Summary
För att undvika de begränsningar som är förknippade med enzymatisk eller mekanisk passage av humana embryonala stamceller (hESC) och humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) odlade på feederceller, har vi etablerat en snabb, effektiv, kostnadseffektiv, högavkastande metod för att skörda hESC eller hiPSC-kolonier som upprätthålls på ett matarcellskikt av humana förhudsfibroblaster med hjälp av EDTA-medierad dis-vidhäftning.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller (humana embryonala stamceller, hESC, och humaninducerade pluripotenta stamceller, hiPSCs) odlades ursprungligen på olika typer av feederceller för att bibehållas i ett odifferentierat tillstånd vid långtidsodling. Detta tillvägagångssätt har i stor utsträckning ersatts av feederfria odlingsprotokoll, men dessa involverar dyrare reagenser och kan främja en övergång till ett primat tillstånd, vilket begränsar cellernas differentieringsförmåga. Under både feeder- och feederfria förhållanden är skörd av hESC- eller hiPSC-kolonier för passering en nödvändig procedur för att expandera kulturerna.
För att tillhandahålla en enkel och högavkastande procedur för passering av hESC/hiPSCs odlade på matarceller, har vi etablerat en skördemetod som använder dis-adhesion framkallad av kalciumkelatoretylendiamintetraättiksyra (EDTA). Vi har utvärderat utbytet och kvaliteten på de resulterande passagecellerna genom att jämföra detta tillvägagångssätt med den ursprungliga mekaniska skördemetoden, där kolonier isoleras med en skalpell under ett mikroskop (mekanisk skörd valdes som jämförelsematerial för att undvika reagensvariabilitet i samband med enzymatisk skörd).
I en uppsättning experiment bibehölls två olika hESC-linjer på ett matarcellskikt av humana förhudsfibroblaster. Varje linje utsattes för flera passager med hjälp av EDTA-baserad eller mekanisk skörd och bedömdes med avseende på kolonistorlek och morfologi, celltäthet, stammarköruttryck, differentiering till de tre groddlagren i embryoidkroppar och genomiska avvikelser. I en annan uppsättning experiment använde vi EDTA-baserad skörd på två olika hiPSC-linjer och fick liknande resultat. EDTA-inducerad vidhäftning sparade tid och gav ett högre utbyte av kolonier av en mer gynnsam storlek och mer enhetlig morfologi jämfört med mekanisk skörd. Det var också snabbare än enzymatisk skörd och inte benäget att variera enzymsatser. Den EDTA-inducerade vidhäftningsmetoden underlättar också överföringen av hESC/hiPSC-linjer från matarcellbaserad odling till matarfria förhållanden om så önskas för nedströms användning och analys.
Introduction
Korrekt underhåll av hESCs och hiPSCs in vitro är en grundläggande och bekväm metod för flera forskningsvägar inom mänsklig cell- och utvecklingsbiologi. På grund av den inneboende drivkraften hos hESCs och hiPSCs att differentiera, kräver upprätthållandet av det odifferentierade tillståndet in vitro särskild omsorg och uppmärksamhet. Att utveckla kostnadseffektiva protokoll för underhåll och passage av hESC och hiPSCs med så liten metodologisk variation som möjligt är därför av stor allmän nytta.
Ursprungligen odlades hESCs och hiPSCs på olika typer av matarceller för att hjälpa till med långtidsodling och upprätthållande av det odifferentierade tillståndet 1,2,3. På senare tid har odling under ätarfria förhållanden blivit normen, eftersom man undviker att hantera matarceller heltoch hållet 4. Vissa laboratorier och kärnanläggningar odlar dock fortfarande hESCs eller hiPSCs på matarceller. Feederfri odling är dyrare eftersom den kräver användning av odlingsmedier med speciella sammansättningar och någon form av beläggning av odlingsytan för att säkerställa kolonins vidhäftning (större extracellulär matris [ECM]-komponenter eller en kommersiell ECM-förening, eller användning av kommersiellt tillgängliga belagda plattor). Kostnaden är inte obetydlig och utgör ett potentiellt ekonomiskt hinder för vissa laboratorier som är intresserade av att bedriva hESC- eller hiPSC-baserad forskning och utveckling. Dessutom tenderar odling under feederfria förhållanden att driva hESCs och hiPSCs till ett mindre naivt tillstånd än vad som upprätthålls på feederceller5, och detta kan äventyra efterföljande differentiering och leda till genetiska variationer6.
