Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Tortricidae कीट कीटों में बड़े पैमाने पर पालन और आणविक अध्ययन

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/63737
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Agriculture and Technology

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं में टॉट्रिसिड कीट कीटों के पालन की विधि का वर्णन करता है। कीटों के लिंग को अलग करने और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए न्यूक्लिक एसिड निकालने की प्रक्रियाओं को दो टॉट्रिसिड कीटों का उपयोग करके स्थापित किया जाता है।

Abstract

Tortricidae (Lepidoptera), जिसे आमतौर पर tortrix या leafroller पतंगों के रूप में जाना जाता है, में कई कृषि और वानिकी कीट शामिल हैं, जो गंभीर कृषि नुकसान का कारण बनते हैं। इस तरह के कीट पतंगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए, मौलिक तकनीकों की उच्च मांग रही है। यहां, बड़े पैमाने पर पालन- पोषण, अवलोकन और आणविक अध्ययन के लिए विधियां दो चाय टॉर्ट्रिक्स, होमोना मैग्नानिमा और एडोक्सोफाइज होनमाई (लेपिडोप्टेरा: टॉर्ट्रिसिडी) का उपयोग करके विकसित की जाती हैं। कीटों को कटा हुआ कृत्रिम आहार के साथ बड़े पैमाने पर पाला जाता था और उनकी जैविक विशेषताओं पर विचार करके 100 से अधिक पीढ़ियों तक इनब्रीडिंग द्वारा बनाए रखा जाता था। कीटों में विभिन्न सेक्स द्विरूपताएं होती हैं; इसलिए विकासशील चरणों के दौरान सेक्स को अलग करना मुश्किल है, जिसने बाद के assays को रोका है। वर्तमान कार्य ने इस बात पर प्रकाश डाला कि टॉर्ट्रिसिड लार्वा के लिंग को महिला-विशिष्ट डब्ल्यू गुणसूत्र की कल्पना करने के लिए वृषण या लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन स्टेनिंग को देखकर निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, लिंग निर्धारण विधियों का उपयोग करते हुए, वर्तमान अध्ययन ने लिंग निर्धारित भ्रूण से न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण की ओर आवेदन को सक्षम किया। ये युक्तियाँ अन्य कीट कीटों के लिए लागू होती हैं और आगे के रूपात्मक और आनुवंशिक अध्ययन की सुविधा प्रदान करेंगी।

Introduction

लेपिडोप्टेरन कीड़े सभी वर्णित जीवित प्रजातियों के 10% से अधिक का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कुछ टैक्सा प्रजातियां पौधों को गंभीर नुकसान पहुंचाती हैं और गंभीर कृषि नुकसान 2,3। यद्यपि आणविक और आनुवांशिक अध्ययन मॉडल कीड़ों का उपयोग करके विकसित किए गए हैं जैसे कि रेशम कीट बॉम्बिक्स मोरी 4,5, कीट कीड़े अनपेक्षित रहते हैं, आंशिक रूप से 6,7 के पालन और हैंडलिंग के लिए कठिनाइयों के कारण। इसलिए, ऐसे गैर-मॉडल कीट कीटों के जीव विज्ञान को समझने के लिए मौलिक अध्ययन और तकनीकें आवश्यक हैं।

Tortricidae (Lepidoptera), जिसे आमतौर पर tortrix या leafroller पतंगों के रूप में जाना जाता है, में कई कृषि और वानिकी कीटशामिल हैं। कीट टैक्सा में से, ओरिएंटल चाय tortrix Homona magnanima Diakonoff और गर्मियों के फल tortrix Adoxophyes honmai Yasuda गंभीर polyphagous कीट हैं जो पूर्वी एशिया7 में चाय के पेड़ों को नुकसान पहुंचाने के लिए जाने जाते हैं। दो प्रजातियां फ्लैट और अंडाकार पैमाने जैसे अंडे समूहों (या अंडे के द्रव्यमान) को रखती हैं, जिसमें मातृ स्राव द्वारा कवर किए गए पतले, नरम और नाजुक अंडे होते हैं। यद्यपि भ्रूणजनन चरण कीट विकास और लिंग निर्धारण9 के लिए महत्वपूर्ण हैं, अंडे की संरचनाएं कीटों के जीव विज्ञान को समझने से आगे के विश्लेषण को रोकती हैं। इस तरह के जटिल अंडे द्रव्यमान को रोकने वाले कीटों पर आगे के अध्ययन के लिए कठिनाइयों को दूर करना महत्वपूर्ण है।

