Summary
Здесь мы представляем три протокола анализа данных для флуоресцеиновой ангиографии (FA) и изображений оптической когерентной томографии (OCT) в исследовании окклюзии вен сетчатки (RVO).
Abstract
Достижения в области инструментов офтальмологической визуализации предлагают беспрецедентный уровень доступа к исследователям, работающим с животными моделями нейрососудистых повреждений. Чтобы должным образом использовать эту большую переводимость, необходимо разработать воспроизводимые методы извлечения количественных данных из этих изображений. Оптическая когерентная томография (ОКТ) может разрешить гистологию сетчатки при микрометровом разрешении и выявить функциональные различия в сосудистом кровотоке. Здесь мы очерчиваем неинвазивные сосудистые показания, которые мы используем для характеристики патологического повреждения после сосудистого инсульта в оптимизированной мышиной модели окклюзии вен сетчатки (RVO). Эти показания включают анализ морфологии сетчатки в реальном времени, измерение дезорганизации внутренних слоев сетчатки (DRIL) капиллярной ишемии и флуоресцеиновую ангиографию отека сетчатки и плотности сосудов. Эти методы напрямую соответствуют тем, которые используются для обследования пациентов с заболеваниями сетчатки в клинике. Стандартизация этих методов позволяет проводить прямое и воспроизводимое сравнение моделей животных с клиническими фенотипами офтальмологических заболеваний, увеличивая поступательную силу моделей сосудистых повреждений.
Introduction
Нейрососудистые заболевания являются основной проблемой здравоохранения, ответственной за ишемические инсульты, ведущую причину смертности и заболеваемости, а также сосудистые заболевания сетчатки, которые приводят к потере зрения 1,2. Для моделирования нейрососудистых заболеваний мы используем мышиную модель окклюзии вен сетчатки (RVO). Эта модель является неинвазивной и использует методы визуализации in vivo, аналогичные тем, которые используются для обследования людей с сосудистыми заболеваниями сетчатки в клинических условиях. Таким образом, использование этой модели увеличивает трансляционный потенциал исследований, использующих эту модель. Как и во всех моделях мыши, крайне важно максимизировать воспроизводимость модели.
Сосудистые заболевания сетчатки являются основной причиной потери зрения у людей в возрасте до 70 лет. RVO является вторым наиболее распространенным сосудистым заболеванием сетчатки после диабетической ретинопатии3. Клинические признаки, характерные для RVO, включают ишемическое повреждение, отек сетчатки и потерю зрения как следствие потери нейронов 3,4. Мышиные модели RVO с использованием лазерной фотокоагуляции крупных сосудов были разработаны и усовершенствованы для воспроизведения ключевых клинических патологий, наблюдаемых у человека RVO 5,6,7. Достижения в области офтальмологической визуализации также позволяют воспроизводить неинвазивные диагностические инструменты, используемые у людей, а именно флуоресцеиновую ангиографию (ФА) и оптическую когерентную томографию (ОКТ)6. Флуоресцеиновая ангиография позволяет наблюдать утечку из-за разрушения гемато-ретинального барьера (BRB), а также динамику кровотока в сетчатке, включая участки окклюзии, с помощью инъекции флуоресцеина, небольшого флуоресцентного красителя 8,9. OCT-визуализация позволяет получать изображения с высоким разрешением поперечного сечения сетчатки и изучать толщину и организацию слоев сетчатки10. Анализ изображений ФА исторически был в значительной степени качественным, что ограничивает потенциал для прямого и воспроизводимого сравнения между исследованиями. В последнее время был разработан ряд методов количественной оценки толщины слоя в OCT-визуализации, хотя в настоящее время не существует стандартизированного протокола анализа, а место получения изображений OCT варьируетсяна 11. Чтобы правильно использовать эти инструменты, необходима стандартизированная, количественная и воспроизводимая методология анализа данных. В этой статье мы представляем три таких сосудистых считывания, используемых для оценки патологического повреждения в мышиной модели утечки RVO-флуоресцеина, толщины слоя OCT и дезорганизации слоев сетчатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Эксперименты на грызунах были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация была сделана на 2-месячных самцах мышей C57BL/6J, которые весили примерно 23 г.
