Summary
I modelli preclinici mirano a far progredire la conoscenza della biologia del cancro e a prevedere l'efficacia del trattamento. Questo articolo descrive la generazione di xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish con frammenti di tessuto tumorale. Gli zPDX sono stati trattati con chemioterapia, il cui effetto terapeutico è stato valutato in termini di apoptosi cellulare del tessuto trapiantato.
Abstract
Il cancro è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e l'incidenza di molti tipi di cancro continua ad aumentare. Sono stati fatti molti progressi in termini di screening, prevenzione e trattamento; Tuttavia, mancano ancora modelli preclinici che prevedano il profilo di chemiosensibilità dei pazienti oncologici. Per colmare questa lacuna, è stato sviluppato e convalidato un modello di xenotrapianto derivato dal paziente in vivo . Il modello era basato su embrioni di zebrafish (Danio rerio) a 2 giorni dopo la fecondazione, che sono stati utilizzati come destinatari di frammenti di xenotrapianto di tessuto tumorale prelevati dal campione chirurgico di un paziente.
Vale anche la pena notare che i campioni bioptici non sono stati digeriti o disaggregati, al fine di mantenere il microambiente tumorale, che è cruciale in termini di analisi del comportamento del tumore e della risposta alla terapia. Il protocollo descrive un metodo per stabilire xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish dalla resezione chirurgica primaria del tumore solido. Dopo lo screening da parte di un anatomopatologo, il campione viene sezionato utilizzando una lama di bisturi. Il tessuto necrotico, i vasi o il tessuto adiposo vengono rimossi e quindi tagliati in pezzi da 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
I pezzi vengono quindi etichettati in modo fluorescente e xenotrapiantati nello spazio perivitellino degli embrioni di zebrafish. Un gran numero di embrioni può essere trattato a basso costo, consentendo analisi in vivo ad alto rendimento della chemiosensibilità degli zPDX a più farmaci antitumorali. Le immagini confocali vengono acquisite di routine per rilevare e quantificare i livelli apoptotici indotti dal trattamento chemioterapico rispetto al gruppo di controllo. La procedura di xenotrapianto ha un vantaggio temporale significativo, poiché può essere completata in un solo giorno, fornendo una finestra temporale ragionevole per effettuare uno screening terapeutico per gli studi co-clinici.
Introduction
Uno dei problemi della ricerca clinica sul cancro è che il cancro non è una singola malattia, ma una varietà di malattie diverse che possono evolvere nel tempo, richiedendo trattamenti specifici a seconda delle caratteristiche del tumore stesso e del paziente1. Di conseguenza, la sfida è quella di muoversi verso la ricerca sul cancro orientata al paziente, al fine di identificare nuove strategie personalizzate per la previsione precoce dei risultati del trattamento del cancro2. Ciò è particolarmente rilevante per l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), poiché è considerato un tumore difficile da trattare, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell'11%3.
La diagnosi tardiva, la rapida progressione e la mancanza di terapie efficaci rimangono i problemi clinici più urgenti del PDAC. La sfida principale è, quindi, quella di modellare il paziente e identificare i biomarcatori che possono essere applicati in clinica per selezionare la terapia più efficace in linea con la medicina personalizzata 4,5,6. Nel corso del tempo, sono stati proposti nuovi approcci per modellare le malattie tumorali: organoidi derivati dal paziente (PDO) e xenotrapianti derivati dal paziente di topo (mPDX) hanno avuto origine da una fonte di tessuto tumorale umano. Sono stati utilizzati per riprodurre la malattia per studiare la risposta e la resistenza alla terapia, nonché la recidiva della malattia 7,8,9.
