Summary
Burada, Retinal Ven Tıkanıklığı (RVO) çalışmasında floresein anjiyografi (FA) ve optik koherens tomografi (OCT) görüntüleri için üç veri analizi protokolü sunulmuştur.
Abstract
Oftalmik görüntüleme araçlarındaki gelişmeler, nörovasküler hasarın hayvan modelleriyle çalışan araştırmacılara benzeri görülmemiş bir erişim seviyesi sunmaktadır. Bu daha büyük çevrilebilirlikten düzgün bir şekilde yararlanmak için, bu görüntülerden nicel veriler çizmek için tekrarlanabilir yöntemler tasarlamaya ihtiyaç vardır. Optik koherens tomografi (OKT) görüntüleme, retina histolojisini mikrometre çözünürlükte çözebilir ve vasküler kan akımındaki fonksiyonel farklılıkları ortaya çıkarabilir. Burada, retinal ven tıkanıklığının (RVO) optimize edilmiş bir fare modelinde vasküler hakaret sonrası patolojik hasarı karakterize etmek için kullandığımız noninvaziv vasküler okumaları tanımladık. Bu okumalar arasında retina morfolojisinin canlı görüntüleme analizi, retinal iç tabakaların düzensizliği (DRIL) kılcal iskemi ölçümü ve retina ödemi ve vasküler yoğunluğun floresein anjiyografi ölçümleri yer almaktadır. Bu teknikler doğrudan klinikte retina hastalığı olan hastaları incelemek için kullanılanlara karşılık gelir. Bu yöntemlerin standartlaştırılması, hayvan modellerinin oftalmik hastalığın klinik fenotipleri ile doğrudan ve tekrarlanabilir bir şekilde karşılaştırılmasını sağlayarak vasküler yaralanma modellerinin translasyonel gücünü arttırır.
Introduction
Nörovasküler hastalık, mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biri olan iskemik inmelerden ve görme kaybına yol açan retinal vasküler hastalıklardan sorumlu önemli bir sağlık sorunudur 1,2. Nörovasküler hastalığı modellemek için, retinal ven tıkanıklığının (RVO) bir fare modelini kullanıyoruz. Bu model noninvazivdir ve retinal vasküler hastalığı olan kişileri klinik ortamda incelemek için kullanılanlara benzer in vivo görüntüleme tekniklerini kullanır. Bu modelin kullanılması, bu modeli kullanan çalışmaların çeviri potansiyelini arttırmaktadır. Tüm fare modellerinde olduğu gibi, modelin tekrarlanabilirliğini en üst düzeye çıkarmak çok önemlidir.
Retinal damar hastalıkları 70 yaşın altındaki kişilerde görme kaybının önemli bir nedenidir. RVO, diyabetik retinopatiden sonra en sık görülen ikinci retinal vasküler hastalıktır3. RVO'nun karakteristik klinik özellikleri arasında iskemik hasar, retina ödemi ve nöronal kaybın bir sonucu olarak görme kaybıyer alır 3,4. Büyük damarların lazer fotokoagülasyonunu kullanan RVO'nun fare modelleri, insan RVO 5,6,7'de gözlenen temel klinik patolojileri çoğaltmak için geliştirilmiş ve rafine edilmiştir. Oftalmik görüntülemedeki gelişmeler ayrıca insanlarda kullanılan noninvaziv tanı araçlarının, yani floresein anjiyografi (FA) ve optik koherens tomografinin (OCT)6 replikasyonuna da olanak sağlamaktadır. Floresein Anjiyografi, kan-retinal bariyerin (BRB) parçalanmasının yanı sıra retinadaki kan akış dinamiklerinin yanı sıra, küçük bir floresan boya olan floresein enjeksiyonu kullanılarak tıkanma bölgeleri de dahil olmak üzere kan akış dinamiklerinin gözlenmesine izin verir 8,9. OCT görüntüleme, retinanın yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntülerinin elde edilmesine ve retina katmanlarının kalınlığının ve organizasyonunun incelenmesine olanak tanır10. FA görüntülerinin analizi tarihsel olarak büyük ölçüde nitel olmuştur, bu da çalışmalar arasında doğrudan ve tekrarlanabilir karşılaştırma potansiyelini sınırlar. Son zamanlarda, OCT görüntülemede katman kalınlığının ölçülmesi için bir dizi yöntem geliştirilmiştir, ancak şu anda standartlaştırılmış bir analiz protokolü yoktur ve OCT görüntü elde etme yeri11'e kadar değişmektedir. Bu araçlardan düzgün bir şekilde yararlanmak için standartlaştırılmış, nicel ve çoğaltılabilir veri analizi metodolojisine ihtiyaç vardır. Bu yazıda, RVO-floresein kaçağı, OCT tabakası kalınlığı ve retina tabakalarının düzensizliğinin bir fare modelinde patolojik hasarı değerlendirmek için kullanılan üç vasküler okuma sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için yaptığı açıklamayı takip eder. Kemirgen deneyleri, Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve izlenmiştir.
NOT: Görüntüleme, yaklaşık 23 g ağırlığındaki 2 aylık C57BL/6J erkek fareler üzerinde yapıldı.
