Summary
Det föreliggande protokollet beskriver uppfödningsmetoden för tortricid skadedjursinsekter i laboratorierna. Förfarandena för att särskilja insekters kön och extrahera nukleinsyror för sekvensering med hög genomströmning fastställs med hjälp av två tortricid skadedjur.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), allmänt känd som tortrix eller bladrullemalar, omfattar många jordbruks- och skogsbruksskadegörare som orsakar allvarliga jordbruksförluster. För att förstå biologin hos sådana skadedjursmoths har grundläggande tekniker varit i hög efterfrågan. Här utvecklas metoder för massuppfödning, observationer och molekylära studier med hjälp av två tetortrix, Homona magnanima och Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insekter massuppföddes med skivad konstgjord kost och upprätthölls genom inavel i över 100 generationer genom att överväga deras biologiska egenskaper. Insekter har olika könsdimorfismer; därför är det svårt att skilja könet under utvecklingsstadierna, vilket har förhindrat efterföljande analyser. Det föreliggande arbetet belyste att könet på tortricidlarver kunde bestämmas genom att observera testiklar eller mjölk-ättiksyra orceinfärgning för att visualisera den kvinnospecifika W-kromosomen. Dessutom, med hjälp av könsbestämningsmetoderna, möjliggjorde den aktuella studien nukleinsyraextraktioner från könsbestämda embryon och applicering mot sekvensering med hög genomströmning. Dessa tips är tillämpliga för andra skadeinsekter och kommer att underlätta ytterligare morfologiska och genetiska studier.
Introduction
Lepidopteraninsekter utgör mer än 10 % av alla beskrivna levande arter1, och vissa taxaarter orsakar allvarliga skador på växter och allvarliga jordbruksförluster 2,3. Även om molekylära och genetiska studier har utvecklats med hjälp av modellinsekter som silkesmasken Bombyx mori 4,5, förblir skadeinsekter outredda, delvis på grund av svårigheterna att föda upp och hantera 6,7. Därför är grundläggande studier och tekniker nödvändiga för att förstå biologin hos sådana icke-modellskadegörare.
Tortricidae (Lepidoptera), allmänt känd som tortrix eller bladrullemalar, omfattar många jord- och skogsbruksskadegörare8. Av insektstaxan är den orientaliska tetortrix homona magnanima Diakonoff och sommarfrukten tortrix Adoxophyes honmai Yasuda allvarliga polyfagiska skadedjur som är kända för att skada teträd i Östasien7. De två arterna lägger platta och ovala skalliknande äggkluster (eller äggmassor) bestående av tunna, mjuka och ömtåliga ägg täckta av moderns sekret. Även om embryogenesstadier är avgörande för insektsutveckling och könsbestämningar9, hindrar äggens strukturer ytterligare analys från att förstå insekternas biologi. Det är viktigt att övervinna svårigheterna för vidare studier av skadedjur som ovipositerar en sådan komplex äggmassa.
Här, för att förstå tortricids biologi, har metoder för massuppfödning, observationer och molekylära studier utvecklats med hjälp av A. honmai och H. magnanima. För det första upprätthåller massuppfödningsmetoder båda tortriciderna över 100 generationer av inavlade. Separationen av ägg från den sammanfogade skalliknande äggmassan underlättade embryogenesobservationen av tortriciderna med användning av alkaliska och organiska lösningsmedel som tidigare utvecklats från tekniker som används i flugor10. Dessutom fastställde den föreliggande studien könsdiskriminering av små embryon genom att utveckla färgningsmetoder för könskromatin hos lepidopterankvinnor med användning av mjölk-ättiksyraorcein11. Genom att kombinera dessa metoder extraherades nukleinsyror av hög kvalitet och kvantitet från könsbestämda embryon, vilket annars var svårt att fastställa6. Det extraherade RNA användes för nästa generations sekvensering. Sammantaget gäller de metoder som presenteras här för andra lepidopteraninsekter och andra insektstaxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektsinsamling och massuppfödning
- Samla tortricidinsekter från fält efter tidigare publicerade Referenser 8,12.
OBS: H. magnanima och A. honmai larver samlas in från skadade teblad (figur 1A); Vuxna lockas med 4 W bärbart UV-ljus (365 nm våglängd, se Materialtabell, figur 1B). - Baka de uppsamlade larverna (figur 1C,D) individuellt på en bit konstgjord diet i en 1/2-oz kopp i 2-3 veckor tills vuxen eclosion (Figur 1E,F). Bekräfta könet hos puppor och vuxna med morfologiska egenskaper (figur 1G,I).
