Summary
Questo articolo presenta una dimostrazione e un riassunto dei protocolli di produzione di fantasmi di gelatina che imitano i tessuti molli e la corrispondente caratterizzazione viscoelastica utilizzando l'indentazione e l'elastografia a risonanza magnetica.
Abstract
La caratterizzazione delle proprietà biomeccaniche dei tessuti biologici molli è importante per comprendere la meccanica dei tessuti ed esplorare i meccanismi biomeccanici correlati alla malattia, alle lesioni e allo sviluppo. Il metodo di prova meccanica è il modo più semplice per la caratterizzazione dei tessuti ed è considerato come verifica per la misurazione in vivo . Tra le molte tecniche di test meccanici ex vivo , il test di indentazione fornisce un modo affidabile, specialmente per campioni piccoli, difficili da fissare e viscoelastici come il tessuto cerebrale. L'elastografia a risonanza magnetica (MRE) è un metodo clinicamente utilizzato per misurare le proprietà biomeccaniche dei tessuti molli. Sulla base della propagazione dell'onda di taglio nei tessuti molli registrata utilizzando la risonanza magnetica, le proprietà viscoelastiche dei tessuti molli possono essere stimate in vivo sulla base dell'equazione delle onde. Qui, le proprietà viscoelastiche dei fantocci di gelatina con due diverse concentrazioni sono state misurate mediante MRE e indentazione. Sono stati presentati i protocolli di fabbricazione fantasma, test e stima del modulo.
Introduction
La maggior parte dei tessuti biologici molli sembrano avere proprietà viscoelastiche che sono importanti per comprendere la loro lesione e sviluppo 1,2. Inoltre, le proprietà viscoelastiche sono importanti biomarcatori nella diagnosi di una varietà di malattie come la fibrosi e il cancro 3,4,5,6. Pertanto, la caratterizzazione delle proprietà viscoelastiche dei tessuti molli è cruciale. Tra le molte tecniche di caratterizzazione utilizzate, i test meccanici ex vivo di campioni di tessuto e l'elastografia in vivo mediante imaging biomedico sono i due metodi ampiamente utilizzati.
Sebbene siano state utilizzate varie tecniche di prova meccanica per la caratterizzazione dei tessuti molli, i requisiti relativi alle dimensioni del campione e alle condizioni di prova non sono facili da soddisfare. Ad esempio, la prova di taglio deve avere campioni fissati saldamente tra le piastre di taglio7. Il test biassiale è più adatto per il tessuto della membrana e ha requisiti specifici di serraggio 8,9. Un test di compressione è comunemente usato per il test dei tessuti, ma non può caratterizzare posizioni specifiche all'interno di un campione10. Il test di indentazione non ha requisiti aggiuntivi per fissare il campione di tessuto e può essere utilizzato per misurare molti campioni di tessuto biologico come il cervello e il fegato. Inoltre, con una piccola testa di penetratore, è possibile testare le proprietà regionali all'interno di un campione. Pertanto, sono stati adottati test di indentazione per testare una varietà di tessuti molli 1,3,11.
La caratterizzazione delle proprietà biomeccaniche dei tessuti molli in vivo è importante per gli studi traslazionali e le applicazioni cliniche della biomeccanica. Le modalità di imaging biomedico come l'ecografia (US) e la risonanza magnetica (RM) sono le tecniche più utilizzate. Sebbene l'imaging statunitense sia relativamente economico e facile da eseguire, soffre di basso contrasto ed è difficile misurare organi come il cervello. In grado di visualizzare strutture profonde, l'elastografia MR (MRE) potrebbe misurare una varietà di tessuti molli6,12, in particolare il cervello13,14. Con la vibrazione esterna applicata, la MRE potrebbe misurare le proprietà viscoelastiche dei tessuti molli a una frequenza specifica.