Historiskt sett har passagen av hESCs och hiPSCs odlade på feederceller involverat mekanisk skörd - med hjälp av en skalpell för att skära kolonier under ett mikroskop7 - men detta ersattes senare till stor del av enzymatisk nedbrytning med eller utan försiktig skrapning för att isolera kolonier eller dissocierade celler. Mekanisk skörd är tråkigt och kräver precisionsmikrokirurgi. Enzymatisk skörd kan variera i effektivitet på grund av enzymskillnader mellan satser och tenderar att gynna fullständig dissociation, vilket främjar celldöd om det inte motverkas av ROCK-hämmare 8,9 och ökar förekomsten av onormala karyotyper9.
För att dra nytta av den lägre kostnaden och större differentieringspotentialen för att odla hESCs och hiPSCs på matarceller samtidigt som vi undviker nackdelarna med mekanisk och enzymatisk skörd, har vi etablerat en snabb, effektiv, kostnadseffektiv, högavkastande metod för att skörda hESC- och hiPSC-kolonier som upprätthålls på ett matarskikt av humana förhudsfibroblaster med hjälp av EDTA-medierad dis-vidhäftning. Vi har jämfört avkastningen, variabiliteten och stamcellskvaliteten med den som erhålls med mekanisk skörd (vi jämförde inte med enzymatisk nedbrytning på grund av den ytterligare variabilitet som detta tillvägagångssätt medför). Vi noterar att EDTA-medierad dis-adhesion också fungerar bra för att överföra kolonier från feederbaserad kultur till feederfria förhållanden, om så önskas för nedströms användning och analyser. Denna metod ger en övergång med en konsekvent passage-metod, eftersom EDTA-inducerad dis-adhesion är en populär metod som används för feederfria kulturer.
Protocol
Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.
1. Odling av humana fibroblastceller och beredning av matarcelskiktet
- Frö 0,5 × 106 humana förhudsfibroblaster (nedan kallade "feederceller") per varje T-75-odlingskolv (antal kolvar efter behov) med 20 ml Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) med (w/) 10 % fetalt bovint serum (FBS), nedan kallat "feeder cell medium".
- När matarcellerna når 90 % sammanflöde, ta bort mediet och tvätta 3 gånger med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) per kolv för att undvika hämning av trypsin av faktorer i mediet. Tillsätt 2 ml trypsin-EDTA till varje kolv och placera kolven/kolvarna i en inkubator med 37 °C/5 % CO2 i 5 minuter eller tills matarcellerna har lossnat från kolven/kolvarna. Observera att cellerna lossnar under ett mikroskop som flytande aggregat av celler eller enstaka celler.
- Tillsätt 5 ml färskt förvärmt matarcellmedium till varje kolv för att inaktivera trypsin-EDTA och suspendera försiktigt matarcellerna genom pipettering.
- Överför matarcellerna till ett 15 ml centrifugrör. Täck röret och pelletera matarcellerna genom centrifugering vid 200 × g i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa matarcellpelleten. Återsuspendera sedan försiktigt pelleten i 4 ml färskt matarcellmedium. Se till att matarcellerna är ordentligt återsuspenderade innan du räknar med hjälp av en cellräkningskammare eller annan cellräkningsapparat.
- Tillsätt 0,5 × 106 matarceller till erforderligt antal nya T-75-odlingskolvar för expansion och tillsätt 20 ml färskt matarcellmedium till varje kolv. Inkubera odlingskolven (odlingskolvarna) i en inkubator med 37 °C/5 % CO2 tills matarcellerna har nått 90 % sammanflöde.
OBS: Matarceller kan användas upp till minst passage 25. - Beräkna det antal matarceller som krävs för det antal 35 mm vävnadsodlingskärl som ska användas för odling av hESC/hiPSC.
