Summary
هنا ، نقدم ثلاثة بروتوكولات لتحليل البيانات لتصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) في دراسة انسداد الوريد الشبكي (RVO).
Abstract
توفر التطورات في أدوات تصوير العيون مستوى غير مسبوق من الوصول إلى الباحثين الذين يعملون مع نماذج حيوانية لإصابات الأوعية الدموية العصبية. للاستفادة بشكل صحيح من هذه القابلية الأكبر للترجمة ، هناك حاجة إلى ابتكار طرق قابلة للتكرار لاستخلاص البيانات الكمية من هذه الصور. يمكن لتصوير التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) حل أنسجة الشبكية بدقة ميكرومتر والكشف عن الاختلافات الوظيفية في تدفق الدم الوعائي. هنا ، نحدد قراءات الأوعية الدموية غير الباضعة التي نستخدمها لتوصيف الضرر المرضي بعد إهانة الأوعية الدموية في نموذج فأر محسن لانسداد الوريد الشبكي (RVO). تشمل هذه القراءات تحليل التصوير المباشر لمورفولوجيا الشبكية ، وقياس عدم تنظيم الطبقات الداخلية للشبكية (DRIL) لنقص تروية الشعيرات الدموية ، ومقاييس تصوير الأوعية بالفلوريسئين لوذمة الشبكية وكثافة الأوعية الدموية. تتوافق هذه التقنيات مباشرة مع تلك المستخدمة لفحص المرضى الذين يعانون من أمراض الشبكية في العيادة. يتيح توحيد هذه الأساليب مقارنة مباشرة وقابلة للتكرار للنماذج الحيوانية مع الأنماط الظاهرية السريرية لأمراض العيون ، مما يزيد من القوة الانتقالية لنماذج إصابات الأوعية الدموية.
Introduction
أمراض الأوعية الدموية العصبية هي مشكلة رعاية صحية رئيسية مسؤولة عن السكتات الدماغية الإقفارية ، وهي سبب رئيسي للوفيات والمراضة ، وأمراض الأوعية الدموية في شبكية العين التي تؤدي إلى فقدان البصر 1,2. لنمذجة الأمراض الوعائية العصبية ، نستخدم نموذج فأر لانسداد الوريد الشبكي (RVO). هذا النموذج غير جراحي ويستخدم تقنيات تصوير مماثلة لتلك المستخدمة لفحص الأشخاص المصابين بأمراض الأوعية الدموية في شبكية العين في بيئة سريرية. وبالتالي فإن استخدام هذا النموذج يزيد من إمكانات الترجمة للدراسات التي تستخدم هذا النموذج. كما هو الحال مع جميع طرز الماوس ، من الأهمية بمكان زيادة قابلية استنساخ النموذج.
أمراض الأوعية الدموية في شبكية العين هي سبب رئيسي لفقدان البصر لدى الأشخاص الذين تقل أعمارهم عن 70 عاما. RVO هو ثاني أكثر أمراض الأوعية الدموية الشبكية شيوعا بعد اعتلال الشبكية السكري3. تشمل السمات السريرية المميزة ل RVO الإصابة الإقفارية وذمة الشبكية وفقدان البصر نتيجة لفقدان الخلايا العصبية 3,4. تم تطوير نماذج الفئران من RVO باستخدام التخثير الضوئي بالليزر للأوعية الرئيسية وصقلها لتكرار الأمراض السريرية الرئيسية التي لوحظت في RVOالبشري 5،6،7. تسمح التطورات في تصوير العيون أيضا بتكرار أدوات التشخيص غير الباضعة المستخدمة في البشر ، وهي تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)6. يسمح تصوير الأوعية بالفلوريسئين بمراقبة التسرب بسبب انهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) وكذلك ديناميكيات تدفق الدم في شبكية العين ، بما في ذلك مواقع الانسداد ، باستخدام حقن الفلوريسئين ، صبغة فلورسنت صغيرة 8,9. يسمح التصوير المقطعي المحوسب بالحصول على صور مقطعية عالية الدقة لشبكية العين ودراسة سمك وتنظيم طبقات الشبكية10. كان تحليل صور FA تاريخيا نوعيا إلى حد كبير ، مما يحد من إمكانية المقارنة المباشرة والقابلة للتكرار بين الدراسات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير عدد من الطرق لتحديد سمك الطبقة في تصوير OCT ، على الرغم من عدم وجود بروتوكول تحليل موحد حاليا ويختلف موقع الحصول على صورة OCT11. من أجل الاستفادة بشكل صحيح من هذه الأدوات ، هناك حاجة إلى منهجية تحليل بيانات موحدة وكمية وقابلة للتكرار. في هذه الورقة ، نقدم ثلاث قراءات وعائية تستخدم لتقييم الضرر المرضي في نموذج فأر لتسرب RVO-fluorescein ، وسمك طبقة OCT ، وعدم تنظيم طبقات الشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول بيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على تجارب القوارض ومراقبتها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة كولومبيا.
ملاحظة: تم التصوير على ذكور C57BL / 6J البالغة من العمر شهرين والتي تزن حوالي 23 جم.
1. إعداد الكواشف لتصوير الشبكية
- تحضير محلول الفلوريسئين عن طريق الحقن.