- Para männen och kvinnorna i en plastlåda (30 cm x 20 cm x 5 cm) för att oviposit äggmassor på ett paraffinpapper (Figur 1J-L). Placera en hona och två hanar i en 120 ml plastkopp med en bit paraffinpapper för att skapa en matrilin.
OBS: Det är viktigt att göra veck på paraffinpapperet. För H. magnanima måste paraffinpapper vara på botten av fodralet. Under tiden, för A. honmai, lägg ett papper på fodralets tak för att samla ägg (Figur 1L) eftersom H. magnanima oviposit äggmassa på ovansidan av teblad, men A. honmai lägger ägg på undersidan av bladen8. Förfarandena verifierades också i andra tortricidarter, och det är bättre att placera papper på båda sidor om ekologin och beteendet hos målarten är oklara. - Skär ut äggmassorna (cirka 100-200 ägg per äggmassa12, figur 1M) på paraffinpapperet med sax. Lägg äggen i en 1/2 oz kopp med dumpat papper i 5-7 dagar.
OBS: Det mogna embryot uppvisar en pormaskar kapsel (Figur 1N). Perioderna av embryogenes tillskrivs olika tortricidarter, men i allmänhet 5 dagar efter oviposition (dpo) för H. magnanima och 4 dpo för A. honmai vid 25 ° C med 60% relativ fuktighet, 16 h ljus / 8 h mörka cykler7. - Förvara äggmassorna som visar svarta huvudkapslar vid 4-8 ° C i 7 dagar.
- Skiva ~ 60 g konstgjorda dieter med ett rivjärn för massuppfödning. Placera äggmassan fylld med mogna embryon på den skivade konstgjorda kosten i en plastbehållare (23 cm x 16 cm x 8 cm). Lägg paraffinpapper på äggmassan med de skivade dieterna (Figur 10).
OBS: Under 30% relativ luftfuktighet anses vara över torr, medan över 70% är för fuktig. Att skapa hål på plastbehållarens lock är bättre för att möjliggöra bättre ventilation. Fyll hålen med bomull för att förhindra att små larver flyr. - För att eliminera ytföroreningar från ägget, blötlägg äggmassan i 3% formalin och 0,2% Bensalkoniumkloridlösning i 5 min respektive12. För att utrota tarm- eller intracellulära bakterier, använd en artificiell diet kompletterad med 0,05% (w / w) tetracyklinhydroklorid eller 0,06% (w / w) rifampicin istället för en normal artificiell diet (se Materialtabell).
OBS: Det här steget är valfritt. Det är viktigt att knåda Silk Mate 2S och 0,05% (w/w) tetracyklinhydroklorid eller 0,06% (w/w) rifampicin lika med samma konsistens. - Samla popparna från plastbehållaren och särskilja könet baserat på morfologiska12 egenskaper (figur 1G-I).
OBS: I allmänhet presenterar tortricids 5-6 instars fram till valp12. H. magnanima och A. honmai larverna tar 3 veckor respektive 2 veckor efter kläckning tills valp. - Placera 15 hanar och 10 honor i en plastlåda (30 cm x 20 cm x 5 cm, figur 1K) för parning med 25 °C, 16 L/8 D. Samla ägg per 5-7 dagar och upprepa steg 1,4-1,9. för varje generation.
OBS: Om det behövs insamling av nyligen ovipositerade äggmassor för efterföljande analys, ställ in den mörka periodens början och slut, t.ex. från 9:00 till 17:00. I detta tillstånd oviposit ägg efter 5 timmar (2 PM) brukar H.
2. Separation av ägg och faratlarver från äggmassor för fixering, permeabilisering och färgning
- Blötlägg äggmassan i 1 000 μL 1,2 % natriumhypoklorit vattenlösning i 10 min eller i 1 000 μL 5 M kaliumhydroxid vattenlösning i 30 min för att separera äggen.
- Tvätta de separerade äggen i 1 000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05 % polyoxietylen (20) Sorbitan monolaurat [Tween-20] pH 7,4, se materialtabell) enligt den tidigare publicerade rapporten7.
