトルトリシッド害虫昆虫の飼育方法を記載する。昆虫の性別を区別し、ハイスループットシーケンシングのために核酸を抽出する手順は、2つのトルトリシッド害虫を使用して確立されています。
Abstract
一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、深刻な農業損失を引き起こす多くの農業および林業害虫を含む。このような害虫の蛾の生物学を理解するために、基本的な技術が強く求められている。ここでは、2つの茶癇翅目、 ホモナ・マグナニマ と アドキソフィエス・ホンマイ (鱗翅目:トルトリシダ科)を用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。昆虫はスライスした人工食で大量飼育され、その生物学的特性を考慮して100世代以上にわたって近親交配によって維持された。昆虫には様々な性二型性があります。したがって、その後のアッセイを妨げている発達段階における性別を区別することは困難である。今回の研究は、トルトリシッド幼虫の性別は、精巣を観察するか、または乳酸酢酸オルセイン染色を観察することによって決定し、女性特異的W染色体を視覚化することによって決定できることを強調した。さらに、本研究では、性決定法を用いて、性決定胚からの核酸抽出とハイスループットシーケンシングへの応用を可能にした。これらのヒントは、他の害虫の昆虫にも適用可能であり、さらなる形態学的および遺伝的研究を容易にする。
Introduction
鱗翅目昆虫は、記載されたすべての生物種1の10%以上を占め、特定の分類群種は植物に深刻な被害および深刻な農業損失を引き起こす2,3。カイコBombyx mori4,5などのモデル昆虫を用いて分子的および遺伝的研究が開発されているが、害虫昆虫は、飼育および取り扱いの困難さもあって、未調査のままである6,7。したがって、そのような非モデル害虫昆虫の生物学を理解するためには、基本的な研究および技術が必要である。
一般的にトルトリックスまたはリーフローラーの蛾として知られているトルトリシダ科(鱗翅目)は、多くの農業および林業害虫8を含む。昆虫分類群のうち、オリエンタル・ティー・トルトリックス・ ホモナ・マグナニマ ・ディアコノフとサマーフルーツ・トルトリックス・ アドキソフィエス・ホンマイ・ ヤスダは、東アジアのティーツリーにダメージを与えることが知られている深刻な多食性害虫です7。2つの種は、母親の分泌物で覆われた薄くて柔らかく壊れやすい卵からなる平らで楕円形の鱗片のような卵塊(または卵塊)を産む。胚発生段階は昆虫の発生と性決定9にとって極めて重要であるが、卵の構造は昆虫の生物学を理解するのを妨げるさらなる分析を妨げる。このような複雑な卵塊を産卵させる害虫に関するさらなる研究のための困難を克服することが重要である。
ここでは、トルトリシドの生物学を理解するために、 A. honmai と H. magnanimaを用いて、大量飼育、観察、および分子研究のための方法が開発されている。第一に、大量飼育方法は、近親交配によって100世代にわたって両方のトルトリシッドを維持する。連結された鱗片状の卵塊から卵を分離することは、ハエ10で用いられる技術から以前に開発されたアルカリ性および有機溶媒を用いたトルトリシドの胚発生観察を容易にした。また、本研究は、乳酸酢酸オルセインを用いた鱗翅目雌の性クロマチンの染色法の開発により、小胚の性差別を確立した11。これらの方法を組み合わせることにより、性決定された胚から高品質および量の核酸が抽出されたが、そうでなければ確立することは困難であった6。抽出したRNAを次世代シーケンシングに利用しました。集合的に、ここで提示された方法は、他の鱗翅目昆虫および他の昆虫分類群に適用される。
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Protocol
1. 昆虫の収集と大量飼育
- 以前に出版された参考文献8,12に続く畑からトルトリシッド昆虫を集める。
注:H. magnanima および A. honmai 幼虫は、損傷した茶葉から収集される(図1A)。成虫は、4Wの携帯用UV光(波長365nm、 材料表、 図1B参照)を用いて誘引される。 - 採取した幼虫(図1C、D)を1/2オンスカップに入れた人工飼料片上で、成虫の開墾まで2~3週間、個別に飼育する(図1E、F)。形態学的形質により蛹と成虫の性別を確認する(図1G,I)。
- プラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm)の中の男性と女性をパラフィン紙の卵塊に嵌合させます(図1J-L)。女性1人と男性2人をパラフィン紙と一緒に120mLのプラスチックカップに入れて、マトリリンを確立します。
注:パラフィン紙にしわを作ることが重要です。H. magnanimaの場合、パラフィン紙はケースの底に貼っておく必要があります。一方、A.ホンマイについては、茶葉の上側にH.マグナニマ産卵卵塊が入るので、ケース天井に紙を貼って卵を集める(図1L)が、A.ホンマイは葉8の下側に卵を産む。手順は他のトルトリシッド種でも検証されており、対象種の生態や行動が明らかにならない場合は、両面に論文を貼った方が良いでしょう。 - はさみでパラフィン紙上の卵塊(卵塊12、 図1Mあたり約100〜200個の卵)を切り取ります。卵をダンプされた紙と一緒に1/2オンスのカップに5〜7日間入れます。
注:成熟した胚は黒ずみのカプセルを呈する(図1N)。胚発生の期間は、トルトリシド種に多様に起因しているが、一般に、 H. magnanima では産卵後5日間、 A. honmai では4 dpoが相対湿度60%、16時間明暗/8時間のサイクルで25°Cで7. - 黒い頭部カプセルを示す卵塊を4〜8°Cで7日間保存する。
- 大量飼育用のおろし金を使用して〜60gの人工食をスライスする。成熟した胚で満たされた卵塊をプラスチック容器(23 cm x 16 cm x 8 cm)のスライスした人工飼料の上に置きます。スライスした食事と一緒に卵塊にパラフィン紙を置きます(図10)。
注: 相対湿度が 30% 未満は乾燥しすぎていると見なされ、70% を超えると湿度が高すぎます。プラスチック容器の蓋に穴を開けることは、より良い換気を可能にするためにより良いです。小さな幼虫の脱出を防ぐために、穴を綿で満たしてください。 - 卵から表面汚染物質を除去するために、卵塊を3%ホルマリンおよび0.2%塩化ベンザルコニウム溶液にそれぞれ5分間浸す12。腸内細菌や細胞内細菌を根絶するには、通常の人工食の代わりに、塩酸テトラサイクリン0.05%(w/w)またはリファンピシン0.06%(w/w)を添加した人工食を利用してください( 資料表参照)。
メモ: この手順はオプションです。一貫性を保つために、シルクメイト2Sと0.05%(w / w)テトラサイクリン塩酸塩または0.06%(w / w)リファンピシンを均等に混練することが重要です。 - プラスチック容器から蛹を収集し、形態学的12 の特徴に基づいて性別を区別する(図1G-I)。
注:一般的に、トルトリシドは蛹化12まで5〜6個のインスターを呈する。 H. magnanima と A. honmai 幼虫は、孵化後蛹化するまでそれぞれ3週間と2週間かかります。 - 15人の男性と10人の女性をプラスチック製の箱(30 cm x 20 cm x 5 cm、 図1K)に入れ、25°C、16 L/8 Dで交配します。各世代のために。
注:その後の分析のために新たに産卵した卵塊を収集する必要がある場合は、暗期の開始と終了(例えば、午前9時から午後5時まで)を設定します。この状態では、 H. magnanima と A. honami は通常5時間後(午後2時)に産卵卵します。
2.固定、透過処理、染色のための卵塊からの卵およびフェレート幼虫の分離
- 卵塊を1,000 μLの1.2%次亜塩素酸ナトリウム水溶液に10分間または1,000 μLの5 M水酸化カリウム水溶液に30分間浸して卵を分離します。
- 分離した卵を1,000 μLのPBSt(137 mM NaCl、8.1 mM Na2 HPO4、2.68 mM KCl、1.47 mMKH2 PO4、0.05%のポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート[Tween-20] pH 7.4、材料表を参照)で洗浄し、以前に公表された報告7に従ってください。
- 卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの4%パラホルムアルデヒド-PBSt溶液(w / v)の混合物に浸します。ボルテックスミキサーを用いて1,500rpmで10分間混合する。