1. Retinal görüntüleme için reaktiflerin hazırlanması
- Enjekte edilebilir floresein çözeltisinin hazırlanması.
NOT: Floresein ışığa çok duyarlıdır. Işıktan koruyun ve hazırlıktan kısa bir süre sonra kullanın.- Floreseini steril salin içinde% 1'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin.
- Ketamin/Ksilazin hazırlanması
- Ketamin ve Ksilazin'i steril salin içinde aşağıdaki konsantrasyona göre seyreltin: Ketamin (80-100 mg / kg) ve Ksilazin (5-10 mg / kg).
- Steril salin
- Steril salinli 26 G'lik bir iğne ile 5 mL'lik bir şırınga hazırlayın.
2. OCT ve floresein görüntüleme
- Retinal görüntüleme mikroskobu ışık kutusunu, OCT makinesini ve ısıtmalı fare platformunu AÇIK duruma getirin.
- Bilgisayarı AÇIN ve görüntüleme programını açın.
- Her göze bir damla fenilefrin ve tropikamidin ekleyin.
- İntraperoton (IP) olarak 150 μL anestezi (Ketamin (80-100 mg/kg) ve Ksilazin (5-10 mg/kg)) enjekte edin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak belirleyin ve hayvan yanıt vermeyene kadar bekleyin. Her iki göze de oftalmik merhem veya yapay gözyaşı uygulayın.
- Fareyi platforma yerleştirin.
- Retinal fundusun görünümü net ve odaklanmış olana kadar platformun yüksekliğini ve açısını ayarlayın. Fundusun fotoğrafını çekin.
- Görüntüleme ve OCT yazılımını açın. OCT programında, dürtmeyi 5 olarak ayarlayın.
- Yanıktan 75 μm distal bir OCT görüntüsü alın. Retinanın diğer üç kadranını tekrarlayın.
- 100 μL% 1 floresein IP enjekte edin.
- Fotoğraf makinesini 488 nm filtreye geçirin. Kamera kazancını 5'e yükseltin.
- Floresan enjeksiyonundan tam 5 dakika sonra fundusun fotoğrafını çekin.
NOT: Floresein retinal fotohasarı şiddetlendirebileceğinden, gözün maksimum ayarda kamera ışığına uzun süre maruz kalmasını önleyin. 5 dakikalık bekleme süresi dolana ve fare görüntülemeye hazır olana kadar ışık kaynağını kapalı tutun.
3. Bakım Sonrası
- 1 mL steril salin IP enjekte edin. Her iki göze de kayganlaştırıcı göz damlası uygulayın. Her iki göze de oftalmik merhem veya yapay gözyaşı uygulayın.
- Anesteziden kurtulan fareyi gözlemleyin. Kafese diğer hayvanlarla birlikte sadece tamamen iyileştiğinde, genellikle yaklaşık 40 dakika sonra geri dönün.
4. Dışlama kriterleri için değerlendirme
- Dışlama kriterlerini değerlendirmek için prosedürden 24 saat sonra çekilen fundus görüntüsünü açın. Aşağıdaki kriterlerden herhangi biri tanımlanırsa gözü hariç tutun.
- Görüntüde sıfır tıkanıklık olup olmadığını değerlendirme
- Görüntüyü tıkanmış gemilerin sayısı için değerlendirin.
NOT: Başarılı bir oklüzyon genellikle yanık üzerinde veya çevresinde bir miktar mor pigmentasyona, yanık yoluyla çok ince veya süreksiz damara, yanık alanının dışında soluk veya var olmayan damar görünümüne ve hipoksiden retinal renk değişikliğine sahiptir. Tüm damar lazer tarafından beyaz yanıktan görülebiliyorsa, damar tıkanamaz. Bazen gemi kısmen tıkanmış görünecektir, ancak yanığın dışında kesintisiz görünüyorsa, gemi muhtemelen tıkanmamıştır. - Belirsiz vakalarda, tıkanıklıkları değerlendirmek için aynı zamanda FA görüntülemeyi kullanın. Bu görüntülerde, bir tıkanıklık, bir geminin sürekliliğinde, genellikle çevreleyen kabın sivrilmesiyle bir kırılma olarak görünecektir.
- Sıfır tıkanıklık tespit edilirse, RVO etkisiz olarak kabul edildiğinden, gözü analizden çıkarın.
NOT: Tıkanıklıklar tipik olarak RVO'dan sonra 48-72 saat arasında çözülür ve tıkanıklıkların varlığı artık bu zaman noktalarında bir dışlama kriteri olarak kullanılmamalıdır.
- Görüntüyü tıkanmış gemilerin sayısı için değerlendirin.
