Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Beredning och morfologisk analys av kycklingkraniala neurala vapencellkulturer

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

Detta mångsidiga protokoll beskriver isoleringen av premigrativa neurala vapenceller (NCC) genom excision av kraniala neurala veck från kycklingembryon. Vid plätering och inkubation uppstår migrerande NCC från neurala vikplantor, vilket möjliggör bedömning av cellmorfologi och migration i en förenklad 2D-miljö.

Abstract

Under ryggradsdjurens utveckling migrerar neurala vapenceller (NCC) i stor utsträckning och differentieras till olika celltyper som bidrar till strukturer som kraniofacialt skelett och det perifera nervsystemet. Även om det är viktigt att förstå NCC-migration i samband med ett 3D-embryo, underlättar isolering av migrerande celler i 2D-odling visualisering och funktionell karakterisering, vilket kompletterar embryonala studier. Detta protokoll demonstrerar en metod för att isolera kycklingkraniala neurala veck för att generera primära NCC-kulturer. Migrerande NCC kommer ut från neurala vikplantor pläterade på ett fibronektinbelagt substrat. Detta resulterar i spridda, vidhäftande NCC-populationer som kan bedömas genom färgning och kvantitativa morfologiska analyser. Denna förenklade kulturmetod är mycket anpassningsbar och kan kombineras med andra tekniker. Till exempel kan NCC-emigrations- och migrationsbeteenden utvärderas genom time-lapse-avbildning eller funktionellt frågas genom att inkludera hämmare eller experimentella manipuleringar av genuttryck (t.ex. DNA, morfolino eller CRISPR-elektroporering). På grund av sin mångsidighet ger denna metod ett kraftfullt system för att undersöka kranial NCC-utveckling.

Introduction

Neurala vapenceller (NCC) är en övergående cellpopulation i embryon från ryggradsdjur. NCC specificeras vid neuralplattans gränser och genomgår en epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) för att migrera från dorsala neuralröret1. Efter EMT sprids NCC i stor utsträckning genom embryot, vilket i slutändan differentierar och bidrar till olika strukturer, inklusive kraniofacialt skelett, utflödeskanal i hjärtat och majoriteten av det perifera nervsystemet2. Förändringar i cellpolaritet, cytoskelett och vidhäftningsegenskaper ligger till grund för detta skifte från en premigrerande till en migrerande cellpopulation3. Att studera NCC EMT och migration ger insikter i grundläggande mekanismer för cellmotilitet och informerar om insatser för att förebygga och behandla fosterskador och cancermetastaser.

Medan in vivo-analys är avgörande för att förstå NCC-utvecklingsprocesser i ett embryonalt sammanhang, erbjuder in vitro-metoder visuell och fysisk tillgänglighet som underlättar ytterligare experimentella vägar. I en förenklad 2D-miljö kan NCC-morfologi, cytoskelettstrukturer och migrerat avstånd utvärderas. Dessutom kan effekterna av genetisk eller löslig faktorstörning på migrerande beteenden hos rörliga NCC analyseras 4,5,6,7,8,9,10. Dessutom kan isolerade premigrerande eller migrerande NCC samlas in, poolas och användas för metoder med hög genomströmning för att studera utvecklingsreglering av NCC genom proteomisk, transkriptomisk och epigenomisk profilering 7,11. Medan metoder finns tillgängliga för att förbereda kranial NCC från olika utvecklingsmodellorganismer12,13,14, visar den här artikeln mekaniken i tillvägagångssättet för dem som först lär sig att odla kranial NCC från kycklingembryon.

Det nuvarande protokollet beskriver en mångsidig teknik för beredning av NCC-kulturer av kycklingkranier (figur 1). Eftersom NCC migrerar lätt från explanterade neurala veck till ett odlingssubstrat, separerar kyckling-NCC naturligt från embryonal vävnad och primära kulturer genereras lätt. Eftersom NCC: er i mitten av hjärnan migrerar massor från kranialneurala veck (i motsats till den långvariga, cell-för-cell-delamineringen i stammen15), består dessa kulturer huvudsakligen av migrerande kraniala neurala vapenceller, med initial neural fold excision som ger en insamlingsmetod för premigrativa NCC. En grundläggande metod för dissekering och odling av kycklingkraniala neurala veck är detaljerad, och förslag på olika applikationer och variationer på denna metod erbjuds.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över chick cranial neural fold culture protocol. (A,B) Kraniala neurala veck (skisserade i blått) skärs ut från ett kycklingembryo med fem somiter (visas i dorsalvy i A). Grå band, hjärtmåne. (C) När de pläteras på fibronektin kommer migrerande neurala vapenceller ut från neurala veck och sprids på substratet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla typer av Gallus gallus raser kan användas, inklusive White Leghorn, Golden Sex Link eller Rhode Island Red. Kycklingäggen som användes i den aktuella studien var av olika raser och erhölls från flera källor, inklusive lokala gårdar och kläckerier.

