Summary
在这里，我们提出了三种用于荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）图像的数据分析协议，用于视网膜静脉遮挡（RVO）的研究。
Abstract
眼科成像工具的进步为研究神经血管损伤动物模型的研究人员提供了前所未有的访问水平。为了正确利用这种更大的可翻译性，需要设计可重复的方法，从这些图像中提取定量数据。光学相干断层扫描 （OCT） 成像可以在微米分辨率下解析视网膜组织学，并揭示血管血流的功能差异。在这里，我们描绘了无创血管读数，用于在优化的视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型中表征血管损伤后的病理损伤。这些读数包括视网膜形态的实时成像分析、毛细血管缺血的视网膜内层紊乱 （DRIL） 测量以及视网膜水肿和血管密度的荧光素血管造影测量。这些技术直接对应于临床上用于检查视网膜疾病患者的技术。标准化这些方法可以直接和可重复地比较动物模型与眼科疾病的临床表型，从而提高血管损伤模型的转化能力。
Introduction
神经血管疾病是导致缺血性中风的主要医疗保健问题，缺血性中风是导致死亡和发病的主要原因，以及导致视力丧失的视网膜血管疾病1，2。为了模拟神经血管疾病，我们采用了视网膜静脉阻塞（RVO）的小鼠模型。该模型是非侵入性的，利用与临床环境中用于检查视网膜血管疾病患者的体内成像技术类似的 体内 成像技术。因此，该模型的使用增加了使用该模型的研究的转化潜力。与所有小鼠模型一样，最大限度地提高模型的可重复性至关重要。
视网膜血管疾病是70岁以下人群视力丧失的主要原因。RVO是仅次于糖尿病视网膜病变的第二常见的视网膜血管疾病3。RVO 的临床特征包括缺血性损伤、视网膜水肿和神经元丢失导致的视力丧失3，4。已经开发和改进了使用激光光凝主要血管的RVO小鼠模型，以复制在人类RVO5，6，7中观察到的关键临床病理。眼科成像的进步也允许复制用于人类的无创诊断工具，即荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）6。荧光素血管造影允许使用注射荧光素（一种小荧光染料8，9）来观察由于血液 - 视网膜屏障（BRB）的破坏以及视网膜中的血流动力学（包括闭塞部位）引起的泄漏。OCT成像允许获取视网膜的高分辨率横截面图像并研究视网膜层的厚度和组织10。对FA图像的分析历来主要是定性的，这限制了研究之间直接和可重复比较的潜力。最近，已经开发了许多用于量化OCT成像中层厚度的方法，尽管目前还没有标准化的分析协议，并且OCT图像采集的地点各不相同11。为了正确利用这些工具，需要标准化、定量和可复制的数据分析方法。在本文中，我们提出了三种这样的血管读数，用于评估RVO-荧光素渗漏，OCT层厚度和视网膜层紊乱的小鼠模型中的病理损伤。
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Protocol
该协议遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。啮齿动物实验由哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准和监测。
注意：对重约23g的2个月大的C57BL / 6J雄性小鼠进行成像。
1. 视网膜成像试剂的制备
- 注射荧光素溶液的制备。
注意：荧光素对光非常敏感。避光，准备后不久使用。- 在无菌盐水中将荧光素稀释至1%的浓度。
- 氯胺酮/甲苯噻嗪的制备
- 在无菌盐水中相应地稀释氯胺酮和赛拉嗪，浓度如下：氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg）。
- 无菌生理盐水
- 用带有无菌盐水的26 G针头准备5 mL注射器。
2. OCT和荧光素成像
- 打开视网膜成像显微镜灯箱、OCT 机和加热鼠标平台。
- 打开计算机并打开映像程序。
- 每只眼睛加入一滴去氧肾上腺素和托品卡胺。