- Blötlägg ägg i en blandning av 500 μL 100% heptan och 500 μL 4% paraformaldehyd-PBSt-lösning (w/v). Blanda i 10 min vid 1 500 rpm med en virvelblandare.
- Blötlägg äggen i en blandning av 500 μL 100% heptan och 500 μL 100% metanol. Blanda i 10 min vid 1 500 v/min.
- Tvätta äggen två gånger med 1 000 μL 100 % metanol och förvara vid 4 °C i 100 % metanol tills ytterligare experiment (figur 2A).
OBS: Äggen kan lagras i minst 1 år vid 4 °C. - Blötlägg äggen sekventiellt i 99%, 70%, 50% etanol och PBSt i 5 minuter vardera för hydrofilisering enligt den tidigare publicerade rapporten7.
- Tvätta äggen med PBSt, sänk ner äggen i 1 μg / ml DAPI-lösning i 5 minuter och tvätta sedan äggen med 1x PBS två gånger. Blötlägg äggen i 20 μL av 1,25% (w/w) mjölk-ättisk orceinlösning (se materialtabell)11 för att visualisera heterokromatin tills kärnorna uppvisar en lysande röd färg (detta varierar från 5-60 min) (figur 2B,C).
OBS: Mjölk-ättiksyra orceinfärgningsperioder beror på temperatur och fuktighet. Det är bättre att kontrollera om det finns korrekt färgning med ett mikroskop med 4x-10x förstoring. - Överför de färgade äggen med en pipett till en glasskiva. Bifoga de färgade äggen med antifadereagens (se Materialtabell) och ett täckglas7.
- Extrahera farat H. magnanima och A. honmai larver (4-5 dagar efter oviposition (dpo)) från äggmassorna med hjälp av pincett (Figur 2D). Bisektlarver på en glasrutschbana (figur 2E).
- Fixa eventuella vävnader (t.ex. suboesofageal ganglion, bröstkorgsganglier, malpighian tubule, etc.) med en blandning av 1: 3 (v / v) 99,7% ättiksyra / 100% metanol i 5 min. Fläck de med 1,25% (w/w) mjölk-ättiksyra orceinlösning11 tills kärnorna är färgade (detta kan ta 5-60 min, beroende på temperatur och fuktighet).
- Bestäm könet på varje prov genom att observera närvaron (kvinnlig) eller frånvaron (manlig) av heterokromatin (W-kromosomen, figur 2F,G) under ett mikroskop.
OBS: Könet bestäms genom att visualisera könskromatinet. Varje cell representerar könskromatinet som en punkt hos kvinnor11,12, medan den återstående delen av faratlarvvävnader (ej fixerad) omedelbart ska nedsänkas i celllysbuffert12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA och 1% SDS, pH 8,0) eller fenolhaltiga RNA-extraktionsreagens för antingen DNA- eller RNA-extraktion. Före dissektionerna, dosera 20 μL av reagenserna i 0,2 ml PCR-rör i förväg (figur 3A). Sänk ned och förvara proverna vid -80 °C tills ytterligare extraktion. Proverna kan lagras i minst 3 månader, men det är bättre att fortsätta med nedströmsexperimenten för att förhindra nedbrytning av nukleinsyror.
3. DNA- och RNA-extraktioner från könsbestämda faratlarver
- Slå samman 12 könsbestämda manliga eller kvinnliga faratlarver (5 dpo-embryon) och tillsätt antingen celllysbuffert eller RNA-extraktionsreagens (se steg 2.11 och materialtabell) i ett 1,5 ml rör.
OBS: Följ steg 3.2-3.7 för DNA-extraktion och steg 3.8-3.11 för RNA-extraktion. - Homogenisera vävnader i 600 μL av celllysbufferten (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA och 1% SDS, pH 8,0) och centrifugera proverna vid 10 000 x g i 5 min vid 4 ° C.
- Samla supernatanten (500 μL) med en pipett och inkubera vid 50 °C med 1,5 μL proteinas K (20 mg/ml, se materialförteckningen) i 5 timmar på ett värmeblock.
- Behandla proverna med 1,0 μL 10 mg/ml RNas-lösning (se materialförteckningen) vid 37 °C i 30 minuter.
- Tillsätt 200 μL proteinutfällningslösning (se materialtabell) till rören7, följt av en centrifug vid 17 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Blanda supernatanten (500 μL) med 500 μL 100 % isopropanol och centrifugera sedan vid 20 400 x g i 10 min vid 4 °C.
