Summary
Этот универсальный протокол описывает выделение премигрирующих клеток нервного гребня (NCC) путем иссечения черепных нервных складок из эмбрионов цыплят. После покрытия и инкубации мигрирующие NCC возникают из эксплантов нервной складки, что позволяет оценить морфологию клеток и миграцию в упрощенной 2D-среде.
Abstract
Во время развития позвоночных клетки нервных гребней (NCC) широко мигрируют и дифференцируются в различные типы клеток, которые способствуют таким структурам, как черепно-лицевой скелет и периферическая нервная система. Хотя важно понимать миграцию NCC в контексте 3D-эмбриона, выделение мигрирующих клеток в 2D-культуре облегчает визуализацию и функциональную характеристику, дополняя эмбриональные исследования. Настоящий протокол демонстрирует метод выделения черепно-мозговых складок цыплят для генерации первичных культур NCC. Мигрирующие NCC возникают из эксплантов нервной складки, покрытых фибронектиновым субстратом. Это приводит к дисперсным, адгезивным популяциям NCC, которые могут быть оценены с помощью окрашивания и количественного морфологического анализа. Этот упрощенный культурный подход обладает высокой адаптивностью и может сочетаться с другими методами. Например, эмиграция NCC и миграционное поведение могут быть оценены с помощью покадровой визуализации или функционально запрошены путем включения ингибиторов или экспериментальных манипуляций экспрессии генов (например, ДНК, морфолино или электропорации CRISPR). Благодаря своей универсальности этот метод обеспечивает мощную систему для исследования развития черепных NCC.
Introduction
Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой переходную клеточную популяцию в эмбрионах позвоночных. НКЦ указываются на границах нервной пластинки и претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) для миграции из дорсальной нервной трубки1. После ЭМТ NCC широко рассеиваются по всему эмбриону, в конечном итоге дифференцируя и способствуя различным структурам, включая черепно-лицевой скелет, отток сердца и большую часть периферической нервной системы2. Изменения в полярности клеток, цитоскелете и адгезионных свойствах объясняют этот переход от премиграционной к мигрирующей клеточной популяции3. Изучение NCC EMT и миграции дает представление о фундаментальных механизмах подвижности клеток и информирует об усилиях по профилактике и лечению врожденных дефектов и метастазирования рака.
В то время как анализ in vivo имеет жизненно важное значение для понимания процессов развития NCC в эмбриональном контексте, методы in vitro предлагают визуальную и физическую доступность, которая облегчает дополнительные экспериментальные возможности. В упрощенной 2D-среде можно оценить морфологию NCC, цитоскелетные структуры и расстояние миграции. Кроме того, влияние возмущения генетического или растворимого фактора на миграционное поведение подвижных ННК может быть проанализировано 4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, изолированные премиграторные или мигрирующие НКЦ могут быть собраны, объединены и использованы для высокопроизводительных методологий для изучения регуляции развития NCC посредством протеомного, транскриптомного и эпигеномного профилирования 7,11. В то время как доступны методы получения черепных NCC из различных модельных организмов развития 12,13,14, в этой статье демонстрируется механика подхода для тех, кто впервые научился культивировать черепные NCC из эмбрионов цыплят.
Текущий протокол описывает универсальную технику приготовления черепно-черепных культур NCC цыплят (рисунок 1). Поскольку NCC легко мигрируют из эксплантированных нервных складок на субстрат культуры, цыплята NCC естественным образом отделяются от эмбриональной ткани, и первичные культуры легко генерируются. Поскольку НКЦ среднего мозга массово мигрируют из черепных нервных складок (в отличие от затяжного расслоения клетки за клеткой в стволе15), эти культуры состоят в основном из мигрирующих клеток черепно-мозгового нервного гребня, причем начальное иссечение нервной складки обеспечивает метод сбора для премиграторных NCC. Подробно описан базовый метод вскрытия и культивирования черепно-мозговых складок цыплят, предложены предложения по различным применениям и вариациям этого метода.