यहां, टॉर्ट्रिसिड के जीव विज्ञान को समझने के लिए, बड़े पैमाने पर पालन, टिप्पणियों और आणविक अध्ययनों के लिए विधियों को ए होनमाई और एच मैग्नानिमा का उपयोग करके विकसित किया गया है। सबसे पहले, बड़े पैमाने पर पालन करने के तरीके इनब्रीड द्वारा 100 पीढ़ियों से अधिक टॉट्रिसिड दोनों को बनाए रखते हैं। concatenated पैमाने की तरह अंडे द्रव्यमान से अंडे के अलगाव ने पहले मक्खियों में उपयोग की जाने वाली तकनीकों से विकसित क्षारीय और कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके टॉर्ट्रिसिड के भ्रूणजनन अवलोकन की सुविधा प्रदानकी। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन ने लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन11 का उपयोग करके लेपिडोप्टेरन मादाओं के सेक्स क्रोमैटिन के धुंधला तरीकों को विकसित करके छोटे भ्रूण के लिंग भेदभाव की स्थापना की। इन विधियों के संयोजन से, उच्च गुणवत्ता और मात्रा न्यूक्लिक एसिड को लिंग निर्धारित भ्रूण से निकाला गया था, जो अन्यथा स्थापित करना मुश्किल था6। निकाले गए आरएनए का उपयोग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए किया गया था। सामूहिक रूप से, यहां प्रस्तुत विधियां अन्य लेपिडोप्टेरन कीड़ों और अन्य कीट टैक्सा पर लागू होती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कीट संग्रह और बड़े पैमाने पर पालन

  1. पहले प्रकाशित संदर्भ 8,12 के बाद क्षेत्रों से tortricid कीड़े ले लीजिए.
    नोट: एच मैग्नानिमा और ए होनमाई लार्वा क्षतिग्रस्त चाय की पत्तियों से एकत्र किए जाते हैं (चित्रा 1 ए); वयस्कों को 4 डब्ल्यू पोर्टेबल यूवी प्रकाश (365 एनएम तरंग दैर्ध्य, सामग्री की तालिका, चित्रा 1 बी देखें) का उपयोग करके आकर्षित किया जाता है।
  2. एकत्रित लार्वा (चित्रा 1 C, D) को व्यक्तिगत रूप से 1/2-oz कप में 2-3 सप्ताह के लिए कृत्रिम आहार के एक टुकड़े पर वयस्क eclosion (चित्रा 1E, F) तक पीछे करें। रूपात्मक लक्षणों द्वारा प्यूपे और वयस्कों के लिंग की पुष्टि करें (चित्रा 1 जी, आई)।
  3. एक पैराफिन पेपर (चित्रा 1J-L) पर अंड द्रव्यमान को ओविपोज़िट अंडे के द्रव्यमान के लिए एक प्लास्टिक बॉक्स (30 सेमी x 20 सेमी x 5 सेमी) में पुरुषों और महिलाओं को मिलाएं। एक मादा और दो पुरुषों को एक मैट्रिलाइन स्थापित करने के लिए पैराफिन पेपर के एक टुकड़े के साथ 120 मिलीलीटर प्लास्टिक कप में रखें।
    नोट: पैराफिन पेपर पर क्रीज बनाना महत्वपूर्ण है। एच मैग्नानिमा के लिए, पैराफिन पेपर को मामले के निचले भाग पर होना चाहिए। इस बीच, ए होनमाई के लिए, चाय की पत्तियों के ऊपरी हिस्से पर एच मैग्नानिमा ओविपोसिट अंडे के द्रव्यमान के बाद से अंडे (चित्रा 1 एल) इकट्ठा करने के लिए केस सीलिंग पर एक पेपर डालें, लेकिन ए होनमाई पत्तियों के नीचे अंडेदेता है 8। प्रक्रियाओं को अन्य टॉरट्रिसिड प्रजातियों में भी सत्यापित किया गया था, और यदि लक्ष्य प्रजातियों की पारिस्थितिकी और व्यवहार को अस्पष्ट किया जाता है तो दोनों पक्षों पर कागजात रखना बेहतर होता है।