1. Подготовка реагентов для визуализации сетчатки
- Приготовление инъекционного флуоресцеинового раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцеин очень светочувствительный. Защитите от света и используйте его вскоре после приготовления.- Разбавляют флуоресцеин до концентрации 1% в стерильном физиологическом растворе.
- Препарат кетамина/ксилазина
- Разбавляют кетамин и ксилазин в стерильном физиологическом растворе соответственно для следующей концентрации: кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг).
- Стерильный физиологический раствор
- Приготовьте шприц объемом 5 мл с иглой 26 г со стерильным физиологическим раствором.
2. Визуализация ОКТ и флуоресцеина
- Включите лайтбокс микроскопа визуализации сетчатки, машину OCT и платформу мыши с подогревом.
- Включите компьютер и откройте программу создания образов.
- Добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз.
- Вводят 150 мкл анестезии (кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг)) внутрибрюшинно (ИП). Определите глубину анестезии по щелчку пальца ноги и подождите, пока животное перестанет реагировать. Нанесите офтальмологическую мазь или искусственные слезы на оба глаза.
- Разместите мышь на платформе.
- Отрегулируйте высоту и угол наклона платформы до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным. Сфотографируйте глазное дно.
- Откройте программное обеспечение для создания образов и центра развертывания Office. В программе центра развертывания Office отрегулируйте подталкивание на 5.
- Сделайте изображение OCT на расстоянии 75 мкм от ожога. Повторите для трех других квадрантов сетчатки.
- Вводят 100 мкл 1% флуоресцеина IP.
- Переключите камеру на фильтр 488 нм. Увеличьте коэффициент усиления камеры до 5.
- Сделайте снимок глазного дна ровно через 5 мин после инъекции флуоресцеина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия на глаз света камеры при максимальной настройке, так как флуоресцеин может усугубить фотоповреждения сетчатки. Держите источник света выключенным до тех пор, пока не истечет 5-минутное время ожидания и мышь не будет готова к визуализации.
3. Последующий уход
- Вводят 1 мл стерильного физиологического раствора IP. Нанесите смазочные глазные капли на оба глаза. Нанесите офтальмологическую мазь или искусственные слезы на оба глаза.
- Понаблюдайте за мышью, когда она восстанавливается после анестезии. Возвращение в клетку с другими животными только после полного выздоровления, как правило, примерно через 40 минут.
4. Оценка по критериям исключения
- Откройте снимок глазного дна, сделанный через 24 часа после процедуры, чтобы оценить критерии исключения. Исключите глаз, если определен любой из следующих критериев.
- Оцените, имеет ли изображение нулевую окклюзию
- Оцените изображение по количеству закупоренных сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная окклюзия обычно имеет некоторую фиолетовую пигментацию на ожоге или вокруг него, очень тонкий или прерывистый сосуд через ожог, слабый или несуществующий вид сосуда за пределами области ожога и обесцвечивание сетчатки от гипоксии. Если весь сосуд можно увидеть сквозь белый ожог лазером, сосуд не смог заткнуться. Иногда сосуд будет казаться частично закупоренным, но если он выглядит непрерывным за пределами ожога, сосуд, вероятно, не закрылся. - Для неоднозначных случаев используйте визуализацию ФА в то же время для оценки окклюзий. На этих изображениях окклюзия будет выглядеть как разрыв в непрерывности сосуда, часто с сужением окружающего сосуда.
- Если выявлены нулевые окклюзии, исключите глаз из анализа, так как РВО считается неэффективным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окклюзии обычно разрешаются через 48-72 ч после RVO, и наличие окклюзий больше не должно использоваться в качестве критерия исключения в эти моменты времени.
- Оцените изображение по количеству закупоренных сосудов.
- Оценка изображений глазного дна и ОКТ на предмет чрезмерной отслойки сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Накопление субретинальной жидкости распространено после индукции RVO и вызывает отделение нервной сетчатки от RPE. Исключающие критерии чрезмерной отслойки сетчатки определяются следующим образом: ОКТ либо будет полностью невидимым, либо некоторые слои будут казаться невероятно искаженными. Качество изображения низкое, с потерей разрешения внешних плексиформных и RPE слоев. Расстояние между нервной сетчаткой и сосудистой оболочкой больше, чем позволяет поле зрения OCT. На изображении глазного дна тон сетчатки будет почти полностью белым, с некоторыми фиолетовыми пятнами. Часть сетчатки может казаться искаженной и не в фокусе. Это связано с тем, что он отделился и находится на другом фокусном расстоянии, чем остальная часть сетчатки.- Если оценка изображений с глаза определяет периферическое или полное отслоение сетчатки, исключите глаз из анализа.