ملاحظة: الفلوريسئين حساس جدا للضوء. يحفظ بعيدا عن الضوء ويستخدمه بعد وقت قصير من التحضير.- تمييع الفلوريسئين إلى تركيز 1 ٪ في المياه المالحة المعقمة.
- تحضير الكيتامين / الزيلازين
- يتم تمييع الكيتامين والزيلازين في محلول ملحي معقم وفقا للتركيز التالي: الكيتامين (80-100 ملغ/كغ) وزيلازين (5-10 ملغ/كغ).
- محلول ملحي معقم
- تحضير حقنة 5 مل بإبرة 26 جم بمحلول ملحي معقم.
2. التصوير OCT والفلوريسئين
- قم بتشغيل صندوق ضوء مجهر تصوير الشبكية وجهاز OCT ومنصة الماوس الساخنة.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير.
- أضف قطرة واحدة من فينيليفرين وتروبيكاميد إلى كل عين.
- حقن 150 ميكرولتر من التخدير (الكيتامين (80-100 ملغم / كغم) وزيلازين (5-10 ملغ / كغ)) داخل الصفاق (IP). تحديد عمق التخدير عن طريق قرصة اصبع القدم وانتظر حتى لا يستجيب الحيوان. ضع مرهم العيون أو الدموع الاصطناعية على كلتا العينين.
- استيعاب الماوس على المنصة.
- اضبط ارتفاع وزاوية المنصة حتى يصبح عرض قاع الشبكية واضحا ومركزا. التقط صورة لقاع العين.
- افتح برنامج التصوير و OCT. في برنامج OCT ، اضبط الدفع على 5.
- التقط صورة OCT على بعد 75 ميكرومتر من الحرق. كرر ذلك مع الأرباع الثلاثة الأخرى من شبكية العين.
- حقن 100 ميكرولتر من 1٪ فلوريسئين IP.
- قم بتبديل الكاميرا إلى مرشح 488 نانومتر. زيادة كسب الكاميرا إلى 5.
- التقط صورة لقاع العين في تمام 5 دقائق بعد حقن الفلوريسين.
ملاحظة: تجنب تعريض العين لفترات طويلة لضوء الكاميرا عند أقصى قدر من الإعداد، لأن الفلوريسئين يمكن أن يؤدي إلى تفاقم التلف الضوئي في شبكية العين. احتفظ بمصدر الضوء بعيدا حتى ينقضي وقت الانتظار لمدة 5 دقائق ويكون الماوس جاهزا للتصوير.
3. الرعاية اللاحقة
- حقن 1 مل من محلول ملحي معقم IP. ضع قطرات العين المزلقة على كلتا العينين. ضع مرهم العيون أو الدموع الاصطناعية على كلتا العينين.
- راقب الفأر وهو يتعافى من التخدير. العودة إلى القفص مع الحيوانات الأخرى فقط عندما تتعافى تماما ، بشكل عام بعد حوالي 40 دقيقة.
4. تقييم معايير الاستبعاد
- افتح صورة قاع العين التي تم التقاطها بعد 24 ساعة من الإجراء لتقييم معايير الاستبعاد. استبعد العين إذا تم تحديد أي من المعايير التالية.
- تقييم ما إذا كانت الصورة لا تحتوي على أي انسداد
- تقييم الصورة لعدد الأوعية المسدودة.
ملاحظة: عادة ما يكون للانسداد الناجح بعض التصبغ الأرجواني على الحرق أو حوله ، وعاء رقيق جدا أو متقطع من خلال الحرق ، مظهر وعاء باهت أو غير موجود خارج منطقة الحرق ، وتغير لون الشبكية من نقص الأكسجة. إذا كان من الممكن رؤية الوعاء بأكمله من خلال الحرق الأبيض بواسطة الليزر ، فقد فشل الوعاء في الانسداد. في بعض الأحيان ، يبدو الوعاء مسدودا جزئيا ، ولكن إذا بدا غير منقطع خارج الحرق ، فمن المحتمل ألا ينسد الوعاء. - بالنسبة للحالات الغامضة ، استخدم تصوير FA في نفس النقطة الزمنية لتقييم الانسداد. في هذه الصور ، سيظهر الانسداد ككسر في استمرارية السفينة ، غالبا مع تناقص الوعاء المحيط.
- إذا تم تحديد عدم وجود انسداد ، استبعد العين من التحليل ، حيث يعتبر RVO غير فعال.
ملاحظة: عادة ما يتم حل الانسدادات بحلول 48-72 ساعة بعد RVO ، ويجب عدم استخدام وجود الانسدادات كمعيار استبعاد في هذه النقاط الزمنية.
- تقييم الصورة لعدد الأوعية المسدودة.
- تقييم قاع العين وصور OCT لانفصال الشبكية المفرط
ملاحظة: تراكم السوائل تحت الشبكية شائع بعد تحريض RVO ، ويسبب انفصال الشبكية العصبية عن RPE. يتم تعريف المعايير الإقصائية لانفصال الشبكية المفرط على النحو التالي: سيكون OCT إما غير قابل للعرض تماما ، أو ستظهر بعض الطبقات مشوهة بشكل لا يصدق. جودة الصورة رديئة ، مع فقدان دقة طبقات الضفيرة الخارجية و RPE. الفصل بين الشبكية العصبية والمشيمية أكبر مما يسمح به مجال رؤية OCT. على صورة قاع العين ، ستكون نغمة شبكية العين بيضاء بالكامل تقريبا ، مع بعض البقع الأرجوانية. قد يبدو جزء من شبكية العين مشوها وخارج نطاق التركيز. هذا لأنه قد انفصل وهو على مسافة بؤرية مختلفة عن بقية شبكية العين.- إذا كان تقييم الصور من العين يحدد انفصال محيطي أو كامل للشبكية ، استبعد العين من التحليل.