- 卵を500 μLの100%ヘプタンと500 μLの100%メタノールの混合物に浸します。1,500rpmで10分間混合する。
- 卵を1,000 μLの100%メタノールで2回洗浄し、さらなる実験まで100%メタノール中で4°Cで保存する(図2A)。
注:卵は4°Cで少なくとも1年間保存することができます。 - 卵を99%、70%、50%エタノール、およびPBStにそれぞれ5分間順次浸し、以前に発表された報告7に続いて親水化を行う。
- 卵をPBStで洗浄し、卵を1μg/mLのDAPI溶液に5分間浸漬した後、1x PBSで卵を2回洗浄する。卵を20 μLの1.25%(w/w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液( 材料表を参照)11 に浸して、核が鮮やかな赤色を示すまでヘテロクロマチンを視覚化する(これは5〜60分で変化する)(図2B、C)。
注:乳酸 - 酢酸オルセイン染色期間は、温度および湿度に依存する。4x-10倍の倍率の顕微鏡を使用して適切な染色を確認することをお勧めします。 - 染色した卵をピペットを用いてスライドガラスに移す。染色した卵を退色防止試薬( 材料表参照)で囲み、カバーガラス7とする。
- 鉗子を用いて卵塊からファレート H. magnanima および A. honmai 幼虫(産卵後4〜5日(dpo))を抽出する(図2D)。スライドガラス上の幼虫を二等分する(図2E)。
- 任意の組織(例えば、食道下神経節、胸部神経節、マルピギ尿細管など)を1:3(v/v)99.7%酢酸/100%メタノールの混合物で5分間固定する。核が染色されるまで、1.25%(w / w)乳酸 - 酢酸オルセイン溶液11 でそれらを染色する(これは、温度および湿度に応じて5〜60分かかることがある)。
- ヘテロクロマチン(W染色体、 図2F、G)の有無(雌)または非存在(雄)を顕微鏡で観察することにより各検体の性を求めた。
注:性別は、性クロマチンを視覚化することによって決定される。各細胞は、雌11、12において性クロマチンをドットとして表し、一方、相長幼虫組織の残りの部分(固定されていない)は、直ちに細胞溶解緩衝液12(10mM Tris-HCl、100mM EDTA、および1% SDS、pH 8.0)またはDNAまたはRNA抽出のためのフェノール含有RNA抽出試薬に浸漬すべきである。解剖の前に、20 μLの試薬を事前に0.2 mL PCRチューブに分注してください(図3A)。サンプルを浸漬し、さらに抽出するまで-80°Cで保存する。サンプルは少なくとも3ヶ月間保存することができますが、核酸の分解を防ぐために下流の実験を進める方が良いです。
3. 性決定されたファレート幼虫からのDNAおよびRNA抽出
- 性決定された雄または雌のファレート幼虫(5dpo胚)を12個プールし、細胞溶解緩衝液またはRNA抽出試薬(ステップ2.11および 材料表を参照)のいずれかを1本の1.5mLチューブに加える。
注: DNA 抽出の場合は手順 3.2 ~ 3.7、RNA 抽出の場合は手順 3.8 ~ 3.11 に従います。 - 600 μL の細胞溶解バッファー (10 mM Tris-HCl、100 mM EDTA、および 1% SDS、pH 8.0) で組織を均質化し、サンプルを 10,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
- ピペットを使用して上清(500 μL)を回収し、1.5 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL、 材料表を参照)とともに50°Cでヒートブロック上で5時間インキュベートします。
- サンプルを 1.0 μL の 10 mg/mL の RNase 溶液 ( 材料表を参照) で 37 °C で 30 分間処理します。
- 200 μLのタンパク質沈殿溶液( 材料表を参照)をチューブ7に加え、続いて17,000 x g で遠心分離機で4°Cで10分間行った。
- 上清(500 μL)を500 μLの100%イソプロパノールと混合し、20,400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- ペレット化したDNAを1,000 μLの70%エタノールで2回洗浄する。次いで、風乾(室温で5〜10分間)し、DNAを30 μLの10 mM Tris-Cl緩衝液(pH 8.5)に溶解する。
