Summary
Her præsenterer vi tre dataanalyseprotokoller for fluorescein angiografi (FA) og optisk kohærenstomografi (OCT) billeder i undersøgelsen af Retinal Vein Occlusion (RVO).
Abstract
Fremskridt inden for oftalmiske billeddannelsesværktøjer giver et hidtil uset niveau af adgang til forskere, der arbejder med dyremodeller af neurovaskulær skade. For at udnytte denne større oversættelighed korrekt er der behov for at udtænke reproducerbare metoder til at trække kvantitative data fra disse billeder. Optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelse kan løse retinal histologi ved mikrometeropløsning og afsløre funktionelle forskelle i vaskulær blodgennemstrømning. Her afgrænser vi ikke-invasive vaskulære udlæsninger, som vi bruger til at karakterisere patologisk skade efter vaskulær fornærmelse i en optimeret musemodel af retinal veneokklusion (RVO). Disse aflæsninger omfatter levende billeddannelsesanalyse af retinal morfologi, disorganisering af retinale indre lag (DRIL) måling af kapillær iskæmi og fluorescein angiografi målinger af retinalt ødem og vaskulær tæthed. Disse teknikker svarer direkte til dem, der anvendes til at undersøge patienter med retinal sygdom i klinikken. Standardisering af disse metoder muliggør direkte og reproducerbar sammenligning af dyremodeller med kliniske fænotyper af oftalmisk sygdom, hvilket øger den translationelle kraft af vaskulære skademodeller.
Introduction
Neurovaskulær sygdom er et stort sundhedsproblem, der er ansvarlig for iskæmiske slagtilfælde, en førende årsag til dødelighed og sygelighed, og retinale vaskulære sygdomme, der fører til synstab 1,2. For at modellere neurovaskulær sygdom anvender vi en musemodel af retinal veneokklusion (RVO). Denne model er ikke-invasiv og anvender lignende in vivo-billeddannelsesteknikker som dem, der bruges til at undersøge mennesker med retinal vaskulær sygdom i kliniske omgivelser. Brugen af denne model øger således det translationelle potentiale i undersøgelser, der anvender denne model. Som med alle musemodeller er det afgørende at maksimere modellens reproducerbarhed.
Retinale vaskulære sygdomme er en væsentlig årsag til synstab hos mennesker under 70 år. RVO er den næsthyppigste retinale vaskulære sygdom efter diabetisk retinopati3. Kliniske træk, der er karakteristiske for RVO, omfatter iskæmisk skade, retinalt ødem og synstab som følge af neuronalt tab 3,4. Musemodeller af RVO ved hjælp af laserfotokoagulation af større fartøjer er blevet udviklet og raffineret til at replikere vigtige kliniske patologier observeret i human RVO 5,6,7. Fremskridt inden for oftalmisk billeddannelse giver også mulighed for replikation af ikke-invasive diagnostiske værktøjer, der anvendes hos mennesker, nemlig fluorescein angiografi (FA) og optisk kohærenstomografi (OCT)6. Fluorescein Angiography giver mulighed for observation af lækage på grund af nedbrydning af blod-retinal barrieren (BRB) samt blodgennemstrømningsdynamik i nethinden, herunder okklusionssteder, ved hjælp af injektion af fluorescein, et lille fluorescerende farvestof 8,9. OCT-billeddannelse giver mulighed for erhvervelse af højopløsningstværsnitsbilleder af nethinden og undersøgelsen af tykkelsen og organisationen af retinale lag10. Analyse af FA-billeder har historisk set været stort set kvalitativ, hvilket begrænser potentialet for direkte og reproducerbar sammenligning mellem undersøgelser. For nylig er der udviklet en række metoder til kvantificering af lagtykkelse i OCT-billeddannelse, selvom der i øjeblikket ikke er nogen standardiseret analyseprotokol, og stedet for OCT-billedoptagelse varierer11. For at kunne udnytte disse værktøjer korrekt er der behov for standardiseret, kvantitativ og replikerbar dataanalysemetode. I dette papir præsenterer vi tre sådanne vaskulære udlæsninger, der bruges til at evaluere patologisk skade i en musemodel af RVO-fluoresceinlækage, OCT-lagtykkelse og desorganisering af retinale lag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring til brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Gnaverforsøg blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Columbia University.
BEMÆRK: Billeddannelse blev udført på 2 måneder gamle C57BL / 6J hanmus, der vejede ca. 23 g.
1. Fremstilling af reagenser til retinal billeddannelse
- Fremstilling af injicerbar fluoresceinopløsning.