OBS: Vanligtvis räcker det med 3,0 × 105 matarceller per vävnadsodlingsskål för att generera ett sammanflytande lager av matarceller. - För att undvika spridning av matarcellerna, se till att de stoppas mitotiskt på något av två sätt.
OBS: För båda metoderna kan ett stort parti mitotiskt stoppade matarceller genereras och frysas ner i alikvoter för senare användning.- Utför mitotisk arrest genom gammabestrålning genom att överföra alla matarceller som behövs till ett 50 ml centrifugrör och fylla på med matarcellmedium till en total volym av 5 ml. Transportera omedelbart vid rumstemperatur till en gammabestrålningsmaskin och bestråla för att mitotiskt stoppa matarcellerna (300 kV och 10 mA i 20 minuter).
OBS: En fördröjning i transporten kan leda till oönskad fastsättning av matarcellerna på väggen på 50 ml centrifugröret. Om transporten tar mer än några minuter, se till att matarcellerna förblir upphängda under transporten genom att kontinuerligt röra om röret. - Utför mitotisk arrest med mitomycin C genom att överföra alla matarceller som behövs i 5 ml matarcellmedium till ett 50 ml centrifugrör och tillsätt sedan 15 ml matarcellmedium innehållande 20 μg/ml mitomycin C och inkubera i en 37 °C/5 % CO2-inkubator i 3 timmar. Tillsätt 20 ml 37 °C PBS, pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 × g i 5 minuter, upprepa PBS-tvätten ytterligare två gånger och återsuspendera i matarcellmedium.
- Utför mitotisk arrest genom gammabestrålning genom att överföra alla matarceller som behövs till ett 50 ml centrifugrör och fylla på med matarcellmedium till en total volym av 5 ml. Transportera omedelbart vid rumstemperatur till en gammabestrålningsmaskin och bestråla för att mitotiskt stoppa matarcellerna (300 kV och 10 mA i 20 minuter).
- Efter att matarcellerna har stoppats mitotiskt, återgå till vävnadsodlingshuven och plätera ut matarcellerna vid 3,0 × 105 celler per 35 mm vävnadsodlingsskål, enligt följande. Se till att matarcellerna är helt återupplösta, tillsätt matarcellmedium för att uppnå en matarcellskoncentration på 1,5 × 105 per ml och tillsätt 2 ml av denna matarcellssuspension till varje 35 mm vävnadsodlingsskål.
- Överför odlingsskålarna till en 37 °C/5 % CO2 -inkubator. För att säkerställa en jämn fördelning av matarcellerna, flytta odlingsskålarna långsamt men bestämt på inkubatorhyllan framåt och bakåt 3x, följt av en paus, och utför sedan samma åtgärd från vänster till höger 3x. Flytta inte disken igen och stäng försiktigt inkubatorns lucka.
- Efter 24 timmar, byt från matarcellsmedium till IMDM med 10 % serumersättning (SR). Byt ut detta medium därefter var tredje dag. Matarcellerna är redo att användas efter de första 3 dagarna.
2. Mekanisk skörd av hESC- eller hiPSC-kolonier
- Förvärm hESC-medium bestående av 80 % Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM), 20 % SR, 1 mM glutaminersättning 100x, 1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1 mM penicillin/streptomycin (P/S), 0,1 mM 2-merkaptoetanol och 10 ng/ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). hESC-mediet används för odling av antingen hESC eller hiPSCs på matarcellerna.
- Ta färska 35 mm vävnadsodlingsskålar som innehåller mitotiskt stoppade matarceller och byt ut matarcellmediet mot 1,2 ml hESC-medium som innehåller bFGF minst 30 minuter före överföringen av hESC/hiPSC-kolonierna.
- Placera en odlingsskål som innehåller hESC/hiPSC-kolonier på mitotiskt stoppade matarceller under ett mikroskop med 10x förstoring placerat i en huv med laminärt flöde. Använd en steril skalpell för att försiktigt skära runt omkretsen av varje koloni och skär sedan varje samhälle i 5-6 ungefär lika stora bitar. Lyft försiktigt upp kolonibitarna med spetsen på skalpellbladet så att de lossnar från matarcellskiktet och flyter fritt i mediet.