Рисунок 1: Схематический обзор протокола культивирования черепно-мозговой складки цыпленка. (A,B) Черепные нервные складки (очерченные синим цветом) иссекаются из эмбриона цыпленка с пятью сомитами (показаны в дорсальном виде в А). Серые полосы, сердечный полумесяц. (C) При нанесении фибронектина мигрирующие клетки нервного гребня выходят из нервных складок и рассеиваются на субстрате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Можно использовать любую разновидность пород Gallus gallus , включая White Leghorn, Golden Sex Link или Rhode Island Red. Куриные яйца, использованные в настоящем исследовании, были различных пород и получены из нескольких источников, включая местные фермы и инкубатории.
1. Подготовка растворов и материалов
- Готовят раствор Рингера, смешивая 123,3 мМ NaCl, 1,53 мМ CaCl2, 4,96 мМ KCl, 0,809 мМ Na2HPO4 и 0,147 мМ KH2PO4 (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте pH до 7,4 и фильтруйте стерилизуйте в бутылки объемом 100 мл. Хранить в чистом, сухом месте. Не мойте бутылки с мылом (относитесь как к тканевой культуре стеклянной посуды).
- Готовят 1 мг/мл исходного раствора фибронектина (FN) (см. Таблицу материалов) путем растворения FN в стерильном растворе Рингера и хранят в 100 мкл аликвот при -80 °C (стабильно в течение не менее 4 лет).
- Приготовьте полную культуральную среду, дополнив среду L15 0,8% L-глютамином, 0,08% пенициллином/стрептомицином, 10% FBS и 10% экстрактом эмбриона цыпленка12. Создайте 3 мл аликвоты и храните при -20 °C или -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если культуры инкубируются в инкубаторе CO2 , DMEM/F12 необходимо заменить на L15, который буферизуется для воздуха. - Готовят 4% раствор параформальдегида в 1x PBS. Отрегулируйте pH до 7,4. Создайте 10 мл аликвот и храните их при -20 °C.
ВНИМАНИЕ: Параформальдегид должен обрабатываться в вытяжном шкафу. - Подготовьте рамки для поддержки фильтровальной бумаги (примерно 1 см х 1,5 см прямоугольники бумаги с двумя или тремя перфорированными отверстиями, перекрывающимися по длинной оси).
- Пробивите отверстия по краю большого куска фильтровальной бумаги с помощью стандартного трехотверстного перфоратора, вырежьте/обрежьте перфорированный край в полоску, а затем разрезайте полосу между отверстиями на прямоугольники ~ 1,5 см в длину. Автоклавная фильтровальная бумага перед использованием (опционально).
- Соберите инструменты для рассечения, включая тонкие щипцы (No 5), тупые щипцы, ножницы для рассечения, пружинные ножницы и заточенные вольфрамовые иглы16.
2. Инкубация эмбрионов
- Получить оплодотворенные яйцеклетки из любого из упомянутых выше источников.
- Поместите оплодотворенные яйца в вертикальное положение (длинная ось яйца вертикально с заостренным концом вниз / тупой стороной вверх) внутри увлажненного инкубатора при 38 ° C (100 ° F).
- Инкубируют до тех пор, пока не образуются четыре-семь сомитов (стадии 8+-9)17, что занимает примерно 35 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может значительно варьироваться в зависимости от штамма, возраста кур, сезона и т.д., и должно быть экспериментально определено. Программируемые таймеры выхода полезны для инициирования инкубации в ночное время для получения желаемого времени. - После извлечения из инкубатора тщательно опрыскайте яйца 70% этанолом и дайте им высохнуть, чтобы продезинфицировать скорлупу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут быть собраны немедленно, но остывание яиц до комнатной температуры снижает хрупкость желтков и потерю эмбрионов во время сбора.
3. Приготовление блюд культуры
- Выберите блюда для культивирования нейронных складок (см. Таблицу материалов), подходящие для последующего применения.
- Для культур, которые будут фиксироваться и окрашиваться, используйте стеклянные крышки, помещенные в многоскважинные блюда для культуры тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чехлы, которые соответствуют размеру скважины, будут меньше перемещаться при смешивании жидкости, что делает экспланты менее склонными к смещению и с большей вероятностью прилипают к крышке, а не к дну тарелки. - Выберите однокамерную или разделенную посуду со стеклянным дном (см. Таблицу материалов) для визуализации в реальном времени с помощью перевернутого микроскопа.
- Для визуализации в реальном времени на вертикальном или стереомикроскопе используйте 6-, 12- или 24-луночные оптически подходящие тканевые культуральные пластины.