BEMÆRK: Fluorescein er meget lysfølsomt. Beskyt mod lys og brug det kort efter tilberedning.- Fortynd fluorescein til en koncentration på 1% i sterilt saltvand.
- Fremstilling af ketamin/xylazin
- Ketamin og Xylazin fortyndes i sterilt saltvand i overensstemmelse hermed i følgende koncentration: Ketamin (80-100 mg/kg) og Xylazin (5-10 mg/kg).
- Steril saltvand
- Forbered en 5 ml sprøjte med en 26 G nål med steril saltvand.
2. OCT- og fluorescein-billeddannelse
- Tænd lysboksen til nethindebilledmikroskopet, OCT-maskinen og den opvarmede museplatform.
- Tænd computeren, og åbn billedbehandlingsprogrammet.
- Tilsæt en dråbe phenylephrin og tropicamid til hvert øje.
- Injicer 150 μL anæstesi (ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (5-10 mg/kg)) intraperitonealt (IP). Bestem dybden af anæstesi ved tåspidsning og vent, indtil dyret ikke reagerer. Påfør oftalmisk salve eller kunstige tårer på begge øjne.
- Plads musen på platformen.
- Juster platformens højde og vinkel, indtil udsigten til nethinden er klar og fokuseret. Tag et billede af fundus.
- Åbn billedbehandlings- og OCT-softwaren. I OCT-programmet skal du justere nudge til 5.
- Tag et OCT-billede ved 75 μm distal fra forbrændingen. Gentag for de tre andre kvadranter i nethinden.
- Der injiceres 100 μL 1% fluorescein IP.
- Skift kameraet til et 488 nm filter. Forøg kameraforstærkningen til 5.
- Tag et billede af fundus nøjagtigt 5 min efter fluorescein injektion.
BEMÆRK: Undgå langvarig eksponering af øjet for kameralyset ved maksimal indstilling, da fluorescein kan forværre nethindefotoskader. Hold lyskilden slukket, indtil ventetiden på 5 minutter er gået, og musen er klar til billeddannelse.
3. Efterbehandling
- Injicer 1 ml steril saltvand IP. Påfør smøremiddel øjendråber på begge øjne. Påfør oftalmisk salve eller kunstige tårer på begge øjne.
- Overhold musen, når den kommer sig efter anæstesi. Vend kun tilbage til buret med andre dyr, når det er helt genoprettet, generelt efter ca. 40 min.
4. Vurdering af eksklusionskriterier
- Åbn fundusbilledet taget kl. 24 efter proceduren for at vurdere eksklusionskriterier. Udeluk øjet, hvis et af følgende kriterier er identificeret.
- Vurder, om billedet har nul okklusioner
- Evaluer billedet for antallet af okkluderede fartøjer.
BEMÆRK: En vellykket okklusion har normalt en vis lilla pigmentering på eller omkring forbrændingen, meget tynd eller diskontinuerlig kar gennem forbrændingen, svagt eller ikke-eksisterende karudseende uden for forbrændingsområdet og retinal misfarvning fra hypoxi. Hvis hele fartøjet kan ses gennem den hvide forbrænding af laseren, kunne fartøjet ikke okkludere. Nogle gange vil fartøjet virke delvist blokeret, men hvis det ser uafbrudt ud uden for forbrændingen, har fartøjet sandsynligvis ikke okkluderet. - I tvetydige tilfælde skal du bruge FA-billeddannelse på samme tidspunkt til at evaluere okklusioner. På disse billeder vises en okklusion som en pause i kontinuiteten i et fartøj, ofte med en nedtrapning af det omgivende fartøj.
- Hvis der identificeres nul okklusioner, skal du udelukke øjet fra analysen, da RVO betragtes som ineffektiv.
BEMÆRK: Okklusioner løser typisk ved 48-72 timer efter RVO, og tilstedeværelsen af okklusioner bør ikke længere bruges som et udelukkelseskriterium på disse tidspunkter.
- Evaluer billedet for antallet af okkluderede fartøjer.
