Summary
Настоящий протокол описывает метод выращивания насекомых-вредителей в лабораториях. Процедуры различения пола насекомых и извлечения нуклеиновых кислот для высокопроизводительного секвенирования установлены с использованием двух вредителей тортрицидов.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые вызывают серьезные сельскохозяйственные потери. Чтобы понять биологию таких мотыльков-вредителей, фундаментальные методы были очень востребованы. Здесь методы массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований разрабатываются с использованием двух чайных тортриксов, Homona magnanima и Adoxophyes honmai (Чешуекрылые: Tortricidae). Насекомые массово выращивались с помощью нарезанной искусственной диеты и поддерживались путем инбридинга в течение более 100 поколений, учитывая их биологические особенности. Насекомые имеют различные половые диморфизмы; следовательно, трудно различить пол на развивающихся стадиях, что помешало последующим анализам. В настоящей работе подчеркивается, что пол личинок тортрицидов может быть определен путем наблюдения за яичками или молочно-уксусным окрашиванием орцеина для визуализации женско-специфической W-хромосомы. Кроме того, используя методы определения пола, настоящее исследование позволило экстрагировать нуклеиновые кислоты из эмбрионов, определенных полом, и применять их для секвенирования с высокой пропускной способностью. Эти советы применимы для других насекомых-вредителей и облегчат дальнейшие морфологические и генетические исследования.
Introduction
Чешуекрылые насекомые составляют более 10% всех описанных живых видов1, а некоторые виды таксонов наносят серьезный ущерб растениям и серьезные сельскохозяйственные потери 2,3. Хотя молекулярные и генетические исследования были разработаны с использованием модельных насекомых, таких как шелкопряд Bombyx mori 4,5, насекомые-вредители остаются неисследованными, отчасти из-за трудностей с выращиванием и обработкой 6,7. Поэтому необходимы фундаментальные исследования и методы, чтобы понять биологию таких немодельных насекомых-вредителей.
Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей8. Из таксонов насекомых восточный чайный тортрикс Homona magnanima Diakonoff и летний фруктовый тортрикс Adoxophyes honmai Yasuda являются серьезными полифаговыми вредителями, которые, как известно, повреждают чайные деревья в Восточной Азии7. Два вида откладывают плоские и овальные чешуйчатые скопления яиц (или яичные массы), состоящие из тонких, мягких и хрупких яиц, покрытых материнскими выделениями. Хотя стадии эмбриогенеза имеют решающее значение для развития насекомых и определения пола9, структуры яиц препятствуют дальнейшему анализу понимания биологии насекомых. Важно преодолеть трудности для дальнейшего изучения вредителей, яйцекладущих такую сложную яичную массу.
Здесь, чтобы понять биологию тортрицидов, методы массового выращивания, наблюдения и молекулярные исследования были разработаны с использованием A. honmai и H. magnanima. Во-первых, методы массового выращивания поддерживают обоих рубцов более 100 поколений инбредными. Отделение яиц от сцепленной чешуйчатой яичной массы облегчило наблюдение за эмбриогенезом рубцов с использованием щелочных и органических растворителей, ранее разработанных на основе методов, используемых у мух10. Кроме того, в настоящем исследовании установлена дискриминация по признаку пола мелких эмбрионов путем разработки методов окрашивания полового хроматина самок чешуекрылых с использованием молочно-уксусного орцеина11. Комбинируя эти методы, высокое качество и количество нуклеиновых кислот извлекали из эмбрионов, определяемых полом, что в противном случае было трудно установить6. Извлеченная РНК использовалась для секвенирования следующего поколения. В совокупности методы, представленные здесь, применимы к другим чешуекрылым насекомым и другим таксонам насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор насекомых и массовое выращивание
- Собирайте тортрицидных насекомых с полей в соответствии с ранее опубликованными ссылками 8,12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. magnanima и A. honmai собирают из поврежденных чайных листьев (рисунок 1А); взрослых привлекают с помощью портативного ультрафиолетового света мощностью 4 Вт (длина волны 365 нм, см. Таблицу материалов, рисунок 1B). - Выращивайте собранных личинок (рисунок 1C, D) индивидуально на искусственной диете в чашке 1/2 унции в течение 2-3 недель до эклозии взрослого человека (рисунок 1E,F). Подтверждают пол куколок и взрослых особей по морфологическим признакам (рисунок 1G,I).