Gli studi hanno dimostrato che a 50-60 Hz, il modulo di taglio del cervello normale è ~1,5-2,5kPa 5,6,13,14,15 e ~2-2,5 kPa per il fegato normale 16. Pertanto, i fantocci di gelatina che hanno proprietà biomeccaniche simili sono stati ampiamente utilizzati per imitare i tessuti molli per test e convalida17,18,19. In questo protocollo, sono stati preparati e testati fantocci di gelatina con due diverse concentrazioni. Le proprietà viscoelastiche dei fantocci di gelatina sono state caratterizzate utilizzando un dispositivo MRE elettromagnetico personalizzato14 e un dispositivo di indentazione 1,3. I protocolli di test potrebbero essere utilizzati per testare molti tessuti molli come il cervello o il fegato.
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Protocol
1. Preparazione fantasma di gelatina
- Pesare gelatina, glicerolo e acqua secondo la Tabella 1. Mescolare la polvere di gelatina con acqua per ottenere la soluzione di gelatina.
NOTA: Le concentrazioni dei singoli componenti per la preparazione dei due fantocci sono indicate nella tabella 1. Maggiore è la concentrazione di gelatina, più rigido è il fantasma. - Riscaldare la soluzione di gelatina a 60 °C a bagnomaria. Aggiungere glicerolo alla soluzione di gelatina mantenendo la temperatura.
NOTA: Il glicerolo stabilizza le miscele di gelatina aumentando la loro temperatura di fusione e il modulo di taglio17. - Mescolare la soluzione e riscaldarla nuovamente a 60 °C. Versare la soluzione miscelata in un contenitore che verrà utilizzato per i test MRE e di indentazione. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e attendere che la soluzione si solidifichi.
2. Test MRE
- Mettere la piastra vibrante sopra il fantasma di gelatina. Assicurarsi che il contatto tra il fantasma e la piastra vibrante sia saldo (Figura 1A).
NOTA: La piastra vibrante è realizzata in poliammide con una dimensione di 50 x 50 x 5 mm3. - Posizionare il fantasma di gelatina nella bobina della testa. Metti spugne e sacchetti di sabbia intorno al fantasma di gelatina per assicurarti che il fantasma sia saldamente posizionato. Utilizzare un attuatore elettromagnetico costruito su misura con una barra di trasmissione14,18. Montare un attuatore elettromagnetico sulla bobina della testa. Collegare la barra di trasmissione alla piastra vibrante (Figura 1B).
- Collegare le linee di alimentazione dell'attuatore con l'amplificatore. Collegare le linee di controllo con il controller (Figura 1C).
- Impostazioni dei parametri di scansione dell'attuatore e della risonanza magnetica
- Impostare la forma d'onda, la frequenza di vibrazione e l'ampiezza nel generatore di funzioni. Impostare l'ampiezza di vibrazione desiderata regolando l'amplificatore di potenza.
NOTA: Qui, la forma d'onda è impostata su sinusoidale nel generatore di funzioni; la frequenza di vibrazione è impostata su 40 Hz o 50 Hz e l'ampiezza è impostata su 1,5 Vpp. Nell'amplificatore di potenza, il rapporto di amplificazione è impostato al 40%. - Impostare il generatore di funzioni in modo che funzioni in modalità trigger. Collegare la linea di trigger alla porta di trigger esterna della macchina MRI.
- Impostare la frequenza di scansione MRE (attuatore) uguale a quella del generatore di funzioni, in modo che il gradiente di codifica del movimento sia sincronizzato con il movimento della piastra vibrante.
- Impostare la forma d'onda, la frequenza di vibrazione e l'ampiezza nel generatore di funzioni. Impostare l'ampiezza di vibrazione desiderata regolando l'amplificatore di potenza.
- Misurazione e analisi dei dati
- Seguire le procedure di posizionamento delle immagini di routine. Utilizzare una sequenza MRE basata su gradiente 2D (GRE) per l'imaging del fantasma di gelatina20. Impostare i parametri di imaging GRE-MRE come segue: Angolo di rotazione = 30°; TR/TE = 50/31 ms; Campo visivo = 300 mm; Spessore fetta = 5 mm; Dimensioni voxel = 2,34 x 2,34 mm2.