- Vurder fundus- og OCT-billederne for overdreven retinal løsrivelse
BEMÆRK: Ophobning af subretinal væske er almindelig efter induktion af RVO og forårsager adskillelse af neural nethinde fra RPE. Ekskluderende kriterier for overdreven retinal løsrivelse er defineret som følger: OCT vil enten være helt usynlige, eller nogle lag vil virke utroligt forvrængede. Billedkvaliteten er dårlig, med et tab af opløsning af ydre plexiforme og RPE-lag. Adskillelsen mellem den neurale nethinde og choroid er større end hvad OCT-synsfeltet tillader. På fundusbilledet vil nethinden være næsten helt hvid med nogle lilla pletter. En del af nethinden kan virke forvrænget og ude af fokus. Dette skyldes, at det har løsnet sig og er i en anden brændvidde end resten af nethinden.- Hvis vurderingen af billederne fra et øje bestemmer perifer eller fuldstændig løsrivelse af nethinden, skal du udelukke øjet fra analysen.
- Udeluk billeder med tegn på hornhindekatorakt
BEMÆRK: En hornhindegrå stær fremstår som en uigennemsigtig hvid prik på musens hornhinde. Grå stær opstår typisk på grund af utilstrækkelig smøring af øjnene, mens dyret bedøves og kan stort set undgås ved at sørge for at anvende øjensalve generøst. Grå stær kan generelt identificeres før billeddannelse ved at inspicere dyret. Mus, der har udviklet grå stær, bør udelukkes fra datasættet uden at skulle gennemgå billeddannelsesprocessen. I billeddannelse vil grå stær skjule nethinden fra kameraet, og OCT vil virke skæv. - Vurder billedet for overdreven blødning
BEMÆRK: Overdreven blødning kan identificeres som mængder af rød væske i billedet, normalt skjult retinal baggrund, kar og forbrænding. Disse områder med rød væske vil være en lysere, opaquer rød end de lilla pletter, der er normale i vellykket RVO. Blødninger dukker op ved ganglioncellelaget på OCT-billeddannelse og forstyrrer evnen til at visualisere andre nethindelager under blødningen.- Hvis billedet er bestemt til at have en overdreven blødning, skal du udelukke øjet fra analysen.
5. Fluorescein billedbehandling
- Åbn fluoresceinbilledet i billedbehandlingssoftwaren.
- Dupliker billedet
- Brug et udvælgelsesværktøj til omhyggeligt at spore de store fartøjer.
- De vigtigste kar er de tykkere vener og arterier, der udstråler ud fra synsskiven. Ignorer eventuelle fartøjer, der forgrener sig fra disse fartøjer.
- Hvis lækage forhindrer, at fartøjets omrids ses nær okklusionsstedet, skal du spore gennem lækagen på fartøjets omtrentlige placering (bevar tykkelsen, tilslut det sidste synlige punkt til det næste synlige punkt).
- I det første billede skal du slette markeringen og kun efterlade baggrunden. Gem dette maskerede billede.
- Flyt markeringen til det andet billede, inverter markeringen og slet, og isolering af karrene. Gem dette maskerede billede.
- Åbn de to billeder i ImageJ. Åbn baggrundsbilledet, og mål den integrerede tæthed.
- Åbn fartøjets billede, vælg konturen af fartøjerne, og mål derefter den gennemsnitlige intensitet.
- Opdel den integrerede tæthed af baggrunden med den gennemsnitlige intensitet af karrene, hvilket genererer lækageforholdet for øjet.
- Optag dette lækageforhold for hvert øje i en eksperimentel kohorte.
- For yderligere kontrol for baggrund skal du normalisere eksperimentelle øjne til det gennemsnitlige lækageforhold for uskadte kontroløjne.
BEMÆRK: For at skabe en standardiseret kvantificering af fluoresceinlækage i FA-billedet bruger denne beregning et forhold mellem baggrundstætheden (hvor lækagen vil være til stede) med lysstyrken på de store fartøjer for at skabe resultater, der styrer variationen i lysstyrke fra billede til billede og kan beregnes pålideligt. Øjne, der er ubeskadigede, har ingen lækage og skal teoretisk have forhold på nul. Forholdet beregnet ud fra disse ubeskadigede kontroløjne repræsenterer derfor baggrundsstøj, og denne værdi bruges til yderligere at normalisere eksperimentelle værdier.
6. Retinal lag tykkelse
- Åbn OCT-billedet i billedbehandlingssoftwaren.
- Spor grænserne for ganglioncellelaget, det indre plexiformlag, det indre nukleare lag, det ydre plexiformlag, fotoreceptorlaget og RPE-laget. Mål den gennemsnitlige tykkelse af hvert lag.
- Gentag for OCT-billeder fra de tre andre kvadranter på nethinden. Gennemsnit de gennemsnitlige lagtykkelser på tværs af de fire kvadranter for at opnå den gennemsnitlige tykkelse af hvert retinalt lag for øjet.
- Gentag for hvert øje i den eksperimentelle kohorte.