- Соедините самцов и самок в пластиковой коробке (30 см х 20 см х 5 см) для яйцекладки яйцевидных масс на парафиновой бумаге (рисунок 1J-L). Поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 мл с кусочком парафиновой бумаги, чтобы установить матрилин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать складки на парафиновой бумаге. Для H. magnanima парафиновая бумага должна быть на дне корпуса. Между тем, для A. honmai, положите бумагу на потолок корпуса для сбора яиц (рисунок 1L), так как H. magnanima яйцекладет яичную массу на верхней стороне чайных листьев, но A. honmai откладывает яйца на нижней стороне листьев8. Процедуры были также проверены на других видах тотеррикидов, и лучше размещать документы с обеих сторон, если экология и поведение целевых видов не прояснены. - Вырежьте яичные массы (примерно 100-200 яиц на яичную массу12, рисунок 1М) на парафиновой бумаге ножницами. Поместите яйца в стаканчик по 1/2 унции с сброшенной бумагой на 5-7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелый эмбрион демонстрирует угревую капсулу (рисунок 1N). Периоды эмбриогенеза по-разному относятся к тортрицидным видам, но обычно 5 дней после яйцекладки (dpo) для H. magnanima и 4 dpo для A. honmai при 25 °C при 60% относительной влажности, 16 ч света / 8 ч темных циклов7. - Хранить яичные массы с черной головкой капсул при 4-8 °C в течение 7 дней.
- Нарежьте ~60 г искусственных диет с помощью терки для массового выращивания. Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер (23 см х 16 см х 8 см). Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами (рисунок 10).
ПРИМЕЧАНИЕ: Относительная влажность ниже 30% считается более сухой, в то время как более 70% слишком влажной. Создание отверстий на крышке пластикового контейнера лучше для обеспечения лучшей вентиляции. Заполните отверстия хлопком, чтобы предотвратить побег мелких личинок. - Для устранения поверхностных загрязнений из яиц замочите яичную массу в 3% формалине и 0,2% растворе бензалкония хлорида в течение 5 мин, соответственно12. Чтобы искоренить кишечные или внутриклеточные бактерии, используйте искусственную диету, дополненную 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлоридом или 0,06% (мас./мас.) рифампицином вместо обычной искусственной диеты (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Важно замешивать Silk Mate 2S и 0,05% (мас./мас.) тетрациклина гидрохлорида или 0,06% (мас./мас.) рифампицина, равнозначно консистенции. - Соберите куколок из пластикового контейнера и различайте пол на основе морфологических12 характеристик (рисунок 1G-I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, тортрициды имеют 5-6 звезд до окукливания12. Личинкам H. magnanima и A. honmai требуется 3 недели и 2 недели соответственно после вылупления до окукливания. - Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковый ящик (30 см х 20 см х 5 см, рисунок 1К) для спаривания с 25 °C, 16 л/8 D. Соберите яйца за 5-7 дней и повторите шаги 1,4-1,9. для каждого поколения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется сбор вновь яйцекладущих яйцекладущих яичных масс для последующего анализа, установите начало и конец темного периода, например, с 9 утра до 5 вечера. В этом состоянии H. magnanima и A. honami обычно яйцекладут яйца через 5 ч (2 часа дня).
2. Отделение яиц и личинок фарата от яичных масс для фиксации, пермеабилизации и окрашивания
- Замочите яичную массу в 1000 мкл 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин или в 1000 мкл водного раствора 5 М гидроксида калия в течение 30 мин для отделения яиц.
- Вымойте отделенные яйца в 1000 мкл PBSt (137 мМ NaCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 2,68 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 0,05% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата [Tween-20] pH 7,4, см. Таблицу материалов) после ранее опубликованного отчета7.
- Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 4% раствора параформальдегида-ПБСт (мас./об.). Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин с помощью вихревого смесителя.
- Замочите яйца в смеси 500 мкл 100% гептана и 500 мкл 100% метанола. Перемешивать в течение 10 мин при 1 500 об/мин.