- Aşırı retina dekolmanı için fundus ve OCT görüntülerini değerlendirin
NOT: Subretinal sıvı birikimi RVO'nun indüksiyonundan sonra yaygındır ve nöral retinanın RPE'den ayrılmasına neden olur. Aşırı retina dekolmanı için dışlayıcı kriterler şu şekilde tanımlanmıştır: OCT ya tamamen görüntülenemez olacak ya da bazı katmanlar inanılmaz derecede çarpık görünecektir. Görüntü kalitesi, dış pleksiform ve RPE katmanlarının çözünürlük kaybı nedeniyle düşüktür. Nöral retina ve koroid arasındaki ayrım, OCT görüş alanının izin verdiğinden daha büyüktür. Fundus görüntüsünde, retina tonu neredeyse tamamen beyaz olacak ve bazı mor lekeler olacaktır. Retinanın bir kısmı çarpık ve odak dışı görünebilir. Bunun nedeni, ayrıldığı ve retinanın geri kalanından farklı bir odak mesafesinde olmasıdır.- Bir gözden gelen görüntülerin değerlendirilmesi retinanın periferik veya tam dekolmanını belirlerse, gözü analizden çıkarın.
- Kornea katarakt kanıtı olan görüntüleri hariç tutun
NOT: Kornea kataraktı, farenin korneasında opak beyaz bir nokta olarak görünür. Katarakt tipik olarak hayvan anestezi altına alınırken gözlerin yetersiz yağlanması nedeniyle ortaya çıkar ve göz merhemini cömertçe uygulamaya özen göstererek büyük ölçüde önlenebilir. Katarakt genellikle görüntülemeden önce hayvanı inceleyerek tanımlanabilir. Katarakt geliştiren fareler, görüntüleme işlemine gerek kalmadan veri kümesinden çıkarılmalıdır. Görüntülemede, katarakt retinayı kameradan gizleyecek ve OCT çarpık görünecektir. - Aşırı kanama için görüntüyü değerlendirin
NOT: Aşırı kanama, görüntüdeki kırmızı sıvı miktarları olarak tanımlanabilir, genellikle retinal arka planı, damarı ve yanığı gizler. Kırmızı sıvının bu alanları, başarılı RVO'da normal olan mor lekelerden daha parlak, opak bir kırmızı olacaktır. Kanamalar, OCT görüntülemede ganglion hücre tabakasında ortaya çıkar ve kanamanın altındaki diğer retinal tabakaları görselleştirme yeteneğine müdahale eder.- Görüntünün aşırı kanama olduğu belirlenirse, gözü analizden çıkarın.
5. Floresein görüntü işleme
- Görüntü işleme yazılımında floresein görüntüsünü açın.
- Görüntüyü çoğaltma
- Bir seçim aracı kullanarak, ana gemileri dikkatlice izleyin.
- Ana damarlar, optik diskten yayılan daha kalın damarlar ve arterlerdir. Bu gemilerden dallanan gemileri görmezden gelin.
- Sızıntı, kabın ana hatlarının tıkanma bölgesinin yakınında görülmesini engelliyorsa, sızıntıyı kabın yaklaşık konumunda izleyin (kalınlığı koruyun, son görünür noktayı bir sonraki görünür noktaya bağlayın).
- İlk görüntüde, yalnızca arka planı bırakarak seçimi silin. Bu maskelenmiş görüntüyü kaydedin.
- Seçimi ikinci görüntüye taşıyın, seçimi tersine çevirin ve damarları izole ederek silin. Bu maskelenmiş görüntüyü kaydedin.
- İki görüntüyü ImageJ'de açın. Arka plan görüntüsünü açın ve entegre yoğunluğu ölçün.
- Geminin görüntüsünü açın, gemilerin ana hatlarını seçin ve ardından ortalama yoğunluğu ölçün.
- Arka planın entegre yoğunluğunu damarların ortalama yoğunluğuna bölün ve göz için sızıntı oranını oluşturun.
- Her göz için bu sızıntı oranını deneysel bir kohortta kaydedin.
- Arka plan için daha fazla kontrol sağlamak için, deneysel gözleri yaralanmamış kontrol gözlerinin ortalama sızıntı oranına normalleştirin.
NOT: FA görüntüsünde floresan sızıntısının standartlaştırılmış bir miktarını oluşturmak için, bu hesaplama, görüntüden görüntüye parlaklıktaki değişimi kontrol eden ve güvenilir bir şekilde ölçülebilen sonuçlar oluşturmak için arka plan yoğunluğunun (sızıntının mevcut olacağı yer) ana kapların parlaklığı ile bir oranını kullanır. Hasar görmemiş gözlerde sızıntı yoktur ve teorik olarak sıfır oranlarına sahip olmalıdır. Bu nedenle, bu hasarsız kontrol gözlerinden hesaplanan oranlar, arka plan gürültüsünü temsil eder ve bu değer deneysel değerleri daha da normalleştirmek için kullanılır.
6. Retina tabakası kalınlığı
- Görüntü işleme yazılımında OCT görüntüsünü açın.
- Ganglion hücre tabakasının, iç pleksiform tabakanın, iç nükleer tabakanın, dış pleksiform tabakanın, fotoreseptör tabakasının ve RPE tabakasının sınırlarını izleyin. Her katmanın ortalama kalınlığını ölçün.
- Retinanın diğer üç kadranından OCT görüntüleri için tekrarlayın. Göz için her retinal tabakanın ortalama kalınlığını elde etmek için dört kadran boyunca ortalama tabaka kalınlıklarının ortalaması.
- Deneysel kohorttaki her göz için tekrarlayın.