- 600 μLのRNA抽出試薬で組織を均質化し、240 μLの超純粋な蒸留水をチューブに加えます。チューブを 12,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。
- 上清(600 μL)を600 μLの100%イソプロパノールと混合し、混合物をシリカスピンカラムに移す( 材料表を参照)。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。
- カラムを750 μLの70%エタノールで洗浄し、カラムを17,900 x g で2回、4°Cでそれぞれ1分間遠心分離した。
- 15 μL の超高純度蒸留水をカラムにロードします。チューブを 17,900 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、RNA を溶出します。
- UVベースの分光光度計を使用してDNAとRNAの品質と量を計算し、検証します。A260/A280(核酸/タンパク質)およびA260/A230(核酸/塩およびその他の汚染物質)比13を使用して核酸の純度を評価します。
注:RNA抽出については、以前に公表された手順12 に従い、フェノール汚染をもたらした(表1)。単一の胚またはフェレート幼虫から抽出されたDNAおよびRNAは、低量および低品質のサンプルを生成する。典型的には、12個のファレート幼虫からのDNA抽出は100〜600ngを生じるが、現在の方法を用いたRNA抽出は、 表1に示すように900〜1,500ngを生成する。
注: ステップ 3.13 ~ 3.15 は、ハイスループットシーケンシングのさらなるアッセイではオプションです。 - 蛍光ベースの分光光度計を使用してDNAおよびRNAの量を計算する。
注:RNA量の比(UVベースの濃度(ng/μL)/蛍光ベースの濃度(ng/μL))を計算し、さらなる実験適用のための品質を評価した。たとえば、UV および蛍光ベースの濃度がそれぞれ 80 ng/uL および 60 ng/uL の場合、その比は 1.5 (80/60) になります。通常、1.5未満の比は、ハイスループットシーケンシング13を使用する下流アプリケーションに対して十分な純度を示します。 - マイクロチップ電気泳動を用いてRNAの品質を分析する14.
- 修飾されたRNAを利用して、RNAライブラリー調製キットを使用してRNAライブラリーを調製する( 材料表を参照)。準備されたライブラリに適したプラットフォームを用いてライブラリを配列決定する。
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Representative Results
ホスト回線の整備と維持管理
野外で採集された幼虫の生存率は、圃場の場所、季節、および飼育条件(例えば、台湾、桃園における生存率の90%、新井ら12に示されているように)に異なる原因がある。ペアの約30%〜50%が、通常どおり次世代を生み出します。 H. magnanima と A. honmaiにとって、母系は100世代以上にわたって近親交配によって維持されてきました。
形態学的観察と性決定
水酸化カリウム(3または5M KOH)または次亜塩素酸ナトリウム(1.2%Cl2 またはNaClO)のいずれかによる処理により、連結された卵塊から卵が分離されます(図2A)。試薬の濃度が低いと分離を達成できなかった。すべての固定、透過処理、および染色ステップにより、DAPI溶液による核の可視化が可能になりました。KOHまたはNaClOのみで処理(分離)した卵を固定および透過処理工程を行わずに、これらの色素7で染色しなかった。未処理の H.マグナニマ 卵塊は染色されなかった。乳酸酢酸オルセインは、ヘテロクロマチン(W染色体)をいつものように濃い赤色で、核を明るい赤色で染色する(図3A)。この染色により、4dpo胚から6齢幼虫までの性決定を容易かつ迅速に行うことができる。0~3dpoの胚で核を可視化したが、400倍の倍率でW染色体を観察することは困難であった。
性決定およびプールされた胚から高品質のDNAおよびRNAが得られた