Allo stesso modo, l'interesse per i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (zPDX) basati sul pesce zebra è aumentato, grazie alle loro caratteristiche uniche e promettenti10, rappresentando uno strumento rapido e a basso costo per la ricerca sul cancro11,12. I modelli zPDX richiedono solo una piccola dimensione del campione tumorale, il che rende fattibile lo screening ad alto rendimento della chemioterapia13. La tecnica più comune utilizzata per i modelli zPDX si basa sulla digestione completa del campione e sull'impianto delle popolazioni cellulari primarie, che riproduce parzialmente il tumore, ma presenta gli svantaggi di una mancanza di microambiente tumorale e diafonia tra cellule maligne e sane14.
Questo lavoro mostra come gli zPDX possono essere utilizzati come modello preclinico per identificare il profilo di chemiosensibilità dei pazienti con cancro del pancreas. La preziosa strategia facilita il processo di xenotrapianto, poiché non è necessaria l'espansione cellulare, consentendo l'accelerazione dello screening chemioterapico. La forza del modello è che tutti i componenti del microambiente sono mantenuti come sono nel tessuto tumorale del paziente, perché, come è noto, il comportamento del tumore dipende dalla loro interazione15,16. Ciò è molto favorevole rispetto ai metodi alternativi in letteratura, in quanto è possibile preservare l'eterogeneità del tumore e contribuire a migliorare la prevedibilità dell'esito del trattamento e della recidiva in modo paziente-specifico, consentendo così al modello zPDX di essere utilizzato in studi co-clinici. Questo manoscritto descrive i passaggi coinvolti nella realizzazione del modello zPDX, iniziando con un pezzo di resezione del tumore del paziente e trattandolo per analizzare la risposta alla chemioterapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il Ministero della Salute Pubblica italiano ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali descritti, in conformità con la Direttiva 2010/63/UE sull'uso e la cura degli animali. Il Comitato Etico locale ha approvato lo studio, con numero di registrazione 70213. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti. Prima di iniziare, tutte le soluzioni e l'attrezzatura devono essere preparate (sezione 1) e il pesce deve essere attraversato (sezione 2).
1. Preparazione di soluzioni e attrezzature
NOTA: vedere la Tabella 1 per le soluzioni e i supporti da preparare.
- Supporto gel di agarosio
- Pesare la polvere di agarosio in un matraccio da microonde e scioglierla in un dato volume di mezzo E3 zebrafish per ottenere un gel all'1%. Riscaldare in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto.
NOTA: non bollire eccessivamente la soluzione. - Versare l'agarosio fuso in una capsula di Petri e attendere che il gel si sia completamente solidificato.
- Realizzare piccoli cilindri di agarosio (~ 5 mm di altezza) utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata. Una volta preparato, conservare in una capsula di Petri a 4 °C avvolto in un foglio di alluminio.
- Pesare la polvere di agarosio in un matraccio da microonde e scioglierla in un dato volume di mezzo E3 zebrafish per ottenere un gel all'1%. Riscaldare in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto.
- Microaghi di vetro
- Tirare i capillari di vetro borosilicato con un estrattore per ottenere aghi sottili (impostazioni: HEAT 990, PULL 550).
NOTA: Da un capillare, è possibile ottenere due aghi sottili con un diametro della punta di 10 μm.
- Tirare i capillari di vetro borosilicato con un estrattore per ottenere aghi sottili (impostazioni: HEAT 990, PULL 550).
2. Incrocio del pesce e raccolta delle uova
- Trasferire i pesci adulti in vasche di riproduzione 3 giorni prima dell'impianto del tessuto, come descritto da Avdesh et al.17.
- NOTA: Si raccomanda un rapporto di 1:1 o 2:3 maschi e femmine. La densità del pesce dovrebbe essere un massimo di cinque pesci per litro d'acqua. Tenere maschi e femmine separati con una barriera durante la notte.
- Il giorno dopo, rimuovere la barriera e consentire al pesce di accoppiarsi.
- Rimuovere i pesci dalle vasche di riproduzione e riportarli alle loro vasche di alloggiamento.
- Versare l'acqua dalla vasca di allevamento attraverso una rete a maglie sottili. Trasferire le uova fecondate in una capsula di Petri con terreno E3 zebrafish.