- Misurare le immagini di fase in quattro punti temporali in un ciclo sinusoidale. Applicate gradienti di codifica del movimento sia positivi che negativi in ogni punto temporale.
- In base all'immagine di fase acquisita, rimuovere la fase di sfondo sottraendo le immagini di fase codificate positive e negative. Scartare la fase con un algoritmo basato sull'ordinamento dell'affidabilità21.
- Estraete la componente principale del movimento applicando la trasformata di Fourier veloce alle immagini di fase senza wrapping. Filtrare l'immagine di fase con un filtro passa banda digitale. Stimare il modulo di taglio con un algoritmo di inversione diretta (DI) 2D per ottenere il modulo di archiviazione G' e il modulo di perdita G''13,14.
NOTA: la frequenza di taglio del filtro passa banda è [0,04 0,08]. La dimensione della finestra di raccordo dell'algoritmo DI è 11 x 11.
3. Prova di indentazione
- Utilizzare un punzone circolare o una lama chirurgica per tagliare il fantasma di gelatina in un campione cilindrico o cuboide, rispettivamente. Assicurarsi che lo spessore del campione sia compreso tra 3 e 10 mm e che il diametro del campione cilindrico o del lato lungo del cuboide sia maggiore di 4 mm. Utilizzare una lama affilata per tagliare la superficie del campione in modo da renderlo il più liscio possibile per la rientranza.
- Accendere il tester di rientro. Eseguire le seguenti operazioni utilizzando il programma di controllo del penetratore progettato per automatizzare la procedura di contatto dell'indentatore (programma personalizzato; vedere Tabella dei materiali).
- Fare clic sul pulsante Back off nella GUI per inizializzare il processo di calibrazione (Figura 2B). Leggere il valore dal sensore laser e digitare il valore nella casella BaseLine .
NOTA: durante il processo di calibrazione, la distanza tra il sensore laser e la piastra deflettore viene regolata su un valore predefinito specifico. - Posizionare un vetrino sulla piastra del deflettore e registrare il valore mostrato dal sensore laser. Quindi, mettere il campione sul vetrino e posizionarli insieme sulla piastra del deflettore. Leggere il valore dal sensore laser e digitarlo nella casella Campione+Diapositiva .
NOTA: Il sensore laser viene utilizzato per registrare lo spostamento della rientranza, ma viene anche utilizzato per misurare lo spessore del campione prima del test. - Prendiamo la differenza tra i due valori ottenuti nel punto 3.2.2 come spessore del campione nella regione di interesse (ROI).
- Posizionare con attenzione il campione insieme al vetrino sottostante proprio sotto il penetratore, quindi fare clic sul pulsante Contatto per avviare il contatto automatico tra il penetratore e la superficie del campione.
NOTA: se il contatto automatico non è soddisfacente, cioè se il penetratore preme in profondità nel campione o non ha un contatto, regolare la posizione del penetratore digitando un valore compreso tra 0,05 e 0,1 mm nella casella Offset e ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.4. - Sulla base dello spessore del campione misurato (fase 3.2.3), stimare lo spostamento di indentazione (cioè la profondità totale di indentazione) moltiplicando lo spessore con la deformazione di prova rientrata (qui, è impostato su ≤8% per mantenere l'impronta all'interno dell'ipotesi di piccola deformazione).
- Digitare i valori di spostamento (passo 3.2.5) nella casella Spostamento (mm). Impostare il tempo di rilassamento su 180 s nella casella Tempo di permanenza . Fare clic sul pulsante Rientro . Lo spostamento e la forza reattiva durante la procedura di ramp-hold verranno automaticamente registrati e salvati in un file nel percorso del file specificato.
NOTA: il percorso del file può essere predefinito come percorso per il salvataggio dei dati di test.
- Fare clic sul pulsante Back off nella GUI per inizializzare il processo di calibrazione (Figura 2B). Leggere il valore dal sensore laser e digitare il valore nella casella BaseLine .