- 腹腔注射150μL麻醉剂（氯胺酮（80-100mg / kg）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg））。通过捏住脚趾确定麻醉深度，并等待动物无反应。在双眼上涂抹眼药膏或人工泪液。
- 将鼠标放在平台上。
- 调整平台的高度和角度，直到视网膜眼底的视图清晰且聚焦。拍一张眼底的照片。
- 打开映像和 OCT 软件。在 OCT 程序中，将微移调整为 5。
- 在距离烧伤远端75μm处拍摄OCT图像。对视网膜的其他三个象限重复此操作。
- 注入 100 μL 1% 荧光素 IP。
- 将相机切换到 488 nm 滤光片。将相机增益增加到 5。
- 在荧光素注射后正好5分钟拍摄眼底照片。
注意：避免在最大设置下将眼睛长时间暴露在相机光线下，因为荧光素会加剧视网膜光损伤。保持光源关闭，直到 5 分钟等待时间过去并且鼠标准备好成像。
3. 善后
- 注入 1 mL 无菌盐水 IP。将润滑剂滴眼液涂抹在双眼上。在双眼上涂抹眼药膏或人工泪液。
- 观察小鼠从麻醉中恢复的过程。只有在完全恢复后，通常在大约40分钟后，才与其他动物一起返回笼子。
4. 排除标准的评估
- 打开术后24小时拍摄的眼底图像以评估排除标准。如果确定以下任何标准，则排除眼睛。
- 评估图像是否具有零遮挡
- 评估图像中阻塞血管的数量。
注意：成功的闭塞通常在烧伤处或周围有一些紫色色素沉着，烧伤处的血管非常薄或不连续，烧伤区域外的血管外观微弱或不存在，以及缺氧引起的视网膜变色。如果可以通过激光的白色烧伤看到整个血管，则容器未能遮挡。有时血管会显得部分阻塞，但如果它在烧伤外看起来没有中断，血管可能没有阻塞。 - 对于不明确的病例，在同一时间点使用 FA 成像来评估闭塞。在这些图像中，遮挡将表现为血管连续性的中断，通常伴随着周围血管的逐渐变细。
- 如果发现零遮挡，则从分析中排除眼睛，因为 RVO 被认为无效。
注意：闭塞通常在RVO后48-72小时消退，在这些时间点，闭塞的存在不应再用作排除标准。
- 评估图像中阻塞血管的数量。
- 评估眼底和OCT图像是否有过度视网膜脱离
注意：诱导RVO后视网膜下积液很常见，并导致神经视网膜与RPE分离。过度视网膜脱离的排除标准定义如下：OCT要么完全不可见，要么某些层看起来非常扭曲。图像质量差，外层丛状和RPE层的分辨率下降。神经视网膜和脉络膜之间的距离大于OCT视野允许的。在眼底图像上，视网膜色调几乎完全是白色的，有一些紫色斑点。部分视网膜可能出现扭曲和失焦。这是因为它已经脱离并且与视网膜其余部分的焦距不同。- 如果对眼睛图像的评估确定视网膜的周边或完全脱离，请将眼睛排除在分析之外。
- 排除有角膜白内障证据的图像
注意：角膜白内障在小鼠角膜上显示为不透明的白点。白内障通常是由于动物麻醉时眼睛润滑不足而发生的，通过注意大量涂抹眼膏可以在很大程度上避免白内障。白内障通常可以在成像前通过检查动物来识别。发生白内障的小鼠应从数据集中排除，而无需进行成像过程。在成像中，白内障会遮挡相机的视网膜，OCT会显得翘曲。 - 评估图像是否出血过多
注意：过度出血可以识别为图像中的红色液体量，通常模糊视网膜背景，血管和烧伤。这些红色液体区域将比成功 RVO 中正常的紫色斑点更亮、更不透明的红色。出血在OCT成像中出现在神经节细胞层，并干扰了在出血下方观察其他视网膜层的能力。- 如果确定图像出血过多，请从分析中排除眼睛。
5. 荧光素图像处理
- 在图像处理软件中打开荧光素图像。
- 复制图像
- 使用选择工具，仔细追踪主要船只。
- 主要血管是从视盘辐射出去的较厚的静脉和动脉。忽略从这些船只分支出来的任何船只。
- 如果泄漏阻止在闭塞部位附近看到容器的轮廓，请在容器的大致位置追踪泄漏（保持厚度，将最后一个可见点连接到下一个可见点）。
- 在第一个图像中，删除所选内容，仅保留背景。保存此蒙版图像。
- 将选区移动到第二个图像，反转选区并删除，隔离容器。保存此蒙版图像。
- 在 ImageJ 中打开两个图像。打开背景图像并测量积分密度。
- 打开容器的图像，选择容器的轮廓，然后测量平均强度。