- Исключить изображения с признаками катаракты роговицы
ПРИМЕЧАНИЕ: Катаракта роговицы выглядит как непрозрачная белая точка на роговице мыши. Катаракта обычно возникает из-за недостаточной смазки глаз, пока животное подвергается анестезии, и его можно в значительной степени избежать, позаботившись о том, чтобы щедро наносить глазную мазь. Катаракта, как правило, может быть идентифицирована перед визуализацией путем осмотра животного. Мыши, у которых развилась катаракта, должны быть исключены из набора данных без необходимости проходить процесс визуализации. При визуализации катаракта будет скрывать сетчатку от камеры, и OCT будет казаться искривленным. - Оцените изображение на предмет чрезмерного кровоизлияния
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное кровоизлияние может быть идентифицировано как количество красной жидкости на изображении, обычно скрывающее фон сетчатки, сосуд и ожог. Эти области красной жидкости будут более яркими, непрозрачными красными, чем фиолетовые пятна, которые являются нормальными при успешном RVO. Кровоизлияния проявляются в ганглиозном клеточном слое на ВИЗУАЛИЗАЦИИ OCT и мешают способности визуализировать другие слои сетчатки под кровоизлиянием.- Если на изображении установлено чрезмерное кровоизлияние, исключите глаз из анализа.
5. Обработка изображений флуоресцеином
- Откройте флуоресцеиновое изображение в программном обеспечении для обработки изображений.
- Дублирование изображения
- Используя инструмент выделения, тщательно проследите основные сосуды.
- Основными сосудами являются более толстые вены и артерии, исходящие из диска зрительного нерва. Игнорируйте любые суда, ответвляющиеся от этих судов.
- Если утечка не позволяет контуру сосуда быть замеченным вблизи места окклюзии, проследите утечку в приблизительном месте сосуда (поддерживайте толщину, соедините последнюю видимую точку со следующей видимой точкой).
- На первом изображении удалите выделенную область, оставив только фон. Сохраните это замаскированное изображение.
- Переместите выделенную область на второе изображение, инвертируйте выделенную область и удалите, изолировав сосуды. Сохраните это замаскированное изображение.
- Откройте два изображения в ImageJ. Откройте фоновое изображение и измерьте встроенную плотность.
- Откройте изображение сосуда, выберите контур сосудов, а затем измерьте среднюю интенсивность.
- Разделите интегральную плотность фона на среднюю интенсивность сосудов, создав коэффициент утечки для глаза.
- Запишите этот коэффициент утечки для каждого глаза в экспериментальной когорте.
- Для дальнейшего контроля за фоном нормализуйте экспериментальные глаза до среднего коэффициента утечки неповрежденных контрольных глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать стандартизированную количественную оценку утечки флуоресцеина в изображении FA, этот расчет использует отношение плотности фона (где утечка будет присутствовать) с яркостью основных сосудов для создания результатов, которые контролируют изменение яркости от изображения к изображению и могут быть надежно количественно определены. Глаза, которые не повреждены, не имеют утечки и теоретически должны иметь нулевые соотношения. Таким образом, коэффициенты, рассчитанные из этих неповрежденных контрольных глаз, представляют собой фоновый шум, и это значение используется для дальнейшей нормализации экспериментальных значений.
6. Толщина слоя сетчатки
- Откройте изображение центра развертывания Office в программном обеспечении для обработки изображений.
- Проследите границы слоя ганглиозных клеток, внутреннего плексиформного слоя, внутреннего ядерного слоя, наружного плексиформного слоя, слоя фоторецепторов и слоя RPE. Измерьте среднюю толщину каждого слоя.
- Повторите для изображений OCT из трех других квадрантов сетчатки. Усредните среднюю толщину слоя по четырем квадрантам, чтобы получить среднюю толщину каждого слоя сетчатки для глаза.