- Esportare i dati di rientro in un foglio di calcolo. Utilizzare una serie
di Prony a due termini per adattarsi alla curva di rilassamento della forza 1,3,11:
- Stimare il modulo di taglio istantaneo (G 0) e il modulo di taglio a lungo termine (G∞) in base ai parametri adattati:
NOTA: Nelle equazioni precedenti, C 0, C i e τi sono parametri del modello della serie di Prony, F è la forza di indentazione, R è il raggio del penetratore, X è il fattore di compensazione per l'ipotesi del mezzo spazio infinito, V è la velocità di indentazione, t è la variabile temporale e t R è il tempo di rampa.
di Prony a due termini per adattarsi alla curva di rilassamento della forza 1,3,11:
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Representative Results
Seguendo il protocollo MRE, è stata osservata una chiara propagazione dell'onda di taglio nei fantocci di gelatina a 40 e 50 Hz (Figura 3). Le proprietà viscoelastiche misurate dalla MRE e i test di indentazione sono mostrati nella Figura 4. I valori stimati di G' e G" ad ogni prova per ciascun fantasma sono riassunti nella Tabella 2. Seguendo il protocollo di indentazione, le proprietà viscoelastiche di ciascun fantoccio in ciascun punto di prova sono riassunte nella Tabella 3.
Come mostrato nella Figura 4, per le misurazioni utilizzando la risonanza magnetica, un confronto dei valori G' e G" misurati a 40 e 50 Hz ha mostrato differenze significative tra i due fantocci di gelatina (test t dello studente, p < 0,05). Inoltre, sono state osservate differenze significative per entrambi i valori G' e G" tra le misurazioni di 40 e 50 Hz (test t dello studente, p < 0,05). Allo stesso modo, per le misurazioni utilizzando il test di indentazione, sono state osservate differenze significative tra i due fantocci per i valori G 0 e G∞ (test t di Student, p < 0,05). Sia la MRE che l'indentazione hanno fornito risultati coerenti per distinguere i fantasmi di gelatina morbida e rigida.
Figura 1: Prova di risonanza magnetica . (A) Posizionare la piastra vibrante sopra il fantasma di gelatina. (B) Posizionare il fantasma di gelatina all'interno della bobina della testa e montare l'attuatore elettromagnetico sopra la bobina della testa. (C) Una panoramica del sistema MRE elettromagnetico che mostri le connessioni tra ciascun componente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Prova di indentazione . (A) Mettere il fantasma della gelatina proprio sotto la testa del penetratore nel tester. (B) Preparare l'indentazione utilizzando il pannello di configurazione del controllo nella GUI. Inserire i parametri di indentazione nella GUI per impostare il test di rilassamento della rampa. Osservare le curve di rientro nella finestra Visualizzatore dati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini di propagazione delle onde per i due fantocci di gelatina a 40 e 50 Hz. Le quattro fasi corrispondono ai quattro punti temporali in un ciclo sinusoidale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Proprietà viscoelastiche misurate da esperimenti di MRE e di indentazione. (A) Mappe tipiche stimate di G' e G'' a 40 e 50 Hz per i due fantocci di gelatina da MRE. (B) Deviazione media e standard dei valori G 0 e G∞ per i due fantocci di sei prove di rientro ripetute. (C) Deviazione media e standard dei valori G' e G'' a 40 e 50 Hz per i due fantocci di sei prove MRE ripetute. Il simbolo dell'asterisco indica una differenza significativa (test t dello studente; p < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gelatina | Acqua | Glicerolo | Totale | |
| Fantasma 1 | 100 (4.35%) | 1200 (52.17%) | 1000 (43.48%) | 2300 (100%) |
| Fantasma 2 | 160 (6.96%) | 1140 (49.56%) | 1000 (43.48%) | 2300 (100%) |
Tabella 1: La massa e la concentrazione di massa della gelatina, del glicerolo e dell'acqua utilizzati per preparare i due fantocci di gelatina. L'unità di massa è grammi.
