Summary
Ici, nous présentons trois protocoles d’analyse de données pour les images d’angiographie à la fluorescéine (AF) et de tomographie par cohérence optique (OCT) dans l’étude de l’occlusion veineuse rétinienne (OVR).
Abstract
Les progrès réalisés dans les outils d’imagerie ophtalmique offrent un niveau d’accès sans précédent aux chercheurs travaillant avec des modèles animaux de lésions neurovasculaires. Pour tirer correctement parti de cette plus grande traduisibilité, il est nécessaire de concevoir des méthodes reproductibles pour tirer des données quantitatives de ces images. L’imagerie par tomographie par cohérence optique (TCO) peut résoudre l’histologie rétinienne à une résolution micrométrique et révéler des différences fonctionnelles dans le flux sanguin vasculaire. Ici, nous décrivons des lectures vasculaires non invasives que nous utilisons pour caractériser les dommages pathologiques post-agression vasculaire dans un modèle murin optimisé d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ces lectures comprennent l’analyse par imagerie en direct de la morphologie rétinienne, la désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL) mesure de l’ischémie capillaire et les mesures d’angiographie à la fluorescéine de l’œdème rétinien et de la densité vasculaire. Ces techniques correspondent directement à celles utilisées pour examiner les patients atteints de maladie de la rétine en clinique. La normalisation de ces méthodes permet une comparaison directe et reproductible de modèles animaux avec des phénotypes cliniques de maladies ophtalmiques, augmentant ainsi le pouvoir translationnel des modèles de lésions vasculaires.
Introduction
Les maladies neurovasculaires sont un problème de santé majeur responsable des accidents vasculaires cérébraux ischémiques, l’une des principales causes de mortalité et de morbidité, et des maladies vasculaires rétiniennes entraînant une perte de vision 1,2. Pour modéliser la maladie neurovasculaire, nous utilisons un modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ce modèle est non invasif et utilise des techniques d’imagerie in vivo similaires à celles utilisées pour examiner les personnes atteintes d’une maladie vasculaire rétinienne en milieu clinique. L’utilisation de ce modèle augmente donc le potentiel translationnel des études utilisant ce modèle. Comme pour tous les modèles de souris, il est essentiel de maximiser la reproductibilité du modèle.
Les maladies vasculaires rétiniennes sont une cause majeure de perte de vision chez les personnes de moins de 70 ans. La RVO est la deuxième maladie vasculaire rétinienne la plus fréquente après la rétinopathie diabétique3. Les caractéristiques cliniques caractéristiques de la RVO comprennent une lésion ischémique, un œdème rétinien et une perte de vision à la suite d’une perte neuronale 3,4. Des modèles murins de RVO utilisant la photocoagulation laser des principaux vaisseaux ont été développés et affinés pour reproduire les principales pathologies cliniques observées chez l’homme RVO 5,6,7. Les progrès de l’imagerie ophtalmique permettent également la reproduction d’outils de diagnostic non invasifs utilisés chez l’homme, à savoir l’angiographie à la fluorescéine (AF) et la tomographie par cohérence optique (OCT)6. L’angiographie à la fluorescéine permet d’observer les fuites dues à la rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) ainsi que la dynamique du flux sanguin dans la rétine, y compris les sites d’occlusion, en utilisant l’injection de fluorescéine, un petit colorant fluorescent 8,9. L’imagerie OCT permet l’acquisition d’images transversales haute résolution de la rétine et l’étude de l’épaisseur et de l’organisation des couches rétiniennes10. L’analyse des images FA a toujours été largement qualitative, ce qui limite le potentiel de comparaison directe et reproductible entre les études. Récemment, un certain nombre de méthodes ont été développées pour la quantification de l’épaisseur de couche en imagerie OCT, bien qu’il n’existe actuellement aucun protocole d’analyse normalisé et que le site d’acquisition d’images OCT varie11. Afin de tirer correctement parti de ces outils, une méthodologie d’analyse des données normalisée, quantitative et reproductible est nécessaire. Dans cet article, nous présentons trois lectures vasculaires utilisées pour évaluer les dommages pathologiques dans un modèle murin de fuite de fluorescéine RVO, d’épaisseur de couche OCT et de désorganisation des couches rétiniennes.
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Protocol
Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.
REMARQUE : L’imagerie a été effectuée sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 2 mois qui pesaient environ 23 g.
1. Préparation des réactifs pour l’imagerie rétinienne
- Préparation d’une solution injectable de fluorescéine.