  4. कैंची के साथ पैराफिन पेपर पर अंडे के द्रव्यमान (लगभग 100-200 अंडे प्रति अंडा द्रव्यमान12, चित्रा 1 एम) को काट लें। अंडे को 5-7 दिनों के लिए डंप किए गए पेपर के साथ 1/2 ऑउंस कप में रखें।
    नोट: परिपक्व भ्रूण एक ब्लैकहेड कैप्सूल (चित्रा 1 एन) प्रदर्शित करता है। भ्रूणजनन की अवधि को विभिन्न रूप से टॉट्रिसिड प्रजातियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, लेकिन आम तौर पर एच. मैग्नेनिमा के लिए ओवीपोज़िशन (डीपीओ) के बाद 5 दिन और 25 डिग्री सेल्सियस पर ए होनमाई के लिए 4 डीपीओ 60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ, 16 एच प्रकाश / 8 एच अंधेरे चक्र7।
  5. 7 दिनों के लिए 4-8 डिग्री सेल्सियस पर काले सिर कैप्सूल दिखाने वाले अंडे के द्रव्यमान को स्टोर करें।
  6. स्लाइस ~ 60 ग्राम कृत्रिम आहार बड़े पैमाने पर पालन के लिए एक grater का उपयोग कर. एक प्लास्टिक कंटेनर (23 सेमी x 16 सेमी x 8 सेमी) में कटा हुआ कृत्रिम आहार पर परिपक्व भ्रूण से भरे अंडे के द्रव्यमान को रखें। कटा हुआ आहार (चित्रा 10) के साथ अंडे के द्रव्यमान पर पैराफिन कागजात रखें।
    नोट: 30% से नीचे सापेक्ष आर्द्रता को शुष्क माना जाता है, जबकि 70% से अधिक बहुत आर्द्र होता है। बेहतर वेंटिलेशन को सक्षम करने के लिए प्लास्टिक कंटेनर के ढक्कन पर छेद बनाना बेहतर है। छोटे लार्वा के भागने को रोकने के लिए कपास के साथ छेद भरें।
  7. अंडे से सतह के संदूषकों को खत्म करने के लिए, अंडे के द्रव्यमानको क्रमशः 5 मिनट के लिए 3% फॉर्मेलिन और 0.2% बेंजाल्कोनियम क्लोराइड समाधान में भिगोएं। आंत या इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए, एक सामान्य कृत्रिम आहार के बजाय 0.05% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) टेट्रासाइक्लिन हाइड्रोक्लोराइड या 0.06% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) रिफाम्पिसिन के साथ पूरक एक कृत्रिम आहार का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: यह चरण वैकल्पिक है। स्थिरता के लिए सिल्क मेट 2S और 0.05% (w/ w) टेट्रासाइक्लिन हाइड्रोक्लोराइड या 0.06% (w / w) रिफैम्पिसिन को गूंथना महत्वपूर्ण है।
  8. प्लास्टिक कंटेनर से प्यूपे को इकट्ठा करें और रूपात्मक12 विशेषताओं (चित्रा 1 जी-I) के आधार पर लिंग को अलग करें।
    नोट: आम तौर पर, tortricids pupation12 तक 5-6 instars प्रस्तुत करते हैं। H. magnanima और A. honmai लार्वा क्रमशः 3 सप्ताह और 2 सप्ताह लगते हैं, pupation तक हैचिंग के बाद।
  9. 15 पुरुषों और 10 मादाओं को 25 °C, 16 L/8 D के साथ संभोग करने के लिए एक प्लास्टिक बॉक्स (30 सेमी x 20 सेमी x 5 सेमी, चित्रा 1K) में रखें। प्रति 5-7 दिनों में अंडे इकट्ठा करें और चरण 1.4-1.9 को दोहराएं। हर पीढ़ी के लिए।
    नोट: यदि बाद के विश्लेषण के लिए नए अंड द्रव्यमान एकत्र करने की आवश्यकता है, तो अंधेरे अवधि की शुरुआत और अंत सेट करें, उदाहरण के लिए, सुबह 9 बजे से शाम 5 बजे तक। इस स्थिति में, एच मैग्नानिमा और ए होनमी आमतौर पर 5 घंटे (2 बजे) के बाद अंडों को ओविपोसिट अंडे देते हैं।