7. Retinal iç tabakaların düzensizliği (DRIL)
- OCT görüntüsünü ImageJ'de açın.
- Çizgi aracını kullanarak, dış pleksiform tabakanın üst sınırının belirsiz olduğu mesafeyi ölçün.
NOT: DRIL ile görüntüleme yapıtlarının neden olduğu zayıf katman görünürlüğü alanları arasında ayrım yapmak önemlidir. Düşük OCT görüntü kalitesi, yeterli görüntü çözünürlüğü mümkün değilse, DRIL analizi için bir gözü geçersiz kılabilir. DRIL'li görüntüler tipik olarak açıkça çözülmüş ve organize edilmiş başka bölgelere veya retina katmanlarına sahip olacaktır, bu da yeterli görüntü kalitesinin iyi bir göstergesi olabilir.- Dağınıklığın başladığı enlemden, dış pleksiform tabakanın üst sınırının tekrar görünür hale geldiği enlemine kadar yatay olarak ölçün. Dış pleksiform tabaka dikey olarak yukarı veya aşağı doğru kaysa bile, mükemmel yatay olarak ölçün.
- Dağınıklığın olmadığı alanlarla ayrılmış birden fazla örgütsüzlük alanı olabilir. Bunları tek tek ölçün ve mesafelerin toplamını hesaplayın.
- Görüntü için düzensizlik oranını elde etmek için düzensizlik uzunluğunu her OCT görüntüsünde görülebilen retinanın toplam uzunluğuna bölün.
- Retinanın diğer üç kadranından alınan OCT görüntüleri için ölçümü ve hesaplamayı tekrarlayın.
- Dört OCT görüntüsünden düzensizlik oranlarının ortalamasını alın. Bu sayı, tüm retina için ortalama düzensizliği temsil eder. Deneysel kohorttaki her göz için tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu analiz yöntemleri, FA ve OCT görüntüleme ile yakalanan retinal patolojinin nicelleştirilmesine izin verir. Temsili verilerin çıkarıldığı deneylerde, yaralanmamış kontroller olarak görev yapan veya RVO prosedüründen geçen ve Pen1-XBir3 tedavisi göz damlası veya Pen1-Salin araç göz damlası alan C57BL / 6J erkek fareleri kullanıldı. RVO yaralanma modeli, bir fotoaktivatör boya12 olan gül bengalinin kuyruk damarı enjeksiyonunu takiben anestezi uygulanmış bir farenin her gözündeki ana damarların lazer ışınlamasını (532 nm) içeriyordu. Fotokoagülasyona neden olmak ve damarları tıkamak için optik sinir merkezinden ortalama 375 μm mesafede üç lazer darbesi verildi12. RVO prosedürünün etkin kullanımı Avrutsky ve ark.12'de gösterilmiştir ve RVO yöntemi optimizasyonu hakkında daha fazla ayrıntı Colón Ortiz ve ark.13'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Şekil 1A, her iki gruptan FA ve OCT görüntülerinin örneklerini göstermektedir. Tıkanma oluşumunun değişken doğası ve fotokoagülasyon işlemi yoluyla stabilizasyon nedeniyle, farklı derecelerde hasar gözlenebilir. Bazı retinalarda, RVO prosedürünün neden olduğu hasar, retinal görüntüleri analiz için uygun hale getirmeyen oftalmik patolojileri ortaya çıkarır. Elde edildikten sonra, en iyi analiz ve güvenilir sonuçları sağlamak için önce görüntüler hariç tutma kriterleri açısından değerlendirilmelidir. Şekil 1B'de tanımlanan bu dışlama kriterleri retina dekolmanı, kanama ve kataraktı içerir. Örnek fundus ve OCT görüntülerinde de görülebileceği gibi, bu patolojiler net OCT görüntülemeyi önleyerek retinaları veri analizi için uygun hale getirmez. Ek olarak, bazı retinaların stabil tıkanıklıklar içermemesi mümkündür; Bu görüntüler iskemik-hipoksik hasarı doğru bir şekilde modellemez ve analizin dışında tutulmalıdır.
Kan-retina bariyerinin parçalanması RVO14,15'in patogenezine katkıda bulunur. Gemilerden kaçak miktarının değerlendirilmesi, yaralanmaya bağlı damar geçirgenliğinin yararlı bir göstergesidir. FA görüntüleme bu sızıntının görselleştirilmesine izin verir, ancak dolaşım hızındaki farklılıklar gibi bir dizi faktör, FA görüntülerinin ham yoğunluğunu etkiler ve tutarlı bir niceleme yapar16,17. Yöntemimiz, retinada gözlenen yoğunluğu majör vaskülatürün ortalama yoğunluğuna normalleştirerek bu değişkenliği kontrol eder. Bu, her retinal görüntü için diğerleriyle karşılaştırılabilecek ve analiz edilebilecek bir sızıntı oranı sağlar. Şekil 2A, bu hesaplama için kullanılan maskelenmiş görüntüleri göstermekte ve majör vaskülatürü retinanın diğer bölgelerinden ayırmaktadır. Floreseini ölçme yeteneği, yaralanma şiddeti ve tedavi etkinliğinin karşılaştırılmasının yanı sıra, yaralanma süresi boyunca sızıntıdaki değişikliklerin incelenmesine izin verir (Şekil 2B), bu da yalnızca nitel raporlama ile gösterilemeyecek kadar ince bir etki olabilir.