12個のファレート幼虫から、高品質のDNA(A260/A280 = 1.7-2.0;A260/A230=1.7-2.4)を総量で100-600 ngで抽出した(表1)。以前に発表された方法12に従って抽出されたRNAは、低品質で500〜1,000ngの生成物を生じたが:A260/A280 = 1.7〜2.1;A260/A230 = 0.1-0.5(表1)、スピンカラムを用いた改変プロトコルはRNAの品質を改善し、A260/A280 = 1.9-2.1およびA260/A230 = 1.9-2.3で900-1,500ngの生成物を産生した(表1)。さらに、改変プロトコルのRNA濃度比(UVベース/Qbit蛍光ベースの値)は1.2未満であり、次世代シーケンシングの品質要件を満たしていました13。逆に、単一の胚から抽出された核酸の質と量は、計算するには低すぎた。改変プロトコールを用いて性決定されたファレート幼虫から抽出されたRNAの無傷性も、マイクロチップ電気泳動を用いて確認された(図3B)。調製したライブラリーは、高いQ30スコアリードを生じることを確認した(表2)。
図1:H. magnanimaとA. honmaiの昆虫採集と大量飼育の概要(A)幼虫によって損傷を受けた茶葉と巣。(B)UV光によるライトトラップ。(C、D)雌(C)と雄(D)H. magnanimaの6齢幼虫。オレンジ色の三角形は精巣を示します。(E,F)採取した幼虫を人工食片と共に1/2オンスのカップに入れて個々に飼育した。(G,H)H. magnanima (G) と A. honmai (H) の蛹。女性は左側に表示され、男性は右側に表示されます。(I) H. magnanima (上) と A. honmai (下) の成人。男性と女性の両方がそれぞれ右と左に表示されます。(J,K)卵塊採取用のビニール袋(J)またはプラスチックケース(K)。(L)A. honmai 卵子を蓋の上に置いたパラフィン紙に、H. magnanimaはケースの底に置かれたパラフィン紙に卵を産む。(M,N)H. magnanimaの卵塊。成熟した胚は、白い矢印(N)で示された黒い頭部カプセルを示す。(O)大量飼育用のおろし金でスライスした人工食。卵から孵化した幼虫は、スライスされた食事の上に置かれ、25°Cで孵化してから3〜4週間後(16時間の明/8時間の暗サイクル下)に蛹を形成する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:胚の観察 (A)5 N KOH、4% PFA/ヘプタン、メタノール/ヘプタン、およびメタノールを使用して、 マグナニマの分離 、固定、および透過処理卵子。分離された卵は破線で強調表示されます。(b)3dpo胚を乳酸酢酸オルセインで染色した。黒い矢印は胚を示す。(c)4dpo胚をDAPIで染色した。白い矢印は胚を示す。(D,E)鉗子を用いたファレート幼虫(5dpo)の解剖。ファレート幼虫は卵塊(D)から抽出され、スライドガラス(E)上で二等分される。(F,G)解剖したファレート幼虫を用いた乳酸酢酸オルセイン染色。雌はヘテロクロマチンをドットとして示す(黒い矢印(F)で示すが、雄はヘテロクロマチン(G)を欠いている)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:性決定されたファレート幼虫およびH. magnanimaおよびA. honmaiのRNA品質を用いた核酸抽出のグラフィカルな要約。(A)スライドガラス上で解剖したファレート幼虫の組織を乳酸酢酸オルセインで染色し、その性別を決定した。残りの組織を試薬に浸し、個体の性別で分類した1本のチューブにプールし、DNA/RNA抽出を行った。(B)12雄のH. magnanimaまたはA. honmaiから抽出されたRNAの品質を、マイクロチップ電気泳動システムを用いて評価した。略語: [nt], ヌクレオチドサイズ;[FU]、蛍光ユニット;M、分子マーカー;うーん、H.マグナニマ;Ad, A. honmai. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