2. निर्धारण, permeabilization, और धुंधला के लिए अंडे के द्रव्यमान से अंडे और pharate लार्वा का पृथक्करण

  1. अंडे को अलग करने के लिए अंडे के द्रव्यमान को 1.2% सोडियम हाइपोक्लोराइट जलीय घोल के 1,000 μL में 10 मिनट के लिए या 5 M पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड जलीय घोल के 1,000 μL में 30 मिनट के लिए भिगोएं।
  2. PBSt के 1,000 μL (137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO4,2.68mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, Polyoxyethylene के 0.05%( 20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH 7.4, सामग्री की तालिका देखें) में अलग अंडे धोएं, पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 के बाद।
  3. 100% हेप्टेन के 500 μL और 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड-PBSt समाधान (w / v) के 500 μL के मिश्रण में अंडे भिगोएं। एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके 1,500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए मिलाएं।
  4. अंडे को 100% हेप्टेन के 500 μL और 100% मेथनॉल के 500 μL के मिश्रण में भिगोएं। 1,500 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए मिलाएं।
  5. 100% मेथनॉल के 1,000 μL के साथ अंडे को दो बार धोएं और आगे के प्रयोगों तक 100% मेथनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (चित्रा 2 ए)।
    नोट: अंडे को 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 वर्ष के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. पहले सेप्रकाशित रिपोर्ट 7 के बाद हाइड्रोफिलाइजेशन के लिए अंडे को 99%, 70%, 50% इथेनॉल और पीबीटी में 5 मिनट के लिए क्रमिक रूप से भिगोएं।
  7. PBSt के साथ अंडे धोएं, 5 मिनट के लिए DAPI समाधान के 1 μg / mL में अंडे को विसर्जित करें, और फिर अंडे को 1x PBS के साथ दो बार धोएं। 1.25% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन समाधान के 20 μL में अंडे भिगोएं ( सामग्री की तालिका देखें) 11 हेटरोक्रोमैटिन की कल्पना करने के लिए जब तक कि नाभिक एक शानदार लाल रंग प्रदर्शित नहीं करता है (यह 5-60 मिनट से भिन्न होता है) (चित्रा 2 बी, सी)।
    नोट: लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन स्टेनिंग अवधि तापमान और आर्द्रता पर निर्भर करती है। 4x-10x आवर्धन के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उचित धुंधला करने के लिए जांच करना बेहतर है।
  8. एक कांच स्लाइड के लिए एक पिपेट का उपयोग कर सना हुआ अंडे स्थानांतरित करें। एंटीफ़ेड अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) और एक कवर ग्लास7 के साथ दाग वाले अंडे को संलग्न करें।
  9. फरेट एच मैग्नानिमा और ए होनमाई लार्वा (4-5 दिन बाद ओवीपोज़िशन (डीपीओ)) को संदंश (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके अंडे के द्रव्यमान से निकालें। एक ग्लास स्लाइड पर द्विभाजक लार्वा (चित्रा 2E)।
  10. 5 मिनट के लिए 1: 3 (v / v) 99.7% एसिटिक एसिड / 100% मेथनॉल के मिश्रण के साथ किसी भी ऊतक (जैसे, suboesophageal गैंग्लियन, वक्षीय गैन्ग्लिया, मालपिघियन नलिका, आदि) को ठीक करें। 1.25% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन समाधान11 के साथ उन लोगों को दाग दें जब तक कि नाभिक दाग नहीं हो जाते हैं (यह तापमान और आर्द्रता के आधार पर 5-60 मिनट लग सकता है)।
  11. माइक्रोस्कोप के तहत हेटरोक्रोमैटिन (डब्ल्यू क्रोमोसोम, चित्रा 2 एफ, जी) की उपस्थिति (महिला) या अनुपस्थिति (पुरुष) का निरीक्षण करके प्रत्येक नमूने के लिंग का निर्धारण करें।
    नोट: सेक्स क्रोमैटिन की कल्पना करके सेक्स निर्धारित किया जाता है। प्रत्येक सेल11,12 महिलाओं में एक बिंदु के रूप में सेक्स क्रोमैटिन का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि फर्रेट लार्वा ऊतकों के शेष हिस्से (निश्चित नहीं) को तुरंत सेल लाइसिस बफर12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, और 1% SDS, pH 8.0) या फिनोल युक्त आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों में विसर्जित किया जाना चाहिए या तो डीएनए या आरएनए निष्कर्षण के लिए। विच्छेदन से पहले, अभिकर्मकों के 20 μL को अग्रिम में 0.2 mL PCR ट्यूबों में वितरित करें (चित्रा 3A)। विसर्जित करें और आगे निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें। नमूनों को कम से कम 3 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन न्यूक्लिक एसिड के क्षरण को रोकने के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ आगे बढ़ना बेहतर है।