- Дважды промыть яйца 1000 мкл 100% метанола и хранить при 4 °C в 100% метаноле до дальнейших экспериментов (рисунок 2A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут храниться не менее 1 года при температуре 4 °C. - Замачивайте яйца последовательно в 99%, 70%, 50% этаноле и PBSt в течение 5 мин каждый для гидрофилизации после ранее опубликованного отчета7.
- Вымойте яйца с PBSt, погрузите яйца в 1 мкг/мл раствора DAPI на 5 мин, а затем дважды вымойте яйца 1x PBS. Замочите яйца в 20 мкл 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусном орцеиновом растворе (см. Таблицу материалов)11 для визуализации гетерохроматина до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет (это варьируется от 5 до 60 мин) (рисунок 2B,C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Периоды окрашивания молочно-уксусного орцеина зависят от температуры и влажности. Лучше проверить правильность окрашивания с помощью микроскопа с увеличением 4х-10х. - Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку. Заключите витражные яйца в антизатухающий реагент (см. Таблицу материалов) и покровное стекло7.
- Извлеките фарат H. magnanima и личинки A. honmai (через 4-5 дней после яйцекладки (dpo)) из яичных масс с помощью щипцов (рисунок 2D). Разделите личинок пополам на стеклянной горке (рисунок 2Е).
- Фиксируют любые ткани (например, субэзофагеальные ганглии, грудные ганглии, мальпигиевы канальцы и др.) смесью 1:3 (v/v) 99,7% уксусной кислоты/100% метанола в течение 5 мин. Окрашивают их 1,25% (мас./мас.) молочно-уксусным орцеиномраствором 11 до окрашивания ядер (это может занять 5-60 мин, в зависимости от температуры и влажности).
- Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием (женским) или отсутствием (мужской) гетерохроматина (W-хромосома, рисунок 2F, G) под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пол определяется путем визуализации полового хроматина. Каждая клетка представляет собой половой хроматин в виде точки у самок 11,12, в то время как оставшаяся часть фаратных личиночных тканей (не фиксированная) должна быть немедленно погружена в буфер лизиса клеток12 (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) или фенолсодержащие реагенты экстракции РНК для экстракции ДНК или РНК. Перед рассечением дозируйте 20 мкл реагентов в 0,2 мл ПЦР-пробирок заранее (рисунок 3А). Погружайте и храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшей экстракции. Образцы могут храниться не менее 3 месяцев, но лучше приступить к последующим экспериментам, чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот.
3. Извлечение ДНК и РНК из половых детерминированных личинок фарата
- Объедините 12 определяемых полом мужских или женских личинок фарата (эмбрион 5 дпо) и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК (см. этап 2.11 и Таблицу материалов) в одну трубку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.2-3.7 для экстракции ДНК и шаги 3.8-3.11 для экстракции РНК. - Гомогенизировать ткани в 600 мкл буфера лизиса клеток (10 мМ Tris-HCl, 100 мМ ЭДТА и 1% SDS, рН 8,0) и центрифугировать образцы при 10 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Собирают супернатант (500 мкл) с помощью пипетки и инкубируют при 50 °C с 1,5 мкл протеиназы K (20 мг/мл, см. Таблицу материалов) в течение 5 ч на тепловом блоке.
- Обрабатывайте образцы 1,0 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы (см. Таблицу материалов) при 37 °C в течение 30 мин.
- Добавляют 200 мкл раствора осаждения белка (см. Таблицу материалов) в пробирки7, а затем центрифугу при 17 000 х г в течение 10 мин при 4°С.
- Смешайте супернатант (500 мкл) с 500 мкл 100% изопропанола, а затем центрифугу при 20 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Дважды промыть гранулированную ДНК 1000 мкл 70% этанола. Затем, высушив на воздухе (5-10 мин при комнатной температуре), растворяют ДНК в 30 мкл 10 мМ буфера Tris-Cl (рН 8,5).