OCT görüntüleme, RVO'nun bireysel retina katmanları ve genel retina kalınlığı üzerindeki etkisinin analizine olanak tanır. Şekil 3A , bir OCT görüntüsünde retina katmanlarının bir tasvirini göstermektedir. Her katmanın sınırlarını izlemek (Şekil 3B) çeşitli analiz yollarına izin verir. Her retina tabakası için kalınlığın ölçülmesi yararlıdır, çünkü başlangıçtaki ödemli yanıtın iç retinal tabakalar üzerinde daha derin bir etkisi vardır. İzler ayrıca toplam retina kalınlığının incelenmesine ve iç ve dış retina tabakalarının ayrılmış analizine izin verir. Şekil 3C , retina tabakalarının ilk enflamatuar şişmesinin ve nihai dejeneratif incelmenin gözlenebildiği RVO hasarının zaman seyrinin bir analizini sağlar. Her bir tabakanın kalınlığının zaman içinde çizilmesi, iç nükleer tabakanın ilk yaralanmaya çok daha büyük bir tepki verdiği, ancak iç pleksiform tabakanın ilk ödem stabilize edildikten ve taban çizgisine döndükten sonra daha şiddetli incelme gösterdiği iç pleksiform ve iç nükleer tabakalar için farklı dinamikler ortaya çıkarır (Şekil 3D) ). Bu, farklı zaman noktalarında yanıtın itici güçlerinin daha kesin bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Ayrıca, bir kaspaz inhibitörünün şişliği azaltmada ve nihai dejenerasyona karşı korunmada etkinliğini test ettik ve analiz, bireysel katmanlarda farklı etkileri ortaya çıkardı.
İç retina tabakalarının (DRIL) dağınıklığı, diyabetik retinopatide iskeminin tanısal bir ölçüsü olarak kullanılan bir başka OCT özelliğidir ve RVO18,19'da görme keskinliğinin öngörücü bir ölçüsüdür. OCT görüntülemede DRIL, dış-pleksiform tabaka12'nin üst sınırının kaybolması, dış-pleksiform ve iç nükleer tabakaların birlikte harmanlanması şeklinde kendini gösterir (Şekil 4A). Şekil 4B, DRIL'in vurgulanmış alanlarına sahip OCT görüntülerinin iki örneğini göstermektedir. DRIL'yi toplam retina uzunluğunun bir oranı olarak ifade ediyoruz ve dört OCT kesitinde ortalama olarak ifade ediyoruz. Bu ölçüm, deney gruplarını nicel olarak karşılaştırmamızı sağlar; Şekil 4C, RVO'da retina hasarını hafifletmede bir inhibitörün etkinliğini araştırmak için iki deney grubunun retinal disorganizasyonunun karşılaştırıldığı örnek bir analiz sunmaktadır.
Şekil 1: Floresein anjiyografi (FA) ve optik koherens tomografi (OCT) görüntülemelerinden elde edilen görüntüler. (A) RVO sonrası 24 saat retinalardan FA ve OCT görüntülerine örnekler ve yaralanmamış kontroller. (B) Farklı dışlama kriterlerinin fundus ve OCT görüntülemesi: aşırı retina dekolmanı, kanama, kornea kataraktı ve tıkanıklık olmaması. OCT ediniminin mesafesi yeşil kılavuzla gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresein sızıntısının miktarı. (A) FA görüntüsünün damarlara ayrılması ve analiz için arka plan (B) İşlem sonrası 24 saat ve 48 saatte 10 mg Pen1-XBir3 inhibitörü göz damlası (N = 17) veya Pen1-Salin araç göz damlası (N = 13) alan C57BL / 6J retinal ven tıkalı (RVO) farelerin gözlerinden floresein sızıntısı miktarı. Arka plan görüntüsünün yoğunluk okuması, geminin görüntüsünden ortalama yoğunluk okumasına normalleştirilir. RVO fareleri için yoğunluk okumasının ortalaması, yaralanmamış kontrollere göre daha da normalleştirilmiştir. Hata çubukları SEM ile ortalamayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OCT görüntülerinde retina tabakası kalınlığının miktarı . (A) Ganglion Hücre Tabakası, İç Pleksiform Tabaka, İç Nükleer Tabaka, Dış Pleksiform Tabaka, Fotoreseptör Tabakası, RPE ve Koroid etiketli bireysel retinal tabakalarla yaralanmamış retina. (B) Yaralanmamış kontrolden ve RVO C57/BL6 sonrası 24 saat farelerden alınan OCT görüntülerinin katman izlerine örnek. (C) RVO'dan 4 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 8 gün sonra C57BL/6J fare retinalarının OCT görüntülemesinde gözlenen toplam retina kalınlığı ve retina içi kalınlıktaki değişimin miktarı. (D) RVO prosedüründen hemen sonra 10 mg Pen1-XBir3 inhibitörü göz damlası (N = 14) veya Pen1-Saline araç göz damlası (N = 15) alan C57BL / 6J fareler için C57BL / 6J farelerin retinalarının iç pleksiform ve iç nükleer katmanlarındaki kalınlık değişiminin 24 saat, 48 saat ve RVO sonrası 8 gün miktarı. Hata çubukları SEM ile ortalamayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RVO sonrası OCT görüntülerinde gözlenen iç retinal tabakaların (DRIL) düzensizliğinin miktarı. OCT görüntülerinde, DRIL, iç nükleer ve dış pleksiform tabakalar arasında net bir betimlemenin kaybı ile gösterilir. (A) OCT görüntülemede DRIL'li ve DRIL'siz retina bölümlerine örnekler. (B) RVO'dan 24 