- استبعاد الصور التي تحتوي على دليل على إعتام عدسة العين في القرنية
ملاحظة: يظهر إعتام عدسة العين في القرنية كنقطة بيضاء معتمة على قرنية الفأر. يحدث إعتام عدسة العين عادة بسبب عدم كفاية تزييت العينين أثناء تخدير الحيوان ويمكن تجنبه إلى حد كبير من خلال الحرص على تطبيق مرهم العين بسخاء. يمكن التعرف على إعتام عدسة العين بشكل عام قبل التصوير عن طريق فحص الحيوان. يجب استبعاد الفئران التي أصيبت بإعتام عدسة العين من مجموعة البيانات دون الحاجة إلى الخضوع لعملية التصوير. في التصوير ، سوف يحجب إعتام عدسة العين شبكية العين عن الكاميرا ، وسيظهر OCT مشوها. - تقييم الصورة للنزيف المفرط
ملاحظة: يمكن تحديد النزف المفرط على أنه كميات من السائل الأحمر في الصورة ، وعادة ما يحجب خلفية الشبكية والأوعية الدموية والحروق. ستكون هذه المناطق من السائل الأحمر أكثر إشراقا وحمراء معتمة من البقع الأرجوانية الطبيعية في RVO الناجح. يظهر النزيف في طبقة الخلايا العقدية في تصوير OCT ويتداخل مع القدرة على تصور طبقات الشبكية الأخرى تحت النزيف.- إذا تم تحديد الصورة على أنها تعاني من نزيف مفرط ، فقم باستبعاد العين من التحليل.
5. معالجة صور الفلوريسئين
- افتح صورة الفلوريسئين في برنامج معالجة الصور.
- تكرار الصورة
- باستخدام أداة الاختيار ، تتبع بعناية الأوعية الرئيسية.
- الأوعية الرئيسية هي الأوردة والشرايين السميكة التي تشع من القرص البصري. تجاهل أي سفن متفرعة من هذه السفن.
- إذا كان التسرب يمنع رؤية مخطط الوعاء بالقرب من موقع الانسداد ، فتتبع التسرب في الموقع التقريبي للوعاء (حافظ على السماكة ، وقم بتوصيل آخر نقطة مرئية بالنقطة المرئية التالية).
- في الصورة الأولى ، احذف التحديد ، مع ترك الخلفية فقط. احفظ هذه الصورة المقنعة.
- انقل التحديد إلى الصورة الثانية ، واعكس التحديد وحذفه ، وعزل الأوعية. احفظ هذه الصورة المقنعة.
- افتح الصورتين في ImageJ. افتح صورة الخلفية وقم بقياس الكثافة المدمجة.
- افتح صورة السفينة ، وحدد الخطوط العريضة للأوعية ، ثم قم بقياس متوسط الشدة.
- قسم الكثافة المتكاملة للخلفية على متوسط شدة الأوعية ، مما يولد نسبة التسرب للعين.
- سجل نسبة التسرب هذه لكل عين في مجموعة تجريبية.
- لمزيد من التحكم في الخلفية ، قم بتطبيع العيون التجريبية إلى متوسط نسبة التسرب لعيون التحكم غير المصابة.
ملاحظة: من أجل إنشاء تقدير كمي موحد لتسرب الفلوريسئين في صورة FA ، يستخدم هذا الحساب نسبة كثافة الخلفية (حيث سيكون التسرب موجودا) مع سطوع الأوعية الرئيسية لإنشاء نتائج تتحكم في الاختلاف في السطوع من صورة إلى أخرى ويمكن قياسها كميا بشكل موثوق. العيون غير التالفة ليس لها تسرب ويجب أن يكون لها نظريا نسب صفر. وبالتالي ، فإن النسب المحسوبة من عيون التحكم غير التالفة هذه تمثل ضوضاء الخلفية ، وتستخدم هذه القيمة لزيادة تطبيع القيم التجريبية.
6. سمك طبقة الشبكية
- افتح صورة OCT في برنامج معالجة الصور.
- تتبع حدود طبقة الخلية العقدية ، وطبقة الضفيرة الداخلية ، والطبقة النووية الداخلية ، وطبقة الضفيرة الخارجية ، وطبقة مستقبلات الضوء ، وطبقة RPE. قياس متوسط سمك كل طبقة.
- كرر ذلك لصور OCT من الأرباع الثلاثة الأخرى من شبكية العين. متوسط سمك الطبقة المتوسط عبر الأرباع الأربعة للحصول على متوسط سمك كل طبقة شبكية للعين.
- كرر لكل عين في المجموعة التجريبية.
7. عدم تنظيم الطبقات الداخلية للشبكية (DRIL)
- افتح صورة OCT في ImageJ.