REMARQUE: La fluorescéine est très sensible à la lumière. Protéger de la lumière et l’utiliser peu de temps après la préparation.- Diluer la fluorescéine à une concentration de 1% dans une solution saline stérile.
- Préparation de kétamine/xylazine
- Diluer la kétamine et la xylazine dans une solution saline stérile en conséquence pour obtenir la concentration suivante : kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg).
- Solution saline stérile
- Préparez une seringue de 5 mL avec une aiguille de 26 G avec une solution saline stérile.
2. Imagerie OCT et fluorescéine
- Allumez le caisson lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil OCT et la plate-forme de souris chauffée.
- Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie.
- Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide à chaque œil.
- Injecter 150 μL d’anesthésie (kétamine (80-100 mg / kg) et xylazine (5-10 mg / kg)) par voie intrapéritonéale (IP). Déterminez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils et attendez que l’animal ne réponde plus. Appliquez une pommade ophtalmique ou des larmes artificielles sur les deux yeux.
- Accueillez la souris sur la plate-forme.
- Ajustez la hauteur et l’angle de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette. Prenez une photo du fond d’œil.
- Ouvrez le logiciel d’imagerie et d’OPO. Dans le programme de l’OPO, réglez nudge sur 5.
- Prenez une image OCT à 75 μm distale de la brûlure. Répétez l’opération pour les trois autres quadrants de la rétine.
- Injecter 100 μL de fluorescéine IP à 1%.
- Basculez la caméra sur un filtre de 488 nm. Augmentez le gain de la caméra à 5.
- Prenez une photo du fond d’œil exactement 5 min après l’injection de fluorescéine.
REMARQUE: Évitez l’exposition prolongée de l’œil à la lumière de l’appareil photo au réglage maximal, car la fluorescéine peut exacerber les photodommages rétiniens. Gardez la source lumineuse éteinte jusqu’à ce que le temps d’attente de 5 minutes soit écoulé et que la souris soit prête pour l’imagerie.
3. Suivi
- Injecter 1 mL de solution saline IP stérile. Appliquez des gouttes ophtalmiques lubrifiantes sur les deux yeux. Appliquez une pommade ophtalmique ou des larmes artificielles sur les deux yeux.
- Observez la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie. Ne retournez à la cage avec d’autres animaux que lorsqu’ils sont complètement rétablis, généralement après environ 40 minutes.
4. Appréciation des critères d’exclusion
- Ouvrez l’image du fond d’œil prise 24 heures après la procédure pour évaluer les critères d’exclusion. Exclure l’œil si l’un des critères suivants est identifié.
- Évaluer si l’image n’a aucune occlusion
- Évaluez l’image pour le nombre de vaisseaux occlus.
REMARQUE: Une occlusion réussie a généralement une pigmentation pourpre sur ou autour de la brûlure, un vaisseau très mince ou discontinu à travers la brûlure, une apparence de vaisseau faible ou inexistant à l’extérieur de la zone de brûlure et une décoloration rétinienne due à l’hypoxie. Si le vaisseau entier peut être vu à travers la brûlure blanche par le laser, le vaisseau n’a pas réussi à s’obstruer. Parfois, le vaisseau semblera partiellement obstrué, mais s’il semble ininterrompu à l’extérieur de la brûlure, le vaisseau ne s’est probablement pas obstrué. - Pour les cas ambigus, utilisez l’imagerie FA au même moment pour évaluer les occlusions. Dans ces images, une occlusion apparaîtra comme une rupture dans la continuité d’un vaisseau, souvent avec un effilement du vaisseau environnant.
- Si aucune occlusion n’est identifiée, exclure l’œil de l’analyse, car l’ORV est considéré comme inefficace.
REMARQUE : Les occlusions disparaissent généralement 48 à 72 h après l’OVR, et la présence d’occlusions ne doit plus être utilisée comme critère d’exclusion à ces moments.
- Évaluez l’image pour le nombre de vaisseaux occlus.
- Évaluer les images du fond d’œil et de la TCO pour détecter un décollement excessif de la rétine
REMARQUE: L’accumulation de liquide sous-rétinien est fréquente après l’induction de l’OVR et provoque la séparation de la rétine neurale de l’EPR. Les critères d’exclusion pour un décollement excessif de la rétine sont définis comme suit : soit la TCO sera complètement invisible, soit certaines couches apparaîtront incroyablement déformées. La qualité d’image est médiocre, avec une perte de résolution des couches plexiformes et RPE extérieures. La séparation entre la rétine neurale et la choroïde est plus grande que ce que permet le champ de vision OCT. Sur l’image du fond d’œil, le ton de la rétine sera presque complètement blanc, avec quelques taches violettes. Une partie de la rétine peut sembler déformée et floue. C’est parce qu’il s’est détaché et est à une distance focale différente du reste de la rétine.- Si l’évaluation des images d’un œil détermine un décollement périphérique ou complet de la rétine, exclure l’œil de l’analyse.