- Försök att undvika regioner i kolonierna som innehåller differentierande celler, som uppträder som öar av mindre celler med mindre distinkta kärnor jämfört med hESC/hiPSC inom en koloni.
- Överför de fritt flytande kolonierna med en 1 ml pipett till de nya odlingsskålarna som innehåller matarcellerna. Försök att hålla samhällena åtskilda så att de inte växer in i varandra senare. Flytta odlingsskålarna försiktigt till en cellinkubator och undvik att störa disken till nästa dag.
- Följande dag tillsätts försiktigt 600 μl hESC-medium som innehåller bFGF till en slutlig volym på 1,8 ml. Byt ut hESC + bFGF-mediet varje dag därefter fram till nästa passage (vanligtvis efter 1 vecka).
3. Skörd av hESC- eller hiPSC-kolonier med EDTA-medierad vidhäftning
- Ta färska odlingsskålar med mitotiskt stoppade matarceller och byt från IMDM med 10 % SR till 1,2 ml förvärmt hESC + bFGF-medium minst 30 minuter före överföringen av samhällena.
- Hantera en odlingsskål som innehåller hESC- eller hiPSC-kolonier åt gången. Ta bort hESC + bFGF-mediet och tvätta kolonierna med 1 ml rumstempererad DPBS för att eliminera eventuella obundna celler och cellrester. Tillsätt 1 ml 0,5 mM EDTA och inkubera i 1 minut vid 37 °C. Om huven med laminärt flöde har en värmeplatta, utför detta steg och stegen i avsnitt 4 på värmeplattan för bättre vidhäftning.
- Efter 1 minuters inkubation avlägsnar du EDTA-lösningen och tillsätter försiktigt 1 ml hESC + bFGF-medium med en 1 ml pipett. Triturera försiktigt med samma pipett för att frigöra kolonierna från matarcelskiktet. Fortsätt att triturera försiktigt tills matarcellskiktet lossnar och viker sig på sig själv i en separat klump. Dra bort matarcellskiktet med pipettspetsen.
- Överför de suspenderade hESC/hiPSC-kolonierna med en ny 1 ml pipett till nya odlingsskålar som innehåller matarcellerna och hESC + bFGF-mediet, dela i förhållandet 1:5. Kolonierna tenderar att fördela sig jämnt inom varje ny kulturskål, men underlättar detta genom att flytta skålen försiktigt från sida till sida. Byt ut hESC + bFGF-mediet varje dag därefter fram till nästa passage (vanligtvis efter 1 vecka).
Representative Results
I de analyser och jämförelser som dokumenteras nedan använde vi två hESC-linjer (H9 och HS429, från WiCell respektive Karolinska Institutet) och två hiPSC-linjer (NCS001 och NCS002, båda genererade av den norska Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). De data som presenteras i figurerna och tabellerna är från hESC-linjerna, men helt likartade resultat erhölls från hiPSC-linjerna.
I våra händer resulterade mekanisk skörd i att kolonierna delades upp i cirka fem till sex klumpar med ~200-250 μm i diameter, medan med EDTA-inducerad vidhäftning följt av trituration delades varje samhälle upp i ~10-20 klumpar med ~60 μm i diameter. Vi uppskattar att antalet celler i varje EDTA-skördad klump är ~20. Eftersom det är opraktiskt att dela upp en koloni i klumpar av denna storlek med en skalpell, är EDTA-inducerad vidhäftning i detta avseende överlägsen, eftersom den genererar klumpar av en storlek som är mer gynnsam för kolonicellernas överlevnad 10,11.