- Tvätta det pelleterade DNA:t två gånger med 1 000 μL 70 % etanol. Därefter lufttorkar (5-10 min vid rumstemperatur) lös upp DNA i 30 μL av 10 mM Tris-Cl-buffert (pH 8,5).
- Homogenisera vävnaderna i 600 μL RNA-extraktionsreagens och tillsätt 240 μL ultrarent destillerat vatten till röret. Centrifugera rören vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Blanda supernatanten (600 μL) med 600 μL 100% isopropanol och överför blandningen till en kiseldioxidspinnkolonn (se Materialtabell). Centrifugera rören vid 17 900 x g i 1 min vid 4 °C.
- Tvätta kolonnen med 750 μL 70 % etanol och centrifugera kolonnen två gånger vid 17 900 x g i 1 min vardera vid 4 °C.
- Lägg 15 μL ultrarent destillerat vatten i kolonnen. Centrifugera rören vid 17 900 x g i 1 min vid 4 ° C för att eluera RNA.
- Beräkna och verifiera kvaliteten och kvantiteten av DNA och RNA med hjälp av en UV-baserad spektrofotometer. Bedöm renheten hos nukleinsyror med hjälp av förhållandena A260/A280 (nukleinsyror/protein) och A260/A230 (nukleinsyror/salter och andra föroreningar)13.
OBS: För RNA-extraktion följdes det tidigare publicerade förfarandet12 , vilket resulterade i fenolkontaminering (tabell 1). Det extraherade DNA och RNA från ett enda embryo eller faratlarver ger prover av låg mängd och låg kvalitet. Typiskt ger DNA-extraktion från 12 faratlarver 100-600 ng, medan RNA-extraktion med den aktuella metoden genererar 900-1 500 ng, som visas tabell 1.
OBS: Steg 3.13–3.15 är valfria för ytterligare analyser av sekvenseringar med högt dataflöde. - Beräkna mängderna DNA och RNA med hjälp av en fluorescensbaserad spektrofotometer.
OBS: Förhållandet mellan RNA-kvantiteter (UV-baserad koncentration (ng / μL) / fluorescensbaserad koncentration (ng / μL)) beräknades för att bedöma kvaliteten för ytterligare experimentell tillämpning. Till exempel, när UV- och fluorescensbaserade koncentrationer är 80 ng / uL respektive 60 ng / uL, kommer förhållandet att vara 1,5 (80/60). Vanligtvis indikerar förhållanden under 1,5 tillräcklig renhet för nedströmsapplikationer som använder sekvensering med högt dataflöde13. - Analysera kvaliteten på RNA med hjälp av mikrochipelektrofores14.
- Använd de kvalificerade RNA: erna för att förbereda RNA-biblioteket med hjälp av ett RNA-biblioteksberedningssats (se Materialtabell). Sekvensera biblioteken med hjälp av en plattform som är lämplig för de förberedda biblioteken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Upprättande av värdlinjer och underhåll av dessa
Livskraften hos fältinsamlade larver tillskrivs olika fältplats, årstider och uppfödningsförhållanden (t.ex. 90% av livskraften i Taiwan, Taoyuan, som visas i Arai et al.12). Cirka 30% -50% av paren kommer att generera nästa generation som vanligt. För H. magnanima och A. honmai har matriliner upprätthållits genom inavel i över 100 generationer.
Morfologiska observationer och könsbestämningar
Behandlingen med antingen kaliumhydroxid (3 eller 5 M KOH) eller natriumhypoklorit (1,2%Cl2 eller NaClO) separerar ägg från deras sammanfogade äggmassor (Figur 2A). Den lägre koncentrationen av reagenserna kunde inte uppnå separation. Alla fixerings-, permeabiliserings- och färgningssteg möjliggjorde visualisering av kärnor med DAPI-lösning. Äggen som behandlades med endast KOH eller NaClO (separerade) utan fixerings- och permeabiliseringssteg färgades inte med dessa färgämnen7. Icke-behandlade H. magnanima äggmassor färgades inte. Mjölk-ättiksyraorcein fläckar heterokromatin (W-kromosom) med en mörkröd färg och kärnor med en ljus röd färg som vanligt (Figur 3A). Denna färgning möjliggör enkel och snabb könsbestämning från 4 dpo embryo till sjätte instar larver. Även om kärnor visualiserades i 0-3 dpo-embryon var det svårt att observera W-kromosomen med 400x förstoring.