saat sonra C57BL/6J farede iki bölgenin OCT görüntülemesinde DRIL alanları, beyaz çizgilerle gösterilir. DRIL, retinanın şeklini takip etmek yerine görüntü boyunca yatay olarak ölçülür. (C) RVO prosedüründen sonra 2.5 mg Pen1-XBir3 inhibitörü göz damlası (N = 19) veya Pen1-Saline araç göz damlası (N = 21) alan C57BL / 6J farelerin gözleri için RVO sonrası 24 saat ve 48 saat DRIL'in gözlendiği retina uzunluğunun oranının ölçülmesi. Hata çubukları SEM ile ortalamayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noninvaziv kemirgen retinal görüntüleme, patolojiyi incelemek ve müdahaleler geliştirmek için bir yol sunar. Önceki çalışmalar, değişkenliği sınırlayan ve murin retinadaki yaygın klinik patolojilerin güvenilir bir şekilde çevrilmesine izin veren bir RVO fare modeli geliştirmiş ve optimize etmiştir 5,7,13. Oftalmik görüntüleme teknolojisindeki gelişmeler, deney hayvanlarında FA ve OCT gibi klinik in vivo görüntüleme tekniklerinin kullanılmasına izin vererek, fare modellerini insan hastalığı profilleriyle karşılaştırma yeteneği kazandırmaktadır 6,12,15. Bununla birlikte, bu görüntülerden çıkarılabilecek bilgileri ve modelin genel çeviri potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için, görüntüleri analiz etmek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir ve titiz nicel yöntemlere ihtiyaç vardır. Burada, hasar şiddetinin nicel gösterimlerine izin veren, fareler arasında ve deney grupları arasında daha kesin ve güvenilir karşılaştırmalara izin veren analiz yöntemleri sunuyoruz. Bu analizler, FA görüntülerinde sızıntı miktarını, ortalama katman kalınlığının nicelleştirilmesini ve OCT görüntülerinde DRIL alanlarını içerir.
Başarılı analizde kritik bir faktör, elde edilen görüntülerin kalitesinde yatmaktadır. Kötü çözümlenmiş OCT görüntüleri, tek tek katmanların izlenmesinde zorluklara ve iç retinal düzensizliğin düşük görüntü kalitesinden ayırt edilememesine neden olabilir. Görüntüleme yaparken, farenin platform üzerinde konumlandırılmasına, fundus görüntüsünün odakta olmasına, optik sinirin nispeten ortalanmış olmasına ve retinal kesitin görüntü boyunca yatay olmasına dikkat etmek önemlidir. Hayvan anestezi altındayken gözlerin tutarlı bir şekilde yağlanması, özellikle aynı hayvan birkaç gün görüntülendiğinde de önemlidir. Yetersiz yağlama, retinayı gizleyen ve görüntüleme için uygun olmayan hale getiren kornea kataraktlarına neden olabilir. RVO görüntülemede çeşitli retina patolojileri ortaya çıkabilir ve bu da görüntüleri analiz için uygun hale getirmez. Bunlar arasında aşırı retina dekolmanı ve aşırı kanama bulunur; bu, görüntüleme kalitesinden büyük ölçüde ödün vermenin yanı sıra, bir RVO modeli olarak kullanılamayacak kadar şiddetli bir hasar derecesini de temsil eder. Ek olarak, tüm tıkanmış gemilerin yaralanmadan kısa bir süre sonra tamamen yankılanması mümkündür, bu da RVO hasarını doğru bir şekilde modellemez ve bir dışlama kriteri olarak kullanılmalıdır. Bununla birlikte, başarılı oklüzyonların yaralanma sonrası 48-72 saat ile doğal olarak çözüleceğini ve dışlama kriteri olarak tıkanıklıkların varlığının en iyi prosedür sonrası 24 saat veya öncesinde kullanıldığını belirtmek önemlidir. Colón Ortiz ve ark.13, RVO prosedürü için optimize edilmiş bir modelde değişkenliği sınırlamak ve yaralanmayı kalibre etmek için en iyi uygulamaları detaylandırmaktadır. Dışlama kriterlerinin belirlenmesi ve yargılanması da görüntü analizi için kritik bir adımdır. Bu büyük ölçüde değerlendiricinin takdirine bağlı olduğundan, değerlendiricilerin tedavi gruplarına kör olmaları ve patolojinin ciddiyeti kararında tutarlılık uygulamaları önemlidir. Bu yöntemlerin uygulanmasında, özellikle aynı fareyi birden fazla zaman noktasında görüntüleme pratiğinde bazı sınırlamalar vardır. Bir farenin görüntüleme için anestezi altına alınabileceği frekansın bir sınırı vardır, bu da optimal zaman rotasını belirlemek için zaman noktalarının test edilmesini ve ayarlanmasını gerektirir. Çalışmalarımız, ilk yaralanmanın, akut enflamatuar yanıtın ve uzun süreli yaralanmanın yakalama aşamalarını bulduğumuz 4 saat, 24 saat, 48 saat ve 8 günde görüntüleme zaman noktaları kullanmaktadır12. Ek olarak, bazı fare suşları, çeşitli diyabetik fare modellerini içeren kornea kataraktlarının gelişimine daha yatkındır ve bu da çok sayıda dışlanmaya veya eksik zaman kurslarına yol açabilir20,21. Bu tür fare çizgilerini kullanan çalışmaların, korneanın duyarlılığına bağlı olarak deney grubu boyutunu veya görüntüleme zaman noktalarını uyarlaması gerekebilir.