7. Disorganisering af retinale indre lag (DRIL)
- Åbn OCT-billedet i ImageJ.
- Brug linjeværktøjet til at måle afstanden, hvor den øvre kant af det ydre plexiformlag er utydelig.
BEMÆRK: Det er vigtigt at skelne mellem DRIL og områder med dårlig lagsynlighed forårsaget af billeddannelsesartefakter. Dårlig OCT-billedkvalitet kan ugyldiggøre et øje for DRIL-analyse, hvis tilstrækkelig billedopløsning ikke er mulig. Billeder med DRIL vil typisk have andre regioner eller retinale lag, der er tydeligt opløst og organiseret, hvilket kan være en god indikator for tilstrækkelig billedkvalitet.- Mål vandret fra breddegraden, hvor uorganiseringen begynder, til breddegraden, hvor den øvre grænse af det ydre plexiformlag bliver synlig igen, hvis overhovedet. Selvom det ydre plexiformlag skifter opad eller nedad lodret, måles perfekt vandret.
- Der kan være flere områder af uorganisering adskilt af områder uden uorganisering. Mål disse individuelt og beregn summen af afstandene.
- Divider længden af uorganisering med den samlede længde af nethinden, der er synlig i hvert OCT-billede, for at opnå forholdet mellem uorganisering for billedet.
- Gentag målingen og beregningen for OCT-billeder fra de tre andre kvadranter på nethinden.
- Tag gennemsnittet af forholdet mellem uorganisering fra de fire OCT-billeder. Dette tal repræsenterer den gennemsnitlige uorganisering for hele nethinden. Gentag for hvert øje i den eksperimentelle kohorte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse analysemetoder muliggør kvantificering af retinal patologi fanget af FA- og OCT-billeddannelse. Forsøgene, hvorfra de repræsentative data ekstraheres, brugte C57BL / 6J hanmus, der enten fungerede som uskadte kontroller eller gennemgik RVO-proceduren og modtog enten Pen1-XBir3-behandlingsbriller eller Pen1-Saline køretøjs øjendråber. RVO-skademodellen involverede laserbestråling (532 nm) af de store vener i hvert øje på en bedøvet mus efter en hale-veneinjektion af rosenbengal, et fotoaktivatorfarvestof12. Tre laserimpulser blev leveret i en gennemsnitlig afstand på 375 μm fra synsnervecentret for at inducere fotokoagulation og okkludere karrene12. Effektiv anvendelse af RVO-proceduren er demonstreret i Avrutsky et al.12, og yderligere detaljer om RVO-metodeoptimering er beskrevet i Colón Ortiz et al.13. Figur 1A viser eksempler på FA- og OCT-billeder fra begge grupper. På grund af den variable karakter af okklusionsdannelse og stabilisering gennem fotokoagulationsprocessen kan der observeres forskellige grader af skade. I nogle nethinder introducerer skaden induceret af RVO-proceduren oftalmiske patologier, der gør retinalbillederne uegnede til analyse. Efter erhvervelsen skal billeder først evalueres for eksklusionskriterier for at sikre optimal analyse og pålidelige resultater. Disse eksklusionskriterier, der er afgrænset i figur 1B, omfatter nethindeløsning, blødning og grå stær. Som det kan observeres i eksemplet fundus og OCT-billeder, forhindrer disse patologier klar OCT-billeddannelse, hvilket gør nethinden uegnet til dataanalyse. Derudover er det muligt, at nogle nethinder ikke indeholder stabile okklusioner; Disse billeder modellerer ikke nøjagtigt iskæmisk-hypoxisk skade og bør udelukkes fra analysen.
Nedbrydningen af blod-retinal barrieren bidrager til patogenesen af RVO14,15. Evaluering af mængden af lækage fra fartøjer er en nyttig indikator for skadeinduceret fartøjspermeabilitet. FA-billeddannelse giver mulighed for visualisering af denne lækage, men en række faktorer, såsom forskelle i cirkulationshastigheden, påvirker den rå intensitet af FA-billeder og gør konsekvent kvantificering16,17. Vores metode styrer for denne variabilitet ved at normalisere intensiteten observeret i nethinden til den gennemsnitlige intensitet af den store vaskulatur. Dette giver et forhold mellem lækage for hvert retinalbillede, der kan sammenlignes med andre og analyseres. Figur 2A viser de maskerede billeder, der anvendes til denne beregning, og adskiller den store vaskulatur fra de andre områder af nethinden. Evnen til at kvantificere fluorescein gør det muligt at sammenligne skadens sværhedsgrad og behandlingseffektivitet samt undersøgelsen af ændringer i lækage i løbet af skadesforløbet (figur 2B), hvilket kan være for subtil en effekt til at demonstrere med kvalitativ rapportering alene.
OCT-billeddannelse gør det muligt at analysere virkningen af RVO på individuelle retinale lag og den samlede retinale tykkelse. Figur 3A viser en afgrænsning af lagene på nethinden i et OCT-billede. Sporing af grænserne for hvert lag (figur 3B) giver mulighed for flere analysemuligheder. Kvantificeringen af tykkelsen for hvert retinalt lag viser sig nyttig, da det indledende edematøse respons har en mere dybtgående effekt på de indre retinale lag. Spor giver også mulighed for undersøgelse af total nethindetykkelse og adskilt analyse af de indre versus ydre retinale lag. Figur 3C giver en analyse af et tidsforløb af RVO-skader, hvor den indledende inflammatoriske hævelse af retinale lag og den eventuelle degenerative udtynding kan observeres. Afbildning af tykkelsen af hvert lag over tid afslører forskellige dynamikker for de indre plexiforme og indre nukleare lag, hvor det indre nukleare lag oplever en meget større reaktion på den oprindelige skade, men det indre plexiformlag viser mere alvorlig udtynding, efter at det oprindelige ødem er stabiliseret og vender tilbage til baseline (figur 3D ). Dette giver en mere præcis forståelse af drivkræfterne bag respons på forskellige tidspunkter. Vi testede også effektiviteten af en caspasehæmmer til at afbøde hævelse og beskytte mod eventuel degeneration, med analyse, der afslørede forskellige virkninger i individuelle lag.
Disorganiseringen af indre retinale lag (DRIL) er en anden OCT-funktion, der anvendes som et diagnostisk mål for iskæmi i diabetisk retinopati, samt et forudsigeligt mål for synsskarphed i RVO18,19. I OCT-billeddannelse manifesterer DRIL sig som en forsvinden af den øvre grænse for det ydre plexiforme lag12 og blander de ydre plexiforme og indre nukleare lag sammen (figur 4A). Figur 4B viser to eksempler på OCT-billeder med fremhævede områder af DRIL. Vi udtrykker DRIL som en andel af den samlede nethindelængde, i gennemsnit over fire OCT-tværsnit. Denne foranstaltning giver os mulighed for kvantitativt at sammenligne eksperimentelle grupper; Figur 4C viser en eksempelanalyse, hvor nethindedisorganiseringen af to eksperimentelle grupper blev sammenlignet for at undersøge effekten af en hæmmer til at afbøde retinal skade i RVO.
Figur 1: Billeder opnået fra fluorescein angiografi (FA) og optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelse. (A) Eksempler på FA- og OCT-billeder fra nethinder 24 timer efter RVO og uskadte kontroller. (B) Fundus og OLT billeddannelse af de forskellige udelukkelseskriterier: overdreven retinal løsrivelse, blødning, hornhindekatarakt og ingen okklusioner. Afstanden for OLT-erhvervelse er angivet i den grønne retningslinje. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvantificering af fluoresceinlækage . (A) Adskillelse af FA-billedet i karrene og baggrund for analyse (B) Fluoresceinlækagekvantificering fra øjnene af C57BL/6J retinale vene okkluderede (RVO) mus, der modtager enten 10 mg Pen1-XBir3-hæmmer øjendråber (N = 17) eller Pen1-Saline køretøjs øjendråber (N = 13) ved 24 timer og 48 timer efter proceduren. Intensitetsaflæsning af baggrundsbilledet normaliseres til den gennemsnitlige intensitetsaflæsning fra fartøjets billede. Gennemsnittet af intensitetsaflæsningen for RVO-mus normaliseres yderligere til uskadte kontroller. Fejllinjer viser middelværdi med SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af retinal lagtykkelse i OCT-billeder. (A) Uskadt nethinde med de enkelte retinale lag mærket: Ganglioncellelag, Indre plexiformlag, Indre nukleare lag, Ydre plexiformlag, Fotoreceptorlag, RPE og Choroid. (B) Eksempel på lagspor af OCT-billeder taget fra uskadt kontrol og 24 timers post-RVO C57/BL6-mus. (C) Kvantificering af ændring i total retinal tykkelse og intraretinal tykkelse observeret i OCT-billeddannelse af C57BL/6J mus nethinder ved 4 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer og 8 dage efter RVO. (D) Kvantificering af tykkelsesændring i indre plexiforme og indre nukleare lag af C57BL/6J mus nethinder ved 24 timer, 48 timer og 8 dage efter RVO for C57BL/6J mus, der modtager enten 10 mg Pen1-XBir3-hæmmer øjendråber (N = 14) eller Pen1-Saline køretøjs øjendråber (N = 15) umiddelbart efter RVO-proceduren og 24-timers post-RVO. Fejllinjer viser middelværdi med SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kvantificering af desorganiseringen af de indre nethindelager (DRIL) observeret i OCT-billeder efter RVO. I OCT-billeder er DRIL angivet ved tabet af en klar afgrænsning mellem de indre nukleare og ydre plexiforme lag. (A) Eksempler på dele af nethinden med og uden DRIL i OCT-billeddannelse. (B) Områder med DRIL i OCT-billeddannelse af to regioner i en C57BL/6J-mus 24 timer efter RVO, angivet med hvide linjer. DRIL måles vandret over billedet i stedet for at følge nethindens form. (C) Kvantificering af den andel af nethindelængden, hvor DRIL blev observeret ved 24 timer og 48 timer efter RVO for øjnene hos C57BL/6J-mus, der fik enten 2,5 mg Pen1-XBir3-hæmmerbriller (N = 19) eller Pen1-saltvands-køretøjsøjedråber (N = 21) efter RVO-proceduren. Fejllinjer viser middelværdi med SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ikke-invasiv gnaver retinal billeddannelse præsenterer en vej til at studere patologi og udvikle interventioner. Tidligere undersøgelser har udviklet og optimeret en musemodel af RVO, hvilket begrænser variabiliteten og giver mulighed for pålidelig oversættelse af almindelige kliniske patologier i murine nethinde 5,7,13. Udviklingen inden for oftalmisk billeddannelsesteknologi giver yderligere mulighed for anvendelse af kliniske in vivo-billeddannelsesteknikker såsom FA og OCT i forsøgsdyr, hvilket giver mulighed for at sammenligne musemodeller med profiler af menneskelig sygdom6,12,15. For at maksimere de oplysninger, der kan udvindes fra disse billeder og modellens samlede translationelle potentiale, er der imidlertid behov for standardiserede, reproducerbare og strenge kvantitative metoder til analyse af billeder. Her præsenterer vi analysemetoder, der giver mulighed for kvantitative repræsentationer af skadens sværhedsgrad, hvilket giver mulighed for mere præcise og pålidelige sammenligninger mellem mus og på tværs af eksperimentelle grupper. Disse analyser omfatter lækagekvantificering i FA-billeder, kvantificering af gennemsnitlig lagtykkelse og områder af DRIL i OCT-billeder.
En kritisk faktor i vellykket analyse ligger i kvaliteten af de erhvervede billeder. Dårligt opløste OCT-billeder kan føre til vanskeligheder med at spore individuelle lag og manglende evne til at skelne indre retinal disorganisering fra dårlig billedkvalitet. Ved billeddannelse er det vigtigt at passe på placeringen af musen på platformen og sikre, at fundusbilledet er i fokus, synsnerven er relativt centreret, og nethindetværsnittet er vandret over billedet. Konsekvent smøring af øjnene, mens dyret bedøves, er også vigtigt, især når det samme dyr er afbildet flere dage. Utilstrækkelig smøring kan resultere i hornhindegrå stær, som vil skjule nethinden og gøre den uegnet til billeddannelse. Forskellige retinale patologier kan forekomme i RVO-billeddannelse, hvilket gør billeder uegnede til analyse. Disse omfatter overdreven retinal løsrivelse og overdreven blødning, som sammen med stærkt kompromitterende billeddannelseskvalitet også repræsenterer en grad af skade, der er for alvorlig til at bruge som model for RVO. Det er desuden muligt for alle okkluderede fartøjer at reperfuse fuldt ud kort efter skade, hvilket ikke nøjagtigt modellerer RVO-skader og bør bruges som et udelukkelseskriterium. Det er dog vigtigt at bemærke, at vellykkede okklusioner naturligvis vil løse sig ved 48-72 timer efter skade, og tilstedeværelsen af okklusioner som et udelukkelseskriterium bruges bedst ved eller før 24 timer efter proceduren. Colón Ortiz et al.13 beskriver bedste praksis for begrænsning af variabilitet og kalibrering af skader i en optimeret model til RVO-procedure. Identifikation og vurdering af eksklusionskriterier er også et kritisk skridt til billedanalyse. Da dette i vid udstrækning er op til evaluatorens skøn, er det vigtigt, at evaluatorer er blinde for behandlingsgrupper og praktiserer konsistens i vurderingen af patologiens sværhedsgrad. Der findes nogle begrænsninger i anvendelsen af disse metoder, især i praksis med at billeddanne den samme mus på flere tidspunkter. Der er en grænse for den frekvens, hvormed en mus kan bedøves til billeddannelse, hvilket nødvendiggør test og justering af tidspunkter for at bestemme det optimale tidsforløb. Vores undersøgelser anvender billeddannelsestidspunkter på 4 timer, 24 timer, 48 timer og 8 dage, som vi har fundet indfangningsstadier af indledende skade, akut inflammatorisk respons og længerevarende skade12. Derudover er visse musestammer mere tilbøjelige til udvikling af hornhindegrå stær, som omfatter forskellige diabetiske musemodeller, hvilket kan føre til et stort antal udelukkelser eller ufuldstændige tidskurser20,21. Undersøgelser, der anvender sådanne muselinjer, kan være nødvendigt at skræddersy eksperimentel gruppestørrelse eller billeddannelsestidspunkter afhængigt af hornhindens følsomhed.
Fluorescein angiografi billeddannelse er stort set blevet brugt kvalitativt til at observere og klassificere retinale patologier såsom lækage samt mønstre af ændret blodgennemstrømning RVO6. For nylig har der været bestræbelser på at udvikle en kvantitativ analyse af FA i dyremodeller, såsom beregning af vaskulært areal og tortuositet16 og lineær regressionsanalyse af billedintensitet temporalitet17. Segmentering af de store kar fra fundusbaggrunden har tidligere været brugt, men i en pixelanalyse af fyld- og henfaldsdynamik, der vidner om variationen i billedintensitet hos forskellige mus17. Derudover blev potentialet for bias bemærket i fortolkningen af fluorescein pooling17. Den kvantitative metode, der diskuteres her, er rettet mod lækage af fluorescein fra den store retinale vaskulatur, hvilket tyder på nedbrydningen af BRB, som har vist sig at spille en rolle i RVO-skade11,12,14. En alternativ analyse af lækage kvantificerer farvelækage på nethinde flade monteringer22. Invasive post mortem-analyser er imidlertid mindre egnede til undersøgelser af tidslinjen for RVO-skade inden for en enkelt mus, hvor lækagen undersøges på flere tidspunkter. Analyser af fluoresceinlækageområde på forskellige stadier af nethindesygdommen er tidligere blevet anvendt i kliniske studier og korreleret med andre observerede sygdomspatologier23. Denne metode giver mulighed for lignende udnyttelse af FA-billeder til at studere fartøjslækage in vivo, hvilket giver mulighed for undersøgelse af lækagedynamik inden for tidslinjen for RVO-skade. Da udvælgelsen af lækageområde er afhængig af evaluatorvalg af en region, introducerer det potentielt en større variation via subjektivitet. Da de her diskuterede undersøgelser af RVO-skademodellen undersøger lækage i hele nethinden, har vi i stedet valgt at bruge en maskeringsteknik til beregning. Denne lækagemetode afspejler en anden facet af RVO-skader end dem, der afsløres af DRIL- og OCT-lagsporingsanalyse, og korrelation med disse foranstaltninger gør det muligt at oprette en mere nøjagtig sygdomsprofil.
Vi præsenterer to metoder til evaluering af OCT-billeder. Akut betændelse og efterfølgende degeneration af nethindelagene er kendetegnende for RVO-skade 6,12. OCT-lagsporingsmetoden, der er beskrevet her, giver mulighed for præcis undersøgelse af individuelle lag og afslører mere subtile effekter og forskelle i dynamik i forskellige regioner på nethinden. Denne analyseteknik bygger på andre almindeligt anvendte protokoller til kvantificering af retinal lagtykkelse i OCT-billeddannelse. Denne metode adresserer variationen på tværs af protokoller i det område, der bruges til at estimere lagtykkelse, samt antallet af målinger taget på tværs af billedet11. Da udtynding ikke er ensartet inden for hvert retinalt lag, er det usandsynligt, at metoder, der bruger færre punktmålinger, giver et komplet billede af skadevirkninger. Metaanalyse af flere målestrategier for retinal lagtykkelse rapporterede, at protokoller i gennemsnit på tværs af større områder af OCT-billedet viste en højere korrelation med sygdommens sværhedsgrad samt større repeterbarhed11. Ved at gennemsnit over hele billedet fanger denne metode en mere præcis repræsentation af nethindeudtyndingen, der er til stede i langvarig RVO-skade. Undersøgelser adskiller sig også med hensyn til det sted, hvor OCT-billeder tages - mange undersøgelser centrerer billeddannelse på synsnerven. I modsætning hertil centrerer den præsenterede metode sig i forhold til okklusionerne. En nylig udvikling i analysen af menneskelig OCT-billeddannelse er brugen af maskinlæringsalgoritmer til at klassificere og kvantificere funktioner24. Sådanne analyser kan være en lovende fremtidig retning for analysen af dyrenethindebilleddannelse.
Derudover præsenterer vi en oversættelse af DRIL, et klinisk mål for kapillær iskæmi, til en gnavermodel. Hos mennesker har DRIL vist sig at være en forudsigelse for synsstyrketab og forskelle i nethindetykkelse og har vist høj diagnostisk følsomhed og specificitet18,19. Kvantificering af DRIL hos mus ved at måle andelen af nethinden, der er uorganiseret, har vist korrelation med fraktionen af okkluderede vener, ERG b-bølgeamplitude ved 7 dage efter RVO og retinal udtynding ved 8 dage efter RVO12. Et alternativ til DRIL måling er brugen af HYPOX-4 til måling af retinal hypoxi og iskæmisk skade. HYPOX-4 forbinder pimonidazol animehydrochlorid, en hypoximarkør, med en fluorescerende sonde til påvisning af retinal hypoxi25. De fleste protokoller, der bruger HYPOX-4, er invasive og kræver retinal fladmonteret analyse, som kan være mindre egnet til opbygning af skadetidslinjer, selvom en in vivo-billeddannelsesprotokol ved hjælp af en HYPOX-4-sonde for nylig er blevet piloteret25. DRIL-analyse er også nyttig som en hurtig aflæsning af retinal skade, da enkeltmålinger i hvert OCT-billede er mere tidseffektive end analyser såsom retinal lagsporing. Det skal dog bemærkes, at disse foranstaltninger ikke er udskiftelige og afslører forskellige retinale patologier. De bør snarere bruges i fællesskab, hvor DRIL kan bruges som en indledende aflæsning for effektstørrelse eller interventionseffektivitet, og lagsporing kan efterfølgende anvendes til en grundig analyse af mere subtile effekter i nethindelagene.
Disse metoder er ortogonale, hvilket gør det muligt at oprette en sygdomsprofil for hvert eksperimentelt emne. Da patologierne rapporteret af hver af disse metoder er forskellige, er de ikke garanteret at skalere proportionalt, og opnåelse af et mere holistisk billede af patologi vil give mulighed for en strengere undersøgelse af de forskellige manifestationskonfigurationer af RVO-skader. Evnen til at maksimere mængden af information, der kan ekstraheres fra billeddannelsen af hvert forsøgsdyr, vil reducere antallet af dyr, der er nødvendige for at drage betydelige konklusioner, hvilket forbedrer effektiviteten af forsøgsprocessen. Anvendelse af disse metoder på nyligt raffinerede RVO-protokoller giver mulighed for større reproducerbarhed og undersøgelse af oversættelsen af kliniske fænotyper til dyremodeller. Ud over undersøgelsen af RVO-modeller har brugen af disse metoder anvendelser til andre modeller af retinale sygdomme, der anvender FA- og OCT-billeddannelse. Eksempler på sådanne musemodeller omfatter modeller for aldersrelateret makulært ødem (AMD)26, diabetisk makulært ødem (DME)23, choroidal neovaskularisering (CNV)27, eksperimentel autoimmun uveoretinitis (EAU)28 og præmatur retinopati (ROP)15. Disse metoder kan yderligere generaliseres til undersøgelser, der bruger FA- og OCT-billeddannelse til at studere modeller af disse sygdomme hos andre arter. Disse kvantificeringer er også følsomme over for mere subtile ændringer i sygdomsmekanismen, hvilket gør dem nyttige til evaluering af behandlingseffektivitet, såsom i figur 3D og figur 4C. Nytteværdien omfatter også brugen af billeddannelse i toksicitetstest i tolerabilitetsundersøgelser af lægemiddelforbindelser. Standardiseringen og reproducerbarheden af disse analyseprotokoller kan tjene til at forbedre den translationelle validitet af dyremodeller og udvide vores forståelse af patogenesen og patofysiologien af den retinovaskulære sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) bevilling DGE - 1644869(til CKCO), National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (til AMP), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 til CMT) og Department of Defense Army / Air Force (DURIP til CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