- باستخدام أداة الخط ، قم بقياس المسافة التي يكون فيها الحد العلوي للطبقة الضفيرية الخارجية غير واضح.
ملاحظة: من المهم التمييز بين DRIL والمناطق ذات الرؤية الضعيفة للطبقة الناتجة عن القطع الأثرية التصويرية. قد تؤدي جودة صورة OCT الرديئة إلى إبطال العين لتحليل DRIL إذا كانت دقة الصورة الكافية غير ممكنة. عادة ما تحتوي الصور التي تحتوي على DRIL على مناطق أخرى أو طبقات شبكية تم حلها وتنظيمها بوضوح ، مما قد يكون مؤشرا جيدا لجودة الصورة الكافية.- قم بالقياس أفقيا من خط العرض حيث يبدأ الفوضى إلى خط العرض حيث تصبح الحدود العليا للطبقة الضفيرية الخارجية مرئية مرة أخرى ، إن وجدت. حتى إذا تحولت الطبقة الضفيرية الخارجية لأعلى أو لأسفل عموديا ، فقم بالقياس أفقيا تماما.
- قد تكون هناك مناطق متعددة من عدم التنظيم مفصولة بمناطق خالية من عدم التنظيم. قم بقياسها بشكل فردي واحسب مجموع المسافات.
- اقسم طول عدم التنظيم على الطول الإجمالي لشبكية العين المرئية في كل صورة OCT للحصول على نسبة عدم التنظيم للصورة.
- كرر القياس والحساب لصور OCT من الأرباع الثلاثة الأخرى من شبكية العين.
- خذ متوسط نسب عدم التنظيم من صور OCT الأربعة. يمثل هذا الرقم متوسط عدم التنظيم لشبكية العين بأكملها. كرر لكل عين في المجموعة التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تسمح طرق التحليل هذه بالقياس الكمي لأمراض الشبكية التي تم التقاطها بواسطة تصوير FA و OCT. استخدمت التجارب التي تم استخراج البيانات التمثيلية منها ذكور الفئران C57BL / 6J التي كانت إما بمثابة عناصر تحكم غير مصابة أو خضعت لإجراء RVO وتلقت إما قطرات العين المعالجة Pen1-XBir3 أو قطرات العين Pen1-Saline للمركبة. تضمن نموذج إصابة RVO تشعيع الليزر (532 نانومتر) للأوردة الرئيسية في كل عين من فأر مخدر بعد حقن الوريد الخلفي لوردة البنغال ، وهي صبغة منشط ضوئي12. تم توصيل ثلاث نبضات ليزر على مسافة متوسطة تبلغ 375 ميكرومتر من مركز العصب البصري للحث على التخثير الضوئي وانسداد الأوعية12. تم توضيح الاستخدام الفعال لإجراء RVO في Avrutsky et al.12 ، ومزيد من التفاصيل حول تحسين طريقة RVO مفصلة في Colón Ortiz et al.13. يوضح الشكل 1A أمثلة على صور FA و OCT من كلتا المجموعتين. نظرا للطبيعة المتغيرة لتشكيل الانسداد والاستقرار من خلال عملية التخثير الضوئي ، يمكن ملاحظة درجات مختلفة من الضرر. في بعض شبكية العين ، يؤدي الضرر الناجم عن إجراء RVO إلى أمراض العيون التي تجعل صور الشبكية غير مناسبة للتحليل. بعد الاستحواذ ، يجب أولا تقييم الصور لمعايير الاستبعاد لضمان التحليل الأمثل والنتائج الموثوقة. تشمل معايير الاستبعاد هذه ، المحددة في الشكل 1 ب ، انفصال الشبكية والنزيف وإعتام عدسة العين. كما يمكن ملاحظته في مثال قاع العين وصور OCT ، تمنع هذه الأمراض التصوير المقطعي المحوسب الواضح ، مما يجعل شبكية العين غير مناسبة لتحليل البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن أن بعض شبكية العين لن تحتوي على انسداد مستقر. هذه الصور لا تصمم بدقة الضرر الإقفاري ونقص الأكسجين ويجب استبعادها من التحليل.
يساهم انهيار حاجز الدم والشبكية في التسبب في RVO14,15. يعد تقييم كمية التسرب من الأوعية مؤشرا مفيدا على نفاذية الأوعية الناجمة عن الإصابة. يسمح تصوير FA بتصور هذا التسرب ، ولكن هناك عددا من العوامل ، مثل الاختلافات في معدل الدورة الدموية ، تؤثر على الكثافة الأولية لصور FA وتجعل القياس الكمي المتسق16,17. تتحكم طريقتنا في هذا التباين عن طريق تطبيع الكثافة التي لوحظت في شبكية العين إلى متوسط شدة الأوعية الدموية الرئيسية. يوفر هذا نسبة تسرب لكل صورة شبكية يمكن مقارنتها بغيرها وتحليلها. يوضح الشكل 2A الصور المقنعة المستخدمة في هذا الحساب ، والتي تفصل الأوعية الدموية الرئيسية عن المناطق الأخرى من الشبكية. تسمح القدرة على تحديد كمية الفلوريسئين بمقارنة شدة الإصابة وفعالية العلاج ، بالإضافة إلى دراسة التغيرات في التسرب على مدار فترة الإصابة (الشكل 2 ب) ، والتي قد تكون تأثيرا دقيقا للغاية بحيث لا يمكن إثباته من خلال التقارير النوعية وحدها.