- 将背景的积分密度除以血管的平均强度，生成眼睛的泄漏率。
- 记录实验队列中每只眼睛的泄漏率。
- 为了进一步控制背景，将实验眼睛归一化为未受伤对照眼睛的平均渗漏率。
注意：为了创建FA图像中荧光素泄漏的标准化定量，此计算使用背景密度（将存在泄漏的地方）与主要血管亮度的比率来创建控制图像之间亮度变化的结果，并且可以可靠地量化。未受损的眼睛没有渗漏，理论上的比率应为零。因此，从这些未受损的对照眼计算的比率代表背景噪声，该值用于进一步归一化实验值。
6. 视网膜层厚度
- 在图像处理软件中打开OCT图像。
- 追踪神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、感光器层和 RPE 层的边界。测量每层的平均厚度。
- 对视网膜其他三个象限的OCT图像重复此操作。平均四个象限的平均层厚度，以获得眼睛每个视网膜层的平均厚度。
- 对实验队列中的每只眼睛重复此操作。
7. 视网膜内层紊乱
- 在 ImageJ 中打开 OCT 映像。
- 使用线工具测量外层丛状层上边界不明显的距离。
注意：区分DRIL和由成像伪影引起的层可见性差的区域非常重要。如果没有足够的图像分辨率，较差的OCT图像质量可能会使眼睛无法进行DRIL分析。带有DRIL的图像通常具有清晰解析和组织的其他区域或视网膜层，这可以很好地指示足够的图像质量。- 水平测量从杂乱开始的纬度到外丛状层的上边界再次可见的纬度（如果有的话）。即使外部丛状层垂直向上或向下移动，也可以完美地水平测量。
- 可能有多个无组织区域被没有混乱的区域隔开。单独测量这些并计算距离的总和。
- 将混乱的长度除以每个OCT图像中可见的视网膜的总长度，以获得图像的混乱比率。
- 对视网膜其他三个象限的OCT图像重复测量和计算。
- 取四个OCT图像的混乱比率的平均值。这个数字代表整个视网膜的平均混乱。对实验队列中的每只眼睛重复此操作。
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Representative Results
这些分析方法允许量化FA和OCT成像捕获的视网膜病理。从中提取代表性数据的实验使用C57BL / 6J雄性小鼠，这些小鼠作为未受伤的对照或接受RVO程序并接受Pen1-XBir3治疗眼药水或Pen1-Saline载体滴眼液。RVO损伤模型涉及在尾静脉注射孟加拉玫瑰（一种光活化剂染料12）后，对麻醉小鼠每只眼睛的主要静脉进行激光照射（532 nm）。在距视神经中枢平均375μm的距离处传递三个激光脉冲以诱导光凝并阻塞血管12。Avrutsky等人12演示了RVO程序的有效使用，Colón Ortiz等人13详细介绍了RVO方法优化的更多详细信息。 图1A 显示了两组的FA和OCT图像示例。由于光凝过程中闭塞形成和稳定的可变性质，可以观察到不同程度的损伤。在某些视网膜中，RVO手术引起的损伤引入了眼科病变，使视网膜图像不适合分析。采集后，应首先评估图像的排除标准，以确保最佳分析和可靠的结果。这些排除标准如图 1B所示，包括视网膜脱离、出血和白内障。正如在示例眼底和OCT图像中观察到的那样，这些病理阻止了清晰的OCT成像，使视网膜不适合数据分析。此外，某些视网膜可能不包含稳定的遮挡;这些图像不能准确模拟缺血缺氧损伤，应从分析中排除。
血液视网膜屏障的破坏有助于RVO14，15的发病机制。评估血管泄漏量是损伤引起的血管渗透率的有用指标。FA成像允许可视化这种泄漏，但许多因素，例如循环速率的差异，会影响FA图像的原始强度并使定量保持一致16，17。我们的方法通过将视网膜中观察到的强度归一化为主脉管系统的平均强度来控制这种变异性。这为每张视网膜图像提供了泄漏率，可以与其他图像进行比较并进行分析。 图2A 显示了用于此计算的遮罩图像，将主要脉管系统与视网膜的其他区域分开。量化荧光素的能力允许比较损伤严重程度和治疗效果，以及研究损伤时间过程中渗漏的变化（图2B），这可能太微妙的影响，无法仅通过定性报告来证明。