- Exclure les images présentant des signes de cataracte cornéenne
REMARQUE: Une cataracte cornéenne apparaît comme un point blanc opaque sur la cornée de la souris. La cataracte survient généralement en raison d’une lubrification insuffisante des yeux pendant que l’animal est anesthésié et peut être largement évitée en prenant soin d’appliquer généreusement une pommade pour les yeux. La cataracte peut généralement être identifiée avant l’imagerie en inspectant l’animal. Les souris qui ont développé des cataractes doivent être exclues de l’ensemble de données sans avoir besoin de subir le processus d’imagerie. En imagerie, les cataractes masqueront la rétine de la caméra et l’OCT apparaîtra déformé. - Évaluer l’image pour une hémorragie excessive
REMARQUE: Une hémorragie excessive peut être identifiée comme des quantités de liquide rouge dans l’image, masquant généralement l’arrière-plan rétinien, le vaisseau et la brûlure. Ces zones de liquide rouge seront d’un rouge plus vif et plus opaque que les taches violettes qui sont normales dans une OVR réussie. Les hémorragies apparaissent au niveau de la couche de cellules ganglionnaires sur l’imagerie OCT et interfèrent avec la capacité de visualiser d’autres couches rétiniennes sous l’hémorragie.- S’il est déterminé que l’image présente une hémorragie excessive, exclure l’œil de l’analyse.
5. Traitement d’image à la fluorescéine
- Ouvrez l’image de fluorescéine dans le logiciel de traitement d’image.
- Dupliquer l’image
- À l’aide d’un outil de sélection, tracez soigneusement les principaux navires.
- Les principaux vaisseaux sont les veines et les artères les plus épaisses rayonnant du disque optique. Ignorez tous les navires qui se ramifient à partir de ces navires.
- Si une fuite empêche le contour du navire d’être vu près du site d’occlusion, tracer à travers la fuite à l’emplacement approximatif du récipient (maintenir l’épaisseur, relier le dernier point visible au point visible suivant).
- Dans la première image, supprimez la sélection, en ne laissant que l’arrière-plan. Enregistrez cette image masquée.
- Déplacez la sélection vers la deuxième image, inversez la sélection et supprimez-la, isolant ainsi les vaisseaux. Enregistrez cette image masquée.
- Ouvrez les deux images dans ImageJ. Ouvrez l’image d’arrière-plan et mesurez la densité intégrée.
- Ouvrez l’image du navire, sélectionnez le contour des vaisseaux, puis mesurez l’intensité moyenne.
- Diviser la densité intégrée du bruit de fond par l’intensité moyenne des vaisseaux, générant le rapport de fuite pour l’œil.
- Notez ce rapport de fuite pour chaque œil dans une cohorte expérimentale.
- Pour mieux contrôler le bruit de fond, normaliser les yeux expérimentaux au rapport de fuite moyen des yeux témoins non blessés.
REMARQUE: Afin de créer une quantification normalisée de la fuite de fluorescéine dans l’image FA, ce calcul utilise un rapport entre la densité de fond (où la fuite sera présente) et la luminosité des principaux récipients pour créer des résultats qui contrôlent la variation de luminosité d’une image à l’autre et peuvent être quantifiés de manière fiable. Les yeux qui ne sont pas endommagés n’ont pas de fuite et devraient théoriquement avoir des rapports de zéro. Les rapports calculés à partir de ces yeux témoins non endommagés représentent donc le bruit de fond, et cette valeur est utilisée pour normaliser davantage les valeurs expérimentales.
6. Épaisseur de la couche rétinienne
- Ouvrez l’image de l’OPO dans le logiciel de traitement d’image.
- Tracez les bordures de la couche de cellules ganglionnaires, de la couche plexiforme interne, de la couche nucléaire interne, de la couche plexiforme externe, de la couche photoréceptrice et de la couche RPE. Mesurez l’épaisseur moyenne de chaque couche.
- Répétez l’opération pour les images OCT des trois autres quadrants de la rétine. Faire la moyenne des épaisseurs moyennes des couches dans les quatre quadrants pour obtenir l’épaisseur moyenne de chaque couche rétinienne pour l’œil.
- Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.
7. Désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL)
- Ouvrez l’image de l’OPO dans ImageJ.