- Повторить для каждого глаза в экспериментальной когорте.
7. Дезорганизация внутренних слоев сетчатки (ДРИЛ)
- Откройте изображение центра развертывания Office в ImageJ.
- С помощью инструмента «Линия» измерьте расстояние, на котором верхняя граница внешнего плексиформного слоя нечеткая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно различать DRIL и области плохой видимости слоя, вызванные артефактами визуализации. Низкое качество изображения OCT может сделать невозможным анализ DRIL, если достаточное разрешение изображения невозможно. Изображения с DRIL, как правило, имеют другие области или слои сетчатки, которые четко разрешены и организованы, что может быть хорошим показателем достаточного качества изображения.- Измерьте горизонтально от широты, где начинается дезорганизация, до широты, где верхняя граница внешнего плексиформного слоя снова становится видимой, если вообще видна. Даже если внешний плексиформный слой смещается вверх или вниз по вертикали, измеряйте идеально горизонтально.
- Может быть несколько областей дезорганизации, разделенных областями без дезорганизации. Измерьте их по отдельности и рассчитайте сумму расстояний.
- Разделите длину дезорганизации на общую длину сетчатки, видимой на каждом изображении OCT, чтобы получить соотношение дезорганизации для изображения.
- Повторите измерение и расчет для изображений OCT из трех других квадрантов сетчатки.
- Возьмем среднее значение соотношения дезорганизации из четырех изображений OCT. Это число представляет собой среднюю дезорганизацию для всей сетчатки. Повторить для каждого глаза в экспериментальной когорте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти методы анализа позволяют количественно оценить патологию сетчатки, захваченную визуализацией FA и OCT. В экспериментах, из которых извлекаются репрезентативные данные, использовали самцов мышей C57BL/6J, которые либо служили в качестве неповрежденных контрольных органов, либо проходили процедуру RVO и получали либо глазные капли Pen1-XBir3, либо глазные капли Pen1-Saline. Модель повреждения RVO включала лазерное облучение (532 нм) основных вен в каждом глазу анестезированной мыши после инъекции в хвостовую вену розовой бенгальской розы, фотоактиваторного красителя12. Три лазерных импульса были доставлены на среднем расстоянии 375 мкм от центра зрительного нерва, чтобы индуцировать фотокоагуляцию и закупорить сосуды12. Эффективное использование процедуры RVO продемонстрировано в Avrutsky et al.12, а более подробная информация об оптимизации метода RVO подробно описана в Colón Ortiz et al.13. На рисунке 1A показаны примеры изображений FA и OCT из обеих групп. Из-за изменчивого характера образования и стабилизации окклюзии через процесс фотокоагуляции могут наблюдаться различные степени повреждения. В некоторых сетчатках повреждение, вызванное процедурой RVO, приводит к офтальмологическим патологиям, которые делают изображения сетчатки непригодными для анализа. После получения изображения должны быть сначала оценены по критериям исключения, чтобы обеспечить оптимальный анализ и надежные результаты. Эти критерии исключения, описанные на рисунке 1B, включают отслоение сетчатки, кровоизлияние и катаракту. Как видно на примере изображений глазного дна и ОКТ, эти патологии препятствуют четкой ОКТ-визуализации, что делает сетчатку непригодной для анализа данных. Кроме того, возможно, что некоторые сетчатки не будут содержать стабильных окклюзий; эти изображения не точно моделируют ишемо-гипоксическое повреждение и должны быть исключены из анализа.
Разрушение гемато-сетчаточного барьера способствует патогенезу RVO14,15. Оценка количества утечек из сосудов является полезным показателем проницаемости сосудов, вызванной травмой. Визуализация FA позволяет визуализировать эту утечку, но ряд факторов, таких как различия в скорости циркуляции, влияют на необработанную интенсивность изображений FA и делают последовательную количественную оценку16,17. Наш метод контролирует эту изменчивость путем нормализации интенсивности, наблюдаемой в сетчатке, до средней интенсивности основной сосудистой системы. Это обеспечивает соотношение утечек для каждого изображения сетчатки, которое можно сравнить с другими и проанализировать. На рисунке 2А показаны маскированные изображения, используемые для этого расчета, отделяющие основную сосудистую систему от других областей сетчатки. Способность количественно оценивать флуоресцеин позволяет сравнивать тяжесть травмы и эффективность лечения, а также изучать изменения в утечке в течение времени травмы (рисунок 2B), что может быть слишком тонким эффектом, чтобы продемонстрировать только качественную отчетность.