- Гомогенизировать ткани в 600 мкл реагентов для экстракции РНК и добавить в пробирку 240 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте пробирки при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
- Смешайте супернатант (600 мкл) с 600 мкл 100% изопропанола и перенесите смесь в спиновую колонну кремнезема (см. Таблицу материалов). Центрифугируйте пробирки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
- Промыть колонну 750 мкл 70% этанола и дважды центрифугировать колонну по 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C.
- Загрузите в колонну 15 мкл сверхчистой дистиллированной воды. Центрифугируйте трубки при 17 900 х г в течение 1 мин при 4 °C для элюляции РНК.
- Рассчитайте и проверьте качество и количество ДНК и РНК с помощью спектрофотометра на основе ультрафиолета. Оцените чистоту нуклеиновых кислот, используя соотношения A260/A280 (нуклеиновые кислоты/белок) и A260/A230 (нуклеиновые кислоты/соли и другие загрязняющие вещества)13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экстракции РНК соблюдалась ранее опубликованная процедура12 , в результате чего приводило к фенольному загрязнению (таблица 1). Извлеченная ДНК и РНК из одного эмбриона или личинок фарата дает образцы низкого количества и низкого качества. Как правило, экстракция ДНК из 12 личинок фарата дает 100-600 нг, в то время как экстракция РНК с использованием текущего метода генерирует 900-1 500 нг, как показано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.15 являются необязательными для дальнейших анализов последовательности высокой пропускной способности. - Рассчитайте количество ДНК и РНК с помощью флуоресцентного спектрофотометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки качества для дальнейшего экспериментального применения было рассчитано соотношение количеств РНК (концентрация на основе УФ-излучения (нг/мкл)/концентрация на основе флуоресценции (нг/мкл)). Например, когда концентрации на основе УФ и флуоресценции составляют 80 нг/ул и 60 нг/ул соответственно, соотношение будет составлять 1,5 (80/60). Обычно коэффициенты ниже 1,5 указывают на достаточную чистоту для последующих применений с использованием высокопроизводительного секвенирования13. - Анализ качества РНК с помощью микрочипового электрофореза14.
- Используйте квалифицированные РНК для подготовки библиотеки РНК с помощью комплекта для подготовки библиотеки РНК (см. Таблицу материалов). Упорядочивайте библиотеки с помощью платформы, подходящей для подготовленных библиотек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание хост-линий и их обслуживание
Жизнеспособность собранных в полевых условиях личинок по-разному объясняется расположением поля, сезонами и условиями выращивания (например, 90% жизнеспособности на Тайване, Таоюань, как показано в Arai et al.12). Примерно 30%-50% пар будут генерировать следующее поколение, как обычно. Для H. magnanima и A. honmai матрилины поддерживались путем инбридинга на протяжении более 100 поколений.
Морфологические наблюдения и определение пола
Обработка гидроксидом калия (3 или 5 M KOH) или гипохлоритом натрия (1,2% Cl2 или NaClO) отделяет яйца от их сцепленных яичных масс (рисунок 2A). Более низкая концентрация реагентов не могла достичь разделения. Все этапы фиксации, пермеабилизации и окрашивания позволили визуализировать ядра с помощью раствора DAPI. Яйца, обработанные только KOH или NaClO (отделенные) без стадий фиксации и пермеабилизации, не окрашивались этими красителями7. Необработанные яичные массы H. magnanima не были окрашены. Молочно-уксусный орцеин окрашивает гетерохроматин (W-хромосому) темно-красным цветом и ядра ярко-красным цветом, как обычно (рисунок 3А). Это окрашивание позволяет легко и быстро определить пол от эмбриона 4 dpo до личинок шестой звезды. Хотя ядра были визуализированы в эмбрионах 0-3 dpo, было трудно наблюдать W-хромосому с 400-кратным увеличением.