- À l’aide de l’outil de ligne, mesurez la distance où la bordure supérieure de la couche plexiforme externe est indistincte.
REMARQUE : Il est important de faire la différence entre les DRIL et les zones de mauvaise visibilité des couches causées par les artefacts d’imagerie. Une mauvaise qualité d’image de la TCO peut invalider un œil pour l’analyse DRIL si une résolution d’image suffisante n’est pas possible. Les images avec DRIL auront généralement d’autres régions ou couches rétiniennes qui sont clairement résolues et organisées, ce qui peut être un bon indicateur d’une qualité d’image suffisante.- Mesurer horizontalement à partir de la latitude où la désorganisation commence jusqu’à la latitude où le bord supérieur de la couche plexiforme externe redevient visible, le cas échéant. Même si la couche plexiforme extérieure se déplace verticalement vers le haut ou vers le bas, mesurez parfaitement horizontalement.
- Il peut y avoir plusieurs zones de désorganisation séparées par des zones sans désorganisation. Mesurez-les individuellement et calculez la somme des distances.
- Divisez la longueur de désorganisation par la longueur totale de la rétine visible dans chaque image OCT pour obtenir le rapport de désorganisation de l’image.
- Répétez la mesure et le calcul pour les images OCT des trois autres quadrants de la rétine.
- Prenons la moyenne des ratios de désorganisation des quatre images OCT. Ce nombre représente la désorganisation moyenne pour l’ensemble de la rétine. Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.
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Representative Results
Ces méthodes d’analyse permettent de quantifier la pathologie rétinienne capturée par imagerie FA et OCT. Les expériences dont les données représentatives sont extraites ont utilisé des souris mâles C57BL / 6J qui ont servi de témoins non blessés ou ont subi la procédure RVO et ont reçu soit des gouttes ophtalmiques de traitement Pen1-XBir3, soit des gouttes ophtalmiques pour véhicules Pen1-Saline. Le modèle de lésion RVO impliquait l’irradiation laser (532 nm) des veines principales de chaque œil d’une souris anesthésiée à la suite d’une injection de veine de queue de rose bengal, un colorant photoactivateur12. Trois impulsions laser ont été délivrées à une distance moyenne de 375 μm du centre du nerf optique pour induire la photocoagulation et obstruer les vaisseaux12. L’utilisation efficace de la procédure RVO est démontrée dans Avrutsky et al.12, et d’autres détails sur l’optimisation de la méthode RVO sont détaillés dans Colón Ortiz et al.13. La figure 1A montre des exemples d’images FA et OCT des deux groupes. En raison de la nature variable de la formation et de la stabilisation de l’occlusion par le processus de photocoagulation, différents degrés de dommages peuvent être observés. Dans certaines rétines, les dommages induits par la procédure RVO introduisent des pathologies ophtalmiques qui rendent les images rétiniennes impropres à l’analyse. Après l’acquisition, les images doivent d’abord être évaluées pour les critères d’exclusion afin d’assurer une analyse optimale et des résultats fiables. Ces critères d’exclusion, décrits à la figure 1B, comprennent le décollement de la rétine, l’hémorragie et la cataracte. Comme on peut l’observer dans l’exemple des images du fond d’œil et de l’OCT, ces pathologies empêchent une imagerie OCT claire, rendant les rétines impropres à l’analyse des données. De plus, il est possible que certaines rétines ne contiennent pas d’occlusions stables; Ces images ne modélisent pas avec précision les dommages ischémiques-hypoxiques et doivent être exclues de l’analyse.
La dégradation de la barrière hémato-rétinienne contribue à la pathogenèse de RVO14,15. L’évaluation de la quantité de fuites des navires est un indicateur utile de la perméabilité des navires induite par les blessures. L’imagerie FA permet de visualiser cette fuite, mais un certain nombre de facteurs, tels que les différences dans le taux de circulation, affectent l’intensité brute des images FA et rendent la quantification cohérente16,17. Notre méthode contrôle cette variabilité en normalisant l’intensité observée dans la rétine à l’intensité moyenne du système vasculaire majeur. Cela fournit un ratio de fuite pour chaque image rétinienne qui peut être comparé à d’autres et analysé. La figure 2A montre les images masquées utilisées pour ce calcul, séparant le système vasculaire majeur des autres zones de la rétine. La capacité de quantifier la fluorescéine permet de comparer la gravité des blessures et l’efficacité du traitement, ainsi que d’étudier les changements dans les fuites au cours de la période de la blessure (figure 2B), ce qui peut être un effet trop subtil pour être démontré uniquement par des rapports qualitatifs.