يسمح التصوير المقطعي المحوسب بتحليل تأثير RVO على طبقات الشبكية الفردية وسمك الشبكية الكلي. يوضح الشكل 3 أ ترسيم طبقات الشبكية في صورة OCT. يسمح تتبع حدود كل طبقة (الشكل 3 ب) بعدة طرق للتحليل. يثبت التحديد الكمي للسمك لكل طبقة شبكية أنه مفيد ، حيث أن الاستجابة الوذمية الأولية لها تأثير أكثر عمقا على طبقات الشبكية الداخلية. تسمح الآثار أيضا بدراسة سمك الشبكية الكلي والتحليل المنفصل لطبقات الشبكية الداخلية مقابل الخارجية. يقدم الشكل 3C تحليلا للمسار الزمني لتلف RVO ، حيث يمكن ملاحظة التورم الالتهابي الأولي لطبقات الشبكية والتخفيف التنكسي في نهاية المطاف. يكشف رسم سمك كل طبقة بمرور الوقت عن ديناميكيات مختلفة للطبقات الضفيرية الداخلية والطبقات النووية الداخلية ، حيث تواجه الطبقة النووية الداخلية استجابة أكبر بكثير للإصابة الأولية ، لكن الطبقة الضفيرية الداخلية تظهر ترققا أكثر حدة بعد استقرار الوذمة الأولية والعودة إلى خط الأساس (الشكل 3 دال ). وهذا يمنح فهما أكثر دقة لدوافع الاستجابة في نقاط زمنية مختلفة. اختبرنا أيضا فعالية مثبط الكاسباز في تخفيف التورم والحماية من التنكس في نهاية المطاف ، مع تحليل يكشف عن تأثيرات مختلفة في الطبقات الفردية.
عدم تنظيم طبقات الشبكية الداخلية (DRIL) هي ميزة أخرى من سمات OCT تستخدم كمقياس تشخيصي لنقص التروية في اعتلال الشبكية السكري ، بالإضافة إلى مقياس تنبؤي لحدة البصر في RVO18,19. في التصوير OCT ، يظهر DRIL على أنه اختفاء للحدود العليا للطبقة الخارجية الضفيرة12 ، ويمزج الطبقات الخارجية الضفيرية والطبقات النووية الداخلية معا (الشكل 4 أ). يوضح الشكل 4B مثالين لصور OCT مع مناطق مميزة من DRIL. نعبر عن DRIL كنسبة من إجمالي طول الشبكية ، بمتوسط عبر أربعة مقاطع عرضية OCT. يسمح لنا هذا المقياس بمقارنة المجموعات التجريبية كميا. يقدم الشكل 4C مثالا على التحليل ، حيث تمت مقارنة عدم تنظيم الشبكية لمجموعتين تجريبيتين للتحقيق في فعالية المانع في التخفيف من تلف الشبكية في RVO.
الشكل 1: الصور التي تم الحصول عليها من تصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). (أ) أمثلة على صور FA و OCT من شبكية العين بعد 24 ساعة من RVO والضوابط غير المصابة. (ب) تصوير قاع العين والتصوير المقطعي المحوسب لمعايير الاستبعاد المختلفة: انفصال الشبكية المفرط ، والنزيف ، وإعتام عدسة العين في القرنية ، وعدم الانسداد. يشار إلى مسافة اقتناء OCT من خلال المبدأ التوجيهي الأخضر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: القياس الكمي لتسرب الفلوريسين . (أ) فصل صورة FA في الأوعية والخلفية للتحليل (ب) قياس كمية تسرب الفلوريسئين من عيون الفئران المسدودة بالوريد الشبكي C57BL / 6J (RVO) التي تتلقى إما 10 ملغ من قطرات العين المثبطة Pen1-XBir3 (N = 17) أو قطرات العين للمركبات المالحة Pen1 (N = 13) في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الإجراء. يتم تطبيع قراءة كثافة صورة الخلفية إلى متوسط قراءة الكثافة من صورة السفينة. يتم تطبيع متوسط قراءة الشدة لفئران RVO إلى ضوابط غير مصابة. تظهر أشرطة الخطأ المتوسط مع SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: القياس الكمي لسمك طبقة الشبكية في صور OCT. (أ) شبكية العين غير المصابة مع طبقات الشبكية الفردية المسماة: طبقة الخلايا العقدية ، طبقة الضفيرة الداخلية ، الطبقة النووية الداخلية ، طبقة الضفيرة الخارجية ، طبقة المستقبلات الضوئية ، RPE ، والمشيمية. (ب) مثال على آثار طبقة من صور OCT المأخوذة من السيطرة غير المصابة والفئران بعد 24 ساعة من RVO C57 / BL6. (ج) القياس الكمي للتغير في سمك الشبكية الكلي وسمك الشبكية الذي لوحظ في التصوير المقطعي المحوسب لشبكية فئران C57BL / 6J عند 4 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 8 أيام بعد RVO. (د) القياس الكمي لتغير السماكة في الطبقات الضفيرية الداخلية والطبقات النووية الداخلية لشبكية فئران C57BL / 6J عند 24 ساعة و 48 ساعة و 8 أيام بعد RVO للفئران C57BL / 6J التي تتلقى إما 10 مجم من قطرات العين المثبطة Pen1-XBir3 (N = 14) أو قطرات العين للمركبة المالحة Pen1 (N = 15) مباشرة بعد إجراء RVO و 24 ساعة بعد RVO. تظهر أشرطة الخطأ المتوسط مع SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: القياس الكمي لعدم تنظيم طبقات الشبكية الداخلية (DRIL) التي لوحظت في صور OCT بعد RVO. في صور OCT ، يشار إلى DRIL بفقدان ترسيم واضح بين الطبقات الداخلية النووية والخارجية. (أ) أمثلة على أجزاء من شبكية العين مع أو بدون DRIL في التصوير OCT. (B) مناطق DRIL في التصوير OCT لمنطقتين في ماوس C57BL / 6J بعد 24 ساعة من RVO ، يشار إليها بخطوط بيضاء. يتم قياس DRIL أفقيا عبر الصورة بدلا من اتباع شكل شبكية العين. (ج) التحديد الكمي لنسبة طول الشبكية حيث لوحظ DRIL عند 24 ساعة و 48 ساعة بعد RVO لعيون الفئران C57BL / 6J التي تتلقى إما 2.5 ملغ من قطرات العين المثبطة Pen1-XBir3 (N = 19) أو قطرات العين Pen1-Saline (N = 21) بعد إجراء RVO. تظهر أشرطة الخطأ المتوسط مع SEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم تصوير شبكية القوارض غير الباضعة وسيلة لدراسة علم الأمراض وتطوير التدخلات. طورت الدراسات السابقة وحسنت نموذجا للفأر من RVO ، مما حد من التباين وسمح بترجمة موثوقة للأمراض السريرية الشائعة في شبكية العين5،7،13. تسمح التطورات في تكنولوجيا التصوير العيني أيضا باستخدام تقنيات التصوير السريرية في الجسم الحي مثل FA و OCT في التجارب ، مما يمنح القدرة على مقارنة نماذج الفئران مع ملامح المرض البشري6،12،15. ومع ذلك ، لتعظيم المعلومات التي يمكن استخراجها من هذه الصور والإمكانات الانتقالية الشاملة للنموذج ، هناك حاجة إلى طرق كمية موحدة وقابلة للتكرار وصارمة لتحليل الصور. نقدم هنا طرق التحليل التي تسمح بالتمثيل الكمي لشدة الضرر ، مما يسمح بإجراء مقارنات أكثر دقة وموثوقية بين الفئران وعبر المجموعات التجريبية. تتضمن هذه التحليلات القياس الكمي للتسرب في صور FA ، والقياس الكمي لمتوسط سمك الطبقة ، ومناطق DRIL في صور OCT.
يكمن العامل الحاسم في التحليل الناجح في جودة الصور المكتسبة. يمكن أن تؤدي صور OCT التي تم حلها بشكل سيئ إلى صعوبة في تتبع الطبقات الفردية وعدم القدرة على التمييز بين عدم تنظيم الشبكية الداخلية وجودة الصورة الرديئة. عند التصوير ، من المهم توخي الحذر في وضع الماوس على المنصة ، والتأكد من أن صورة قاع العين في بؤرة التركيز ، والعصب البصري متمركز نسبيا ، والمقطع العرضي للشبكية أفقي عبر الصورة. من المهم أيضا تزييت العينين بشكل متسق أثناء تخدير الحيوان ، خاصة عندما يتم تصوير نفس الحيوان عدة أيام. قد يؤدي التشحيم غير الكافي إلى إعتام عدسة العين في القرنية ، مما يحجب الشبكية ويجعلها غير مناسبة للتصوير. قد تحدث أمراض شبكية مختلفة في تصوير RVO ، مما يجعل الصور غير مناسبة للتحليل. وتشمل هذه انفصال الشبكية المفرط والنزيف المفرط ، والتي ، إلى جانب المساس بشكل كبير بجودة التصوير ، تمثل أيضا درجة من الضرر الشديد بحيث لا يمكن استخدامها كنموذج ل RVO. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن لجميع السفن المسدودة أن تعمل بالكامل بعد فترة وجيزة من الإصابة ، الأمر الذي لن يصمم بدقة تلف RVO ويجب استخدامه كمعيار استبعاد. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن الانسدادات الناجحة ستحل بشكل طبيعي بحلول 48-72 ساعة بعد الإصابة ، ومن الأفضل استخدام وجود الانسدادات كمعيار استبعاد في أو قبل 24 ساعة بعد الإجراء. Colón Ortiz et al.13 تفاصيل أفضل الممارسات للحد من التباين ومعايرة الإصابة في نموذج محسن لإجراء RVO. يعد تحديد معايير الاستبعاد والحكم عليها أيضا خطوة حاسمة لتحليل الصور. نظرا لأن هذا الأمر متروك إلى حد كبير لتقدير المقيم ، فمن المهم أن يعمى المقيمون عن مجموعات العلاج وأن يمارسوا الاتساق في الحكم على شدة الأمراض. توجد بعض القيود في تطبيق هذه الأساليب ، لا سيما في ممارسة تصوير نفس الماوس في نقاط زمنية متعددة. هناك حد للتكرار الذي يمكن عنده تخدير الماوس للتصوير ، مما يستلزم اختبار وتعديل النقاط الزمنية لتحديد المسار الزمني الأمثل. تستخدم دراساتنا نقاط زمنية للتصوير في 4 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 8 أيام ، والتي وجدنا فيها مراحل التقاط الإصابة الأولية والاستجابة الالتهابية الحادة والإصابة طويلة المدى12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض سلالات الماوس أكثر عرضة لتطور إعتام عدسة العين في القرنية ، والتي تشمل نماذج مختلفة من الفئران المصابة بالسكري ، مما قد يؤدي إلى عدد كبير من الاستثناءات أو دورات الوقت غير المكتملة20,21. قد تحتاج الدراسات التي تستخدم خطوط الفئران هذه إلى تخصيص حجم المجموعة التجريبية أو النقاط الزمنية للتصوير اعتمادا على حساسية القرنية.