De hESC/hiPSC-samhällen som skördades med EDTA var också mer homogena i storlek och form jämfört med de samhällen som skördades mekaniskt (Figur 1A-F). Detta beror på att den skärning som krävs för mekanisk avverkning genererar ojämna kanter och varierande klumpstorlekar. För att utvärdera detta kvantitativt bedömde vi kolonins cirkularitet (som ett mått på hur rundade kolonikanterna var; ett värde på 1 indikerar en perfekt cirkel) 5 dagar efter passering med hjälp av ImageJ-win64-protokollet12. Samhällenas cirkularitet var signifikant lägre i de samhällen som skördades mekaniskt (mekanisk skörd: 0,61 ± 0,10; EDTA-baserad skörd: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, Mann-Whitney U-test, U = 10).
Celltätheten i de skördade och ompläterade kolonierna, som är ett mått på cell-cellinteraktioner efter skörd under kolonibildning, var likartad med EDTA-baserad skörd och mekanisk skörd (Tabell 1 och Figur 1G,H). De mekaniskt skördade kolonierna hade en större tendens att utveckla nekros i sina centrala regioner (Figur 1J). Detta berodde sannolikt på variabilitet i formen och särskilt storleken på de mekaniskt isolerade cellklumparna, eftersom när dessa klumpar är för stora kan de lätt vika sig på sig själva när de överförs till nya odlingsskålar. Detta var inte fallet med de samhällen som skördades med EDTA, som enhetligt uppvisade ett genomskinligt utseende med tydliga kanter (Figur 1I).
Med hjälp av EDTA-baserad skörd kunde vi samla in i princip alla samhällen som hade etablerats i en brunn inom 2-3 minuter. Med hjälp av mekanisk skörd skulle det vara tråkigt och tidskrävande att samla alla samhällen i en brunn. Vi lyckades vanligtvis bara samla in ~30%, eller ~20-25 samhällen, med hjälp av mekanisk skörd, och detta tog ~20 min. På samma sätt var det vanligtvis svårt att skörda alla samhällen med hjälp av kollagenasnedbrytning följt av försiktig skrapning, även om den totala proceduren bara tog några minuter. Således är EDTA-baserad skörd lika snabb eller snabbare än enzymatisk skörd och effektivare än både mekanisk eller enzymatisk skörd.
För att bedöma effekten av de olika skördemetoderna på stjälkar och pluripotens, utsatte vi först de samhällen som erhölls efter 20 passager med EDTA-baserad eller mekanisk skörd för qPCR-analys (Figur 2) och immunocytokemisk färgning (Figur 3 och Figur 4) för stemnessmarkörer. Kolonierna som erhölls med båda metoderna uppvisade ett stabilt uttryck av stamhetsmarkörer både på mRNA- och proteinnivå. Vi bedömde sedan pluripotens genom differentiering till de tre groddlagren i embryoidkroppar (Figur 5 och Figur 6). De embryoidkroppar som genererades från hESCs eller hiPSCs erhållna efter 20 passager med endera metoden innehöll en blandning av celler som uttryckte vanligt bedömda markörer för ektoderm, mesoderm och endoderm.
Slutligen bedömde vi förekomsten av genomiska avvikelser i hESCs och hiPSCs som passeras av varje metod med hjälp av qPCR-baserad genetisk analys (se materialtabellen). De kolonier som erhölls efter 20 passager med endera skördemetoden uppvisade några exempel på måttlig avvikelse från ett diploidt kromosomalt referensmönster (de abnormiteter som bedömdes var de som vanligtvis förknippas med omprogrammering av hiPSCs men kan också erhållas i hESC) (Figur 7). Mönstret för dessa avvikelser var dock i stort sett detsamma i de samhällen som erhölls efter endera skördemetoden, vilket tyder på att de inte var kopplade till skördemetoden.