| Modulo(Pa) | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Prova 5 | Test 6 | Significare | Std | ||
| Fantasma 1 | 40 Hz | G' | 2978 | 2976 | 2976 | 2974 | 2971 | 2972 | 2975 | 3 |
| G'' | 198 | 197 | 197 | 198 | 199 | 199 | 198 | 1 | ||
| 50 Hz | G' | 2854 | 2852 | 2852 | 2851 | 2850 | 2848 | 2851 | 2 | |
| G'' | 341 | 342 | 342 | 342 | 341 | 341 | 341 | 1 | ||
| Fantasma 2 | 40 Hz | G' | 5603 | 5589 | 5596 | 5590 | 5586 | 5588 | 5592 | 7 |
| G'' | 419 | 412 | 419 | 413 | 408 | 408 | 413 | 5 | ||
| 50 Hz | G' | 5343 | 5341 | 5336 | 5336 | 5329 | 5331 | 5336 | 6 | |
| G'' | 317 | 317 | 318 | 324 | 321 | 323 | 320 | 3 | ||
Tabella 2: Modulo di stoccaggio (G') e modulo di perdita (G") dei due fantocci di gelatina misurati mediante MRE. Ogni fantasma è stato testato sei volte a una frequenza di attuazione di 40 e 50 Hz.
| Test 1 | Test 2 | Test 3 | Test 4 | Prova 5 | Test 6 | Significare | Std | ||
| Fantasma 1 | C0 | 1.54 | 1.88 | 1.81 | 1.71 | 1.65 | 1.60 | 1.70 | 0.13 |
| C1 | 0.64 | 0.16 | 0.09 | 0.16 | 0.16 | 0.21 | 0.23 | 0.20 | |
| C2 | 0.10 | 0.12 | 0.15 | 0.11 | 0.13 | 0.11 | 0.12 | 0.02 | |
| τ1 (s) | 459.71 | 177.52 | 114.14 | 7.32 | 6.1 | 3.73 | 128.09 | 177.51 | |
| τ2 (s) | 9.83 | 6.38 | 5.83 | 199.28 | 200.2 | 55.78 | 79.55 | 94.98 | |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 0.99 | 1.00 | 0.00 | |
| G0 (Pa) | 2273 | 2145 | 2040 | 1991 | 1935 | 1920 | 2051 | 136 | |
| G∞ (Pa) | 1535 | 1875 | 1808 | 1714 | 1650 | 1601 | 1697 | 128 | |
| Fantasma 2 | C0 | 5.97 | 6.29 | 6.16 | 6.20 | 6.14 | 6.11 | 6.14 | 0.11 |
| C1 | 0.29 | 0.30 | 0.43 | 0.38 | 0.18 | 0.48 | 0.34 | 0.11 | |
| C2 | 0.64 | 0.24 | 0.24 | 0.17 | 0.39 | 0.18 | 0.31 | 0.18 | |
| τ1 (s) | 5.99 | 3.50 | 2.46 | 2.71 | 69.34 | 2.36 | 14.39 | 26.95 | |
| τ2 (s) | 96.28 | 124.98 | 123.87 | 88.01 | 2.34 | 63.35 | 83.14 | 45.88 | |
| R2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 0.00 | |
| G0 (Pa) | 6899 | 6827 | 6825 | 6751 | 6710 | 6771 | 6797 | 67 | |
| G∞ (Pa) | 5967 | 6286 | 6160 | 6197 | 6144 | 6113 | 6145 | 105 |
Tabella 3: Parametri viscoelastici stimati dalle prove di indentazione per i due fantocci di gelatina. Ogni fantasma è stato testato sei volte.
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Discussion
I fantocci di gelatina sono comunemente usati come materiali che imitano i tessuti per testare e convalidare algoritmi e dispositivi 17,19,22,23,24,25,26,27. Uno degli studi pionieristici che utilizzano il fantasma di gelatina per confrontare MRE e test di taglio dinamico è stato presentato da Okamoto et al. (2011) 17. Nel loro studio, la concentrazione di massa della gelatina era ~ 2,8% e i valori stimati di G '' e G'' dopo la correzione erano compresi tra 1,06-1,15 kPa e 0,11-0,27 kPa, rispettivamente. Zeng et al. (2020)19 hanno anche usato il fantasma della gelatina per convalidare l'algoritmo di inversione per la risonanza magnetica. Con una concentrazione di massa di gelatina di ~ 3,5%, il valore G' stimato era ~ 2,5 kPa. Poiché il modulo di taglio aumenta con la concentrazione di gelatina, questi valori erano tutti coerenti con la stima in questo studio.