تم استخدام تصوير الأوعية بالفلوريسئين إلى حد كبير نوعيا لمراقبة وتصنيف أمراض الشبكية مثل التسرب ، وكذلك أنماط تدفق الدم المتغير RVO6. في الآونة الأخيرة ، كانت هناك جهود لتطوير تحليل كمي ل FA في النماذج الحيوانية ، مثل حساب منطقة الأوعية الدموية والتعرج16 وتحليل الانحدار الخطي لشدة الصورة الزمنية17. تم استخدام تجزئة الأوعية الرئيسية من خلفية قاع العين سابقا ، ولكن في تحليل البكسل لديناميكيات التعبئة والاضمحلال ، مما يشهد على التباين في كثافة الصورة في الفئران المختلفة17. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ احتمال التحيز في تفسير تجميع الفلوريسئين17. تستهدف الطريقة الكمية التي تمت مناقشتها هنا تسرب الفلوريسئين من الأوعية الدموية الرئيسية في شبكية العين ، مما يدل على انهيار BRB ، والذي ثبت أنه يلعب دورا في إصابة RVO11،12،14. يحدد التحليل البديل للتسرب تسرب تسرب الصبغة على حوامل شبكية العين المسطحة22. ومع ذلك ، فإن تحليلات ما بعد الوفاة الغازية أقل ملاءمة لدراسات الجدول الزمني لإصابة RVO داخل فأر واحد ، حيث تتم دراسة التسرب في نقاط زمنية متعددة. سبق استخدام تحليلات منطقة تسرب الفلوريسئين في مراحل مختلفة من مرض الشبكية في الدراسات السريرية وارتبطت بأمراض الأمراض الأخرى المرصودة23. تسمح هذه الطريقة بالاستفادة المماثلة من صور FA لدراسة تسرب الأوعية في الجسم الحي ، مما يسمح بدراسة ديناميكيات التسرب ضمن الجدول الزمني لإصابة RVO. نظرا لأن اختيار منطقة التسرب يعتمد على اختيار المقيم للمنطقة ، فمن المحتمل أن يقدم قدرا أكبر من التباين عبر الذاتية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن دراسات نموذج إصابة RVO التي تمت مناقشتها هنا تحقق في التسرب في جميع أنحاء شبكية العين ، فقد اخترنا بدلا من ذلك استخدام تقنية التقنيع للحساب. تعكس طريقة التسرب هذه جانبا مختلفا من أضرار RVO عن تلك التي كشف عنها تحليل تتبع طبقة DRIL و OCT ، ويسمح الارتباط بهذه التدابير بإنشاء ملف تعريف أكثر دقة للمرض.
نقدم طريقتين لتقييم صور OCT. يعد الالتهاب الحاد والتنكس اللاحق لطبقات الشبكية سمة مميزة لإصابة RVO 6,12. تسمح منهجية تتبع طبقة OCT المفصلة هنا بالدراسة الدقيقة للطبقات الفردية وتكشف عن تأثيرات واختلافات أكثر دقة في الديناميات في مناطق مختلفة من شبكية العين. تعتمد تقنية التحليل هذه على بروتوكولات أخرى شائعة الاستخدام لتحديد سمك طبقة الشبكية في التصوير المقطعي المحوسب. تتناول هذه الطريقة التباين عبر البروتوكولات في المنطقة المستخدمة لتقدير سمك الطبقة ، بالإضافة إلى عدد القياسات المأخوذة عبر الصورة11. نظرا لأن التخفيف ليس موحدا داخل كل طبقة من طبقات الشبكية ، فمن غير المرجح أن تعطي الطرق التي تستخدم قياسات أقل نقطية صورة كاملة عن آثار الإصابة. أفاد التحليل التلوي لاستراتيجيات القياس المتعددة لسمك طبقة الشبكية أن البروتوكولات التي يبلغ متوسطها عبر مناطق أكبر من صورة OCT أظهرت ارتباطا أعلى مع شدة المرض ، بالإضافة إلى قابلية تكرار أكبر11. من خلال حساب المتوسط عبر الصورة بأكملها ، تلتقط هذه الطريقة تمثيلا أكثر دقة لترقق الشبكية الموجود في إصابة RVO طويلة المدى. تختلف الدراسات أيضا من حيث الموقع الذي يتم فيه التقاط صور OCT - حيث تركز العديد من الدراسات على التصوير على العصب البصري. على النقيض من ذلك ، فإن الطريقة المقدمة تركز بالنسبة إلى الانسداد. التطور الأخير في تحليل التصوير المقطعي المحوسب البشري هو استخدام خوارزميات التعلم الآلي لتصنيف الميزاتوقياسها كميا 24. يمكن أن تكون هذه التحليلات اتجاها مستقبليا واعدا لتحليل تصوير شبكية العين الحيوانية.