- Controllare la capsula di Petri con uno stereomicroscopio e scartare le uova torbide. Conservare le uova fecondate in terreno fresco E3 zebrafish a 28 °C.
3. Raccolta di campioni
NOTA: pinza per autoclave e manico per bisturi.
- Elaborazione immediata
- Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale a 4 °C (campione tumorale di diametro compreso tra 5 mm e 10 mm). Trasferire il campione a 4 °C dalla posizione desiderata per la lavorazione immediata.
- Conservazione durante la notte (opzionale)
- Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale e conservare il campione per una notte a 4 °C.
- Conservazione a -80 °C (facoltativo, meno consigliato)
- Conservare il campione a -80 °C in un flaconcino criogenico con terreno tumorale integrato con dimetilsolfossido (DMSO) al 5%.
4. Elaborazione del campione
NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.
- Lavare l'intero tessuto tumorale con 5 ml di terreno tumorale fresco, pipettando su e giù 10 volte usando una pipetta Pasteur di plastica. Aspirare e scartare il mezzo di lavaggio. Ripetere questo passaggio 3x.
NOTA: Evitare l'aspirazione del tessuto tumorale in quanto potrebbe rimanere attaccato alla pipetta di plastica Pasteur. - Trasferire il campione in una capsula di Petri e immergerlo in 1-2 ml di terreno tumorale fresco. Tagliare il campione di tumore in piccoli pezzi (1-2 mm3) usando una lama di bisturi e metterli in un tubo di plastica sterile da 5 ml con mezzo tumorale.
- Impostare il trinciatutto McIlwain su uno spessore di 100 μm. Posizionare i frammenti del campione sul tavolo di plastica circolare dell'elicottero e tritarli. Ruotare il tavolo di 90° e ripetere il taglio.
- Centrifugare i frammenti a 300 × g per 3 min. Quindi, aspirare con attenzione il surnatante e scartarlo.
- Incubare i frammenti con un tracker cellulare fluorescente, CM-DiI (concentrazione finale di 10 μg/mL nella soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentrazione finale di 1 μL/mL in DPBS) o CellTrace (concentrazione finale di 5 μM in DPBS) per 30 minuti, ponendo il tubo a bagnomaria a 37 °C.
- Risospendere i frammenti mediante pipettaggio delicato su e giù ogni 10 minuti.
NOTA: Nel caso di CellTrace, aggiungere terreno contenente almeno l'1% di proteine alla fine dell'incubazione, secondo le istruzioni del produttore. - Centrifugare a 300 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio 3x con 1 mL di DPBS per rimuovere il colorante non incorporato.
- Sospendere i frammenti in 5 ml di DPBS in una capsula di Petri da 60 mm.
NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si asciughi.
5. Istituzione di zPDX
NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.
- Anestetizzare gli embrioni 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) con 0,16 mg/ml di tricaina nel terreno E3 di zebrafish.
- Mettere tre cilindri di agarosio (passo 1.1.3) in una capsula di Petri e posare un embrione di zebrafish su un cilindro, esponendo un lato. Rimuovere la soluzione in eccesso per mantenere l'embrione in un film sottile.
- Trasferire il pezzo di tessuto macchiato con una pinza sterile dalla capsula di Petri al supporto di agarosio all'1% dove giace l'embrione. Raccogliere il tessuto, metterlo sopra il tuorlo dell'embrione e quindi spingerlo nello spazio perivitellino usando il microago di vetro tirato dal calore (fase 1.2.1).
- Aggiungere delicatamente alcune gocce di E3 1% penicillina-streptomicina (Pen-Strep) all'embrione per riportarlo nel liquido.
- Ripetere i punti 5.2-5.4 per tutti gli embrioni e, infine, rimuovere i supporti di agarosio dalla capsula di Petri e incubare gli embrioni a 35 °C.