Per fare fantasmi di gelatina, si noti che è necessaria un'agitazione completa e accurata quando si mescola una grande quantità di polvere di gelatina con acqua. Questo è necessario per la completa dissoluzione per creare fantasmi omogeneizzati. Per aumentare la temperatura di fusione e il modulo di taglio, il glicerolo è stato aggiunto alla miscela17. Il bagno d'acqua a circa 60 °C aiuterà ad accelerare la miscelazione ed è consigliato durante il processo di agitazione. Di solito, la gelatina si formerà in un contenitore con una forma specifica, ad esempio cubo o cilindro. Pertanto, è importante filtrare le bolle prima di versare la soluzione miscelata nel contenitore.
Quando ci si prepara per il test MRE, una trasmissione stabile dell'onda di taglio è fondamentale. Pertanto, è necessario assicurarsi che la piastra vibrante sia premuta saldamente sopra il fantasma. Questo per evitare ogni possibile scivolamento tra la piastra e il fantasma. Tuttavia, questo porterà potenzialmente un certo livello di pre-stress locale. Pertanto, è importante non premere eccessivamente la piastra sul fantasma. Quando si imposta la frequenza di attuazione, si nota che lo smorzamento della propagazione dell'onda aumenta con la frequenza.
Si consiglia di posizionare il dispositivo di rientranza su un tavolo di isolamento delle vibrazioni. Questo perché anche una piccola vibrazione influenzerà il processo di registrazione ramp-hold. Inoltre, è necessaria una nuova calibrazione dei sensori se il dispositivo non è stato utilizzato per più di 1 mese.
Per avere le migliori prestazioni di misura della MRE, si consiglia di mantenere la frequenza entro 100 Hz. Questo perché maggiore è la frequenza, maggiore è la dissipazione della vibrazione, inducendo così un SNR inferiore delle immagini acquisite. Il test di indentazione misura principalmente il campione in un intervallo di frequenza inferiore a quello della risonanza magnetica. Per una discussione delle conversioni dei parametri tra i due metodi, si può fare riferimento a Chen et al. (2020)11. La MRE e l'indentazione possono essere utilizzate per misurare molti tessuti biologici molli per studiare le proprietà biomeccaniche ed esplorare i potenziali biomarcatori basati sulla biomeccanica per la diagnosi della malattia o la valutazione del trattamento.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
È riconosciuto il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (grant 31870941), Natural Science Foundation of Shanghai (grant 22ZR1429600) e della Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (grant 19441907700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-channel head & Neck coil | United Imaging Healthcare | 100120 | Equipment |
| 3T MR Scanner | United Imaging Healthcare | uMR 790 | Equipment |
| Acquisition board | Advantech Co | PCI-1706U | Equipment |
| Computer-Windows | HP | 790-07 | Equipment |
| Electromagnetic actuator | Shanghai Jiao Tong University | Equipment | |
| Function generator | RIGOL | DG1022Z | Equipment |
| Gelatin | CARTE D’OR | Reagent | |
| Glycerol | Vance Bioenergy Sdn.Bhd | Reagent | |
| Indenter control program | custom-designed | Software; accessed via: https://github.com/aaronfeng369/FengLab_indentation_code. | |
| Laser sensor | Panasonic | HG-C1050 | Equipment |
| Load cell | Transducer Technique | GSO-10 | Equipment |
| MATLAB | Mathworks | Software | |
| Power amplifier | Yamaha | A-S201 | Equipment |
| Voice coil electric motor | SMAC Corporation | DB2583 | Equipment |
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