L’imagerie OCT permet d’analyser l’impact de la RVO sur les couches rétiniennes individuelles et l’épaisseur rétinienne globale. La figure 3A montre une délimitation des couches de la rétine dans une image OCT. Le traçage des limites de chaque couche (figure 3B) permet plusieurs pistes d’analyse. La quantification de l’épaisseur de chaque couche rétinienne s’avère utile, car la réponse œdémateuse initiale a un effet plus profond sur les couches internes de la rétine. Les traces permettent également d’étudier l’épaisseur totale de la rétine et d’analyser séparément les couches rétiniennes internes et externes. La figure 3C fournit une analyse de l’évolution temporelle des dommages causés par la RVO, où le gonflement inflammatoire initial des couches rétiniennes et l’amincissement dégénératif éventuel peuvent être observés. Le tracé de l’épaisseur de chaque couche au fil du temps révèle une dynamique différente pour les couches plexiformes internes et nucléaires internes, où la couche nucléaire interne subit une réponse beaucoup plus importante à la blessure initiale, mais la couche plexiforme interne présente un amincissement plus sévère après que l’œdème initial a été stabilisé et revient à la ligne de base (Figure 3D ). Cela permet une compréhension plus précise des facteurs de réponse à différents moments. Nous avons également testé l’efficacité d’un inhibiteur de caspase pour atténuer l’enflure et protéger contre une éventuelle dégénérescence, l’analyse révélant différents effets dans les couches individuelles.
La désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL) est une autre caractéristique de la TCO utilisée comme mesure diagnostique de l’ischémie dans la rétinopathie diabétique, ainsi que comme mesure prédictive de l’acuité visuelle dans RVO18,19. En imagerie OCT, DRIL se manifeste par une disparition de la limite supérieure de la couche plexiforme externe12, mélangeant les couches plexiformes externes et nucléaires internes (Figure 4A). La figure 4B montre deux exemples d’images de l’OCO avec des zones de DRIL mises en évidence. Nous exprimons DRIL en proportion de la longueur totale de la rétine, en moyenne sur quatre sections transversales OCT. Cette mesure nous permet de comparer quantitativement les groupes expérimentaux; La figure 4C présente un exemple d’analyse, où la désorganisation rétinienne de deux groupes expérimentaux a été comparée pour étudier l’efficacité d’un inhibiteur dans l’atténuation des dommages rétiniens dans l’OVR.
Figure 1 : Images obtenues à partir de l’angiographie à la fluorescéine (AF) et de la tomographie par cohérence optique (OCT). (A) Exemples d’images FA et OCT provenant de rétines 24 heures après la RVO et de témoins non blessés. (B) Imagerie du fond d’œil et de la TOC des différents critères d’exclusion : décollement excessif de la rétine, hémorragie, cataracte cornéenne et absence d’occlusions. La distance d’acquisition de PTOM est indiquée par la ligne directrice verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification des fuites de fluorescéine. (A) Séparation de l’image FA dans les vaisseaux et le contexte pour l’analyse (B) Quantification des fuites de fluorescéine des yeux de souris C57BL/6J obcluses de la veine rétinienne (OVR) recevant soit 10 mg de gouttes ophtalmiques inhibitrices de Pen1-XBir3 (N = 17) ou de collyres pour véhicules Pen1-Saline (N = 13) 24 h et 48 heures après l’intervention. La lecture de l’intensité de l’image d’arrière-plan est normalisée à la lecture de l’intensité moyenne de l’image du navire. La moyenne de la lecture de l’intensité pour les souris RVO est ensuite normalisée pour les témoins non blessés. Les barres d’erreur indiquent la moyenne avec SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification de l’épaisseur de la couche rétinienne dans les images OCT. (A) Rétine non blessée avec les couches rétiniennes individuelles marquées: couche de cellules ganglionnaires, couche plexiforme interne, couche nucléaire interne, couche plexiforme externe, couche photoréceptrice, EPR et choroïde. (B) Exemple de traces de couches d’images OCT prises sur des souris témoins non blessées et 24 h après RVO C57/BL6. (C) Quantification de la variation de l’épaisseur totale de la rétine et de l’épaisseur intrarétinienne observée dans l’imagerie OCT des rétines de souris C57BL/6J à 4 h, 24 h, 48 h, 72 h et 8 jours après l’OVR. (D) Quantification du changement d’épaisseur dans les couches plexiformes internes et nucléaires internes des rétines de souris C57BL/6J à 24 heures, 48 h et 8 jours après la RVO pour les souris C57BL/6J recevant soit 10 mg de gouttes ophtalmiques inhibitrices de Pen1-XBir3 (N = 14) ou de collyres pour véhicules Pen1-Saline (N = 15) immédiatement après la procédure RVO et 24 heures après l’OVR. Les barres d’erreur indiquent la moyenne avec SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Quantification de la désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL) observée dans les images OCT post-RVO. Dans les images OCT, DRIL est indiqué par la perte d’une délimitation claire entre les couches nucléaires internes et plexiformes externes. (A) Exemples