- Controllare gli embrioni per gli xenotrapianti corretti (colorazione positiva) 2 ore dopo l'impianto utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Scartare gli embrioni con frammenti tumorali che non sono completamente all'interno dello spazio perivitellino, così come gli embrioni morti. Distribuire casualmente gli embrioni in sei piastre multi-pozzetto (massimo n = 20 embrioni/pozzetto), equamente divisi in gruppi secondo il piano sperimentale (ad esempio, controllo e FOLFOXIRI).
6. Trattamento
- Diluire il farmaco (ad es. 5-fluorouracile, oxaliplatino, irinotecan) in E3 1% Pen-Strep, mescolando accuratamente pipettando su e giù più volte. Come proposto da Usai et al.12, utilizzare una diluizione cinque volte del farmaco nell'acqua del pesce, rispetto alla concentrazione plasmatica equivalente (EPC).
- Mescolare i farmaci per preparare il cocktail (ad esempio, FOLFOXIRI).
- Rimuovere il supporto da ciascun pozzetto e aggiungere il cocktail di droga 2 ore dopo l'impianto.
- Trattare gli embrioni per 3 giorni. Rinnova il cocktail di droga ogni giorno.
7. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero
NOTA: Prima di iniziare, porre acetone a -20 °C e preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1.
- Giorno 1:
- Fissare le larve con 1 mL di paraformaldeide al 4% in flaconcini di vetro a 4 °C durante la notte.
- Giorno 2:
- Lavare le larve 3 x 5 min con 1 mL di PBS, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Conservare in 1 mL di metanolo al 100% a -20 °C durante la notte (o per la conservazione a lungo termine).
- Reidratare 3 x 10 minuti con 1 mL di PTw (0,1% di interpolazione in PBS), agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Permeabilizzare con 1 mL di 150 mM Tris-HCl a pH 8,8 per 5 min a RT, quindi riscaldare per 15 min a 70 °C.
- Lavare 2 x 10 min con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH2O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Permeabilizzare con 1 mL di acetone ghiacciato per 20 minuti a -20 °C.
- Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH2O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Lavare 2 x 5 minuti con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Incubare le larve in 1 mL di tampone bloccante per 3 h a 4 °C, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
- Posizionare le larve in piastre di pozzetto divise per gruppo come segue: 10 larve in 50 μL di volume/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti o 20 larve in 100 μL di volume/pozzetto in una piastra da 48 pozzetti.
- Eliminare il tampone bloccante, incubare le larve con una soluzione anticorpale primaria (ad esempio, caspasi scissa anti-umana di coniglio-3, 1:250) diluita in tampone di incubazione per una notte a 4 °C al buio e dondolare delicatamente su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi consigliati.
- Giorno 3:
- Lavare le larve in sequenza 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS (10% siero di capra, 1% Triton X-100 in PBS) e poi, con 2 x 10 min con 1 mL di PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) e 2 x 1 h con 1 mL di PBS-TS. In ogni lavaggio, agitare delicatamente le piastre contenenti le larve su una piastra shaker (400 rpm).
- Incubare le larve con anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti (ad esempio, Goat anti-Rabbit IgG [H+L] Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluito in tampone di incubazione al buio durante la notte a 4 °C, con delicata agitazione su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi raccomandati di soluzione anticorpale secondaria.
- Giorno 4:
- Lavare 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS e 2 x 1 h con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su una piastra shaker (400 rpm).
- Creare uno strato circolare con lo smalto (spessore di ~ 0,5-1 mm) sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare lo smalto e posizionare le larve al centro dello strato circolare, esponendo il lato dello xenotrapianto.
- Asciugare la soluzione in eccesso e montare il vetrino di copertura con un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente.
8. Imaging
- Cattura immagini al microscopio confocale con un obiettivo 40x. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: una risoluzione di 1024 x 512 pixel con una spaziatura Z di 5 μm.
9. Analisi dell'apoptosi mediante ImageJ
- Caricare (Fiji Is Just) ImageJ software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e aprire l'immagine del file Z-stack (fare clic su File | Aperto). Nella finestra pop-up, selezionare Visualizzazione stack/Hyperstack e fare clic su OK.