OCT-визуализация позволяет анализировать влияние RVO на отдельные слои сетчатки и общую толщину сетчатки. На рисунке 3A показано очерчение слоев сетчатки на изображении OCT. Трассировка границ каждого слоя (рисунок 3B) позволяет провести несколько направлений анализа. Количественная оценка толщины для каждого слоя сетчатки оказывается полезной, так как начальная отечная реакция оказывает более глубокое влияние на внутренние слои сетчатки. Следы также позволяют изучать общую толщину сетчатки и проводить сегрегированный анализ внутреннего и наружного слоев сетчатки. На рисунке 3C представлен анализ временного хода повреждения RVO, где может наблюдаться начальный воспалительный отек слоев сетчатки и возможное дегенеративное истончение. Построение толщины каждого слоя с течением времени показывает различную динамику для внутреннего плексиформного и внутреннего ядерных слоев, где внутренний ядерный слой испытывает гораздо большую реакцию на первоначальную травму, но внутренний плексиформный слой демонстрирует более сильное истончение после того, как начальный отек был стабилизирован и возвращается к исходному уровню (рисунок 3D). ). Это дает более точное представление о движущих силах реагирования в разные моменты времени. Мы также проверили эффективность ингибитора каспазы в смягчении отека и защите от возможной дегенерации, причем анализ выявил различные эффекты в отдельных слоях.
Дезорганизация внутренних слоев сетчатки (DRIL) является еще одним признаком ОКТ, используемым в качестве диагностической меры ишемии при диабетической ретинопатии, а также прогностической меры остроты зрения в RVO18,19. В ОКТ-визуализации DRIL проявляется как исчезновение верхней границы наружно-плексиформного слоя12, смешивая внешний плексиформный и внутренний ядерные слои вместе (фиг.4A). На рисунке 4B показаны два примера изображений центра развертывания Office с выделенными областями DRIL. Мы выражаем DRIL как долю от общей длины сетчатки, усредненную по четырем поперечным сечениям OCT. Эта мера позволяет количественно сравнивать экспериментальные группы; На рисунке 4C представлен пример анализа, в котором дезорганизация сетчатки двух экспериментальных групп сравнивалась для исследования эффективности ингибитора в смягчении повреждения сетчатки при RVO.
Рисунок 1: Изображения, полученные с помощью флуоресцеиновой ангиографии (FA) и оптической когерентной томографии (OCT). (A) Примеры изображений FA и OCT с сетчатки через 24 ч после RVO и неповрежденных контрольных групп. (B) Визуализация глазного дна и ОКТ различных критериев исключения: чрезмерная отслойка сетчатки, кровоизлияние, катаракта роговицы и отсутствие окклюзий. Расстояние получения центра развертывания Office обозначено зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Количественная оценка утечки флуоресцеина. (A) Разделение изображения FA на сосуды и фон для анализа (B) Количественная оценка утечки флуоресцеина из глаз мышей c57BL/6J с закупоркой вен сетчатки (RVO), получавших либо 10 мг глазных капель ингибитора Pen1-XBir3 (N = 17), либо глазных капель Pen1-Saline (N = 13) через 24 ч и 48 ч после процедуры. Интенсивность считывания фонового изображения нормируется до средней интенсивности показаний по изображению сосуда. Среднее значение показаний интенсивности для мышей RVO дополнительно нормализуется для неповрежденных контрольных групп. На панелях ошибок отображается среднее значение с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка толщины слоя сетчатки на изображениях OCT. (A) Неповрежденная сетчатка с отдельными слоями сетчатки с маркировкой: Ганглиозный клеточный слой, Внутренний плексиформный слой, Внутренний ядерный слой, Внешний плексиформный слой, Слой фоторецепторов, RPE и Хориоид. (B) Пример следов слоя изображений OCT, взятых у неповрежденного контроля и 24-часовых мышей после RVO C57/BL6. (C) Количественная оценка изменения общей толщины сетчатки и интраретинальной толщины, наблюдаемого при ОКТ-визуализации сетчатки мышей C57BL/6J через 4 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 8 дней после RVO. (D) Количественная оценка изменения толщины внутренних плексиформных и внутренних ядерных слоев сетчатки мышей C57BL/6J через 24 ч, 48 ч и 8 дней после RVO для мышей C57BL/6J, получавших либо 10 мг глазных капель ингибитора Pen1-XBir3 (N = 14), либо глазных капель Pen1-Saline (N = 15) сразу после процедуры RVO и через 24 часа после RVO. На панелях ошибок отображается среднее значение с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественная оценка дезорганизации внутренних слоев сетчатки (DRIL), наблюдаемой на изображениях OCT после RVO. На изображениях OCT DRIL обозначается потерей четкого разграничения между внутренним ядерным и внешним плексиформным слоями. (A) Примеры