3. डीएनए और आरएनए निष्कर्षण सेक्स निर्धारित pharate लार्वा से

  1. पूल 12 सेक्स-निर्धारित नर या मादा फेरेट लार्वा (5 डीपीओ भ्रूण) और एक 1.5 एमएल ट्यूब में या तो सेल लाइसिस बफर या आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों (चरण 2.11 और सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
    नोट:: डीएनए निष्कर्षण के लिए चरण 3.2-3.7 और RNA निष्कर्षण के लिए चरण 3.8-3.11 का पालन करें।
  2. सेल लाइसिस बफर (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, और 1% SDS, pH 8.0) के 600 μL में ऊतकों को homogenize करें, और 4 °C पर 5 मिनट के लिए 10,000 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. Supernatant (500 μL) एक पिपेट का उपयोग कर ले लीजिए और एक गर्मी ब्लॉक पर 5 ज के लिए Proteinase K (20 मिलीग्राम / mL, सामग्री की तालिका देखें) के 1.5 μL के साथ 50 °C पर इनक्यूबेट करें।
  4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर RNase समाधान के 10 मिलीग्राम / एमएल के 1.0 μL के साथ नमूनों का इलाज करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  5. 7 ट्यूबों में प्रोटीन वर्षा समाधान के 200 μL जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें), इसके बाद 4 °C पर 10 मिनट के लिए 17,000 x g पर एक सेंट्रीफ्यूज।
  6. 100% आइसोप्रोपेनॉल के 500 μL के साथ supernatant (500 μL) को मिलाएं, और फिर 4 °C पर 10 मिनट के लिए 20,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. 70% इथेनॉल के 1,000 μL के साथ छर्रे वाले डीएनए को दो बार धोएं। फिर, एयर-ड्राई (कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट), डीएनए को 10 mM Tris-Cl बफर (pH 8.5) के 30 μL में भंग करें।
  8. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मकों के 600 μL में ऊतकों homogenize और ट्यूब के लिए अल्ट्रा शुद्ध आसुत पानी के 240 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. supernatant (600 μL) 100% isopropanol के 600 μL के साथ मिश्रण और एक सिलिका स्पिन कॉलम के लिए मिश्रण हस्तांतरण ( सामग्री की तालिका देखें). 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 17,900 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. 70% इथेनॉल के 750 μL के साथ स्तंभ को धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 1 मिनट के लिए 17,900 x g पर कॉलम को दो बार सेंट्रीफ्यूज करें।
  11. कॉलम के लिए अल्ट्रा शुद्ध आसुत पानी के 15 μL लोड करें। आरएनए को दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 17,900 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. यूवी-आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए और आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा की गणना और सत्यापन करें। A260/A280 (Nucleic acids/protein) और A260/A230 (Nucleic acids/salts and other contaminants)ratios 13 का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड की शुद्धता का आकलन करें।
    नोट: आरएनए निष्कर्षण के लिए, पहले प्रकाशित प्रक्रिया12 का पालन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप फिनोल संदूषण (तालिका 1) हुआ था। एक एकल भ्रूण या फैरेट लार्वा से निकाले गए डीएनए और आरएनए कम मात्रा में और कम गुणवत्ता वाले नमूने उत्पन्न करते हैं। आमतौर पर, 12 फैरेट लार्वा से डीएनए निष्कर्षण 100-600 एनजी उत्पन्न करता है, जबकि वर्तमान विधि का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण 900-1,500 एनजी उत्पन्न करता है, जैसा कि तालिका 1 दिखाया गया है।
    नोट: चरण 3.13-3.15 उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के आगे assays के लिए वैकल्पिक हैं।
  13. प्रतिदीप्ति-आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए और आरएनए की मात्रा की गणना करें।
    नोट: आरएनए मात्राओं (यूवी-आधारित एकाग्रता (एनजी / μL) / प्रतिदीप्ति-आधारित एकाग्रता (एनजी / μL)) के अनुपात की गणना आगे के प्रयोगात्मक अनुप्रयोग के लिए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए की गई थी। उदाहरण के लिए, जब यूवी और प्रतिदीप्ति-आधारित सांद्रता क्रमशः 80 एनजी / यूएल और 60 एनजी / यूएल होती है, तो अनुपात 1.5 (80/60) होगा। आमतौर पर, 1.5 से कम अनुपात उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण13 का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त शुद्धता का संकेत देते हैं।
  14. माइक्रोचिप वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आरएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण करें14.
  15. एक आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करके आरएनए लाइब्रेरी तैयार करने के लिए योग्य आरएनए का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)। तैयार पुस्तकालयों के लिए उपयुक्त प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके पुस्तकालयों को अनुक्रमित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मेजबान लाइनों की स्थापना और उनके रखरखाव
क्षेत्र-एकत्र लार्वा की व्यवहार्यता को अलग-अलग क्षेत्र स्थान, मौसम और पालन की स्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है (उदाहरण के लिए, ताइवान, ताओयुआन में व्यवहार्यता का 90%, जैसा कि अराई एट अल.12 में दिखाया गया है)। लगभग 30% -50% जोड़े हमेशा की तरह अगली पीढ़ी उत्पन्न करेंगे। एच. मैग्नानिमा और ए. होनमाई के लिए, 100 से अधिक पीढ़ियों के लिए इनब्रीडिंग द्वारा मातृरेखाओं को बनाए रखा गया है।

रूपात्मक टिप्पणियां और लिंग निर्धारण
या तो पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (3 या 5 एम KOH) या सोडियम हाइपोक्लोराइट (1.2% Cl2 या NaClO) के साथ उपचार अंडे को उनके concatenated अंडे द्रव्यमान (चित्रा 2A) से अलग करता है। अभिकर्मकों की कम सांद्रता पृथक्करण प्राप्त नहीं कर सकी। सभी निर्धारण, permeabilization, और धुंधला चरणों DAPI समाधान के साथ नाभिक के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम किया। केवल KOH या NaClO (अलग) के साथ इलाज किए गए अंडे निर्धारण और permeabilization चरणों के बिना इन रंजक7 के साथ दाग नहीं थे। गैर-उपचारित एच मैग्नानिमा अंडे के द्रव्यमान को दाग नहीं दिया गया था। लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन हेटरोक्रोमैटिन (डब्ल्यू गुणसूत्र) को गहरे लाल रंग के साथ दागता है और हमेशा की तरह चमकीले लाल रंग के साथ नाभिक (चित्रा 3 ए)। यह धुंधला 4 डीपीओ भ्रूण से छठे इंस्टार लार्वा तक आसान और तेजी से लिंग निर्धारण को सक्षम बनाता है। यद्यपि नाभिक को 0-3 डीपीओ भ्रूण में कल्पना की गई थी, लेकिन 400x आवर्धन के साथ डब्ल्यू गुणसूत्र का निरीक्षण करना मुश्किल था।

उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए और आरएनए को लिंग-निर्धारित और पूल किए गए भ्रूण से प्राप्त किया गया था
12 pharate लार्वा से, उच्च गुणवत्ता डीएनए (A260 / A280 = 1.7-2.0; A260/A230 = 1.7-2.4) को कुल राशि में 100-600 ng के साथ निकाला गया था (तालिका 1)। हालांकि पहले से प्रकाशित विधि12 के बाद निकाले गए आरएनए ने कम गुणवत्ता के साथ 500-1,000 एनजी उत्पाद प्राप्त किया: A260 / A280 = 1.7-2.1; A260/A230 = 0.1-0.5 (तालिका 1), एक स्पिन स्तंभ का उपयोग करके संशोधित प्रोटोकॉल ने आरएनए की गुणवत्ता में सुधार किया, A260/A280 के साथ 900-1,500 ng उत्पाद का उत्पादन किया = 1.9-2.1 और A260/A230 = 1.9-2.3 (तालिका 1)। इसके अलावा, संशोधित प्रोटोकॉल के लिए आरएनए एकाग्रता अनुपात (यूवी-आधारित / क्यूबिट प्रतिदीप्ति-आधारित मान) 1.2 से नीचे था, जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण13 के लिए गुणवत्ता आवश्यकताओं को पूरा करता है। इसके विपरीत, एक ही भ्रूण से निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता और मात्रा की गणना करने के लिए बहुत कम थी। संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेक्स-निर्धारित फैरेट लार्वा से निकाले गए आरएनए की अक्षुण्णता की पुष्टि माइक्रोचिप वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके भी की गई थी। तैयार पुस्तकालयों को उच्च Q30 स्कोर पढ़ता है (तालिका 2) उपज की पुष्टि की गई थी।

Figure 1
चित्र 1: कीट संग्रह और H. magnanima और A. honmai के बड़े पैमाने पर पालन का अवलोकन(A) एक लार्वा द्वारा क्षतिग्रस्त चाय की पत्तियों और घोंसले। (बी) यूवी प्रकाश के साथ प्रकाश जाल। (C,D) एक मादा (सी) और एक पुरुष (डी) एच मैग्नानिमा के 6वें इंस्टार लार्वा। नारंगी त्रिभुज वृषण को इंगित करता है। (E,F) एकत्र लार्वा को कृत्रिम आहार के एक टुकड़े के साथ 1/2 औंस कप में व्यक्तिगत रूप से पाला गया था। (G,H) H. magnanima (G) और A. honmai (H) के Pupae। मादा को बाईं ओर दिखाया गया है, जबकि पुरुष को दाईं ओर दिखाया गया है। (I) एच मैग्नानिमा (ऊपर) और ए होनमाई (नीचे) के वयस्क। नर और मादा दोनों को क्रमशः दाएं और बाएं दिखाया गया है। (J,K) अंडे के द्रव्यमान संग्रह के लिए एक प्लास्टिक बैग (जे) या प्लास्टिक केस (के)। (एल) ढक्कन पर रखे पैराफिन पेपर पर ए होन्मई ओविपोसिट अंडे, और एच मैग्नानिमा मामले के निचले भाग पर रखे पैराफिन पेपर पर अंडे देते हैं। (M,N) एच मैग्नानिमा का अंडा द्रव्यमान। परिपक्व भ्रूण सफेद तीर (एन) के साथ इंगित काले सिर कैप्सूल प्रदर्शित करते हैं। (ओ) बड़े पैमाने पर पालन के लिए एक ग्रेटर के साथ कटा हुआ कृत्रिम आहार। अंडों से निकलने वाले लार्वा, कटा हुआ आहार पर रखा गया है, 25 डिग्री सेल्सियस (16 एच प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे चक्र के तहत) पर हैचिंग के 3-4 सप्ताह बाद प्यूपे बनाएगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण के अवलोकन( A) 5 N KOH, 4% PFA / heptane, मेथनॉल / हेप्टेन, और मेथनॉल का उपयोग करके H. magnanima के अलग, निश्चित और permeabilized अंडे। एक अलग अंडे को टूटी हुई रेखाओं के साथ हाइलाइट किया गया है। (बी) 3 डीपीओ भ्रूण लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन के साथ दाग दिया गया था। काला एरोहेड भ्रूण को इंगित करता है। (सी) 4 डीपीओ भ्रूण को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था। सफेद एरोहेड भ्रूण को इंगित करता है। (D,E) संदंश का उपयोग करके फेरेट लार्वा (5 डीपीओ) का विच्छेदन। फैरेट लार्वा को अंडे-द्रव्यमान (डी) से निकाला जाता है, जिसे ग्लास स्लाइड (ई) पर विभाजित किया जाता है। (F,G) लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सिन विच्छेदित फैरेट लार्वा का उपयोग करके धुंधला। मादाएं हेटरोक्रोमैटिन को एक बिंदु के रूप में प्रदर्शित करती हैं (काले एरोहेड, (एफ) के साथ इंगित किया गया है, लेकिन पुरुषों में हेटरोक्रोमैटिन (जी) की कमी होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लिंग-निर्धारित फेरेट लार्वा और एच. मैग्नानिमा और ए. होनमाई के आरएनए गुणों का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण का ग्राफिकल सारांश। (ए) कांच की स्लाइड पर विच्छेदित फेरेट लार्वा के ऊतकों को उनके लिंग को निर्धारित करने के लिए लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन के साथ दाग दिया गया था। शेष ऊतकों को अभिकर्मकों में भिगोया गया था, व्यक्तियों के लिंग द्वारा क्रमबद्ध एक ट्यूब में पूल किया गया था, और फिर डीएनए / आरएनए निष्कर्षण के अधीन किया गया था। (बी) 12 पुरुष एच मैग्नानिमा या ए होनमाई से निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता का आकलन माइक्रोचिप वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप: [nt], न्यूक्लियोटाइड आकार; [FU], प्रतिदीप्ति इकाई; एम, आणविक मार्कर; एचएम, एच मैग्नानिमा; विज्ञापन, A. honmai. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 1: एच मैग्नैनिमा के लिंग निर्धारित फैरेट लार्वा से निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता और गुणवत्ता। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: आरएनए-अनुक्रमण कच्चे डेटा के गुण। 1 Q20 (%) 99% पठन सटीकता के साथ पढ़ने की संभावना को इंगित करता है। 2 Q30 (%) 99.9% पठन सटीकता के साथ पढ़ने की संभावना को इंगित करता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