- Выберите пластиковые формы для культивирования тканей для массового сбора мигрирующих клеток нервного гребня для высокопроизводительного анализа.
- Для культур, которые будут фиксироваться и окрашиваться, используйте стеклянные крышки, помещенные в многоскважинные блюда для культуры тканей.
- Добавьте 10 Ед/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина во флакон 100 мл стерильного раствора Рингера (например, 100 мкл 10 000 Ед/мл пенициллина и 10 000 мкг/мл стрептомицина, чтобы сделать Р/С Рингера). Используйте P/S Рингера в течение 1 недели.
- Разморозьте на льду аликвоту 1 мг/мл FN. Разбавляют Р/С Рингера до концентрации 10-100 мкг/мл FN.
- Пипетки достаточно раствора FN, чтобы покрыть дно колодца или тарелки. Например, 100 мкл на скважину в 24-луночной плите, 500 мкл для 35-миллиметровой тарелки.
- Замените крышку и инкубируйте посуду или тарелки раствором FN в увлажненном инкубаторе (или накрытом лотке с дистиллированными бумажными полотенцами, пропитанными водой) при 38 °C (100 °F) в течение не менее 1 ч при рассечении нервных складок.
4. Выделение эмбрионов цыплят
- Позаботьтесь о поддержании ориентации яйца (эмбрион всплывает на вершину желтка во время инкубации). Используйте ножницы или тупые щипцы, чтобы проткнуть небольшое отверстие в скорлупе, примерно на 1/4-1/3 пути вниз по длине яйца.
- Осторожно вставьте кончик ножниц или тупых щипцов в небольшое отверстие, следя за тем, чтобы не разрушить желток, и прорежьте яичную скорлупу вокруг яйца, удалив верхнюю часть яичной скорлупы (рисунок 2А).
- Позиционируйте эмбрион для изоляции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион не идеально расположен в чашке оболочки, используйте тупые щипцы, чтобы осторожно повернуть желток, чтобы эмбрион был сверху. В качестве альтернативы, налейте желток в руку в перчатке, будучи осторожным, чтобы не сломать желток и дать альбумину стечь (рисунок 2B). Затем эмбрион можно позиционировать, перемещая желток из рук в руки. - Подготовьте эмбрион, осторожно используя плоский край закрытых тупых щипцов, чтобы стереть избыток альбумина, который остается на поверхности желтка, покрывающей эмбрион (рисунок 2C). Избыток альбумина также может быть удален с помощью мягкого давления с деликатной задачей стеклоочистителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только альбумин очищен, поверхность желтка должна выглядеть текстурированной, а не гладкой. Неспособность вытереть достаточное количество альбумина будет препятствовать адгезии подложки фильтровальной бумаги в разделе 4, шаг 4. - Используйте щипцы, чтобы поместить опорную рамку из фильтровальной бумаги поверх эмбриона, а эмбрион находится в окне рамки. Осторожно надавите на фильтровальную бумагу, чтобы приклеить ее к желтку.
- Вырежьте вокруг внешней стороны рамки фильтровальной бумаги ножницами для рассечения (рисунок 2D). Используйте щипцы или кончики ножниц, чтобы схватить край рамки и осторожно поднять эмбрион от желтка (рисунок 2E). Поднятие под углом поможет удалить эмбрион чисто из желтка.
- Поместите эмбрион с бумажной рамкой стороной вниз (эмбрион вентральной стороной вверх) в чашку Петри толщиной 60 мм или 100 мм, заполненную P/S Рингера (рисунок 2F). Держите блюдо с эмбрионами на льду при сборе для РНК- или белково-чувствительного последующего применения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неспособность поместить эмбрионы вентральной стороной вверх рискует отделить их от бумажных рамок. Несколько эмбрионов могут быть собраны и сохранены в P/S Рингера в течение 1 ч, прежде чем перейти к этапам рассечения нервной складки.
5. Рассечение нервных складок
- Перенесите эмбрион в чистую посуду, содержащую раствор P/S Рингера, и промойте эмбрион, удерживая рамку фильтровальной бумаги щипцами и осторожно размахивая взад и вперед, чтобы очистить любой желток, который скрывает вид эмбриона. Замените P/S Звонаря или переведите на свежее блюдо, если оно станет мутным.