участков сетчатки с ДРИЛ и без нее в ОКТ-визуализации. (B) Области DRIL в ОКТ-визуализации двух областей в мыши C57BL/6J через 24 ч после RVO, обозначенные белыми линиями. DRIL измеряется горизонтально по всему изображению вместо того, чтобы следовать форме сетчатки. (C) Количественная оценка доли длины сетчатки, где DRIL наблюдался через 24 ч и 48 ч после RVO для глаз мышей C57BL/6J, получавших либо 2,5 мг глазных капель ингибитора Pen1-XBir3 (N = 19), либо глазных капель Pen1-Saline (N = 21) после процедуры RVO. На панелях ошибок отображается среднее значение с SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неинвазивная визуализация сетчатки грызунов представляет собой путь для изучения патологии и разработки вмешательств. Предыдущие исследования разработали и оптимизировали мышиную модель RVO, ограничивающую изменчивость и позволяющую достоверно транслировать распространенные клинические патологии в мышиной сетчатке 5,7,13. Развитие технологии офтальмологической визуализации также позволяет использовать клинические методы визуализации in vivo, такие как FA и OCT, у экспериментальных животных, предоставляя возможность сравнивать мышиные модели с профилями заболеваний человека 6,12,15. Однако для максимизации информации, которая может быть извлечена из этих изображений, и общего трансляционного потенциала модели, существует потребность в стандартизированных, воспроизводимых и строгих количественных методах анализа изображений. Здесь мы представляем методы анализа, которые позволяют количественно представлять тяжесть повреждений, что позволяет проводить более точные и надежные сравнения между мышами и экспериментальными группами. Эти анализы включают количественную оценку утечки на изображениях FA, количественную оценку средней толщины слоя и областей DRIL на изображениях OCT.
Решающим фактором успешного анализа является качество полученных изображений. Плохо разрешенные изображения OCT могут привести к трудностям с трассировкой отдельных слоев и неспособности отличить внутреннюю дезорганизацию сетчатки от плохого качества изображения. При визуализации важно позаботиться о позиционировании мыши на платформе, гарантируя, что изображение глазного дна находится в фокусе, зрительный нерв относительно центрирован, а поперечное сечение сетчатки горизонтально по всему изображению. Постоянная смазка глаз во время анестезии животного также важна, особенно когда одно и то же животное изображено несколько дней. Недостаточная смазка может привести к катаракте роговицы, которая заслонит сетчатку и сделает ее непригодной для визуализации. Различные патологии сетчатки могут возникать при визуализации RVO, что делает изображения непригодными для анализа. К ним относятся чрезмерная отслойка сетчатки и чрезмерное кровоизлияние, которые, наряду с большим нарушением качества изображения, также представляют собой степень повреждения, которая слишком серьезна для использования в качестве модели RVO. Кроме того, все закупоренные сосуды могут полностью отдохнуть вскоре после травмы, что не будет точно моделировать повреждение RVO и должно использоваться в качестве критерия исключения. Тем не менее, важно отметить, что успешные окклюзии естественным образом разрешаются через 48-72 ч после травмы, а наличие окклюзий в качестве критерия исключения лучше всего использовать через 24 часа после процедуры или до нее. Colón Ortiz et al.13 подробно описывают лучшие практики по ограничению изменчивости и калибровке травм в оптимизированной модели для процедуры RVO. Идентификация и суждение о критериях исключения также является важным шагом к анализу изображений. Поскольку это в значительной степени зависит от усмотрения оценщика, важно, чтобы оценщики были слепы к группам лечения и практиковали последовательность в суждении о тяжести патологии. Существуют некоторые ограничения в применении этих методов, особенно в практике визуализации одной и той же мыши в нескольких точках времени. Существует предел частоты, с которой мышь может быть анестезирована для визуализации, что требует тестирования и корректировки временных точек для определения оптимального хода времени. В наших исследованиях используются точки времени визуализации через 4 ч, 24 ч, 48 ч и 8 дней, которые, как мы обнаружили, захватывают стадии первоначальной травмы, острой воспалительной реакции и долгосрочной травмы12. Кроме того, некоторые штаммы мышей более склонны к развитию катаракты роговицы, к которым относятся различные диабетические мышиные модели, что может привести к большому количеству исключений или неполным временным курсам20,21. Исследования, использующие такие линии мышей, возможно, потребуют адаптации размера экспериментальной группы или временных точек визуализации в зависимости от чувствительности роговицы.