de coupes de la rétine avec et sans DRIL en imagerie OCT. (B) Aires de DRIL dans l’imagerie OCT de deux régions chez une souris C57BL/6J 24 h après l’OVR, indiquées par des lignes blanches. DRIL est mesuré horizontalement sur l’image au lieu de suivre la forme de la rétine. (C) Quantification de la proportion de la longueur rétinienne où le DRIL a été observé à 24 h et 48 h après la RVO pour les yeux de souris C57BL/6J recevant soit 2,5 mg de collyre inhibiteur de Pen1-XBir3 (N = 19) ou de collyre de véhicule Pen1-Saline (N = 21) après la procédure RVO. Les barres d’erreur indiquent la moyenne avec SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’imagerie rétinienne non invasive des rongeurs offre une avenue pour étudier la pathologie et développer des interventions. Des études antérieures ont développé et optimisé un modèle murin d’OVR, limitant la variabilité et permettant une traduction fiable des pathologies cliniques courantes dans la rétine murine 5,7,13. Les progrès de la technologie d’imagerie ophtalmique permettent en outre l’utilisation de techniques d’imagerie clinique in vivo telles que l’AF et l’OCT chez les animaux de laboratoire, ce qui permet de comparer des modèles murins avec des profils de maladies humaines 6,12,15. Cependant, pour maximiser l’information qui peut être extraite de ces images et le potentiel translationnel global du modèle, il est nécessaire de disposer de méthodes quantitatives normalisées, reproductibles et rigoureuses pour analyser les images. Nous présentons ici des méthodes d’analyse qui permettent des représentations quantitatives de la gravité des dommages, permettant des comparaisons plus précises et fiables entre les souris et entre les groupes expérimentaux. Ces analyses comprennent la quantification des fuites dans les images FA, la quantification de l’épaisseur moyenne de la couche et les zones de DRIL dans les images OCT.
Un facteur critique pour une analyse réussie réside dans la qualité des images acquises. Des images OCT mal résolues peuvent entraîner des difficultés à tracer des couches individuelles et une incapacité à distinguer la désorganisation rétinienne interne de la mauvaise qualité d’image. Lors de l’imagerie, il est important de faire attention au positionnement de la souris sur la plate-forme, en veillant à ce que l’image du fond d’œil soit nette, que le nerf optique soit relativement centré et que la section transversale de la rétine soit horizontale sur l’image. Une lubrification constante des yeux pendant que l’animal est anesthésié est également importante, surtout lorsque le même animal est photographié plusieurs jours. Une lubrification insuffisante peut entraîner des cataractes cornéennes, ce qui obscurcira la rétine et la rendra impropre à l’imagerie. Diverses pathologies rétiniennes peuvent survenir en imagerie RCO, rendant les images impropres à l’analyse. Il s’agit notamment d’un décollement excessif de la rétine et d’une hémorragie excessive qui, en plus de compromettre considérablement la qualité de l’imagerie, représentent également un degré de dommage trop grave pour être utilisé comme modèle d’OVR. Il est également possible que tous les navires obstrués repraient complètement leur perfuser peu de temps après la blessure, ce qui ne permettra pas de modéliser avec précision les dommages causés par la RVO et devrait être utilisé comme critère d’exclusion. Cependant, il est important de noter que les occlusions réussies disparaîtront naturellement 48 à 72 heures après la blessure, et la présence d’occlusions comme critère d’exclusion est mieux utilisée au plus tard 24 heures après l’intervention. Colón Ortiz et al.13 détaillent les meilleures pratiques pour limiter la variabilité et calibrer les blessures dans un modèle optimisé pour la procédure RVO. L’identification et le jugement des critères d’exclusion est également une étape critique de l’analyse d’images. Comme cela dépend en grande partie de la discrétion de l’évaluateur, il est important que les évaluateurs soient aveuglés par les groupes de traitement et pratiquent la cohérence dans le jugement de la gravité de la pathologie. Certaines limites dans l’application de ces méthodes existent, en particulier dans la pratique de l’imagerie de la même souris à plusieurs moments donnés. Il y a une limite à la fréquence à laquelle une souris peut être anesthésiée pour l’imagerie, ce qui nécessite le test et l’ajustement des points temporels pour déterminer le cours temporel optimal. Nos études utilisent des points temporels d’imagerie à 4 h, 24 h, 48 h et 8 jours, ce que nous avons trouvé des stades de capture de la lésion initiale, de la réponse inflammatoire aiguë et de la blessure à plus long terme12. De plus, certaines souches de souris sont plus sujettes au développement de cataractes cornéennes, qui comprennent divers modèles de souris diabétiques, ce qui peut entraîner un grand nombre d’exclusions ou des cours incomplets20,21. Les études utilisant de telles lignées de souris peuvent avoir besoin d’adapter la taille du groupe expérimental ou les points temporels d’imagerie en fonction de la sensibilité de la cornée.