Figur 1: Kolonimorfologi och celltäthet efter EDTA-baserad eller mekanisk skörd. (A-F) Representativa ljusfältsbilder av H9 hESC-kolonier etablerade i feederfri kultur i 5 dagar efter 20 passager med (A-C) EDTA-baserad eller (D-F) mekanisk skörd. (G,H) Representativa fluorescensbilder av celltätheten i H9 hESC-kolonier fastställda efter 20 passager med hjälp av (G) EDTA-baserad eller (H) mekanisk skörd. Cellkärnorna är färgade med DAPI. (I,J) Representativa ljusfältsbilder av H9 hESC-kolonier etablerade efter 20 passager med hjälp av (I) EDTA-baserad eller (J) mekanisk skörd. Notera den nekrotiska centrala regionen i kolonin som skördats mekaniskt (pil i J). Alla bilder togs 5 dagar efter den 20:e passagen. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Uttryck av stammarkör mRNA i två hESC-linjer (H9 och HS429) genererade efter EDTA-baserad eller mekanisk skörd. Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid av de indikerade markörerna i H9 (övre panel) och HS429 (nedre panel) hESC efter en enda passage med mekanisk skörd, efter 20 passager med mekanisk skörd och efter 20 passager med EDTA-baserad skörd (1:5 utspädning). Uttrycksnivån är relativ till den för hushållningsgenen ACTB (beta-aktin). Felstaplarna anger standardavvikelsen. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uttryck av stammarkörproteiner i H9 hESC-linjen efter olika skördeförhållanden. Representativ immunofluorescensfärgning av H9 hESC-kolonier skördade mekaniskt (A-E) före ytterligare passage, (F-J) efter 20 passager med mekanisk skörd och (K-O) efter 20 passager med EDTA-baserad skörd. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uttryck av stammarkörproteiner i HS429 hESC-linjen efter olika skördeförhållanden. Representativ immunofluorescensfärgning av HS429 hESC-kolonier skördade mekaniskt (A-E) före ytterligare passager, (F-J) efter 20 passager med mekanisk skörd och (K-O) efter 20 passager med EDTA-baserad skörd. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uttryck av markörer för de tre groddskikten i embryoidkroppar som genererats från H9 hESC-linjen efter mekanisk eller EDTA-baserad skörd. Representativ immunofluorescensfärgning av markörer för (A- och D-rader) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- och E-rader) endoderm (ENDO, AFP) och (C- och F-rader) mesoderm (MESO, SMA). EB genererade (A-C) efter 20 passager av mekanisk skörd eller (D-F) efter 20 passager av EDTA-baserad avverkning. Skalstaplar = 40 μm. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, EB = embryoidkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Uttryck av markörer för de tre groddskikten i embryoidkroppar som genererats från HS429 hESC-linjen efter mekanisk eller EDTA-baserad skörd. Representativ immunofluorescensfärgning av markörer för (A- och D-rader) ektoderm (ECTO, TUJI), (B- och E-rader) endoderm (ENDO, AFP) och (C- och F-rader) mesoderm (MESO, SMA). EB genererade (A-C) efter 20 passager av mekanisk skörd (A-C) eller (D-F) efter 20 passager av EDTA-baserad skörd. Skalstaplar = 40 μm. Förkortningar: hESC = human embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, EB = embryoidkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: qPCR-baserad genetisk analys av vanliga genomiska avvikelser i HS9 och HS429 ESC-linjerna och NCS002 iPSC-linjen efter 20 passager med mekanisk eller EDTA-baserad skörd. Baslinjen vid värde 2 representerar normal diploiditet vid alla kromosommarkörer. Ett värde på 1 eller 3 skulle representera en förlust respektive vinst av den angivna kromosommarkören i alla celler. Mellanvärden mellan 1 och 2 eller mellan 2 och 3 indikerar närvaron av en förlust eller förstärkning av den angivna markören i en bråkdel av cellerna. Observera att mönstret av avvikelser är likartat under de två skördeförhållandena. Förkortningar: ESC = embryonal stamcell; EDTA = etylendiamintetraättiksyra, iPSC = inducerad pluripotent stamcell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Celltäthet (celler/mm2) | ||
| H9 | betyda | STDAV |
| Mekanisk skörd före ytterligare passering | 3918 | 263.3 |
| Mekanisk skörd 20 gånger | 3868 | 197.7 |
| EDTA-skörd 20 gånger | 4080 | 127.8 |
| HS429 | betyda | STDAV |
| Mekanisk skörd före ytterligare passering | 5249 | 565.4 |
| Mekanisk skörd 20 gånger | 5247 | 726.3 |
| EDTA-skörd 20 gånger | 4963 | 448.8 |
Tabell 1: Jämförelse av celltätheten i kolonierna från de två hESC-linjerna (H9 och HS429) som genererats efter EDTA-baserad eller mekanisk skörd. Celldensiteterna bedömdes antingen efter en enda passage med mekanisk skörd, efter 20 passager med mekanisk skörd eller efter 20 passager med EDTA-baserad skörd (vid 1:5 utspädning). I samtliga fall är n = 5 kolonier.