OCT成像可以分析RVO对单个视网膜层和整体视网膜厚度的影响。 图3A 显示了OCT图像中视网膜层的描绘。追踪每一层的边界（图3B）允许多种分析途径。每个视网膜层厚度的量化被证明是有用的，因为最初的水肿反应对视网膜内层有更深远的影响。迹线还允许研究总视网膜厚度和视网膜内外层的分离分析。 图3C 提供了RVO损伤的时间过程分析，其中可以观察到视网膜层的初始炎症肿胀和最终的退行性变薄。绘制每层随时间变化的厚度揭示了内层丛状层和内核层的不同动力学，其中内核层对初始损伤的反应要大得多，但在初始水肿稳定并恢复到基线后，内丛状层表现出更严重的变薄（图 3D).这样可以更精确地了解不同时间点的响应驱动因素。我们还测试了半胱天冬酶抑制剂在减轻肿胀和防止最终变性方面的有效性，分析揭示了各个层的不同效果。
视网膜内层紊乱 （DRIL） 是另一个 OCT 特征，用作糖尿病视网膜病变缺血的诊断指标，以及 RVO18，19 中视力的预测性测量。在OCT成像中，DRIL表现为外层丛状层12的上边界消失，将外层丛状层和内核层混合在一起（图4A）。 图 4B 显示了两个 OCT 图像示例，其中突出显示了 DRIL 区域。我们将DRIL表示为视网膜总长度的比例，平均跨越四个OCT横截面。该措施使我们能够定量比较实验组; 图4C 提供了一个示例分析，其中比较了两个实验组的视网膜紊乱，以研究抑制剂在减轻RVO视网膜损伤方面的功效。
图1：从荧光素血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）成像获得的图像 。 （A）RVO后24小时视网膜和未受伤对照组的FA和OCT图像示例。（B）眼底和OCT成像的不同排除标准：视网膜过度脱离，出血，角膜白内障和无遮挡。OCT采集距离由绿色指南指示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：荧光素泄漏的定量 。 （A）将FA图像分离到血管和背景中进行分析 （B）在手术后24小时和48小时接受10mg Pen1-XBir3抑制剂滴眼液（N = 17）或Pen1-Saline Vehicle Eyedrop（N = 13）的C57BL / 6J视网膜静脉闭塞（RVO）小鼠眼睛的荧光素泄漏定量。背景图像的强度读数归一化为容器图像的平均强度读数。RVO小鼠的强度读数平均值进一步归一化为未受伤的对照。误差线显示 SEM 的平均值。 请点击此处查看此图的大图。
图3：OCT图像中视网膜层厚度的量化 。 （A）未受伤的视网膜，其单个视网膜层标记为：神经节细胞层，内丛状层，内核层，外丛状层，感光层，RPE和脉络膜。（B）从未受伤的对照组和RVO C57 / BL6小鼠后24小时拍摄的OCT图像的层迹线示例。（C）量化在RVO后4小时，24小时，48小时，72小时和8天在C57BL / 6J小鼠视网膜的OCT成像中观察到的总视网膜厚度和视网膜内厚度的变化。（D） 在 RVO 后 24 小时、48 小时和 8 天对接受 10 mg Pen1-XBir3 抑制剂滴眼液 （N = 14） 或 Pen1-Saline 载体滴眼液 （N = 15） 的 C57BL/6J 小鼠在 RVO 后 24 小时、48 小时和 6J 小鼠视网膜内层和内核层厚度变化的量化RVO 程序和 RVO 后 24 小时。误差线显示 SEM 的平均值。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：RVO 后在 OCT 图像中观察到的视网膜内层 （DRIL） 紊乱的量化。 在OCT图像中，DRIL表现为内核层和外层丛状层之间失去清晰的界限。（A）OCT成像中带和不带DRIL的视网膜切片示例。（B）RVO后24小时C57BL / 6J小鼠两个区域的OCT成像中的DRIL区域，用白线表示。DRIL在图像上水平测量，而不是跟随视网膜的形状。（C）在RVO手术后接受2.5mg Pen1-XBir3抑制剂滴眼液（N = 19）或Pen1-Saline Vehicle Drop（N = 21）的C57BL / 6J小鼠的眼睛在RVO后24小时和48小时观察到DRIL的视网膜长度比例的量化。误差线显示 SEM 的平均值。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