- Расположите дорсальную/рамочную сторону эмбриона вверх под рассекающим микроскопом. Оставив эмбрион на бумажной рамке, чтобы он был растянут и удерживался на месте, удалите вителлиновую мембрану с помощью щипцов, чтобы обнажить нервные складки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эмбрион выпадает из бумажной рамки, его можно выложить плоско в тарелку или приколоть к блюду18 , покрытому сильвардом, для рассечения. - Используя пружинные ножницы или заточенную вольфрамовую иглу, аккуратно иссечь нервные складки среднего мозга. Включите тканевый каудальный к расширяющимся зрительным везикулам и ростральный к заднему мозгу, где ромбомерные сужения только начинают появляться (сердечный полумесяц также является полезным показателем, рисунок 3B,C). Позаботьтесь об исчерпании самого дорсального аспекта нервной складки с минимальным загрязнением нервной трубки и ненейронной эктодермы (рисунок 3C).
- Перенесите нервные складки в чистую посуду, содержащую P/S Рингера, используя пипеттор P20 или стерильную стеклянную пипетку Пастера, промытую желтком Ringer's P/S (это блокирует пластик или стекло, чтобы предотвратить прилипание ткани). Храните собранные складки на льду при вскрытии дополнительных складок.
6. Покрытие нервных складок
- Разморозьте аликвоту полной культуральной среды (раздел 1, шаг 3). Добавьте 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и стерилизуют фильтром. Держите подготовленную среду при температуре 37-38 °C при выполнении других шагов.
- Выньте из инкубатора блюда для культивирования (раздел 3, шаг 5). С помощью пипетки или пипетки Пастера удалите раствор FN из укрытий, посуды или колодцев. После промывки субстрата, покрытого FN, P/S Рингера, добавьте соответствующий объем полной питательной среды в посуду или лунки (500 мкл для скважин в 24-луночной пластине, 2 мл для 35-миллиметровой посуды или шестилуночной тарелки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие объемы могут сохранить дорогостоящие реагенты (например, до 200 мкл для 24-луночной тарелки), но гарантировать, что блюдо достаточно увлажнено, чтобы избежать испарения. - Используя пипеттор p20 или p200, сначала промойте наконечник пипетки желточным P/S Рингера, чтобы заблокировать пластик и предотвратить прилипание ткани. Затем перенесите изолированные нейронные складки на покрытые FN покровные листы, заботясь о том, чтобы перенести как можно меньше P/S Рингера. Поместите складку (складки) к центру покрытой FN крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна или несколько нейронных складок могут быть покрыты на 12-мм крышке в 19-миллиметровом колодце, до 50 на пластине 35 мм. - После того, как экспланты осядут в течение 10-15 мин, поместите их в увлажненную камеру при 38 ° C (100 ° F), медленно и осторожно перенося посуду для культуры с покрытыми нервными складками. Это позволит свести к минимуму смещение нервных складок в скважинах, гарантируя, что они останутся диспергированными и прилипнут к любым покровам.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании L15 (не DMEM) блюда для эксплантных культур также можно инкубировать в инкубаторе для яиц с использованием закрытого лотка с увлажненными бумажными полотенцами. - Инкубируют культуры нервных складок в увлажненном инкубаторе на время активной миграции (всего около 16-20 ч, рисунок 4).
7. Фиксация и окрашивание культивируемых мигрирующих ННК для морфологического анализа
- Удалите питательные среды пипеткой Пастера и промойте колодцы стерилизованным фильтром 1x PBS.
- Добавляют 4% параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется экспериментально определить время фиксации. Также можно добавлять параформальдегид непосредственно в среду в течение 10 мин (50:50), удалять и заменять неразбавленным 4% параформальдегидом в течение 10 мин, чтобы сохранить более тонкие клеточные структуры. - Удалите параформальдегид и промойте три раза 1x PBS.
- Окрашивание фиксированных ННК соответствующим красителем для морфологической оценки. В качестве примера, окрашивание конъюгированным фаллоидином Oregon Green подробно описано здесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация актинового цитоскелета с фаллоидином19 выявляет структурную сложность мигрирующего NCC с относительно равномерной интенсивностью окрашивания; однако фаллоидин может выделять не все области клеток. Также могут использоваться красители, которые маркируют плазматическую мембрану (например, агглютинин зародышей пшеницы или DiI) или цитоплазму, но усложняют визуализацию тонких выступов относительно ярко окрашивающегося тела клетки. Кроме того, иммунофлуоресценцию можно проводить одновременно для маркировки клеток нервного гребня HNK-1 или для определения субклеточной локализации интересующего белка 7,20.- Удалите окончательное полоскание PBS и добавьте PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% сыворотку (FBS или от другого животного, подходящего для закостенения с антителом), чтобы покрыть крышки и инкубировать в течение 10 минут на платформе шейкера при комнатной температуре.