Floresein anjiyografi görüntüleme, sızıntı gibi retinal patolojileri ve ayrıca değişmiş kan akımı RVO6 paternlerini gözlemlemek ve derecelendirmek için büyük ölçüde kalitatif olarak kullanılmıştır. Son zamanlarda, hayvan modellerinde FA'nın vasküler alan ve kıvrımlılığın hesaplanması16 ve görüntü yoğunluğu zamansallığının doğrusal regresyon analizi17 gibi nicel bir analizini geliştirme çabaları olmuştur. Büyük damarların fundus arka planından segmentasyonu daha önce kullanılmıştı, ancak farklı farelerde görüntü yoğunluğundaki değişkenliğe tanıklık eden dolgu ve bozunma dinamiklerinin piksel analizinde17. Ek olarak, floresein havuzu17'nin yorumlanmasında önyargı potansiyeli belirtilmiştir. Burada tartışılan kantitatif yöntem, RVO hasarında rol oynadığı gösterilen BRB'nin parçalanmasının göstergesi olan majör retinal vaskülatürden floresein sızıntısını hedeflemektedir11,12,14. Alternatif bir sızıntı analizi, retinal düz montajlardaki boya sızıntısını ölçer22. Bununla birlikte, invaziv post-mortem analizler, sızıntının birden fazla zaman noktasında incelendiği tek bir fare içindeki RVO yaralanmasının zaman çizelgesi çalışmaları için daha az uygundur. Retina hastalığının farklı evrelerinde floresein kaçak alanının analizleri daha önce klinik çalışmalarda kullanılmış ve gözlenen diğer hastalık patolojileri ile korelasyon göstermiştir23. Bu yöntem, damar sızıntısını in vivo olarak incelemek için FA görüntülerinin benzer şekilde kullanılmasına izin verir ve RVO yaralanmasının zaman çizelgesi içinde sızıntı dinamiklerinin incelenmesine izin verir. Sızıntı alanının seçimi, bir bölgenin değerlendirici seçimine dayandığından, potansiyel olarak öznellik yoluyla daha fazla değişkenlik getirir. Ayrıca, burada tartışılan RVO yaralanma modelinin çalışmaları retina boyunca sızıntıyı araştırdığından, hesaplama için bir maskeleme tekniği kullanmayı tercih ettik. Bu sızıntı yöntemi, DRIL ve OCT katman izleme analizi ile ortaya çıkanlardan farklı bir RVO hasarı yönünü yansıtır ve bu önlemlerle korelasyon, daha doğru bir hastalık profilinin oluşturulmasına izin verir.
OCT görüntülerinin değerlendirilmesi için iki yöntem sunuyoruz. Akut inflamasyon ve retina tabakalarının dejenerasyonu, RVO hasarı 6,12'nin ayırt edici bir özelliğidir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan OCT katman izleme metodolojisi, tek tek katmanların hassas bir şekilde incelenmesine izin verir ve retinanın farklı bölgelerindeki dinamiklerde daha ince etkiler ve farklılıklar ortaya çıkarır. Bu analiz tekniği, OCT görüntülemede retina tabakası kalınlığının ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan diğer protokollere dayanmaktadır. Bu yöntem, katman kalınlığını tahmin etmek için kullanılan alandaki protokoller arasındaki varyasyonun yanı sıra görüntü11 boyunca alınan ölçüm sayısını da ele alır. İnceltme her retinal tabakada eşit olmadığından, daha az nokta ölçümü kullanan yöntemlerin yaralanma etkilerinin tam bir resmini vermesi muhtemel değildir. Retina tabakası kalınlığı için çoklu ölçüm stratejilerinin meta-analizi, OCT görüntüsünün daha geniş alanlarında ortalama protokollerin hastalık şiddeti ile daha yüksek bir korelasyon ve daha fazla tekrarlanabilirlik gösterdiğini bildirmiştir11. Tüm görüntünün ortalamasını alarak, bu yöntem uzun süreli RVO hasarında mevcut retinal incelmenin daha doğru bir temsilini yakalar. Çalışmalar OCT görüntülerinin alındığı yer açısından da farklılık gösterir - birçok çalışma optik sinir üzerinde görüntülemeyi merkeze alır. Buna karşılık, sunulan yöntem oklüzyonlara göre merkezlenir. İnsan OCT görüntülemesinin analizindeki son gelişmelerden biri, özellikleri sınıflandırmak ve ölçmek için makine öğrenimi algoritmalarının kullanılmasıdır24. Bu tür analizler, hayvan retinal görüntülemesinin analizi için umut verici bir gelecek yönü olabilir.