表1:マグナニマ菌の性決定されたファレート幼虫から抽出された核酸の濃度および品質。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2: RNA シーケンシング生データの品質。1Q20 (%) は、読み取り精度が 99% の読み取り確率を示します。2Q30 (%) は、読み取り精度 99.9% の読み取り確率を示します。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
トルトリシドは、いくつかの農業および林業害虫を含む。本研究では、何世代にもわたってトルトリックスを飼育し、昆虫の胚発生と性別を観察し、成熟した胚を用いて分子解析を行う方法を提示した。
害虫昆虫研究の障害の一つは、飼育方法を確立することである。特に、近親交配は時々種の適応度に悪影響を及ぼすことがあります。近親交配による適応度低下は、近親交配うつ病と呼ばれ、昆虫15、16、17、18を含む様々な動植物において広く観察されている。前述のように、H. magnanimaとA. honmaiはどちらも100世代以上(10年以上)維持されており、明らかなフィットネスコストはありません。他のトルトリシドも一般的に近親交配に対して高い耐性を有するかどうかを評価するだけでは不十分であるが、2つの種は単調な環境条件(すなわち、茶畑)を適応させ、いくつかの内部共生微生物(例えば、Wolbachia11,12).2つの種の卵は容易に得られますが、それらの産卵行動はそれらの生態学に異なる原因があります。実際、湿度としわの方向は産卵卵の数に直接影響しているようで、畑の昆虫の自然史を反映している可能性があります。自然界における生物的特徴に関して、種に飼育方法を調整することが重要です。
この研究で確立されたプロトコルは、性決定された成熟胚および幼虫を用いた胚発生および分子研究の観察を可能にした。昆虫の卵は、一般に、いくつかの殻層10、19で被覆されている。さらに、H. magnanimaとA. honmaiの卵は母親の分泌物で覆われています。このような複雑な構造で卵を染色するには、分離、固定、透過処理がすべて必要なようです。H. magnanimaやA. honmaiなどの鱗片状の卵塊を産卵させるOstrinia furnacalis(Crambidae)では、単一胚を用いたPCRベースの性決定プロトコルが提案されているが、その後の解析では核酸の質と量の低さが問題となってきた6,20。対照的に、本研究は、女性特異的性クロマチンを観察した後、プールされた性決定胚から核酸を抽出することを示唆した。RNAは分解されやすく、ここで示した抽出手順はRNAの品質に影響を与えず、トランスクリプトーム解析(RNA-seq)でも確認されています。ここに示す技術は、様々な昆虫種の胚発生の研究に適用可能である。さらに、このプロトコルは、胚発生中に性特異的な欠陥を引き起こすWolbachiaなどの化学農薬または細胞内微生物の影響を評価するために使用される可能性がある6,11,12。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、未熟胚(0-3dpo)の性別は、H. magnanimaおよびA. honmaiにおける乳酸 - 酢酸オルセイン染色を用いて決定することは困難であった。これは、初期胚発生期には核の数や大きさが一般に小さく、W染色体の観察を困難にしているからである。初期胚発生中のトルトリシドの性別を明らかにするために、性染色体6,20上のマーカーの検出および定量化は、代替アプローチであり得る。第二に、性決定後に単一の個体から高純度の核酸を抽出することは、おそらく細胞数が少ないために困難であった。しかしながら、単一の胚から抽出されたRNAまたはDNAは、PCRアッセイおよび単一細胞シーケンシングなどのその後の分析に適用され得る。
要約すると、本議定書は、2つの非モデル鱗翅目害虫昆虫、 H. magnanima および A. honmaiの卵の大量飼育、形態学的観察、および遺伝子解析を記述する。これらの簡便な手法は、トルトリシッド、他の鱗翅目昆虫、および他の分類群に関するさらなる研究に応用できると期待されている。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、日本学術振興会特別研究員[助成金番号19J13123および21J00895]からの支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