Discussion
Vi har beskrivit en snabb och kostnadseffektiv metod för att skörda hESCs och hiPSCs odlade på matarceller med hjälp av EDTA-medierad vidhäftning och jämfört detta främst med den konventionella metoden för mekanisk skörd med hjälp av en skalpell. Vi jämförde också EDTA-baserad skörd med enzymatisk skörd med avseende på metodens hastighet men inte aspekter av den resulterande kolonikvaliteten. Anledningen till detta är att enzymatisk skörd i sig är mer variabel och har kopplats till en högre förekomst av genomiska avvikelser5, vilket kan dölja skillnaderna mellan metoderna.
Vi visar att EDTA-baserad avverkning är snabbare och effektivare än någon av de andra metoderna och genererar mindre och morfologiskt mer homogena kolonier än mekanisk avverkning. Den senare egenskapen är fördelaktig med avseende på cellöverlevnad, eftersom de större klumparna som erhålls med mekanisk skörd är benägna att drabbas av central nekros, medan enzymatisk nedbrytning tenderar att generera isolerade hESCs och hiPSCs, som är mer benägna att apoptos och kräver extra behandling, till exempel med ROCK-hämmare, för att överleva. EDTA-baserad avverkning kan användas för minst 20 passager. De EDTA-baserade och mekaniska skördemetoderna är jämförbara när det gäller kolonicelltäthet, mRNA och proteinuttryck av stamgener, differentiering av de tre groddskikten i embryoidkroppar och genomiska avvikelser. Om målet är effektivitet, högre avkastning, mindre variabilitet och skonsammare hantering av hESC och hiPSC är EDTA-baserad skörd att föredra.
Vi noterar också att EDTA-baserad skörd av hESCs och hiPSCs odlade på feederceller är ett billigt sätt att upprätthålla ett mer naivt tillstånd och ger en smidig övergång från feederbaserad till feederfri odling där detta är önskvärt.
Kritiska steg i protokollet
De mest kritiska stegen i EDTA-medierad vidhäftning är protokollsektion 3 (inkubation i EDTA-lösningen) och sektion 4 (triturering). Om exponeringen för EDTA-lösningen är längre än 1 minut ökar risken för fullständig dissociation till enstaka celler. Detta kan också inträffa om triturationen är för utdragen eller för hård. Det senare påverkas av pipettspetsens storlek. Att använda 1 ml cellodlingspipetter enligt beskrivningen här är idealiskt. Att använda en annan typ av pipett med en mindre spetsdiameter är riskabelt.
Felsökning
Om matarcellerna fortsätter att föröka sig har mitotisk arrest inte varit effektiv, och en ny sats måste tas och proceduren återupptas. Om kolonierna inte lossnar från matarcelskiktet måste man se till att det inte finns något Ca2+ i EDTA och att odlingsskålen som innehåller kolonierna sköljs väl med PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande cellodlingsmedium innan EDTA tillsätts. För mycket dissociation, som genererar isolerade celler eller cellklumpar som är för små, kan uppstå på grund av överdriven trituration och äventyrar etableringen av nya kolonier. Graden av trituration bör bestämmas empiriskt i provkörningar av protokollet för att bekräfta att de resulterande cellklumparna är ~60 μm i diameter. Om matarskiktet lossnar spontant från odlingsskålen, särskilt innan hESC/hiPSC är redo för skörd, kan det bero på att matarcellerna inte har använts inom ~7 dagar efter beredning. Därför bör tidsramen för användning av matarcellerna övervakas noggrant. Om matarskiktet dissocierar under EDTA-exponering (något vi aldrig har observerat med de matarceller som används här), måste antingen typen av matarcell eller deras odlingsmetod ändras.