- Sovrapporre i diversi canali selezionando Immagine | Colore | Crea composito.
- Trascinare la barra Z nella parte inferiore dell'immagine per sfogliare l'immagine Z-stack e identificare l'area dello xenotrapianto (cellule che sono fluorescenti del tracker cellulare positivo. Vedere punto 4.5) nello spazio perivitelline del pesce zebra.
- Selezionare Point Tool e contare il numero di cellule umane apoptotiche (positive al tracker cellulare fluorescente e caspasi scisse-3), come mostrato nel video supplementare S1.
- Fare doppio clic sull'icona Point Tool , modificare il contatore e contare il numero totale di nuclei di cellule umane (nuclei di cellule CM-DiI positive).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo descrive l'approccio sperimentale per stabilire zPDX da adenocarcinoma pancreatico umano primario. Un campione di tumore è stato raccolto, tritato e colorato utilizzando colorante fluorescente, come descritto nella sezione 4 del protocollo. Gli zPDX sono stati quindi stabiliti con successo mediante l'impianto di un pezzo di tumore nello spazio perivitellino di 2 embrioni di zebrafish dpf, come descritto nella sezione 5 del protocollo. Come descritto nella sezione 6 del protocollo, gli zPDX sono stati ulteriormente sottoposti a screening per identificare i profili di sensibilità alla chemioterapia delle cellule tumorali derivate dal paziente. Ad esempio, è stata testata la combinazione di chemioterapia FOLFOXIRI (5-fluorouracile, acido folinico, oxaliplatino e irinotecan), poiché viene utilizzata come chemioterapia di prima linea per l'adenocarcinoma duttale pancreatico avanzato e nel carcinoma colorettale metastatico. Le immagini a montaggio intero degli zPDX sono state acquisite come stack Z sul microscopio confocale e l'induzione dell'apoptosi è stata analizzata come descritto nelle sezioni 8 e 9 del protocollo. Come mostrato in Figura 1A,B, la terapia combinata ha portato ad un aumento dell'apoptosi cellulare rispetto al gruppo di controllo. Nel caso di studio qui riportato, è stato identificato un aumento statisticamente significativo della frazione di cellule apoptotiche negli xenotrapianti impiantati per il gruppo trattato con FOLFOXIRI rispetto al gruppo di controllo (Figura 1C).
| Figura 1: zPDX da adenocarcinoma duttale pancreatico umano 3 giorni dopo il trattamento con FOLFOXIRI. Le membrane cellulari sono state colorate con CM-DiI (rosso) e il tessuto è stato xenoinnestato nello spazio perivitellino di 2 dpf AB zebrafish selvatici. Le larve sono state esposte a una combinazione di FOLFOXIRI (0,216 mg/mL di 5-fluorouracile, 0,013 mg/ml di acido folinico, 0,006 mg/ml di oxaliplatino, 0,011 mg/ml di irinotecan) o non esposte (CTRL) per 3 giorni, fissate e immunocolorate con anticorpi caspasi-3 scissi (ciano) e controcolorate da Hoechst (nuclei blu). Le larve sono state montate con Aqua Poly-Mount in vetrini da microscopio di vetro. (A1-3) Esempio rappresentativo di una larva di controllo (non esposta alla chemioterapia). Non sono state osservate cellule caspasi-3-positive scisse. (B1-3) Esempio rappresentativo di una larva xenotrapiantata 3 giorni dopo il trattamento con FOLFOXIRI, che mostra un'attivazione costante della caspasi-3 scissa. Le immagini a montaggio intero sono state catturate su un microscopio confocale Nikon A1 con una fotocamera digitale. Le linee tratteggiate mostrano le aree di xenotrapianto. (C) Quantificazione delle cellule doppie positive di caspasi-3 e CM-DiI scisse in larve xenotrapiantate trattate con FOLFOXIRI rispetto a CTRL, tracciate come media ± SEM (n ≥ 12); p < 0,001, test U di Mann-Whitney. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: zPDX = xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish; dpf = giorni dopo la fecondazione; FOLFOXIRI = 5-fluorouracile, acido folinico, oxaliplatino e irinotecan; CTRL = controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. |