Högkvalitativt DNA och RNA erhölls från könsbestämda och poolade embryon
Från 12 faratlarver, högkvalitativt DNA (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) extraherades med 100-600 ng i total mängd (tabell 1). Även om RNA extraherat enligt den tidigare publicerade metoden12 gav 500-1000 ng produkt med låg kvalitet: A260 / A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (tabell 1), de modifierade protokollen med användning av en spinnkolonn förbättrade RNA-kvaliteten och producerade 900-1 500 ng-produkt med A260/A280 = 1,9-2,1 och A260/A230 = 1,9-2,3 (tabell 1). Dessutom var RNA-koncentrationsförhållandet (UV-baserade / Qbit-fluorescensbaserade värden) för det modifierade protokollet under 1,2, vilket uppfyllde kvalitetskraven för nästa generations sekvensering13. Omvänt var kvaliteten och kvantiteten av nukleinsyror extraherade från ett enda embryo för låg för att kunna beräknas. Intaktiteten hos RNA extraherat från könsbestämda faratlarver med användning av det modifierade protokollet bekräftades också med hjälp av mikrochipelektrofores (figur 3B). De förberedda biblioteken bekräftades ge höga Q30-poängläsningar (tabell 2).
Figur 1: Översikt över insektsinsamling och massuppfödning av H. magnanima och A. honmai. (A) Teblad och bon som skadats av en larv. (B) Ljusfälla med UV-ljus. (C,D) En hona (C) och en hane (D) 6:e instarlarv av H. magnanima. Den orange triangeln indikerar testiklarna. (E,F) Samlade larver uppföddes individuellt i en 1/2 oz kopp med en bit konstgjord diet. (G,H) Puppor av H. magnanima (G) och A. honmai (H). Honan visas till vänster, medan hanen visas till höger. (I) Vuxna av H. magnanima (ovan) och A. honmai (nedan). Både män och kvinnor visas till höger respektive vänster. (J,K) En plastpåse (J) eller plastfodral (K) för insamling av äggmassa. (L) A. honmai ovipositägg på paraffinpapper placerade på locket, och H. magnanima lägger ägg på paraffinpapper placerat på botten av fodralet. (M,N) Äggmassa av H. magnanima. De mogna embryona uppvisar svarta huvudkapslar indikerade med vita pilar (N). (O) Skivade konstgjorda dieter med rivjärn för massuppfödning. Larverna som kläckts från ägg, placerade på skivad diet, kommer att bilda puppor 3-4 veckor efter kläckning vid 25 ° C (under 16 h ljus / 8 h mörk cykel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Observationer av embryon. (A) De separerade, fasta och permeabiliserade äggen av H. magnanima med användning av 5 N KOH, 4% PFA / heptan, metanol / heptan och metanol. Ett separerat ägg markeras med brutna linjer. (B) 3 dpo-embryot färgades med mjölk-ättiksyraorcein. Den svarta pilspetsen indikerar embryot. (C) Embryot på 4 dpo färgades med DAPI. Den vita pilspetsen indikerar embryot. (D,E) Dissektion av faratlarver (5 dpo) med pincett. Faratlarverna extraheras från äggmassa (D), skärs på en glasskiva (E). (F,G) Mjölk-ättiksyra orceinfärgning med användning av de dissekerade faratlarverna. Kvinnor uppvisar heterokromatin som en prick (indikeras med svart pilspets, (F), men män saknar heterokromatin (G). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Grafisk sammanfattning av nukleinsyraextraktion med användning av könsbestämda faratlarver och RNA-egenskaper hos H. magnanima och A. honmai. (A) Vävnader från dissekerade faratlarver på glasrutschbanor färgades med mjölk-ättikorcein för att bestämma deras kön. De återstående vävnaderna blötläggdes i reagenser, poolades i ett rör sorterat efter individernas kön och utsattes sedan för DNA / RNA-extraktion. (B) Kvaliteten på RNA extraherat från 12 manliga H. magnanima eller A. honmai bedömdes med hjälp av ett mikrochipelektroforessystem. Förkortningar: [nt], nukleotidstorlek; [FU], fluorescensenhet; M, molekylär markör; Hm, H. magnanima; Annons, A. honmai. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Koncentration och kvalitet av nukleinsyror extraherade från könsbestämda faratlarver av H. magnanima. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Kvaliteter av RNA-sekvensering av rådata. 1 Q20 (%) anger sannolikheten för läsningar med 99% läsnoggrannhet. 2 Q30 (%) indikerar sannolikheten för läsningar med 99,9% läsnoggrannhet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid omfattar flera jord- och skogsbruksskadegörare; den föreliggande studien presenterade metoder för att baka tortrix över generationer, observera embryogenes och kön hos insekterna och genomföra molekylär analys med mogna embryon.