टॉरट्रिसिड में कई कृषि और वानिकी कीट शामिल हैं; वर्तमान अध्ययन ने पीढ़ियों से टॉरट्रिक्स को पीछे करने, भ्रूणजनन और कीड़ों के लिंग का निरीक्षण करने और परिपक्व भ्रूण का उपयोग करके आणविक विश्लेषण करने के तरीकों को प्रस्तुत किया।

कीट कीट अध्ययन के लिए बाधाओं में से एक पालन विधियों को स्थापित करना है। विशेष रूप से, इनब्रीडिंग कभी-कभी प्रजातियों की फिटनेस को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है। इनब्रीड द्वारा फिटनेस में कमी, जिसे इनब्रीडिंग डिप्रेशन कहा जाता है, व्यापक रूप से विभिन्न पौधों और जानवरों में देखा गया है, जिसमेंकीड़े 15,16,17,18 शामिल हैं। जैसा कि उल्लेख किया गया है, एच मैग्नानिमा और ए होनमाई दोनों को 100 से अधिक पीढ़ियों (10 वर्षों से अधिक) के लिए बनाए रखा गया है, जिसमें कोई स्पष्ट फिटनेस लागत नहीं है। यद्यपि यह आकलन करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि क्या अन्य टॉर्ट्रिसिड में भी सामान्य रूप से इनब्रीडिंग के लिए उच्च सहिष्णुता है, दो प्रजातियों ने नीरस पर्यावरणीय परिस्थितियों (यानी, चाय बागानों) को अनुकूलित करके और कई एंडोसिम्बायोटिक सूक्ष्मजीवों (जैसे, वोल्बाचिया11,12) के खिलाफ विशेषताओं को विकसित किया हो सकता है। ). दो प्रजातियों के अंडे आसानी से प्राप्त किए जाते हैं, लेकिन उनके ओवीपोज़िशन व्यवहार को अलग-अलग उनकी पारिस्थितिकी के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। दरअसल, आर्द्रता और क्रीज की दिशा सीधे अंडों की संख्या को प्रभावित करती है, जो खेतों में कीड़ों के प्राकृतिक इतिहास को प्रतिबिंबित कर सकती है। प्रकृति में उनकी जैविक विशेषताओं के बारे में प्रजातियों के पालन विधियों को समायोजित करना महत्वपूर्ण है।