无创啮齿动物视网膜成像为研究病理学和开发干预措施提供了途径。以前的研究已经开发并优化了RVO的小鼠模型，限制了变异性并允许对小鼠视网膜中常见临床病理的可靠翻译5，7，13。眼科成像技术的发展进一步允许在实验动物中使用临床体内成像技术，如FA和OCT，从而能够将小鼠模型与人类疾病特征进行比较6，12，15。然而，为了最大限度地利用可以从这些图像中提取的信息以及模型的整体翻译潜力，需要标准化、可重现和严格的定量方法来分析图像。在这里，我们提出了分析方法，可以定量表示损伤严重程度，从而可以在小鼠之间和实验组之间进行更精确和可靠的比较。这些分析包括FA图像中的泄漏量化，平均层厚度的量化以及OCT图像中的DRIL区域。
成功分析的一个关键因素在于所采集图像的质量。分辨率差的OCT图像会导致难以追踪单个层，并且无法区分视网膜内部混乱和图像质量差。成像时，重要的是要注意鼠标在平台上的位置，确保眼底图像聚焦，视神经相对中心，视网膜横截面在图像上水平。在动物麻醉时对眼睛进行一致的润滑也很重要，尤其是当同一只动物被成像多天时。润滑不足可能导致角膜白内障，这会遮挡视网膜并使其不适合成像。RVO成像中可能发生各种视网膜病变，使图像不适合分析。这些包括过度的视网膜脱离和过度出血，除了极大地损害成像质量外，还代表了一定程度的损害，无法用作RVO模型。此外，所有闭塞的血管都有可能在受伤后不久完全再灌注，这不能准确模拟 RVO 损伤，应用作排除标准。然而，重要的是要注意，成功的闭塞将在损伤后48-72小时自然消退，并且最好在手术后24小时或之前使用闭塞作为排除标准。Colón Ortiz等人13 详细介绍了在RVO手术优化模型中限制变异性和校准损伤的最佳实践。排除标准的识别和判断也是图像分析的关键步骤。由于这在很大程度上取决于评估人员的自由裁量权，因此评估人员对治疗组不知情，并在判断病理严重程度时保持一致是很重要的。这些方法的应用存在一些局限性，特别是在多个时间点对同一鼠标进行成像的实践中。麻醉小鼠进行成像的频率是有限的，因此需要测试和调整时间点以确定最佳时间过程。我们的研究采用4小时，24小时，48小时和8天的成像时间点，我们发现捕获初始损伤，急性炎症反应和长期损伤的阶段12。此外，某些小鼠品系更容易发生角膜白内障，其中包括各种糖尿病小鼠模型，这可能导致大量排除或不完整的时间过程20，21。利用这种小鼠系的研究可能需要根据角膜的敏感性定制实验组大小或成像时间点。
荧光素血管造影成像已广泛用于定性观察和分级视网膜病变，例如渗漏，以及血流改变的模式 RVO6。最近，人们一直在努力开发动物模型中FA的定量分析，例如血管面积和曲折度的计算16和图像强度时间性的线性回归分析17。以前已经使用过从眼底背景分割主要血管，但在填充和衰减动力学的像素分析中，证明了不同小鼠图像强度的变化17。此外，在荧光素汇集的解释中注意到可能存在偏倚17。这里讨论的定量方法针对主要视网膜血管系统中荧光素的泄漏，表明BRB的分解，已被证明在RVO损伤中起作用11，12，14。泄漏的替代分析量化了视网膜平面支架上的染料泄漏22。然而，侵入性尸检分析不太适合研究单个小鼠体内RVO损伤的时间线，其中泄漏是在多个时间点研究的。视网膜疾病不同阶段荧光素渗漏区域的分析以前已用于临床研究，并与其他观察到的疾病病理相关23。该方法允许类似地利用FA图像来研究体内血管泄漏，从而允许在RVO损伤的时间范围内研究泄漏动力学。由于泄漏区域的选择依赖于评估者对区域的选择，因此可能会通过主观性引入更大的可变性。此外，由于这里讨论的RVO损伤模型研究调查了整个视网膜的渗漏，因此我们选择使用掩蔽技术进行计算。这种泄漏方法反映了RVO损伤的不同方面，与DRIL和OCT层示踪分析所揭示的方面不同，并且与这些措施的相关性允许创建更准确的疾病概况。