Teknikens begränsningar
Den största begränsningen med tekniken är att den kräver visuell inspektion av vidhäftningsprocessen för att uppnå ett lyckat resultat. Detta innebär att användarna måste lära sig att identifiera när kolonierna släpper från matarcellskiktet och matarcellskiktet lossnar från substratet. Detta är dock inte svårt, och enligt vår erfarenhet kan nya användare av tekniken behärska den inom ett par försök.
Det finns också en inneboende möjlighet att de skördade hESC eller hiPSCs kan vara kontaminerade av ett fåtal matarceller. Om avsikten är att övergå till icke-matarförhållanden eller att isolera hESC eller hiPSC för analyser, skulle en sådan kontaminering äventyra renheten. Vi noterar att med de feederceller som används här (humana förhudsfibroblaster) är det extremt svårt att dissociera feeder-celskiktet, även med enzymatisk matsmältning (visas inte). Eftersom det odissocierade matarcellskiktet avlägsnas i sin helhet är kontamineringen av de skördade hESC- eller hiPSC-cellerna sannolikt försumbar. Eftersom matarcellerna dessutom är mitotiskt stoppade skulle eventuell kontaminering så småningom minska till noll med ytterligare passage av hESC eller hiPSCs.
Betydelse i förhållande till befintliga metoder
Den nuvarande normen för odling av hESC och hiPSCs är att göra det under matarfria förhållanden, för vilka användningen av EDTA för passering är utbredd. Foderfri odling är beroende av användning av speciellt framtagna medier och odlingssubstrat som säkerställer vidhäftning. Dessa reagenser medför en extra kostnad som kan överstiga vissa laboratoriebudgetar. Dessutom har odling under foderfria förhållanden förknippats med en störd differentieringspotential på grund av bristen på specifika faktorer i det matarfria odlingsmediet och en resulterande övergång från det naiva tillståndet till det primade tillståndet. Tillväxt på mitotiskt stoppade feederceller undviker denna övergång och kan sänka de totala kostnaderna till en hanterbar nivå, vilket underlättar en bredare användning av pluripotenta stamceller i laboratorieforskning.
Disclosures
Joel C. Glover är föreståndare och Hege Brincker Fjerdingstad är daglig chef för den norska Core Facility för humana pluripotenta stamceller. Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi tackar Lars Moen för hjälpen under de preliminära experimenten och den norska Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells vid Norsk Center for Stem Cell Research, Oslo Universitetssjukhus, för användningen av faciliteterna. H9 hESC-linjen erhölls från WiCell och HS429 hESC-linjen erhölls från Outi Hovatta vid Karolinska Institutet. Båda användes i enlighet med materialöverföringsavtal. HCS001- och NCS002-hiPSC-linjerna genererades av den norska Core Facility för humana pluripotenta stamceller. Den omprogrammeringen och allt arbete som redovisas här har utförts med godkännande av Etrikkommittén i Sydost (godkännande REK 2017/110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
| Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
| Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
| DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
| Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
| Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
| Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
| Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
| Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
| Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
| H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
| hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
| HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
| Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
| IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
| iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
| Microscope | CETI | ||
| Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
| Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
| Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
| T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
| Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |
References
- Skottman, H., Hovet, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132 (5), 691-698 (2006).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Human Reproduction. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Desai, N., Rambhia, P., Gishto, A. Human embryonic stem cell cultivation: historical perspective and evolution of xeno-free culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 9 (2015).
- Villa-Diaz, L. G., et al. Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 28 (6), 581-583 (2010).
- Watanabe, M., et al. TGFb superfamily signaling regulates the state of human stem cell pluripotency and capacity to create well-structured telencephalic organoids. Stem Cell Reports. 17 (10), 2220-2238 (2022).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10 (2), e0118307 (2015).
- Inzunza, J., et al. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Rivera, T., Zhao, Y., Ni, Y., Wang, J. Human-induced pluripotent stem cell culture methods under cGMP conditions. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 117 (2020).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 23, 569-581 (2021).
- Meng, G., Rancourt, D. E. Derivation and maintenance of undifferentiated human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 873, 69-90 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