Флуоресцеиновая ангиография в значительной степени использовалась качественно для наблюдения и оценки патологий сетчатки, таких как утечка, а также паттернов измененного кровотока RVO6. В последнее время были предприняты усилия по разработке количественного анализа ФА на животных моделях, таких как расчет сосудистой области и извилистости16 и линейный регрессионный анализ темпоральности интенсивности изображения17. Сегментация крупных сосудов от фона глазного дна ранее использовалась, но в пиксельном анализе динамики заполнения и распада, свидетельствующего о вариабельности интенсивности изображения у разных мышей17. Кроме того, потенциал смещения был отмечен при интерпретации флуоресцеинового объединения17. Количественный метод, обсуждаемый здесь, нацелен на утечку флуоресцеина из основной сосудистой системы сетчатки, что свидетельствует о распаде BRB, который, как было показано, играет роль в повреждении RVO 11,12,14. Альтернативный анализ утечки количественно определяет утечку красителя на плоских креплениях22 сетчатки. Тем не менее, инвазивные посмертные анализы менее подходят для изучения временной шкалы повреждения RVO в пределах одной мыши, где утечка изучается в нескольких временных точках. Анализы области утечки флуоресцеина на разных стадиях заболевания сетчатки ранее использовались в клинических исследованиях и коррелировали с другими наблюдаемыми патологиями заболевания23. Этот метод позволяет аналогичным образом использовать изображения FA для изучения утечки в сосуде in vivo, что позволяет изучать динамику утечки в течение временной шкалы повреждения RVO. Поскольку выбор области утечки зависит от выбора региона оценщиком, он потенциально вносит большую степень изменчивости через субъективность. Кроме того, поскольку исследования модели повреждения RVO, обсуждаемые здесь, исследуют утечку по всей сетчатке, мы вместо этого решили использовать метод маскировки для расчета. Этот метод утечки отражает аспект повреждения RVO, отличный от тех, которые были выявлены анализом трассировки слоев DRIL и OCT, и корреляция с этими показателями позволяет создать более точный профиль заболевания.
Представлены два метода оценки изображений центра развертывания Office. Острое воспаление и последующая дегенерация слоев сетчатки является отличительной чертой повреждения РВО 6,12. Методология трассировки слоев OCT, подробно описанная здесь, позволяет точно изучить отдельные слои и выявить более тонкие эффекты и различия в динамике в разных областях сетчатки. Этот метод анализа основан на других широко используемых протоколах для количественной оценки толщины слоя сетчатки в OCT-визуализации. Этот метод учитывает различия между протоколами в области, используемой для оценки толщины слоя, а также количество измерений, выполненных на изображении11. Поскольку истончение не является однородным в пределах каждого слоя сетчатки, методы, использующие меньшее количество точечных измерений, вряд ли дадут полную картину последствий травмы. Мета-анализ нескольких стратегий измерения толщины слоя сетчатки показал, что протоколы, усредненные по большим областям изображения OCT, показали более высокую корреляцию с тяжестью заболевания, а также большую повторяемость11. Усредняя по всему изображению, этот метод захватывает более точное представление об истончении сетчатки, присутствующем при долгосрочном повреждении RVO. Исследования также различаются с точки зрения местоположения, где делаются изображения OCT - многие исследования сосредоточены на визуализации зрительного нерва. Напротив, представленный метод центрируется относительно окклюзий. Недавним событием в анализе изображений ЧЕЛОВЕКА OCT является использование алгоритмов машинного обучения для классификации и количественной оценки функций24. Такой анализ может стать многообещающим будущим направлением для анализа визуализации сетчатки животных.