Ett av hindren för skadedjursbekämpning är att etablera uppfödningsmetoder. Speciellt påverkar inavel ibland artens kondition negativt. Konditionsminskningen av inavlade, kallad inavelsdepression, har i stor utsträckning observerats hos olika växter och djur, inklusive insekter 15,16,17,18. Som nämnts har både H. magnanima och A. honmai bibehållits i över 100 generationer (mer än 10 år) utan några uppenbara fitnesskostnader. Även om det inte räcker att bedöma om andra tortricider också har en hög tolerans mot inavel i allmänhet, kan de två arterna ha utvecklat egenskaperna genom att anpassa monotona miljöförhållanden (dvs. teplantager) och mot flera endosymbiotiska mikroorganismer (t.ex. Wolbachia 11,12 ). Äggen från de två arterna är lätta att erhålla, men deras ovipositionsbeteenden är annorlunda hänförliga till deras ekologi. Faktum är att fuktighet och veckriktning verkar direkt påverka antalet ägglossade ägg, vilket kan återspegla insekternas naturliga historier i fält. Det är viktigt att anpassa uppfödningsmetoderna till arter med avseende på deras biologiska egenskaper i naturen.
Protokollen som fastställdes i denna studie möjliggjorde observation av embryogenes och molekylära studier med könsbestämda mogna embryon och larver. Insektsäggen är i allmänhet belagda med flera skalskikt10,19. Dessutom är ägg av H. magnanima och A. honmai täckta med moderns sekret. För att fläcka äggen med en sådan komplex struktur verkar separation, fixering och permeabilisering vara allt som behövs. I Ostrinia furnacalis (Crambidae), som ovipositer skalliknande äggmassa som H. magnanima och A. honmai, har PCR-baserade könsbestämningsprotokoll med hjälp av enskilda embryon föreslagits, men den låga kvaliteten och kvantiteten av nukleinsyror har varit ett problem för efterföljande analys 6,20. Däremot föreslog den föreliggande studien att extrahera nukleinsyror från poolade könsbestämda embryon efter att ha observerat kvinnospecifikt könskromatin. RNA bryts lätt ned, och extraktionsproceduren som visas här påverkade inte RNA: s kvalitet, vilket också har bekräftats av transkriptomanalysen (RNA-seq). De tekniker som visas här är tillämpliga för studier av embryogenes av olika insektsarter. Dessutom har protokollen potential att användas för att bedöma effekterna av kemiska bekämpningsmedel eller intracellulära mikrober som Wolbachia, vilket orsakar könsspecifika defekter under embryogenes 6,11,12.
Den aktuella studien har flera begränsningar. För det första var könet hos omogna embryon (0-3 dpo) svårt att bestämma med hjälp av mjölk-ättiksyraorceinfärgning i H. magnanima och A. honmai. Detta beror på att antalet och storleken på kärnorna i allmänhet är små under tidig embryogenes, vilket gör det svårt att observera W-kromosomen. För att klargöra tortricidernas kön under tidig embryogenes kan detektion och kvantifiering av markörer på könskromosomer 6,20 vara ett alternativt tillvägagångssätt. För det andra var det svårt att extrahera nukleinsyror med hög renhet från en enda individ efter könsbestämning, möjligen på grund av det lilla antalet celler. RNA eller DNA som extraheras från ett enda embryo kan dock tillämpas på efterföljande analyser såsom PCR-analyser och encellssekvenseringar.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll massuppfödning, morfologiska observationer och genetiska analyser av ägg från två icke-modellerade lepidopteran-skadeinsekter, H. magnanima och A. honmai. Dessa enkla tekniker förväntas vara tillämpliga för vidare forskning om tortricid, andra lepidopterans insekter och andra taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Grant Number 19J13123 and 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