- Пипет 200 нМ конъюгированного фаллоидина Oregon Green (разбавленного в PBST + 5% сыворотке) на гладкую поверхность (например, гибкую парафиновую уплотнительную пленку) для каждого покровного листа. Для крышки 12 мм пипетка объемом 30 мкл.
- Используя пару щипцов, удалите крышку из сыворотки PBST + 5%, обеспечивая поддержание ориентации клеток лицом вверх. Коротко прикоснитесь к краю крышки к деликатной задаче стеклоочистителя, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Аккуратно поместите каждую клетку крышки стороной вниз на каплю разбавленного фаллоидина. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Держите крышки в темноте во время окрашивания (накройте посудой, покрытой алюминиевой фольгой, или поместите в ящик).
- Во время инкубации добавляют ПБСТ в лунки чашки для культивирования (750 мкл ПБСТ на каждую лунку 24-луночной пластины).
- После инкубационного периода снимите покровы с окрашивающего раствора и поместите их обратно в чашку для культивирования, перевернув крышку, чтобы сторона клетки была вверху. Убедитесь, что крышка покрыта PBST и помещена на шейкер платформы в течение 10 минут, сохраняя крышки закрытыми и в темноте. Удалите PBST и повторите этот шаг два раза, в общей сложности три 10-минутные стирки.
- Поместите одну каплю (на крышку) монтажного носителя (см. Таблицу материалов) на предметное стекло микроскопа. Объем 25 мкл хорошо подходит для крышки 12 мм.
- После окончательной стирки pBST прикоснитесь краем крышки к деликатному стеклоочистителю, чтобы удалить лишнюю жидкость, отслеживая сторону ячейки крышки.
- Установите ячейку крышки стороной вниз, медленно опуская крышку под углом на монтажный носитель, чтобы избежать образования пузырьков. Разрешите установку носителя перед созданием изображения.
8. Морфологическая оценка культивируемых мигрирующих ННК
- Изображение окрашенных ячеек и экспорт в виде .tiff файлов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив 40x хорошо работает для визуализации культур, но цели в диапазоне от 10x (для захвата целого поля мигрирующих NCC) до 100x (одиночные NCC) могут использоваться для сбора изображений для морфологической оценки. Изображения в настоящем исследовании были получены с использованием перевернутой мультимодальной платформы визуализации (см. Таблицу материалов). - Загрузите изображения в программное обеспечение для анализа изображений (ImageJ21, см. Таблицу материалов). Нажмите на Image > Duplicate , чтобы создать вторую копию каждого изображения для анализа, тем самым оставив оригинал неотредактированным, так как большая часть обработки изображений не может быть отменена.
- Нажмите на Image > Adjust > Brightness/Contrast и используйте скользящие полосы для настройки яркости или контрастности изображений.
- Преобразуйте изображения в оттенки серого, выполнив следующие действия.
- Если изображения экспортируются в RGB, они будут загружаться в RGB как объединенный канал. Чтобы разделить изображения, нажмите «Изображение > цвет» > «Разделенные каналы», чтобы получить одноканальные изображения в градациях серого.
- Если изображения уже разделены, перейдите в раздел Image > Type > 8-bit , чтобы преобразовать файл в оттенки серого.
- Нажмите «Изображение > «Настроить порог >», чтобы преобразовать его в двоичное изображение, где пиксели идентифицируются как ячейки (передний план; черный) или фон (белый). Используйте скользящую панель и/или нажмите кнопку «Авто », чтобы выбрать параметр «Порог», который четко определяет ячейки из фона.
- Если ячейки перекрываются или окрашивание не является непрерывным, может потребоваться дальнейшая обработка с использованием функций22 водораздела или заполнения отверстий. Это отделит клетки друг от друга или заполнит пробелы в клетках, подлежащих анализу. Нажмите «Обработать > двоичный > «Сделать двоичным», чтобы сначала преобразовать изображение в 8-битный двоичный формат. Затем нажмите «Обработать > двоичный > водораздел или «Заполнить дыры».