L’imagerie angiographie à la fluorescéine a été largement utilisée qualitativement pour observer et classer les pathologies rétiniennes telles que les fuites, ainsi que les modèles de flux sanguin altérés RVO6. Récemment, des efforts ont été déployés pour développer une analyse quantitative de l’AF dans des modèles animaux, comme le calcul de l’aire vasculaire et de la tortuosité16 et l’analyse de régression linéaire de la temporalité de l’intensité de l’image17. La segmentation des principaux vaisseaux à partir du fond du fond d’œil a déjà été utilisée, mais dans une analyse en pixels de la dynamique de remplissage et de désintégration, témoignant de la variabilité de l’intensité de l’image chez différentes souris17. De plus, le potentiel de biais a été noté dans l’interprétation de la mise en commun de la fluorescéine17. La méthode quantitative discutée ici cible la fuite de fluorescéine du système vasculaire rétinien majeur, ce qui indique la dégradation du BRB, dont il a été démontré qu’elle joue un rôle dans les lésions RVO11,12,14. Une analyse alternative des fuites quantifie les fuites de colorant sur les supports plats rétiniens22. Cependant, les analyses post-mortem invasives sont moins appropriées pour les études de la chronologie des lésions causées par la RVO chez une seule souris, où la fuite est étudiée à plusieurs moments. Les analyses de la zone de fuite de fluorescéine à différents stades de la maladie rétinienne ont déjà été utilisées dans des études cliniques et corrélées avec d’autres pathologies de la maladie observées23. Cette méthode permet d’exploiter de manière similaire les images d’AF pour étudier les fuites de récipients in vivo, ce qui permet d’étudier la dynamique des fuites dans la chronologie des lésions de RVO. Comme la sélection de la zone de fuite repose sur la sélection d’une région par l’évaluateur, elle introduit potentiellement une plus grande variabilité par le biais de la subjectivité. De plus, étant donné que les études du modèle de lésion RVO discutées ici portent sur les fuites dans toute la rétine, nous avons plutôt choisi d’utiliser une technique de masquage pour le calcul. Cette méthode de fuite reflète une facette différente des dommages causés par la RVO de celles révélées par l’analyse de traçage des couches DRIL et OCT, et la corrélation avec ces mesures permet de créer un profil de maladie plus précis.
Nous présentons deux méthodes d’évaluation des images OCT. L’inflammation aiguë et la dégénérescence subséquente des couches rétiniennes sont une caractéristique de la lésion RVO 6,12. La méthodologie de traçage des couches OCT détaillée ici permet l’étude précise des couches individuelles et révèle des effets plus subtils et des différences de dynamique dans différentes régions de la rétine. Cette technique d’analyse s’appuie sur d’autres protocoles couramment utilisés pour la quantification de l’épaisseur de la couche rétinienne en imagerie OCT. Cette méthode tient compte de la variation entre les protocoles dans la zone utilisée pour estimer l’épaisseur de la couche, ainsi que du nombre de mesures prises sur l’image11. Comme l’amincissement n’est pas uniforme dans chaque couche rétinienne, il est peu probable que les méthodes utilisant moins de mesures ponctuelles donnent une image complète des effets des blessures. La méta-analyse de stratégies de mesure multiples de l’épaisseur de la couche rétinienne a révélé que les protocoles faisant la moyenne sur de plus grandes zones de l’image OCT présentaient une corrélation plus élevée avec la gravité de la maladie, ainsi qu’une plus grande répétabilité11. En faisant la moyenne sur l’ensemble de l’image, cette méthode capture une représentation plus précise de l’amincissement rétinien présent dans les lésions RVO à long terme. Les études diffèrent également en termes d’endroit où les images OCT sont prises - de nombreuses études portent sur l’imagerie sur le nerf optique. En revanche, la méthode présentée est centrée par rapport aux occlusions. Un développement récent dans l’analyse de l’imagerie OCT humaine est l’utilisation d’algorithmes d’apprentissage automatique pour classer et quantifier les caractéristiques24. De telles analyses pourraient être une orientation future prometteuse pour l’analyse de l’imagerie rétinienne animale.