بالإضافة إلى ذلك ، نقدم ترجمة DRIL ، وهو مقياس سريري لنقص تروية الشعيرات الدموية ، إلى نموذج القوارض. في البشر ، تم العثور على DRIL ليكون مؤشرا على فقدان حدة البصر والاختلافات في سمك الشبكية وأظهر حساسية تشخيصية عالية وخصوصية18,19. أظهر تحديد DRIL في الفئران عن طريق قياس نسبة الشبكية غير المنظمة ارتباطا بجزء الأوردة المسدودة ، وسعة موجة ERG b في 7 أيام بعد RVO ، وترقق الشبكية في 8 أيام بعد RVO12. بديل لقياس DRIL هو استخدام HYPOX-4 لقياس نقص الأكسجة في شبكية العين والضرر الإقفاري. ينضم HYPOX-4 إلى هيدروكلوريد أنيمي بيمونيدازول ، وهو علامة نقص الأكسجة ، مع مسبار فلوري للكشف عن نقص الأكسجة في شبكية العين25. معظم البروتوكولات التي تستخدم HYPOX-4 غازية وتتطلب تحليل جبل شبكية العين المسطح ، والذي قد يكون أقل ملاءمة لبناء الجداول الزمنية للإصابة ، على الرغم من أن بروتوكول التصوير في الجسم الحي باستخدام مسبار HYPOX-4 قد تم تجريبه مؤخرا25. يعد تحليل DRIL مفيدا أيضا كقراءة سريعة لتلف الشبكية ، حيث أن القياسات الفردية في كل صورة OCT أكثر كفاءة من حيث الوقت من التحليلات مثل تتبع طبقة الشبكية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذه التدابير ليست قابلة للتبديل وتكشف عن أمراض الشبكية المختلفة. بدلا من ذلك ، يجب استخدامها بشكل منسق ، حيث يمكن استخدام DRIL كقراءة أولية لحجم التأثير أو فعالية التدخل ، ويمكن استخدام تتبع الطبقة لاحقا لإجراء تحليل شامل للتأثيرات الأكثر دقة في طبقات الشبكية.
هذه الطرق متعامدة بطبيعتها ، مما يسمح بإنشاء ملف تعريف المرض لكل موضوع تجريبي. نظرا لأن الأمراض التي أبلغت عنها كل طريقة من هذه الطرق متميزة ، فليس من المضمون قياسها بشكل متناسب ، كما أن الحصول على صورة أكثر شمولية لعلم الأمراض سيسمح بإجراء تحقيق أكثر صرامة في تكوينات المظاهر المختلفة لتلف RVO. إن القدرة على تعظيم كمية المعلومات التي يمكن استخلاصها من تصوير كل تجريبي ستقلل من عدد الحيوانات اللازمة لاستخلاص استنتاجات مهمة ، مما يعزز كفاءة العملية التجريبية. يسمح تطبيق هذه الأساليب على بروتوكولات RVO التي تم تحسينها مؤخرا بمزيد من التكاثر ودراسة ترجمة الأنماط الظاهرية السريرية إلى نماذج حيوانية. بالإضافة إلى دراسة نماذج RVO ، فإن استخدام هذه الأساليب له تطبيقات على نماذج أخرى من أمراض الشبكية التي تستخدم تصوير FA و OCT. ومن الأمثلة على نماذج الفئران هذه تلك الخاصة بالوذمة البقعية المرتبطة بالعمر (AMD)26، والوذمة البقعية السكرية (DME)23، والأوعية الدموية المشيمية الجديدة (CNV)27، والتهاب الشبكية المناعي الذاتي التجريبي (EAU)28، واعتلال الشبكية الخداجي (ROP)15. يمكن تعميم هذه الطرق على الدراسات التي تستخدم التصوير FA و OCT في دراسة نماذج هذه الأمراض في الأنواع الأخرى. هذه الكميات حساسة أيضا للتغيرات الأكثر دقة في آلية المرض ، مما يجعلها مفيدة في تقييم فعالية العلاج ، كما هو الحال في الشكل 3D والشكل 4C. تمتد المنفعة أيضا إلى استخدام التصوير في اختبار السمية في دراسات التحمل لمركبات الأدوية. يمكن أن يعمل توحيد بروتوكولات التحليل هذه واستنساخها على تحسين الصلاحية الانتقالية للنماذج الحيوانية وتوسيع فهمنا للإمراض والفيزيولوجيا المرضية لمرض الأوعية الدموية الشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة برنامج زمالة أبحاث الخريجين التابع لمؤسسة العلوم الوطنية (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (إلى CKCO) ، والمعهد الوطني للعيون (NEI) 5T32EY013933 (إلى AMP) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (RO1 NS081333 ، R03 NS099920 إلى CMT) ، ووزارة الدفاع الجيش / القوات الجوية (DURIP إلى CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