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение наилучшим образом подходит для того, где сигналы должны быть разделены или заполнены, что может быть дополнительно отрегулировано с помощью плагинов, если это необходимо.
- Если ячейки перекрываются или окрашивание не является непрерывным, может потребоваться дальнейшая обработка с использованием функций22 водораздела или заполнения отверстий. Это отделит клетки друг от друга или заполнит пробелы в клетках, подлежащих анализу. Нажмите «Обработать > двоичный > «Сделать двоичным», чтобы сначала преобразовать изображение в 8-битный двоичный формат. Затем нажмите «Обработать > двоичный > водораздел или «Заполнить дыры».
- Выберите измерения для захвата. Нажмите «Анализировать > установить измерения » и установите флажки «Дескрипторы формы» для анализа цикличности (окружности), соотношения сторон (AR), округлости (округлости) и твердости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть включены и другие измерения, такие как площадь и периметр, в зависимости от типа необходимого анализа. - Нажмите «Анализировать > «Анализировать частицы» и задайте параметры в меню «Анализировать частицы».
- В разделе «Размер» примерно оцените, насколько велики интересующие ячейки или частицы в пикселях, так как фоновый сигнал или меньший клеточный мусор также будут включены, если параметр Size остается установленным на 0-Infinity (например, установлен как 500-Infinity на рисунке 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка размера в более узком диапазоне может исключить более мелкие или более крупные частицы, чем те, которые необходимы для анализа. - В разделе «Циркулярность» оставьте значение 0-1,0, чтобы измерить все формы клеток на изображении.
- В разделе «Показать» выберите «Голые контуры» в раскрывающемся меню, чтобы проверить контуры ячеек, выбранные с помощью функции «Анализ частиц». Сканируйте контуры, чтобы убедиться, что перекрывающиеся ячейки различимы, но ячейки не разделены без необходимости. Кроме того, установите флажки меню «Отображать результаты», «Суммировать» и «Добавить в менеджер».
- В разделе «Размер» примерно оцените, насколько велики интересующие ячейки или частицы в пикселях, так как фоновый сигнал или меньший клеточный мусор также будут включены, если параметр Size остается установленным на 0-Infinity (например, установлен как 500-Infinity на рисунке 5).
- После того, как все параметры были установлены, нажмите ok.
ПРИМЕЧАНИЕ: Появятся четыре отдельных окна, показывающих (1) голые контуры ячеек, идентифицированных на изображении, (2) ячейки, подсчитанные на изображении, (3) результаты измерений каждой ячейки и (4) сводку общего количества подсчитанных ячеек и их усредненных измерений.- Если мусор был подсчитан, перекрывающиеся ячейки считались как одна, отдельные ячейки считались множественными, или многие ячейки были исключены из подсчета, вернитесь к исходному, неотредактированному изображению, сделайте еще один дубликат и настройте «Порог» или другие параметры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор данного протокола показан на рисунке 1. Инкубированные яйца открывали, а желток с эмбрионом на поверхности изолировали, осторожно наливая в ладонь перчаточной руки (рисунок 2A,B). После очистки альбумина (рисунок 2C) на желтковую мембрану, окружающую эмбрион, наносили рамки фильтровальной бумаги, чтобы облегчить разрезание и подъем эмбриона из желтка, который начинает выплескиваться после разрезания желточных мембран (рисунок 2D, E).
Рисунок 2: Выделение от четырех до семи эмбрионов цыплят сомита. Оплодотворенные яйцеклетки инкубировали в течение 35 ч. Яйцо открывали тупыми щипцами (А), а желток наливали в руку в перчатке (Б). Избыток альбумина удаляли (С), чтобы к желтку прилипала фильтровальная бумага (D, вставка). Эмбрион был вырезан из желтка (D), снят (E) и помещен в P/S (F) Рингера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После полоскания эмбриона и перехода к очистке P/S Рингера в изолированных эмбрионах были видны нервные складки (рисунок 3A). Эти складки содержат премигрирующие клетки черепно-мозгового гребня. После вырезания из эмбриона (рисунок 3B, C) и сбора (рисунок 3D) изолированные нейронные складки могут быть покрыты для создания мигрирующих культур NCC.