Высококачественные ДНК и РНК были получены из определяемых полом и объединенных эмбрионов
Из 12 личинок фаратов высококачественные ДНК (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) были извлечены с общим количеством 100-600 нг (таблица 1). Хотя РНК, экстрагированную по ранее опубликованному способу12 , давала 500-1000 нг продукта с низким качеством: A260/A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (таблица 1), модифицированные протоколы с использованием спиновой колонки улучшили качество РНК, получив продукт 900-1 500 нг с A260/A280 = 1,9-2,1 и A260/A230 = 1,9-2,3 (таблица 1). Кроме того, коэффициент концентрации РНК (значения на основе УФ/флуоресценции Qbit) для модифицированного протокола был ниже 1,2, что соответствовало требованиям к качеству для секвенирования следующего поколения13. И наоборот, качество и количество нуклеиновых кислот, извлеченных из одного эмбриона, были слишком низкими, чтобы их можно было рассчитать. Интактность РНК, извлеченной из определяемых полом личинок фарата с использованием модифицированного протокола, также была подтверждена с помощью микрочипового электрофореза (рисунок 3B). Было подтверждено, что подготовленные библиотеки дают высокую оценку Q30 (таблица 2).
Рисунок 1: Обзор сбора насекомых и массового выращивания H. magnanima и A. honmai. (A) Чайные листья и гнезда, поврежденные личинкой. (B) Световая ловушка с ультрафиолетовым светом. (С,Г) Самка (C) и самец (D)6-й звездной личинки H. magnanima. Оранжевый треугольник указывает на яичко. (Э,Ф) Собранных личинок выращивали индивидуально в чашке 1/2 унции с кусочком искусственной диеты. (Г,Ч) Куколки H. magnanima (G) и A. honmai (H). Самка показана слева, в то время как самец показан справа. (I) Взрослые H. magnanima (выше) и A. honmai (ниже). Как самцы, так и самки показаны справа и слева соответственно. (Дж,К) Пластиковый пакет (J) или пластиковый чехол (K) для сбора яичной массы. (L) A. honmai яйцекладет яйца на парафиновой бумаге, помещенной на крышку, а H. magnanima откладывает яйца на парафиновой бумаге, помещенной на дно корпуса. (М,Н) Яичная масса H. magnanima. Зрелые эмбрионы демонстрируют черные головные капсулы, обозначенные белыми стрелками (N). (O) Нарезанные искусственные диеты с теркой для массового выращивания. Личинки, вылупившиеся из яиц, помещенные на нарезанный рацион, образуют куколок через 3-4 недели после вылупления при 25 °C (менее 16 ч светлого/8 ч темного цикла). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Наблюдения за эмбрионами. (A) Отделенные, фиксированные и пермеабилизированные яйца H. magnanima с использованием 5 N KOH, 4% PFA / гептан, метанол / гептан и метанол. Отделенное яйцо подсвечивается ломаными линиями. (B) Эмбрион 3 dpo окрашивали молочно-уксусным орцеином. Черный наконечник стрелки указывает на эмбрион. (C) Эмбрион 4 dpo был окрашен DAPI. Белый наконечник стрелки указывает на эмбрион. (Д,Д) Рассечение личинок фарата (5 дпо) с помощью щипцов. Личинки фарата извлекают из яичной массы (D), разделенной пополам на стеклянной горке (E). (Ф,Г) Молочно-уксусное окрашивание орцеина с помощью рассеченных личинок фарата. Самки демонстрируют гетерохроматин в виде точки (обозначенной черным наконечником стрелы (F), но у самцов отсутствует гетерохроматин (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Графическое резюме экстракции нуклеиновых кислот с использованием определяемых полом личинок фаратов и РНК качеств H. magnanima и A. honmai. (А) Ткани рассеченных личинок фарата на стеклянных предметных стеклах окрашивали молочно-уксусным орцеином для определения их пола. Остальные ткани были пропитаны реагентами, объединены в одну трубку, отсортированную по полу людей, а затем подвергнуты экстракции ДНК / РНК. (B) Качество РНК, извлеченной из 12 самцов H. magnanima или A. honmai , оценивали с использованием системы электрофореза микрочипа. Сокращения: [nt], размер нуклеотидов; [FU], флуоресцентный блок; М, молекулярный маркер; Хм, Х. Маньянима; Ad, A. honmai. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Концентрация и качество нуклеиновых кислот, извлеченных из половых определяемых личинок фарата H. magnanima. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Качества РНК-секвенирования необработанных данных. 1 См. Q20 (%) указывает на вероятность считывания с точностью считывания 99%. 2 См. Q30 (%) указывает на вероятность считывания с точностью считывания 99,9%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid включает в себя несколько сельскохозяйственных и лесных вредителей; в настоящем исследовании представлены методы выращивания черепахи на протяжении поколений, наблюдения за эмбриогенезом и полом насекомых и проведения молекулярного анализа с использованием зрелых эмбрионов.