De plus, nous présentons une traduction de DRIL, une mesure clinique de l’ischémie capillaire, dans un modèle de rongeurs. Chez l’homme, le DRIL s’est avéré être un prédicteur de la perte d’acuité visuelle et des différences d’épaisseur rétinienne et a démontré une sensibilité et une spécificité diagnostiques élevées18,19. La quantification de la DRIL chez la souris en mesurant la proportion de la rétine désorganisée a montré une corrélation avec la fraction de veines obstruées, l’amplitude de l’onde ERG b 7 jours après l’OVR et l’amincissement de la rétine 8 jours après la RVO12. Une alternative à la mesure DRIL est l’utilisation de HYPOX-4 pour mesurer l’hypoxie rétinienne et les lésions ischémiques. HYPOX-4 rejoint le chlorhydrate d’anime de pimonidazole, un marqueur d’hypoxie, avec une sonde fluorescente pour détecter l’hypoxierétinienne 25. La plupart des protocoles utilisant HYPOX-4 sont invasifs et nécessitent une analyse rétinienne à montage plat, ce qui peut être moins approprié pour l’établissement de chronologies de blessures, bien qu’un protocole d’imagerie in vivo utilisant une sonde HYPOX-4 ait récemment été mis à l’essai25. L’analyse DRIL est également utile comme lecture rapide des dommages rétiniens, car des mesures uniques dans chaque image OCT sont plus rapides que des analyses telles que le traçage de la couche rétinienne. Cependant, il convient de noter que ces mesures ne sont pas interchangeables et révèlent différentes pathologies rétiniennes. Ils devraient plutôt être utilisés de concert, où DRIL peut être utilisé comme lecture initiale de l’ampleur de l’effet ou de l’efficacité de l’intervention, et le traçage des couches peut ensuite être utilisé pour une analyse approfondie des effets plus subtils dans les couches rétiniennes.
Ces méthodes sont de nature orthogonale, ce qui permet de créer un profil de maladie pour chaque sujet expérimental. Comme les pathologies rapportées par chacune de ces méthodes sont distinctes, il n’est pas garanti qu’elles évoluent proportionnellement, et l’obtention d’une image plus holistique de la pathologie permettra une étude plus rigoureuse des différentes configurations de manifestation des dommages causés par la RVO. La capacité de maximiser la quantité d’information pouvant être extraite de l’imagerie de chaque animal de laboratoire réduira le nombre d’animaux nécessaires pour tirer des conclusions significatives, améliorant ainsi l’efficacité du processus expérimental. L’application de ces méthodes sur des protocoles RVO récemment affinés permet une meilleure reproductibilité et étude de la traduction des phénotypes cliniques en modèles animaux. Au-delà de l’étude des modèles RVO, l’utilisation de ces méthodes a des applications à d’autres modèles de maladies rétiniennes qui utilisent l’imagerie FA et OCT. Des exemples de tels modèles murins comprennent ceux pour l’œdème maculaire lié à l’âge (DMLA)26, l’œdème maculaire diabétique (OMD)23, la néovascularisation choroïdienne (CNV)27, l’uvéorétinite auto-immune expérimentale (EAU)28 et la rétinopathie du prématuré (RDP)15. Ces méthodes peuvent ensuite être généralisées aux études utilisant l’imagerie FA et OCT pour étudier des modèles de ces maladies chez d’autres espèces. Ces quantifications sont également sensibles à des changements plus subtils dans le mécanisme de la maladie, ce qui les rend utiles dans l’évaluation de l’efficacité du traitement, comme dans la figure 3D et la figure 4C. L’utilité s’étend également à l’utilisation de l’imagerie dans les essais de toxicité dans les études de tolérabilité des composés médicamenteux. La normalisation et la reproductibilité de ces protocoles d’analyse peuvent servir à améliorer la validité translationnelle des modèles animaux et à élargir notre compréhension de la pathogenèse et de la physiopathologie de la maladie rétinovasculaire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention DGE-1644869 (à CKCO) du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) (à CKCO), au National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (à l’AMP), au National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 à CMT) et au Department of Defense Army/Air Force (DURIP à CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
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