Рисунок 3: Рассечение дорсальных нервных складок цыпленка. Работая в P/S Рингера, пружинные ножницы использовались для иссечения нервных складок. (A) Дорсальный вид эмбриона, передний к верхней части фигуры. Нервные складки кажутся более непрозрачными, чем окружающие ткани. Нервные складки среднего мозга лежат кзади к зрительным долям (розовый) и к переднему к сердечному полумесяцу (желтый). (B) Дорсальный вид эмбриона после удаления нервных складок, показывающий границы иссечения. (C) Боковой вид эмбриона с удаленными нервными складками. Техника рассечения удаляет дорсальную нервную трубку, избегая вентральных и неневралевых трубочных структур. (D) Изолированные нейронные складки в P/S Рингера. Шкала шкалы = 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Когда нейронные складки были покрыты на FN, NCC начали появляться из адгезивных эксплантов нейронных складок в течение 3-4 ч после инкубации (рисунок 4A), и миграция была завершена примерно через 20 ч (рисунок 4B). Окрашивание HNK-1, которое маркирует мигрирующие NCC20, было очевидным в большинстве клеток культуры (рисунок 4D). Отрицательный результат возникал, когда нервные складки не смогли прилипнуть к покрову, или ни один NCC не эмигрировал из экспланта (данные не показаны). NCC были проанализированы путем фиксации культур, окрашивания для нитевидного актина и выполнения различных измерений в ImageJ для оценки морфологии и миграции NCC (рисунок 5). Средняя площадь 69 проанализированных клеток составила 802,11 ± 69,65мкм2 с диапазоном от 60,27 до 2664,53мкм2, распределенных, как показано на гистограмме и скрипичном графике (рисунок 5C). Циркулярность (формула: циркулярность = 4π(площадь/периметр²)), мера, отражающая выпячивание клетки, колеблется в пределах 0,101-0,875, при среднем значении 0,38 ± 0,15. Более низкие значения указывают на вытянутую форму, в то время как значение 1 указывает на идеальный круг. Как видно из скрипичного сюжета, большинство клеток имеют вытянутую форму (рисунок 5D). Другой мерой формы ячейки является соотношение сторон (AR), которое является большой осью ячейки, разделенной на второстепенную ось. Значение AR, равное 1, указывает на симметричную форму23. Миграционные ННК в этой области имели средний AR 2,13 ± 0,11, со значениями в диапазоне от 1,14 до 5,59 (рисунок 5E). Используя эти количественные показатели морфологии NCC, можно проводить строгие сравнения между экспериментальными условиями и различными опубликованными исследованиями.
Рисунок 4: Мигрирующие ННК возникают из культивируемых нейронных складок. Яркие изображения покрытых нервных складок после 3 ч инкубации (А) и 20 ч инкубации (В). Шкала бара = 200 мкм. (С,Г) Нейронная складка в значительной степени рассеивается после 20 ч инкубации, но остаточно присутствует на правой стороне этих изображений. Шкала бара = 500 мкм. Мигрирующие NCC видны с окрашиванием DAPI (C) и HNK-1 (D). Иммуноокрашивание HNK-1 подтверждает, что культивируемые клетки являются мигрирующими NCC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Морфологическая оценка культивируемых мигрирующих ННК. (A) Фаллоидиновое окрашивание нитевидного актина в NCC мигрировало из нейронной складки через 20 ч в культуре. Шкала бара = 50 мкм. (B) Пороговое изображение с ячейками, выглядящими черными, и фоном белым. Желтые контуры окружают объекты, считающиеся ячейками, а ячейки нумеруются. (С-Е) Параметры построения графиков для отображения данных морфологической оценки. Гистограммы и скрипичные графики были созданы на основе измерений 69 ячеек, показанных на панели B, для изображения площади (мкм2, C), окружности (D) и соотношения сторон (E) измеренных ячеек. Гистограммы показывают средние значения со полосами погрешностей, представляющими стандартную погрешность среднего значения слева от каждой панели. Скрипичные сюжеты создавались с app.rawgraphs.io. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь, обеспечивает адаптируемый метод выделения нервных складок цыплят и их покрытия для создания культур мигрирующих черепных NCC. Эти культуры обеспечивают упрощенные 2D-условия для легкого анализа миграции и морфологии цыплят NCC, которые могут дополнять более технически сложные методы визуализации 24,25,26. Хотя этот метод in vitro относительно прост, последовательные результаты зависят от высококачественных яиц и реагентов. Кроме того, из-за присущей культурам изменчивости воспроизводимость требует экспериментального повторения и количественного определения.