Кроме того, мы представляем перевод DRIL, клинической меры капиллярной ишемии, в модель грызунов. Было обнаружено, что у людей DRIL является предиктором потери остроты зрения и различий в толщине сетчатки и демонстрирует высокую диагностическую чувствительность и специфичность18,19. Количественная оценка DRIL у мышей путем измерения доли дезорганизованной сетчатки показала корреляцию с фракцией закупоренных вен, амплитудой волны ERG b через 7 дней после RVO и истончением сетчатки через 8 дней после RVO12. Альтернативой измерению DRIL является использование HYPOX-4 для измерения гипоксии сетчатки и ишемического повреждения. HYPOX-4 присоединяется к пимонидазолу аниме гидрохлориду, маркеру гипоксии, с флуоресцентным зондом для обнаружения гипоксии сетчатки25. Большинство протоколов, использующих HYPOX-4, являются инвазивными и требуют анализа плоского крепления сетчатки, который может быть менее подходящим для построения временных шкал травм, хотя протокол визуализации in vivo с использованием зонда HYPOX-4 недавно был опробован25. Анализ DRIL также полезен для быстрого считывания повреждений сетчатки, поскольку одиночные измерения в каждом изображении OCT более эффективны по времени, чем анализы, такие как трассировка слоя сетчатки. Однако следует отметить, что эти меры не являются взаимозаменяемыми и выявляют различные патологии сетчатки. Скорее, они должны использоваться согласованно, где DRIL может быть использован в качестве начального показания для размера эффекта или эффективности вмешательства, а трассировка слоев может быть впоследствии использована для тщательного анализа более тонких эффектов в слоях сетчатки.
Эти методы носят ортогональный характер, что позволяет создать профиль заболевания для каждого подопытного. Поскольку патологии, о которых сообщает каждый из этих методов, различны, они не гарантируют пропорционального масштабирования, и получение более целостной картины патологии позволит более тщательно исследовать различные конфигурации проявления повреждения RVO. Способность максимизировать объем информации, которая может быть извлечена из визуализации каждого экспериментального животного, уменьшит количество животных, необходимых для того, чтобы сделать существенные выводы, повышая эффективность экспериментального процесса. Применение этих методов к недавно усовершенствованным протоколам RVO позволяет повысить воспроизводимость и изучить трансляцию клинических фенотипов на животные модели. Помимо изучения моделей RVO, использование этих методов имеет применение к другим моделям заболеваний сетчатки, которые используют визуализацию FA и OCT. Примеры таких моделей мышей включают модели для возрастного макулярного отека (AMD)26, диабетического макулярного отека (DME)23, хориоидальной неоваскуляризации (CNV)27, экспериментального аутоиммунного увеоретинита (EAU)28 и ретинопатии недоношенных (ROP)15. Эти методы могут быть дополнительно обобщены для исследований с использованием визуализации FA и OCT при изучении моделей этих заболеваний у других видов. Эти количественные оценки также чувствительны к более тонким изменениям в механизме заболевания, что делает их полезными при оценке эффективности лечения, например, на рисунке 3D и рисунке 4C. Полезность также распространяется на использование визуализации в тестировании токсичности в исследованиях переносимости лекарственных соединений. Стандартизация и воспроизводимость этих протоколов анализа могут служить улучшению трансляционной валидности животных моделей и расширению нашего понимания патогенеза и патофизиологии ретиноваскулярного заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом DGE - 1644869 (CKCO), Национальным институтом глаз (NEI) 5T32EY013933 (для AMP), Национальным институтом глаз (NEI) 5T32EY013933 (для AMP), Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (RO1 NS081333, R03 NS099920 для CMT) и Министерством обороны армии / военно-воздушных сил (DURIP to CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