इस अध्ययन में स्थापित प्रोटोकॉल ने लिंग-निर्धारित परिपक्व भ्रूण और लार्वा का उपयोग करके भ्रूणजनन और आणविक अध्ययनों के अवलोकन को सक्षम किया। कीट के अंडे को आमतौर पर10,19 कई खोल परतों के साथ लेपित किया जाता है। इसके अलावा, एच मैग्नानिमा और ए होनमाई के अंडे मातृ स्राव के साथ कवर किए जाते हैं। इस तरह की जटिल संरचना के साथ अंडे को दागने के लिए, अलगाव, निर्धारण, और permeabilization सभी आवश्यक प्रतीत होता है। Ostrinia furnacalis (Crambidae) में, जो एच मैग्नानिमा और ए होनमाई जैसे पैमाने की तरह अंडे द्रव्यमान को प्रभावित करता है, एकल भ्रूण का उपयोग करके पीसीआर-आधारित लिंग निर्धारण प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं, लेकिन न्यूक्लिक एसिड की कम गुणवत्ता और मात्रा बाद के विश्लेषण के लिए एक समस्या रही है 6,20। इसके विपरीत, वर्तमान अध्ययन ने मादा-विशिष्ट सेक्स क्रोमैटिन को देखने के बाद पूल किए गए सेक्स-निर्धारित भ्रूण से न्यूक्लिक एसिड निकालने का सुझाव दिया। आरएनए को आसानी से अपमानित किया जाता है, और यहां दिखाई गई निष्कर्षण प्रक्रिया ने आरएनए की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं किया, जिसकी पुष्टि ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण (आरएनए-सेक) द्वारा भी की गई है। यहां दिखाई गई तकनीकें विभिन्न कीट प्रजातियों के भ्रूणजनन के अध्ययन के लिए लागू होती हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में रासायनिक कीटनाशकों या इंट्रासेल्युलर रोगाणुओं जैसे वोल्बाचिया के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने की क्षमता है, जो भ्रूणजनन 6,11,12 के दौरान सेक्स-विशिष्ट दोषों का कारण बनता है।

वर्तमान अध्ययन की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, अपरिपक्व भ्रूण (0-3 डीपीओ) का लिंग एच मैग्नानिमा और ए होनमाई में लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन स्टेनिंग का उपयोग करके निर्धारित करना मुश्किल था। ऐसा इसलिए है क्योंकि नाभिक की संख्या और आकार आमतौर पर प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान छोटे होते हैं, जिससे डब्ल्यू गुणसूत्र का निरीक्षण करना मुश्किल हो जाता है। प्रारंभिक भ्रूणजनन के दौरान टॉर्ट्रिसिड के लिंग को स्पष्ट करने के लिए, सेक्स गुणसूत्रों 6,20 पर मार्करों का पता लगाना और परिमाणीकरण एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है। दूसरा, लिंग निर्धारण के बाद एक व्यक्ति से उच्च शुद्धता के साथ न्यूक्लिक एसिड निकालना मुश्किल था, संभवतः कोशिकाओं की छोटी संख्या के कारण। हालांकि, एक एकल भ्रूण से निकाले गए आरएनए या डीएनए बाद के विश्लेषणों जैसे पीसीआर एसेस और एकल-सेल अनुक्रमण पर लागू हो सकते हैं।

संक्षेप में, वर्तमान प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर पालन, रूपात्मक टिप्पणियों, और दो गैर-मॉडल लेपिडोप्टेरन कीट कीटों, एच मैग्नानिमा और ए होनमाई के अंडों के आनुवंशिक विश्लेषण का वर्णन करता है। इन सरल तकनीकों को टॉरट्रिसिड, अन्य लेपिडोप्टेरन कीड़ों और अन्य टैक्सा पर आगे के शोध के लिए लागू होने की उम्मीद है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक युवा वैज्ञानिकों के लिए जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) रिसर्च फैलोशिप [अनुदान संख्या 19J13123 और 21J00895] से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/2 ounce cup FP CHUPA CP070009 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid FP CHUPA CP070011 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 36289 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies not shown Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit Agilent Technologies 5067-1511 Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG
.pdf
benzalkonium chloride solution Nihon Pharmaceutical Co., Ltd No.4987123116046 Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton AOUME 8-1611-02 insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution Dojindo, Tokyo, Japan 340-07971 stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit Invitrogen Q33231 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column Epoch Life Science Inc. EP-11201 RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper HEIKO 2100010 insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc&utm_source=
Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK ATTO, Tokyo, Japan 4002620 incubation; https://www.attoeng.site/
heptane FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII Nippon Gene 311-07361 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex Biosan BS-010210-TAK Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80 Implen not shown Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide Inomata chemical 1859 insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3%
83%A9%E3%83%AB%E3%83%91%
E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7770S Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde FUJIFILM Wako Chemicals Co. 160-16061 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan not shown Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen, MA, USA P36965 antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution Merck 71049-4CN DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution Qiagen 158912 DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4 Invitrogen Q33238 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit Invitrogen Q32855 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution Nippon Gene 313-01461 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water Invitrogen 10977023 RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
  2. Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
  3. Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
  4. Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
  6. Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
  7. Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
  8. vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
  9. Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
  10. Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
  11. Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
  12. Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
  13. Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
  14. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
  15. Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
  16. Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
  17. Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
  18. Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
  19. Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
  20. Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 181 Tortricidae embryogenesis लिंग निर्धारण आरएनए-seq कीट endosymbionts
Tortricidae कीट कीटों में बड़े पैमाने पर पालन और आणविक अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M.,… More

Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects. J. Vis. Exp. (181), e63737, doi:10.3791/63737 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter