Summary
Hier stellen wir drei Datenanalyseprotokolle für Fluorescein-Angiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT) Bilder in der Studie der Netzhautvenenokklusion (RVO) vor.
Abstract
Fortschritte bei ophthalmologischen Bildgebungswerkzeugen bieten Forschern, die mit Tiermodellen für neurovaskuläre Verletzungen arbeiten, einen beispiellosen Zugang. Um diese bessere Übersetzbarkeit richtig zu nutzen, müssen reproduzierbare Methoden entwickelt werden, um quantitative Daten aus diesen Bildern zu ziehen. Die optische Kohärenztomographie (OCT) kann die Netzhauthistologie mit Mikrometerauflösung auflösen und funktionelle Unterschiede im vaskulären Blutfluss aufdecken. Hier beschreiben wir nichtinvasive Gefäßanzeigen, die wir verwenden, um pathologische Schäden nach vaskulärer Beleidigung in einem optimierten Mausmodell des Netzhautvenenverschlusses (RVO) zu charakterisieren. Diese Auslesungen umfassen Live-Bildgebungsanalysen der Netzhautmorphologie, Disorganisation der retinalen inneren Schichten (DRIL) zur Messung der Kapillarischämie und Fluoreszenzangiographiemessungen des Netzhautödems und der vaskulären Dichte. Diese Techniken entsprechen direkt denen, die zur Untersuchung von Patienten mit Netzhauterkrankungen in der Klinik verwendet werden. Die Standardisierung dieser Methoden ermöglicht einen direkten und reproduzierbaren Vergleich von Tiermodellen mit klinischen Phänotypen ophthalmologischer Erkrankungen und erhöht die Translationskraft von Gefäßverletzungsmodellen.
Introduction
Neurovaskuläre Erkrankungen sind ein großes Gesundheitsproblem, das für ischämische Schlaganfälle, eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität, und retinale Gefäßerkrankungen, die zu Sehverlust führen, verantwortlichist 1,2. Um neurovaskuläre Erkrankungen zu modellieren, verwenden wir ein Mausmodell des Netzhautvenenverschlusses (RVO). Dieses Modell ist nicht-invasiv und verwendet ähnliche In-vivo-Bildgebungstechniken wie diejenigen, die zur Untersuchung von Menschen mit retinalen Gefäßerkrankungen in einem klinischen Umfeld verwendet werden. Die Verwendung dieses Modells erhöht somit das translationale Potenzial von Studien, die dieses Modell verwenden. Wie bei allen Mausmodellen ist es wichtig, die Reproduzierbarkeit des Modells zu maximieren.
Netzhaut-Gefäßerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Sehverlust bei Menschen unter 70 Jahren. RVO ist nach der diabetischen Retinopathie die zweithäufigste retinale Gefäßerkrankung3. Zu den klinischen Merkmalen, die für RVO charakteristisch sind, gehören ischämische Verletzungen, Netzhautödeme und Sehverlust als Folge eines neuronalen Verlusts 3,4. Mausmodelle von RVO unter Verwendung der Laser-Photokoagulation von Großgefäßen wurden entwickelt und verfeinert, um wichtige klinische Pathologien zu replizieren, die bei humaner RVO 5,6,7 beobachtet wurden. Fortschritte in der ophthalmologischen Bildgebung ermöglichen auch die Replikation nichtinvasiver Diagnosewerkzeuge, die beim Menschen verwendet werden, nämlich Fluoreszenzangiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT)6. Die Fluoreszenzangiographie ermöglicht die Beobachtung von Leckagen aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Netzhaut-Barriere (BRB) sowie der Blutflussdynamik in der Netzhaut, einschließlich der Okklusionsstellen, unter Verwendung der Injektion von Fluorescein, einem kleinen Fluoreszenzfarbstoff 8,9. Die OCT-Bildgebung ermöglicht die Aufnahme hochauflösender Querschnittsbilder der Netzhaut und die Untersuchung der Dicke und Organisation von Netzhautschichten10. Die Analyse von FA-Bildern war in der Vergangenheit weitgehend qualitativ, was das Potenzial für einen direkten und reproduzierbaren Vergleich zwischen Studien einschränkt. In jüngster Zeit wurde eine Reihe von Methoden zur Quantifizierung der Schichtdicke in der OCT-Bildgebung entwickelt, obwohl es derzeit kein standardisiertes Analyseprotokoll gibt und der Ort der OCT-Bildaufnahme variiert11. Um diese Tools richtig nutzen zu können, sind standardisierte, quantitative und replizierbare Datenanalysemethoden erforderlich. In diesem Artikel präsentieren wir drei solcher vaskulären Messwerte, die verwendet werden, um pathologische Schäden in einem Mausmodell von RVO-Fluorescein-Leckage, OCT-Schichtdicke und Desorganisation von Netzhautschichten zu bewerten.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.
HINWEIS: Die Bildgebung wurde an 2 Monate alten männlichen C57BL / 6J-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 23 g durchgeführt.
1. Vorbereitung von Reagenzien für die Netzhautbildgebung
- Herstellung einer injizierbaren Fluoreszenzlösung.
HINWEIS: Fluorescein ist sehr lichtempfindlich. Vor Licht schützen und kurz nach der Zubereitung verwenden.- Verdünnen Sie Fluorescein auf eine Konzentration von 1% in steriler Kochsalzlösung.
- Herstellung von Ketamin/Xylazin
- Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung entsprechend für folgende Konzentration verdünnen: Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg).
- Sterile Kochsalzlösung
- Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel mit steriler Kochsalzlösung vor.
2. OCT- und Fluoreszenzbildgebung
- Schalten Sie den Netzhaut-Bildgebungsmikroskop-Leuchtkasten, das OCT-Gerät und die beheizte Mausplattform ein.
- Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm.
- Fügen Sie jedem Auge einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid hinzu.
- Injizieren Sie 150 μL Anästhesie (Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (5-10 mg / kg)) intraperitoneal (IP). Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen und warten Sie, bis das Tier nicht mehr reagiert. Tragen Sie Augensalbe oder künstliche Tränen auf beide Augen auf.
- Platzieren Sie die Maus auf der Plattform.
- Passen Sie die Höhe und den Winkel der Plattform an, bis die Sicht auf den Netzhautfundus klar und fokussiert ist. Machen Sie ein Foto vom Fundus.
- Öffnen Sie die Imaging- und OAT-Software. Stellen Sie im OAT-Programm den Anstoß auf 5 ein.
- Nehmen Sie ein OCT-Bild bei 75 μm distal von der Verbrennung auf. Wiederholen Sie dies für die anderen drei Quadranten der Netzhaut.
- Injizieren Sie 100 μL 1% Fluorescein IP.
- Schalten Sie die Kamera auf einen 488-nm-Filter um. Erhöhen Sie die Kameraverstärkung auf 5.
- Machen Sie ein Foto des Fundus genau 5 Minuten nach der Fluorescein-Injektion.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine längere Exposition des Auges gegenüber dem Kameralicht bei maximaler Einstellung, da Fluoreszin retinale Lichtschäden verschlimmern kann. Lassen Sie die Lichtquelle ausgeschaltet, bis die 5-minütige Wartezeit abgelaufen ist und die Maus für die Bildgebung bereit ist.
3. Nachsorge
- Injizieren Sie 1 ml sterile Kochsalzlösung IP. Gleitende Augentropfen auf beide Augen auftragen. Tragen Sie Augensalbe oder künstliche Tränen auf beide Augen auf.
- Beobachten Sie die Maus, wie sie sich von der Narkose erholt. Erst wenn Sie sich vollständig erholt haben, kehren Sie mit anderen Tieren in den Käfig zurück, in der Regel nach ca. 40 Minuten.
4. Beurteilung der Ausschlusskriterien
- Öffnen Sie das Fundusbild, das 24 Stunden nach dem Eingriff aufgenommen wurde, um die Ausschlusskriterien zu beurteilen. Schließen Sie das Auge aus, wenn eines der folgenden Kriterien identifiziert wird.
- Beurteilen, ob das Bild keine Okklusionen aufweist
- Werten Sie das Bild für die Anzahl der verschlossenen Gefäße aus.
HINWEIS: Ein erfolgreicher Verschluss hat normalerweise eine violette Pigmentierung auf oder um die Verbrennung, ein sehr dünnes oder diskontinuierliches Gefäß durch die Verbrennung, ein schwaches oder nicht vorhandenes Gefäßerscheinungsbild außerhalb des Verbrennungsbereichs und eine Netzhautverfärbung durch Hypoxie. Wenn das gesamte Gefäß durch die weiße Verbrennung durch den Laser gesehen werden kann, konnte das Gefäß nicht verschließen. Manchmal erscheint das Gefäß teilweise verstopft, aber wenn es außerhalb der Verbrennung ununterbrochen aussieht, hat das Gefäß wahrscheinlich nicht verschlossen. - Verwenden Sie in mehrdeutigen Fällen die FA-Bildgebung zum gleichen Zeitpunkt, um Okklusionen zu bewerten. In diesen Bildern erscheint eine Okklusion als Bruch in der Kontinuität eines Gefäßes, oft mit einer Verjüngung des umgebenden Gefäßes.
- Wenn keine Okklusionen festgestellt werden, schließen Sie das Auge von der Analyse aus, da die RVO als unwirksam angesehen wird.
HINWEIS: Okklusionen klingen in der Regel 48-72 h nach RVO ab, und das Vorhandensein von Okklusionen sollte zu diesen Zeitpunkten nicht mehr als Ausschlusskriterium verwendet werden.
- Werten Sie das Bild für die Anzahl der verschlossenen Gefäße aus.
- Beurteilung der Fundus- und OCT-Bilder auf übermäßige Netzhautablösung
HINWEIS: Subretinale Flüssigkeitsansammlung ist nach Induktion von RVO üblich und verursacht eine Trennung der neuronalen Netzhaut von RPE. Ausschlusskriterien für eine übermäßige Netzhautablösung sind wie folgt definiert: OCT wird entweder völlig unsichtbar sein oder einige Schichten werden unglaublich verzerrt erscheinen. Die Bildqualität ist schlecht, mit einem Verlust der Auflösung von äußeren plexiformen und RPE-Schichten. Der Abstand zwischen der neuronalen Netzhaut und der Aderhaut ist größer als das, was das OCT-Sichtfeld erlaubt. Auf dem Fundusbild wird der Netzhautton fast vollständig weiß sein, mit einigen violetten Flecken. Ein Teil der Netzhaut kann verzerrt und unscharf erscheinen. Dies liegt daran, dass es sich gelöst hat und sich in einer anderen Brennweite befindet als der Rest der Netzhaut.- Wenn die Beurteilung der Bilder eines Auges eine periphere oder vollständige Ablösung der Netzhaut feststellt, schließen Sie das Auge von der Analyse aus.
- Bilder mit Hinweisen auf Hornhautkatarakt ausschließen
HINWEIS: Eine Hornhautkatarakt erscheint als undurchsichtiger weißer Punkt auf der Hornhaut der Maus. Katarakte treten typischerweise aufgrund unzureichender Schmierung der Augen auf, während das Tier betäubt wird, und können weitgehend vermieden werden, indem darauf geachtet wird, die Augensalbe großzügig aufzutragen. Katarakte können in der Regel vor der Bildgebung durch Inspektion des Tieres identifiziert werden. Mäuse, die Katarakte entwickelt haben, sollten aus dem Datensatz ausgeschlossen werden, ohne sich dem bildgebenden Verfahren unterziehen zu müssen. In der Bildgebung verdecken Katarakte die Netzhaut von der Kamera und das OCT erscheint verzogen. - Beurteilen Sie das Bild auf übermäßige Blutungen
HINWEIS: Übermäßige Blutungen können als Mengen an roter Flüssigkeit im Bild identifiziert werden, die normalerweise den Netzhauthintergrund, das Gefäß und die Verbrennung verdecken. Diese Bereiche der roten Flüssigkeit werden heller, undurchsichtig rot sein als die violetten Flecken, die bei erfolgreicher RVO normal sind. Blutungen zeigen sich an der Ganglienzellschicht auf der OCT-Bildgebung und stören die Fähigkeit, andere Netzhautschichten unter der Blutung zu visualisieren.- Wenn festgestellt wird, dass das Bild eine übermäßige Blutung aufweist, schließen Sie das Auge von der Analyse aus.
5. Fluoreszenz-Bildverarbeitung
- Öffnen Sie das Fluoreszenzbild in der Bildverarbeitungssoftware.
- Duplizieren des Bilds
- Verfolgen Sie die wichtigsten Schiffe sorgfältig mit einem Auswahlwerkzeug.
- Die Hauptgefäße sind die dickeren Venen und Arterien, die von der Sehscheibe ausgehen. Ignorieren Sie alle Schiffe, die von diesen Gefäßen abzweigen.
- Wenn die Leckage verhindert, dass der Umriss des Gefäßes in der Nähe der Okklusionsstelle zu sehen ist, verfolgen Sie die Leckage an der ungefähren Position des Gefäßes (Dicke beibehalten, den letzten sichtbaren Punkt mit dem nächsten sichtbaren Punkt verbinden).
- Löschen Sie im ersten Bild die Auswahl, wobei nur der Hintergrund erhalten bleibt. Speichern Sie dieses maskierte Bild.
- Verschieben Sie die Auswahl in das zweite Bild, kehren Sie die Auswahl um und löschen Sie sie, wodurch die Gefäße isoliert werden. Speichern Sie dieses maskierte Bild.
- Öffnen Sie die beiden Bilder in ImageJ. Öffnen Sie das Hintergrundbild und messen Sie die integrierte Dichte.
- Öffnen Sie das Bild des Gefäßes, wählen Sie den Umriss der Gefäße aus, und messen Sie dann die mittlere Intensität.
- Teilen Sie die integrierte Dichte des Hintergrunds durch die mittlere Intensität der Gefäße, wodurch das Leckageverhältnis für das Auge erzeugt wird.
- Zeichnen Sie dieses Leckageverhältnis für jedes Auge in einer experimentellen Kohorte auf.
- Um den Hintergrund weiter zu kontrollieren, normalisieren Sie experimentelle Augen auf das mittlere Leckageverhältnis von unverletzten Kontrollaugen.
HINWEIS: Um eine standardisierte Quantifizierung der Fluoreszenzleckage im FA-Bild zu erstellen, verwendet diese Berechnung ein Verhältnis der Hintergrunddichte (wo die Leckage vorhanden sein wird) mit der Helligkeit der Hauptgefäße, um Ergebnisse zu erzielen, die die Helligkeitsvariation von Bild zu Bild kontrollieren und zuverlässig quantifiziert werden können. Augen, die unbeschädigt sind, haben keine Leckage und sollten theoretisch Verhältnisse von Null haben. Die aus diesen unbeschädigten Kontrollaugen berechneten Verhältnisse stellen daher Hintergrundgeräusche dar, und dieser Wert wird verwendet, um experimentelle Werte weiter zu normalisieren.
6. Netzhautschichtdicke
- Öffnen Sie das OAT-Bild in der Bildverarbeitungssoftware.
- Verfolgen Sie die Grenzen der Ganglienzellschicht, der inneren Plexiformschicht, der inneren Kernschicht, der äußeren plexiformen Schicht, der Photorezeptorschicht und der RPE-Schicht. Messen Sie die mittlere Dicke jeder Schicht.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für OCT-Bilder aus den anderen drei Quadranten der Netzhaut. Mittelwert der mittleren Schichtdicken über die vier Quadranten, um die mittlere Dicke jeder Netzhautschicht für das Auge zu erhalten.
- Wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte.
7. Desorganisation der inneren Netzhautschichten (DRIL)
- Öffnen Sie das OAT-Bild in ImageJ.
- Messen Sie mit dem Linienwerkzeug den Abstand, in dem der obere Rand der äußeren plexiformen Schicht undeutlich ist.
HINWEIS: Es ist wichtig, zwischen DRIL und Bereichen mit schlechter Layer-Sichtbarkeit zu unterscheiden, die durch Bildartefakte verursacht werden. Eine schlechte OCT-Bildqualität kann ein Auge für die DRIL-Analyse ungültig machen, wenn eine ausreichende Bildauflösung nicht möglich ist. Bilder mit DRIL haben typischerweise andere Regionen oder Netzhautschichten, die klar aufgelöst und organisiert sind, was ein guter Indikator für eine ausreichende Bildqualität sein kann.- Messen Sie horizontal vom Breitengrad, in dem die Desorganisation beginnt, bis zum Breitengrad, wo der obere Rand der äußeren plexiformen Schicht wieder sichtbar wird, wenn überhaupt. Auch wenn sich die äußere plexiforme Schicht vertikal nach oben oder unten verschiebt, messen Sie perfekt horizontal.
- Es kann mehrere Bereiche der Desorganisation geben, die durch Bereiche ohne Desorganisation getrennt sind. Messen Sie diese einzeln und berechnen Sie die Summe der Entfernungen.
- Teilen Sie die Länge der Desorganisation durch die Gesamtlänge der Netzhaut, die in jedem OCT-Bild sichtbar ist, um das Verhältnis der Desorganisation für das Bild zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Messung und Berechnung für OCT-Bilder aus den anderen drei Quadranten der Netzhaut.
- Nehmen Sie den Mittelwert der Verhältnisse der Desorganisation aus den vier OCT-Bildern. Diese Zahl stellt die durchschnittliche Desorganisation für die gesamte Netzhaut dar. Wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte.
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Representative Results
Diese Analysemethoden ermöglichen die Quantifizierung der Netzhautpathologie, die durch FA- und OCT-Bildgebung erfasst wird. Die Experimente, aus denen die repräsentativen Daten extrahiert wurden, verwendeten männliche C57BL / 6J-Mäuse, die entweder als unverletzte Kontrollen dienten oder sich dem RVO-Verfahren unterzogen und entweder Pen1-XBir3-Behandlungsaugentropfen oder Pen1-Saline-Vehikelaugentropfen erhielten. Das RVO-Verletzungsmodell beinhaltete die Laserbestrahlung (532 nm) der Hauptvenen in jedem Auge einer anästhesierten Maus nach einer Schwanzveneninjektion von Rosenbengalen, einem Photoaktivatorfarbstoff12. Drei Laserpulse wurden in einem durchschnittlichen Abstand von 375 μm vom Sehnervenzentrum abgegeben, um Photokoagulation zu induzieren und die Gefäße zu verschließen12. Die effektive Anwendung des RVO-Verfahrens wird in Avrutsky et al.12 demonstriert, und weitere Details zur RVO-Methodenoptimierung sind in Colón Ortiz et al.13 detailliert beschrieben. Abbildung 1A zeigt Beispiele für FA- und OAT-Bilder aus beiden Gruppen. Aufgrund der variablen Natur der Okklusionsbildung und -stabilisierung durch den Photokoagulationsprozess können unterschiedliche Schädigungsgrade beobachtet werden. Bei einigen Netzhäuten führt die durch das RVO-Verfahren induzierte Schädigung zu ophthalmischen Pathologien, die die Netzhautbilder für die Analyse ungeeignet machen. Nach der Aufnahme sollten die Bilder zunächst nach Ausschlusskriterien bewertet werden, um eine optimale Analyse und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Diese Ausschlusskriterien, die in Abbildung 1B beschrieben sind, umfassen Netzhautablösung, Blutungen und Katarakte. Wie in den Beispiel-Fundus- und OCT-Bildern zu sehen ist, verhindern diese Pathologien eine klare OCT-Bildgebung, wodurch die Netzhaut für die Datenanalyse ungeeignet ist. Darüber hinaus ist es möglich, dass einige Netzhäute keine stabilen Verschlüsse enthalten; Diese Bilder modellieren ischämisch-hypoxische Schäden nicht genau und sollten von der Analyse ausgeschlossen werden.
Der Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke trägt zur Pathogenese von RVO14,15 bei. Die Bewertung der Leckage von Behältern ist ein nützlicher Indikator für die verletzungsbedingte Gefäßpermeabilität. Die FA-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung dieser Leckage, aber eine Reihe von Faktoren, wie Unterschiede in der Zirkulationsrate, beeinflussen die Rohintensität von FA-Bildern und machen eine konsistente Quantifizierung16,17. Unsere Methode kontrolliert diese Variabilität, indem sie die in der Netzhaut beobachtete Intensität auf die mittlere Intensität des Hauptgefäßsystems normalisiert. Dies liefert ein Verhältnis der Leckage für jedes Netzhautbild, das mit anderen verglichen und analysiert werden kann. Abbildung 2A zeigt die maskierten Bilder, die für diese Berechnung verwendet wurden und das Hauptgefäßsystem von den anderen Bereichen der Netzhaut trennen. Die Fähigkeit, Fluorescein zu quantifizieren, ermöglicht den Vergleich der Schwere der Verletzung und der Wirksamkeit der Behandlung sowie die Untersuchung von Veränderungen der Leckage im Verlauf der Verletzungszeit (Abbildung 2B), die möglicherweise ein zu subtiler Effekt ist, um ihn mit qualitativer Berichterstattung allein nachzuweisen.
Die OCT-Bildgebung ermöglicht die Analyse des Einflusses von RVO auf einzelne Netzhautschichten und die gesamte Netzhautdicke. Abbildung 3A zeigt eine Abgrenzung der Netzhautschichten in einem OCT-Bild. Das Nachzeichnen der Grenzen jeder Schicht (Abbildung 3B) ermöglicht mehrere Analysemöglichkeiten. Die Quantifizierung der Dicke für jede Netzhautschicht erweist sich als nützlich, da die anfängliche ödematöse Reaktion eine tiefgreifendere Wirkung auf die inneren Netzhautschichten hat. Spuren ermöglichen auch die Untersuchung der Gesamtdicke der Netzhaut und die getrennte Analyse der inneren und äußeren Netzhautschichten. Abbildung 3C zeigt eine Analyse eines zeitlichen Verlaufs von RVO-Schäden, wobei die anfängliche entzündliche Schwellung der Netzhautschichten und die eventuelle degenerative Ausdünnung beobachtet werden kann. Die Darstellung der Dicke jeder Schicht im Laufe der Zeit zeigt unterschiedliche Dynamiken für die inneren plexiformen und inneren Kernschichten, wobei die innere Kernschicht eine viel größere Reaktion auf die anfängliche Verletzung erfährt, aber die innere plexiforme Schicht zeigt eine stärkere Ausdünnung, nachdem das anfängliche Ödem stabilisiert wurde und zum Ausgangswert zurückkehrt (Abbildung 3D ). Dies ermöglicht ein genaueres Verständnis der Treiber der Reaktion zu verschiedenen Zeitpunkten. Wir testeten auch die Wirksamkeit eines Caspase-Inhibitors bei der Linderung von Schwellungen und dem Schutz vor eventueller Degeneration, wobei die Analyse unterschiedliche Effekte in einzelnen Schichten zeigte.
Die Desorganisation der inneren Netzhautschichten (DRIL) ist ein weiteres OCT-Merkmal, das als diagnostisches Maß für Ischämie bei diabetischer Retinopathie sowie als prädiktives Maß für die Sehschärfe in RVO18,19 verwendet wird. In der OCT-Bildgebung manifestiert sich DRIL als Verschwinden der oberen Grenze der äußer-plexiformen Schicht12, wodurch die äußer-plexiforme und die innere Kernschicht miteinander verschmelzen (Abbildung 4A). Abbildung 4B zeigt zwei Beispiele für OCT-Bilder mit hervorgehobenen Bereichen von DRIL. Wir drücken DRIL als Anteil an der gesamten Netzhautlänge aus, gemittelt über vier OCT-Querschnitte. Diese Messung ermöglicht es uns, experimentelle Gruppen quantitativ zu vergleichen; Abbildung 4C zeigt eine Beispielanalyse, bei der die Netzhautdesorganisation zweier experimenteller Gruppen verglichen wurde, um die Wirksamkeit eines Inhibitors bei der Milderung von Netzhautschäden bei RVO zu untersuchen.
Abbildung 1: Bilder aus der Fluoreszenzangiographie (FA) und der optischen Kohärenztomographie (OCT). (A) Beispiele für FA- und OCT-Bilder von Netzhäuten 24 h nach RVO und unverletzten Kontrollen. (B) Fundus- und OCT-Bildgebung der verschiedenen Ausschlusskriterien: übermäßige Netzhautablösung, Blutung, Hornhautkatarakt und keine Verschlüsse. Die Entfernung der OCT-Erfassung wird durch die grüne Richtlinie angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Quantifizierung der Fluorescein-Leckage. (A) Trennung des FA-Bildes in die Gefäße und den Hintergrund für die Analyse (B) Quantifizierung der Fluorescein-Leckage aus den Augen von C57BL/6J-Netzhautvenen-verdeckten (RVO) Mäusen, die entweder 10 mg Pen1-XBir3-Inhibitor-Augentropfen (N = 17) oder Pen1-Kochsalzlösung (N = 13) nach dem Eingriff erhielten. Die Intensitätsmessung des Hintergrundbildes wird auf die mittlere Intensitätsmessung aus dem Bild des Schiffes normalisiert. Der Mittelwert der Intensitätsmessung für RVO-Mäuse wird weiter auf unverletzte Kontrollen normalisiert. Fehlerbalken zeigen Mittelwert mit SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Netzhautschichtdicke in OCT-Bildern . (A) Unverletzte Netzhaut mit den einzelnen Netzhautschichten gekennzeichnet: Ganglienzellschicht, innere plexiforme Schicht, innere Kernschicht, äußere plexiforme Schicht, Photorezeptorschicht, RPE und Aderhaut. (B) Beispiel für Schichtspuren von OCT-Bildern, die von unverletzten Kontrollmäusen und 24 Stunden nach RVO C57/BL6 aufgenommen wurden. (C) Quantifizierung der Veränderung der gesamten Netzhautdicke und der intraretinalen Dicke, die in der OCT-Bildgebung von C57BL/6J-Mäusenetzhaut bei 4 h, 24 h, 48 h, 72 h und 8 Tagen nach der RVO beobachtet wurde. (D) Quantifizierung der Dickenänderung in inneren plexiformen und inneren Kernschichten der Netzhaut von C57BL/6J-Mäusen nach 24 h, 48 h und 8 Tagen nach RVO für C57BL/6J-Mäuse, die entweder 10 mg Pen1-XBir3-Inhibitor-Augentropfen (N = 14) oder Pen1-Kochsalzlösung (N = 15) unmittelbar nach dem RVO-Verfahren und 24 h nach der RVO erhielten. Fehlerbalken zeigen Mittelwert mit SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung der Desorganisation der inneren Netzhautschichten (DRIL) in OCT-Bildern nach RVO. In OCT-Bildern wird DRIL durch den Verlust einer klaren Abgrenzung zwischen den inneren Kern- und äußeren plexiformen Schichten angezeigt. (A) Beispiele für Schnitte der Netzhaut mit und ohne DRIL in der OCT-Bildgebung. (B) Bereiche von DRIL in der OCT-Bildgebung von zwei Regionen in einer C57BL/6J-Maus 24 h nach RVO, gekennzeichnet durch weiße Linien. DRIL wird horizontal über das Bild gemessen, anstatt der Form der Netzhaut zu folgen. (C) Quantifizierung des Anteils der Netzhautlänge, bei dem DRIL 24 h und 48 h nach RVO für die Augen von C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurde, die nach dem RVO-Verfahren entweder 2,5 mg Pen1-XBir3-Inhibitor-Augentropfen (N = 19) oder Pen1-Kochsalzlösung (N = 21) erhielten. Fehlerbalken zeigen Mittelwert mit SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die nichtinvasive Netzhautbildgebung von Nagetieren bietet eine Möglichkeit, Pathologie zu untersuchen und Interventionen zu entwickeln. Frühere Studien haben ein Mausmodell von RVO entwickelt und optimiert, das die Variabilität begrenzt und eine zuverlässige Translation häufiger klinischer Pathologien in der murinen Netzhaut ermöglicht 5,7,13. Entwicklungen in der ophthalmologischen Bildgebungstechnologie ermöglichen darüber hinaus den Einsatz klinischer In-vivo-Bildgebungsverfahren wie FA und OCT bei Versuchstieren, wodurch Mausmodelle mit Profilen menschlicher Krankheiten verglichen werdenkönnen 6,12,15. Um jedoch die Informationen, die aus diesen Bildern extrahiert werden können, und das gesamte translationale Potenzial des Modells zu maximieren, sind standardisierte, reproduzierbare und strenge quantitative Methoden zur Analyse von Bildern erforderlich. Hier stellen wir Analysemethoden vor, die quantitative Darstellungen der Schädigungsschwere ermöglichen, was genauere und zuverlässigere Vergleiche zwischen Mäusen und zwischen experimentellen Gruppen ermöglicht. Diese Analysen umfassen die Quantifizierung von Leckagen in FA-Bildern, die Quantifizierung der mittleren Schichtdicke und Bereiche von DRIL in OCT-Bildern.
Ein kritischer Faktor für eine erfolgreiche Analyse liegt in der Qualität der aufgenommenen Bilder. Schlecht aufgelöste OCT-Bilder können zu Schwierigkeiten bei der Nachzeichnung einzelner Schichten und zu einer Unfähigkeit führen, innere Netzhautdesorganisation von schlechter Bildqualität zu unterscheiden. Bei der Bildgebung ist es wichtig, bei der Positionierung der Maus auf der Plattform darauf zu achten, dass das Fundusbild scharf ist, der Sehnerv relativ zentriert ist und der Netzhautquerschnitt horizontal über das Bild ist. Eine konsequente Schmierung der Augen, während das Tier betäubt wird, ist ebenfalls wichtig, insbesondere wenn dasselbe Tier mehrere Tage abgebildet wird. Eine unzureichende Schmierung kann zu Katarakten der Hornhaut führen, die die Netzhaut verdecken und für die Bildgebung ungeeignet machen. In der RVO-Bildgebung können verschiedene Netzhautpathologien auftreten, wodurch Bilder für die Analyse ungeeignet sind. Dazu gehören eine übermäßige Netzhautablösung und übermäßige Blutung, die neben einer starken Beeinträchtigung der Bildqualität auch einen Grad an Schädigung darstellen, der zu schwerwiegend ist, um als Modell für RVO verwendet zu werden. Darüber hinaus ist es möglich, dass alle verschlossenen Gefäße kurz nach der Verletzung vollständig reperfundiert werden, was RVO-Schäden nicht genau modelliert und als Ausschlusskriterium verwendet werden sollte. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass erfolgreiche Verschlüsse auf natürliche Weise 48-72 Stunden nach der Verletzung verschwinden und das Vorhandensein von Okklusionen als Ausschlusskriterium am besten 24 Stunden nach dem Eingriff verwendet wird. Colón Ortiz et al.13 beschreiben Best Practices zur Begrenzung der Variabilität und zur Kalibrierung von Verletzungen in einem optimierten Modell für RVO-Verfahren. Die Identifizierung und Beurteilung von Ausschlusskriterien ist ebenfalls ein kritischer Schritt zur Bildanalyse. Da dies weitgehend im Ermessen des Evaluators liegt, ist es wichtig, dass die Evaluatoren für Behandlungsgruppen blind sind und Konsistenz bei der Beurteilung des Schweregrads der Pathologie praktizieren. Es bestehen einige Einschränkungen bei der Anwendung dieser Methoden, insbesondere in der Praxis, dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten abzubilden. Es gibt eine Grenze für die Häufigkeit, mit der eine Maus für die Bildgebung betäubt werden kann, was das Testen und Anpassen von Zeitpunkten erfordert, um den optimalen Zeitverlauf zu bestimmen. Unsere Studien verwenden Bildgebungszeitpunkte bei 4 h, 24 h, 48 h und 8 Tagen, von denen wir festgestellt haben, dass sie Stadien der anfänglichen Verletzung, der akuten Entzündungsreaktion und der längerfristigen Verletzung erfassen12. Darüber hinaus sind bestimmte Mausstämme anfälliger für die Entwicklung von Hornhautkatarakten, zu denen verschiedene diabetische Mausmodelle gehören, was zu einer großen Anzahl von Ausschlüssen oder unvollständigen Zeitverläufen führen kann20,21. Studien, die solche Mauslinien verwenden, müssen möglicherweise die Größe der experimentellen Gruppe oder die Bildgebungszeitpunkte abhängig von der Empfindlichkeit der Hornhaut anpassen.
Die Fluoreszenzangiographie-Bildgebung wurde weitgehend qualitativ verwendet, um Netzhautpathologien wie Leckagen sowie Muster des veränderten Blutflusses RVO6 zu beobachten und zu bewerten. In jüngster Zeit gab es Bestrebungen, eine quantitative Analyse der FA in Tiermodellen zu entwickeln, wie z.B. die Berechnung der Gefäßfläche und Tortuosität16 und die lineare Regressionsanalyse der Bildintensitätszeit17. Die Segmentierung der Hauptgefäße aus dem Fundushintergrund wurde zuvor verwendet, jedoch in einer Pixelanalyse der Füll- und Zerfallsdynamik, was die Variabilität der Bildintensität bei verschiedenen Mäusen bezeugt17. Darüber hinaus wurde das Potenzial für Bias bei der Interpretation von Fluorescein-Poolingfestgestellt 17. Die hier diskutierte quantitative Methode zielt auf das Austreten von Fluorescein aus dem großen retinalen Gefäßsystem ab, was auf den Abbau des BRB hinweist, von dem gezeigt wurde, dass es eine Rolle bei der RVO-Verletzungspielt 11,12,14. Eine alternative Analyse der Leckage quantifiziert die Farbstoffleckage auf Netzhautflachhalterungen22. Invasive Post-mortem-Analysen eignen sich jedoch weniger für Studien über den zeitlichen Ablauf von RVO-Verletzungen innerhalb einer einzelnen Maus, bei denen die Leckage zu mehreren Zeitpunkten untersucht wird. Analysen des Fluorescein-Leckagebereichs in verschiedenen Stadien der Netzhauterkrankung wurden zuvor in klinischen Studien verwendet und korrelierten mit anderen beobachteten Krankheitspathologien23. Diese Methode ermöglicht eine ähnliche Nutzung von FA-Bildern, um Gefäßleckagen in vivo zu untersuchen, was die Untersuchung der Leckagedynamik innerhalb der Zeitachse von RVO-Verletzungen ermöglicht. Da die Auswahl des Leckagebereichs von der Auswahl einer Region durch den Bewerter abhängt, führt dies möglicherweise zu einer größeren Variabilität durch Subjektivität. Da die hier diskutierten Studien des RVO-Verletzungsmodells die Leckage in der gesamten Netzhaut untersuchen, haben wir uns stattdessen für eine Maskierungstechnik zur Berechnung entschieden. Diese Leckagemethode spiegelt eine andere Facette von RVO-Schäden wider als diejenigen, die durch DRIL- und OCT-Schichtverfolgungsanalysen aufgedeckt wurden, und die Korrelation mit diesen Maßnahmen ermöglicht die Erstellung eines genaueren Krankheitsprofils.
Wir stellen zwei Methoden zur Auswertung von OCT-Bildern vor. Eine akute Entzündung und anschließende Degeneration der Netzhautschichten ist ein Kennzeichen der RVO-Verletzung 6,12. Die hier beschriebene OCT-Layer-Tracing-Methodik ermöglicht die präzise Untersuchung einzelner Schichten und zeigt subtilere Effekte und Unterschiede in der Dynamik in verschiedenen Regionen der Netzhaut. Diese Analysetechnik baut auf anderen häufig verwendeten Protokollen zur Quantifizierung der Netzhautschichtdicke in der OCT-Bildgebung auf. Diese Methode berücksichtigt die Unterschiede zwischen den Protokollen in dem Bereich, der zur Schätzung der Schichtdicke verwendet wird, sowie die Anzahl der Messungen, die über das Bild11 durchgeführt werden. Da die Ausdünnung innerhalb jeder Netzhautschicht nicht gleichmäßig ist, ist es unwahrscheinlich, dass Methoden, die weniger Punktmessungen verwenden, ein vollständiges Bild der Verletzungseffekte liefern. Die Meta-Analyse mehrerer Messstrategien für die Netzhautschichtdicke ergab, dass Protokolle, die über größere Bereiche des OCT-Bildes gemittelt wurden, eine höhere Korrelation mit dem Schweregrad der Erkrankung sowie eine größere Wiederholbarkeit zeigten11. Durch die Mittelung über das gesamte Bild erfasst diese Methode eine genauere Darstellung der Netzhautverdünnung, die bei langfristigen RVO-Verletzungen vorhanden ist. Studien unterscheiden sich auch in Bezug auf den Ort, an dem OCT-Bilder aufgenommen werden - viele Studien konzentrieren sich auf die Bildgebung auf den Sehnerv. Im Gegensatz dazu zentriert sich die vorgestellte Methode relativ zu den Okklusionen. Eine neuere Entwicklung in der Analyse der menschlichen OCT-Bildgebung ist die Verwendung von maschinellen Lernalgorithmen zur Klassifizierung und Quantifizierung von Merkmalen24. Solche Analysen könnten eine vielversprechende zukünftige Richtung für die Analyse der retinalen Bildgebung von Tieren sein.
Zusätzlich präsentieren wir eine Translation von DRIL, einem klinischen Maß für Kapillarischämie, in ein Nagetiermodell. Beim Menschen hat sich DRIL als Prädiktor für Sehschärfeverlust und Netzhautdickenunterschiede erwiesen und eine hohe diagnostische Sensitivität und Spezifität gezeigt18,19. Die Quantifizierung der DRIL bei Mäusen durch Messung des Anteils der Netzhaut, der unorganisiert ist, hat eine Korrelation mit dem Anteil der verschlossenen Venen, der ERG-b-Wellenamplitude 7 Tage nach der RVO und der Netzhautverdünnung 8 Tage nach RVO12 gezeigt. Eine Alternative zur DRIL-Messung ist die Verwendung von HYPOX-4 zur Messung von Netzhauthypoxie und ischämischen Schäden. HYPOX-4 verbindet Pimonidazol-Anime-Hydrochlorid, einen Hypoxie-Marker, mit einer Fluoreszenzsonde zum Nachweis von Netzhauthypoxie25. Die meisten Protokolle, die HYPOX-4 verwenden, sind invasiv und erfordern eine retinale Flachmontageanalyse, die für die Erstellung von Verletzungszeitplänen möglicherweise weniger geeignet ist, obwohl kürzlich ein In-vivo-Bildgebungsprotokoll mit einer HYPOX-4-Sonde pilotiert wurde25. Die DRIL-Analyse ist auch als schnelles Auslesen von Netzhautschäden nützlich, da einzelne Messungen in jedem OCT-Bild zeiteffizienter sind als Analysen wie die Nachverfolgung der Netzhautschicht. Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Maßnahmen nicht austauschbar sind und unterschiedliche Netzhautpathologien offenbaren. Vielmehr sollten sie im Konzert verwendet werden, wo DRIL als erste Anzeige für Effektgröße oder Interventionswirksamkeit verwendet werden kann, und Layer-Tracing kann anschließend für eine gründliche Analyse subtilerer Effekte in den Netzhautschichten verwendet werden.
Diese Methoden sind orthogonaler Natur, was die Erstellung eines Krankheitsprofils für jedes Versuchsobjekt ermöglicht. Da die von jeder dieser Methoden berichteten Pathologien unterschiedlich sind, ist nicht garantiert, dass sie proportional skaliert werden, und die Gewinnung eines ganzheitlicheren Bildes der Pathologie ermöglicht eine genauere Untersuchung der unterschiedlichen Manifestationskonfigurationen von RVO-Schäden. Die Fähigkeit, die Menge an Informationen zu maximieren, die aus der Bildgebung jedes Versuchstiers extrahiert werden kann, reduziert die Anzahl der Tiere, die notwendig sind, um signifikante Schlussfolgerungen zu ziehen, und erhöht die Effizienz des experimentellen Prozesses. Die Anwendung dieser Methoden auf kürzlich verfeinerte RVO-Protokolle ermöglicht eine bessere Reproduzierbarkeit und Untersuchung der Translation klinischer Phänotypen in Tiermodelle. Über die Untersuchung von RVO-Modellen hinaus hat die Verwendung dieser Methoden Anwendungen für andere Modelle von Netzhauterkrankungen, die FA- und OCT-Bildgebung verwenden. Beispiele für solche Mausmodelle sind die für altersbedingte Makulaödeme (AMD)26, diabetische Makulaödeme (DME)23, choroidale Neovaskularisation (CNV)27, experimentelle autoimmune Uveoretinitis (EAU)28 und Frühgeborenenretinopathie (ROP)15. Diese Methoden können weiter auf Studien mit FA- und OCT-Bildgebung bei der Untersuchung von Modellen dieser Krankheiten bei anderen Arten verallgemeinert werden. Diese Quantifizierungen reagieren auch empfindlich auf subtilere Veränderungen im Krankheitsmechanismus, was sie bei der Bewertung der Behandlungswirksamkeit nützlich macht, wie in Abbildung 3D und Abbildung 4C. Der Nutzen erstreckt sich auch auf die Verwendung von Bildgebung bei Toxizitätstests in Verträglichkeitsstudien von Arzneimittelverbindungen. Die Standardisierung und Reproduzierbarkeit dieser Analyseprotokolle kann dazu dienen, die translationale Validität von Tiermodellen zu verbessern und unser Verständnis der Pathogenese und Pathophysiologie der retinovaskulären Erkrankung zu erweitern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) Stipendium DGE - 1644869 (an CKCO), das National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (an AMP), das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 an CMT) und das Department of Defense Army / Air Force (DURIP an CMT) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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