Ek olarak, kılcal iskeminin klinik bir ölçüsü olan DRIL'in bir kemirgen modeline çevirisini sunuyoruz. İnsanlarda, DRIL'nin görme keskinliği kaybı ve retina kalınlığı farklılıklarının bir göstergesi olduğu bulunmuştur ve yüksek tanısal duyarlılık ve özgüllük göstermiştir18,19. Dağınık retinanın oranını ölçerek farelerde DRIL'nin ölçülmesi, tıkalı damarların fraksiyonu, RVO'dan 7 gün sonra ERG b dalga genliği ve RVO12'den 8 gün sonra retinal incelme ile korelasyon göstermiştir. DRIL ölçümüne bir alternatif, retinal hipoksi ve iskemik hasarı ölçmek için HYPOX-4'ün kullanılmasıdır. HYPOX-4, retinal hipoksi25'i tespit etmek için bir floresan probu ile bir hipoksi belirteci olan pimonidazol anime hidroklorüre katılır. HYPOX-4 kullanan protokollerin çoğu invazivdir ve yaralanma zaman çizelgelerinin oluşturulması için daha az uygun olabilecek retinal düz montaj analizi gerektirir, ancak bir HYPOX-4 probu kullanan bir in vivo görüntüleme protokolü yakın zamanda pilot olarak uygulanmıştır25. DRIL analizi, retina hasarının hızlı bir şekilde okunması için de yararlıdır, çünkü her OCT görüntüsündeki tek ölçümler, retinal tabaka izleme gibi analizlerden daha zaman verimlidir. Bununla birlikte, bu önlemlerin birbirinin yerine geçemeyeceği ve farklı retina patolojilerini ortaya çıkardığı belirtilmelidir. Daha ziyade, DRIL'nin etki boyutu veya müdahale etkinliği için ilk okuma olarak kullanılabileceği ve katman izlemenin daha sonra retinal katmanlardaki daha ince etkilerin kapsamlı bir analizi için kullanılabileceği uyum içinde kullanılmalıdır.
Bu yöntemler doğada ortogonaldir ve bu da her deneysel denek için bir hastalık profilinin oluşturulmasına izin verir. Bu yöntemlerin her biri tarafından bildirilen patolojiler farklı olduğundan, orantılı olarak ölçeklenmeleri garanti edilmez ve patolojinin daha bütünsel bir resmini elde etmek, RVO hasarının değişen tezahür konfigürasyonlarının daha titiz bir şekilde araştırılmasına izin verecektir. Her deney hayvanının görüntülenmesinden çıkarılabilecek bilgi miktarını en üst düzeye çıkarma yeteneği, önemli sonuçlar çıkarmak için gerekli hayvan sayısını azaltacak ve deneysel sürecin verimliliğini artıracaktır. Bu yöntemlerin yakın zamanda rafine edilmiş RVO protokollerine uygulanması, daha fazla tekrarlanabilirlik ve klinik fenotiplerin hayvan modellerine çevrilmesinin incelenmesine izin verir. RVO modellerinin incelenmesinin ötesinde, bu yöntemlerin kullanımının, FA ve OCT görüntülemeyi kullanan diğer retina hastalıkları modellerine uygulamaları vardır. Bu tür fare modellerine örnek olarak yaşa bağlı makula ödemi (AMD)26, diyabetik makula ödemi (DME)23, koroidal neovaskülarizasyon (CNV)27, deneysel otoimmün üveoretinit (EAU)28 ve prematüre retinopatisi (ROP)15 verilebilir. Bu yöntemler, diğer türlerdeki bu hastalıkların modellerini incelemek için FA ve OCT görüntüleme kullanan çalışmalara daha da genelleştirilebilir. Bu nicelemeler aynı zamanda hastalık mekanizmasındaki daha ince değişikliklere karşı hassastır, bu da onları Şekil 3D ve Şekil 4C'de olduğu gibi tedavi etkinliğinin değerlendirilmesinde yararlı kılar. Yararlılık ayrıca, ilaç bileşiklerinin tolere edilebilirlik çalışmalarında toksisite testinde görüntülemenin kullanımına da uzanmaktadır. Bu analiz protokollerinin standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği, hayvan modellerinin translasyonel geçerliliğini geliştirmeye ve retinovasküler hastalığın patogenezi ve patofizyolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletmeye hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (NSF-GRFP) hibe DGE - 1644869(CKCO'ya), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) 5T32EY013933 (AMP'ye), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (RO1 NS081333, R03 NS099920 CMT'ye) ve Savunma Bakanlığı Ordusu / Hava Kuvvetleri (DUP'tan CMT'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