Одним из препятствий для изучения насекомых-вредителей является установление методов выращивания. Тем более, что инбридинг иногда негативно влияет на приспособленность вида. Снижение приспособленности инбредным телом, называемое депрессией инбридинга, широко наблюдалось у различных растений и животных, включая насекомых 15,16,17,18. Как уже отмечалось, и H. magnanima, и A. honmai поддерживались на протяжении более 100 поколений (более 10 лет) без каких-либо очевидных затрат на фитнес. Хотя недостаточно оценить, имеют ли другие тортрициды также высокую толерантность к инбридингу в целом, эти два вида, возможно, развили характеристики, адаптируя монотонные условия окружающей среды (т.е. чайные плантации) и против нескольких эндосимбиотических микроорганизмов (например, Wolbachia 11,12). ). Яйца двух видов легко получить, но их поведение яйцекладки по-разному объясняется их экологией. Действительно, влажность и направление складок, по-видимому, напрямую влияют на количество яйцекладущих яиц, что может отражать естественную историю насекомых на полях. Важно корректировать методы выращивания видов с учетом их биологических особенностей в природе.
Протоколы, установленные в этом исследовании, позволили наблюдать эмбриогенез и молекулярные исследования с использованием определяемых полом зрелых эмбрионов и личинок. Яйца насекомых, как правило, покрыты несколькими слоями скорлупы10,19. Кроме того, яйца H. magnanima и A. honmai покрыты материнскими выделениями. Чтобы окрасить яйца такой сложной структурой, разделение, фиксация и пермеабилизация кажутся всем необходимым. В Ostrinia furnacalis (Crambidae), которая яйцекладет чешуйчатую яичную массу, такую как H. magnanima и A. honmai, были предложены протоколы определения пола на основе ПЦР с использованием одиночных эмбрионов, но низкое качество и количество нуклеиновых кислот были проблемой для последующего анализа 6,20. В отличие от этого, настоящее исследование предложило извлекать нуклеиновые кислоты из объединенных эмбрионов, определяемых полом, после наблюдения за женским половым хроматином. РНК легко деградируют, и показанная здесь процедура экстракции не повлияла на качество РНК, что также было подтверждено анализом транскриптома (RNA-seq). Приведенные здесь методики применимы для исследований эмбриогенеза различных видов насекомых. Кроме того, протоколы могут быть использованы для оценки воздействия химических пестицидов или внутриклеточных микробов, таких как Wolbachia, которая вызывает специфические для пола дефекты во время эмбриогенеза 6,11,12.
Настоящее исследование имеет ряд ограничений. Во-первых, пол незрелых эмбрионов (0-3 дпо) было трудно определить с помощью молочно-уксусного орцеинового окрашивания у H. magnanima и A. honmai. Это связано с тем, что количество и размер ядер, как правило, малы во время раннего эмбриогенеза, что затрудняет наблюдение W-хромосомы. Для уточнения пола тортрицидов во время раннего эмбриогенеза, обнаружение и количественная оценка маркеров на половых хромосомах 6,20 может быть альтернативным подходом. Во-вторых, было трудно извлечь нуклеиновые кислоты высокой чистоты из одного человека после определения пола, возможно, из-за небольшого количества клеток. Однако РНК или ДНК, извлеченные из одного эмбриона, могут применяться к последующим анализам, таким как ПЦР-анализы и секвенирование одиночных клеток.
Таким образом, настоящий протокол описывает массовое выращивание, морфологические наблюдения и генетический анализ яиц двух немодельных чешуекрылых насекомых-вредителей, H. magnanima и A. honmai. Ожидается, что эти простые методы будут применимы для дальнейших исследований тортрицидов, других чешуекрылых насекомых и других таксонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Исследовательских стипендий японского общества содействия развитию науки (JSPS) для молодых ученых [номер гранта 19J13123 и 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