| Soluzione/mezzo | Composizione, commenti | Scopo | ||
| Terreno tumorale (1x) | Al mezzo RPMI-1640, aggiungere penicillina-streptomicina (concentrazione finale 100 U/ml) e amfotericina (concentrazione finale 2,50 μg/ml). | |||
| E3 zebrafish medio (1x) | Diluire il mezzo embrionale 60x E3 (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) in acqua deionizzata fino ad una concentrazione di lavoro finale di 1x. | |||
| E3 1% Pen-Strep | Aggiungere 1 mL di penicillina-streptomicina a 99 mL di terreno E3 zebrafish. Mescolare per inversione. Conservare la soluzione a 4 °C | |||
| PTw | 0,1% Tween in PBS | Immunocolorazione a montaggio intero | ||
| Blocco del buffer | 10% siero di capra, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 in PTw | Immunocolorazione a montaggio intero | ||
| Buffer di incubazione | 1% siero di capra, 1% DMSO, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 in PTw | Immunocolorazione a montaggio intero | ||
| PBS-TS | 10% siero di capra, 1% Triton X-100 in PBS | Immunocolorazione a montaggio intero | ||
| PBS-T | 1% Triton X-100 in PBS | Immunocolorazione a montaggio intero | ||
Tabella 1: Soluzioni e supporti utilizzati nel protocollo.
Figura supplementare S1: Il campione di tumore PDAC è stato colorato con DiO (verde) e xenoinnestato nello spazio perivitellino di 2 embrioni di zebrafish dpf.Dopo un tempo di incubazione di 3 giorni, gli zPDX sono stati iniettati con 2 μg/mL di ioduro di propidio (PI; rosso) e quindi sottoposti a imaging confocale 3D. La vitalità cellulare è stata verificata misurando le cellule PI-positive sul numero totale di cellule umane (DiO positive). Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: PDAC = adenocarcinoma duttale pancreatico; dpf = giorni dopo la fecondazione; zPDX = xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish. Clicca qui per scaricare questo file.
Video supplementare S1: Esempio di conteggio apoptotico delle cellule umane, utilizzando lo strumento multipunto di ImageJ. Il video è uno Z-stack di uno zPDX 3 giorni dopo l'impianto, acquisito dopo l'immunocolorazione con caspasi-3 e Hoechst 33258. Abbreviazioni: zPDX = xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I modelli in vivo nella ricerca sul cancro forniscono strumenti inestimabili per comprendere la biologia del cancro e prevedere la risposta al trattamento del cancro. Attualmente sono disponibili diversi modelli in vivo , ad esempio animali geneticamente modificati (topi transgenici e knockout) o xenotrapianti derivati da pazienti da cellule primarie umane. Nonostante molte caratteristiche ottimali, ognuna ha varie limitazioni. In particolare, i suddetti modelli mancano di un modo affidabile per imitare il microambiente del tessuto tumorale del paziente.
È stato suggerito che il microambiente tumorale può svolgere molti ruoli importanti nella risposta ai farmaci18. Pertanto, per trovare un modello animale adatto che mantenga il microambiente del tessuto tumorale, è stato sviluppato un modello PDX alternativo, utilizzando pezzi di tessuto tumorale xenotrapiantati in 2 embrioni di zebrafish dpf. Il protocollo descrive come eseguire xenotrapianti in un gran numero di embrioni, consentendo lo screening ad alto rendimento dei farmaci, sia come singoli agenti che in combinazione.