我们提出了两种评估OCT图像的方法。急性炎症和随后的视网膜层变性是RVO损伤的标志6，12。这里详述的OCT层追踪方法允许对单个层进行精确研究，并揭示视网膜不同区域的更微妙的影响和动力学差异。该分析技术建立在OCT成像中量化视网膜层厚度的其他常用协议之上。该方法解决了用于估计层厚度的区域中不同协议之间的差异，以及在整个图像11上进行的测量次数。由于每个视网膜层内的变薄并不均匀，因此使用较少点测量的方法不太可能提供损伤效应的完整图片。对视网膜层厚度的多种测量策略的荟萃分析报告说，在OCT图像的较大区域取平均值的方案显示，与疾病严重程度的相关性更高，重复性更高11。通过对整个图像进行平均，该方法可以更准确地表示长期RVO损伤中存在的视网膜变薄。研究在拍摄OCT图像的位置方面也有所不同 - 许多研究以视神经为中心成像。相比之下，所提出的方法相对于遮挡的中心。人类OCT成像分析的最新发展是使用机器学习算法对特征进行分类和量化24。这种分析可能是动物视网膜成像分析的未来有希望的方向。
此外，我们还介绍了DRIL（毛细血管缺血的临床测量方法）转化为啮齿动物模型。在人类中，已发现 DRIL 是视力丧失和视网膜厚度差异的预测因子，并已显示出高诊断敏感性和特异性18，19。通过测量杂乱无章的视网膜比例来量化小鼠的 DRIL，已显示出与闭塞静脉的比例、RVO 后 7 天 ERG b 波振幅和 RVO 后 8 天视网膜变薄的相关性12。DRIL 测量的替代方法是使用 HYPOX-4 测量视网膜缺氧和缺血性损伤。HYPOX-4将缺氧标志物盐酸匹莫硝唑与荧光探针连接以检测视网膜缺氧25。大多数使用HYPOX-4的方案都是侵入性的，需要视网膜平面安装分析，这可能不太适合建立损伤时间表，尽管最近已经试用了使用HYPOX-4探针的 体内 成像方案25。DRIL分析也可用于快速读取视网膜损伤，因为每个OCT图像中的单次测量比视网膜层示踪等分析更省时。然而，应该注意的是，这些措施不可互换，并揭示了不同的视网膜病变。相反，它们应该协同使用，其中DRIL可以用作效应大小或干预效果的初始读数，并且随后可以采用层追踪来彻底分析视网膜层中更微妙的影响。
这些方法本质上是正交的，允许为每个实验对象创建疾病概况。由于这些方法中每种方法报告的病理都是不同的，因此不能保证按比例缩放，并且获得更全面的病理学图片将允许对RVO损伤的不同表现配置进行更严格的调查。最大化可以从每只实验动物的成像中提取的信息量的能力将减少得出重要结论所需的动物数量，从而提高实验过程的效率。将这些方法应用于最近改进的RVO方案可以提高可重复性，并研究临床表型到动物模型中的翻译。除了RVO模型的研究之外，这些方法的使用还应用于采用FA和OCT成像的其他视网膜疾病模型。这种小鼠模型的例子包括年龄相关性黄斑水肿（AMD）26，糖尿病黄斑水肿（DME）23，脉络膜新生血管（CNV）27，实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU）28和早产儿视网膜病变（ROP）15。这些方法可以进一步推广到使用FA和OCT成像研究其他物种中这些疾病的模型的研究。这些定量对疾病机制的更细微变化也很敏感，使其可用于评估治疗效果，如图3D和图4C所示。实用性还扩展到在药物化合物耐受性研究中的毒性测试中使用成像。这些分析方案的标准化和可重复性有助于提高动物模型的翻译有效性，并扩展我们对视网膜血管疾病的发病机制和病理生理学的理解。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）拨款DGE - 1644869（CKCO），国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（AMP），国家神经疾病和中风研究所（RO1 NS081333，R03 NS099920至CMT）和国防部陆军/空军（DURIP至CMT）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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