Адгезия нервных складок к FN имеет важное значение для миграции NCC в культуре. Иногда экспланты не будут прилипать должным образом, и нейронная складка либо уплывет, либо не произведет несколько мигрирующих NCC. Это может произойти, когда черепная нервная складка не приземляется срезанной стороной вниз; попробуйте сориентировать экспланты в культуральном сосуде перед инкубацией и дайте им осесть в течение 10-15 минут, прежде чем перемещать их. Однако из-за перемешивания жидкости при переносе в инкубатор некоторые нервные складки неизбежно будут время от времени прилипать неоптимально. Когда адгезия и миграция являются проблематичными для всего эксперимента, это может отражать старый FN (используйте свежую аликвоту от -80 ° C для каждого эксперимента), питательную среду с просроченными компонентами (хранить среду, приготовленную в аликвотах размером с эксперимент при -20 ° C и добавлять свежий антибиотик во время использования) или использование обложек, не подходящих для клеточной культуры (например, клетки не будут прилипать к покровам для гистологии). Загрязненный инкубатор также может привести к провалу всех экспериментов с культурой NCC.
В дополнение к получению дисперсных NCC в культуре и проведению анализа морфологии мигрирующих NCC, этот протокол также является отправной точкой для многих других экспериментов. Экспланты, покрытые на покровных листах, также могут быть обработаны для иммунофлуоресценции (после раздела 7, стадия 3) для определения субклеточной локализации интересующего белка7. В то время как анализ морфологии и расстояния миграции возможен в фиксированных культурах, как описано здесь, покадровая визуализация NCC во время инкубации культуры (раздел 6, шаг 5) позволяет дополнительно собирать данные о направленности и стойкости миграции и динамике подвижности клеток (измерения протрузии мембраны, адгезии и т. Д.). 14,24,27. Преходящее генетическое манипулирование эмбрионами может быть достигнуто путем электропорации18,28 реагентов (морфолино29, конструкции экспрессии ДНК или векторы CRISPR30) на стадии Гамбургера и Гамильтона 4 + 17. Эти электропорированные эмбрионы затем могут быть использованы в протоколе для создания мигрирующих культур NCC с потерей функции или сверхэкспрессией генов, представляющих интерес. Функциональный анализ также может быть достигнут путем добавления химических ингибиторов в среду культурNCC 7,27 (раздел 6, этап 2). Профилирование стран-чистых доноров на уровне населения с помощью анализа на уровне омики требует сбора стран-чистых доноров в качестве сырья7 11 31. Хотя маркеры использовались для изоляции NCC с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток31, для этого требуется специализированное оборудование для проточной цитометрии и ферментативная диссоциация клеток. Следование описанным здесь методам тщательного иссечения дорсальных нервных складок (минимизация сбора вентральной нервной трубки и ненейронных клеток эктодермы) обеспечивает недорогой метод сбора премиграционных NCC11 (раздел 5, шаг 4). Сбор ННК после рассеивания в культуре (раздел 6, этап 5) обеспечивает относительно чистую популяцию естественно сегрегированных, мигрирующих ННК для дальнейшего анализа (окрашивание HNK-1, маркер мигрирующих НКЦ, в большинстве культивируемых клеток на рисунке 4D; как нарисунке 7). Наконец, эти вариации могут быть использованы в комбинации. Например, иммунофлуоресценция или покадровая визуализация могут быть использованы для оценки эффектов манипуляций с экспрессией генов или добавления ингибиторов27. В целом, этот адаптируемый, недорогой протокол предоставляет средства для оценки морфологии черепно-мигрирующих NCC дикого типа в культуре с множественными потенциальными модификациями для достижения различных экспериментальных целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Коринн А. Фэйрчайлд и Кэти Л. Вермиллион, которые участвовали в разработке нашей версии протокола культивирования черепно-мозговой нейронной складки цыпленка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
- Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
- McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
- Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
- Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
- Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
- Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
- Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
- Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
- Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T.
- Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
- Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
- McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
- Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
- Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
- Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).