Il punto chiave di questo approccio innovativo è che preserva sia le interazioni cellula-cellula che il microambiente tumorale, rispetto agli zPDX comunemente eseguiti con sospensioni monocellulari. Il PDAC da un campione chirurgico viene immediatamente messo in terreni tumorali freschi e freddi e il tumore viene tagliato in piccoli frammenti. La procedura complessiva utilizzata per generare il modello zPDX si basa sull'impianto diretto di un frammento dal tumore di un paziente nello spazio perivitellino di un embrione di zebrafish a 2 dpf.
Il modello proposto potrebbe servire come alternativa al modello PDX basato sulla digestione del campione di tessuto tumorale derivato dal paziente, seguita da iniezione diretta nel sacco vitellino o nello spazio perivitellino. Come evidenziato dal lavoro di Fior et al., è possibile stabilire un modello zAvatar dalla dissezione enzimatica di tumori pancreatobarici resecati chirurgicamente. Il tasso di impianto variava tra il 44% e il 64%, a causa della tipica bassa cellularità del campione pancreatico tumorale e dello sfavorevole stroma desmoplastico denso19.
Tuttavia, la sospensione cellulare ha riprodotto solo parzialmente il tumore originale14. Al contrario, l'mPDX, costruito trapiantando direttamente il tessuto tumorale in topi immunodeficienti, assomiglia meglio al tumore originale, che può aiutare meglio i medici a comprendere il comportamento del tumore e valutare le risposte individuali prima del trattamento20. Infatti, il piccolo frammento innestato mantiene il microambiente tumorale e conserva la diafonia tra cellule maligne e sane, simile al tumore originale21. La chemiosensibilità o chemioresistenza viene quindi riprodotta meglio, con un impatto diretto della tecnologia zPDX nel campo dell'oncologia traslazionale14. L'approccio zPDX consente a ciascun paziente di sviluppare il proprio tumore in un sistema vivente. Pertanto, questo rappresenta una buona alternativa all'uso di mPDX, in cui il tessuto tumorale viene ortoinnestato intatto o disaggregato in cellule, che vengono poi xenografate in modelli di riceventi murini13.
Questo protocollo è stato sviluppato in collaborazione con patologi che sono responsabili della selezione dei pezzi tumorali più adatti per il trapianto. I campioni di tessuto biologico sono sempre stati prelevati dal campione chirurgico e mai da una biopsia, in quanto quest'ultima è solitamente caratterizzata da una scarsità di tessuto ed è quindi destinata ai soli scopi diagnostici. Il criterio per il campionamento dei tessuti di solito non è marginale rispetto al nucleo, ma piuttosto un'area tumorale priva di emorragia e necrosi. Per questo motivo, una sezione istologica di criostato è stata sempre eseguita su metà del campione per un controllo di qualità immediato del materiale. Il presente studio potrebbe essere limitato dalla capacità delle cellule tumorali primarie di innestarsi nello spazio perivitellino degli embrioni di zebrafish. Tuttavia, un tasso di attecchimento dell'80% di tessuto vitale è stato osservato 3 giorni dopo il trapianto, sia dopo la conservazione a 4 °C (12/15 casi) che scongelato da -80 °C (10/12 casi), suggerendo che il tumore può essere efficacemente crioconservato, con una vitalità cellulare del 74% ± del 2% (Figura supplementare S1). Nonostante ciò, il tasso di successo dell'attecchimento tissutale varia tra i diversi tumori del paziente PDAC; Di conseguenza, la rapida lavorazione del tessuto subito dopo la resezione chirurgica, oltre a prevenire il congelamento, può migliorare l'efficienza.
Alcuni accorgimenti tecnici sono anche suggeriti nel protocollo per xenotrapianti di successo. Ad esempio, l'uso dell'elicottero ha standardizzato le dimensioni dei pezzi xenointrapati. Per verificare che i pezzi di tessuto tumorale siano di dimensioni uguali dopo il taglio, una possibile soluzione è quella di utilizzare un vetro di calibrazione per misurare il diametro dei frammenti prima dello xenotrapianto.
L'uso del supporto cilindrico di agarosio all'1% è essenziale sia per la posa degli embrioni su un lato che per il semplice impianto di un pezzo di tumore, nonché per prevenire la rottura del microago. Poiché i tumori presentano un'elevata variabilità, un'altra limitazione del metodo è che l'eterogeneità intratumorale è meno rappresentata in un frammento rispetto a una sospensione cellulare. Infatti, piccoli pezzi di tessuto potrebbero divergere in termini di popolazioni cellulari benigne e subcloni tumorali. Per superare questa critica, un numero elevato di embrioni iniettati dovrebbe essere utilizzato per ricapitolare l'eterogeneità del tumore e ridurre la variabilità nell'analisi. Secondo l'analisi statistica, ogni gruppo richiede una dimensione del campione superiore a 15, considerando una dimensione dell'effetto di d = 2 e una potenza dell'80% e del 95% di significatività statistica. Questo numero è ragionevole, in quanto un operatore esperto può elaborare circa 40 embrioni all'ora.
Oltre alla metodologia utilizzata per generare il modello zPDX, è stato anche evidenziato qui che una combinazione di FOLFOXIRI induce l'apoptosi delle cellule derivate dal paziente nel modello zPDX. Come con FOLFOXIRI, è possibile testare la chemiosensibilità zPDX ad altri schemi chemioterapici, come quelli testati con successo da Usai et al.11.
Inoltre, viene presentata la tecnica di immunocolorazione e imaging a montaggio intero per fornire la quantificazione della caratteristica di interesse. Per superare alcuni problemi e portare a un'immunocolorazione a montaggio intero di successo, si consiglia una soluzione DMSO al 5% per permeabilizzare i tessuti. Per quanto riguarda l'imaging confocale, i limiti di risoluzione del microscopio confocale potrebbero compromettere l'acquisizione delle pile più profonde delle larve xenotrapiantate. Tuttavia, nello studio, le cellule apoptotiche vengono contate sul numero totale di cellule del paziente. Una ricostruzione tridimensionale dalla base alla sommità della massa tumorale impiantata, con una dimensione del passo di 5 μm, consente di identificare tutti i nuclei umani, considerando la probabilità che lo stesso nucleo possa diffondersi all'interno del piano Z precedente o successivo. Di conseguenza, il contatore di strumenti multipunto ImageJ può essere utilizzato per controllare e prevenire il conteggio della stessa cella due volte e per eseguire il doppio conteggio nelle stesse pile Z (apoptotico sul totale delle cellule umane) e può facilmente tracciare l'apoptosi a livello di singola cellula.
Nonostante i suoi limiti, il modello zPDX presenta diversi vantaggi rispetto ai modelli in vivo: il ciclo di vita estremamente rapido del pesce zebra, essendo in grado di ottenere un gran numero di animali in breve tempo; la chiarezza ottica nelle fasi di sviluppo; e, soprattutto, l'impatto etico estremamente basso nella finestra temporale 0-120 h post fecondazione22. Oggi, uno studio co-clinico che utilizza zPDX è più economico di quello condotto con PDX basati su topi, poiché i ceppi dell'ospite immunodeficienti richiedono elevati costi di manutenzione e metodi di imaging complessi per monitorare la crescita del tumore23. In conclusione, tutti questi fattori evidenziano il potenziale del modello zPDX per l'uso in studi co-clinici per la previsione dei profili di sensibilità alla chemioterapia dei pazienti oncologici e per l'uso da parte di ricercatori interessati a nuovi modelli per lo screening dei farmaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Pisa (progetto 114/16). Gli autori ringraziano Raffaele Gaeta dell'Unità Operativa di Istopatologia dell'Azienda Ospedaliera Pisana per la selezione dei campioni di pazienti e il supporto patologico. Ringraziamo anche Alessia Galante per il supporto tecnico nelle sperimentazioni. Questo articolo è basato sul lavoro di COST Action TRANSPAN, CA21116, sostenuto da COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