1. Beredning av lösningar och material

  1. Bered Ringers lösning genom att blanda 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 och 0,147 mM KH 2PO4 (se materialförteckning). Justera pH till 7,4 och filtrera sterilisera i 100 ml flaskor. Förvara på en ren, torr plats. Tvätta inte flaskor med tvål (behandla som vävnadsodlingsglas).
  2. Bered 1 mg/ml stamlösning fibronektin (FN) (se materialtabell) genom att lösa FN i steril Ringers lösning och förvara i 100 μl alikvoter vid -80 °C (stabilt i minst 4 år).
  3. Förbered kompletta odlingsmedier genom att komplettera L15-media med 0,8% L-glutamin, 0,08% penicillin/streptomycin, 10% FBS och 10% kycklingembryoextrakt12. Skapa alikvoter på 3 ml och förvara vid -20 °C eller -80 °C.
    OBS: Om kulturer inkuberas i en CO2-inkubator måste DMEM/F12 ersättas med L15, som buffras för luft.
  4. Förbered 4% paraformaldehydlösning i 1x PBS. Justera pH till 7,4. Skapa alikvoter på 10 ml och förvara dem vid -20 °C.
    VARNING: Paraformaldehyd måste hanteras i en dragskåp.
  5. Förbered stödramar för filterpapper (cirka 1 cm x 1,5 cm rektanglar av papper med två eller tre stansade hål som överlappar varandra på den långa axeln).
    1. Stansa hål längs kanten på en stor bit filterpapper med en vanlig trehålsstans, skär / trimma den stansade kanten i en remsa och skär sedan remsan mellan hålen i rektanglar ~ 1,5 cm i längd. Autoklavfilterpapper före användning (valfritt).
  6. Samla dissektionsverktyg, inklusive fina pincett , trubbiga pincett, dissektionssax, fjädersax och slipade volframnålar16.

2. Inkubation av embryon

  1. Få befruktade ägg från någon av de ovan nämnda källorna.
  2. Placera de befruktade äggen i upprätt läge (äggets långa axel vertikalt med den spetsiga änden nedåt / trubbig sida uppåt) inuti en fuktad inkubator vid 38 ° C (100 ° F).
  3. Inkubera tills fyra till sju somiter har bildats (steg 8+-9)17, vilket tar cirka 35 timmar.
    OBS: Inkubationstiden kan variera avsevärt beroende på stammen, hönsens ålder, säsong etc. och måste bestämmas experimentellt. Programmerbara utloppstimer är användbara för att initiera inkubation under natten för att erhålla önskad timing.
  4. Efter avlägsnande från inkubatorn, spraya äggen noggrant med 70% etanol och låt dem torka för att desinficera skalen.
    OBS: Embryon kan samlas in omedelbart, men att låta ägg svalna till rumstemperatur minskar äggulornas bräcklighet och embryoförlust under insamlingen.

3. Beredning av kulturrätter

  1. Välj neurala vikodlingsrätter (se Materialförteckning) som är lämpliga för nedströmsapplikationen.
    1. För kulturer som kommer att fixeras och färgas, använd glasöverdrag placerade i flerbrunnsvävnadsodlingsrätter.
      OBS: Täckglas som matchar brunnstorleken kommer att röra sig mindre med vätskeblandning, vilket gör explanter mindre benägna att skifta och mer benägna att fästa vid täckglaset snarare än skålens botten.
    2. Välj enkelkammare eller delade kammarskålar med glasbotten (se materialförteckning) för levande avbildning med ett inverterat mikroskop.
    3. För levande avbildning på ett upprätt eller stereomikroskop, använd 6-, 12- eller 24-brunns optiskt lämpliga vävnadsodlingsplattor.
    4. Välj plastvävnadsodlingsskålar för massuppsamling av migrerande neurala vapenceller för analyser med hög genomströmning.
  2. Tillsätt 10 U/ml penicillin och 10 μg/ml streptomycin till en 100 ml flaska steril Ringers lösning (till exempel 100 μl 10 000 U/ml penicillin och 10 000 μg/ml streptomycin, för att göra Ringers P/S). Använd Ringers P/S inom 1 vecka.
  3. Tina en alikvot på 1 mg/ml FN på is. Späd med Ringers P/S till en koncentration av 10-100 μg/ml FN.
  4. Pipet tillräckligt med FN-lösning för att täcka botten av brunnen eller skålen. Till exempel 100 μL per brunn i en 24-brunnsplatta, 500 μL för en 35 mm skål.
  5. Byt ut locket och inkubera diskar eller tallrikar med FN-lösning i en fuktad inkubator (eller en täckt bricka med destillerade vattendränkta pappershanddukar) vid 38 ° C (100 ° F) i minst 1 timme medan du dissekerar neurala veck.

4. Isolering av kycklingembryon

  1. Var noga med att bibehålla äggets orientering (embryot flyter till toppen av äggulan under inkubation). Använd sax eller trubbiga tångar för att sticka ett litet hål i skalet, cirka 1/4-1/3 av vägen ner i äggets längd.
    1. För försiktigt in spetsen på saxen eller trubbiga pincett i det lilla hålet, se till att inte störa äggulan och skär genom äggskalet runt ägget och ta bort toppen av äggskalet (figur 2A).
  2. Placera embryot för isolering.
    OBS: Om embryot inte är idealiskt beläget i skalkoppen, använd trubbiga pincett för att försiktigt vrida äggulan, så embryot är på toppen. Alternativt häll äggulan i en handske, kupad hand, var försiktig så att du inte bryter äggulan och låt albuminet rinna bort (figur 2B). Sedan kan embryot placeras genom att flytta äggulan från hand till hand.
  3. Bered embryot genom att försiktigt använda den plana kanten av slutna trubbiga tångar för att torka bort eventuellt överskott av albumin som finns kvar på äggulans yta som täcker embryot (figur 2C). Överskott av albumin kan också avlägsnas med försiktigt tryck med en känslig uppgiftstorkare.
    OBS: När albumin har rensats bort ska äggulans yta se texturerad ut istället för slät. Underlåtenhet att torka bort tillräckligt med albumin kommer att hämma vidhäftningen av filterpappersstödet i avsnitt 4, steg 4.
  4. Använd pincett för att placera en filterpappersstödram över embryot, med embryot i ramens fönster. Tryck försiktigt ner filterpapperet för att fästa det på äggulan.
  5. Klipp runt utsidan av filterpappersramen med dissektionssax (figur 2D). Använd pincett eller saxspetsar för att ta tag i ramens kant och lyft försiktigt bort embryot från äggulan (figur 2E). Att lyfta bort i en vinkel hjälper till att ta bort embryot rent från äggulan.
  6. Placera embryot med pappersramens sida nedåt (embryots ventrala sida uppåt) i en 60 mm eller 100 mm petriskål fylld med Ringers P/S (figur 2F). Förvara skålen med embryon på is om du samlar in för en RNA- eller proteinkänslig nedströmsapplikation.
    OBS: Underlåtenhet att placera embryon ventral sida uppåt riskerar att lossna dem från sina pappersramar. Flera embryon kan samlas in och lagras i Ringers P/S i upp till 1 timme innan de flyttas till neurala veckdissektionsstegen.

5. Dissekera neurala veck

  1. Överför ett embryo till en ren skål som innehåller Ringers P/S-lösning och skölj embryot genom att hålla i filterpappersramen med pincett och försiktigt swisha fram och tillbaka för att rensa bort eventuell äggula som skymmer sikten över embryot. Byt ut Ringers P/S eller överför till en ny maträtt om den blir grumlig.
  2. Placera embryots dorsal/ramsida uppåt under ett dissekerande mikroskop. Lämna embryot på pappersramen för att hålla det sträckt spänt och hålls på plats, ta bort vitellinmembranet med pincett för att exponera nervvecken.
    OBS: Om embryot faller av pappersramen kan det läggas platt i skålen eller fästas på en sylgardbelagd skål18 för dissektion.
  3. Använd vårsax eller en vässad volframnål, skär försiktigt ut midbrain neurala veck. Inkludera vävnadskaudal till de expanderande optiska vesiklarna och rostral till bakhjärnan, där rhombomerförträngningar just börjar dyka upp (hjärtmånen är också en användbar indikator, figur 3B,C). Var noga med att skära ut den dorsala aspekten av neuralvecket med minimal förorenande neuralrör och icke-neural ektoderm (figur 3C).
  4. Överför nervvecken till en ren skål som innehåller Ringers P/S med en P20-pipettor eller en steril Pasteur-pipett av glas som sköljts med yolky Ringers P/S (detta blockerar plasten eller glaset för att förhindra att vävnaden fastnar). Förvara uppsamlade veck på is medan du dissekerar ytterligare veck.

6. Plätering av neurala veck

  1. Tina en alikvot av kompletta kulturmedier (avsnitt 1, steg 3). Tillsätt 100 U/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin och filtrera sterilisera. Håll förberedda medier vid 37–38 °C medan du utför andra steg.
  2. Ta bort odlingsrätter från inkubatorn (avsnitt 3, steg 5). Använd en pipettor eller Pasteur-pipett och ta bort FN-lösningen från täckglas, diskar eller brunnar. Efter sköljning av det FN-belagda substratet med Ringers P/S, tillsätt en lämplig volym kompletta odlingsmedier till diskarna eller brunnarna (500 μl för brunnar i en 24-brunnsplatta, 2 ml för en 35 mm skål eller en sexbrunnsplatta).
    OBS: Mindre volymer kan bevara dyra reagenser (t.ex. så låga som 200 μL för en 24-brunnsplatta) men se till att skålen är tillräckligt fuktad för att undvika avdunstning.
  3. Använd en p20- eller p200-pipettor och skölj först pipettspetsen med yolky Ringers P/S för att blockera plasten och förhindra att vävnaden fastnar. Överför sedan de isolerade neurala vecken till de FN-belagda täckglasen och var noga med att överföra så lite Ringers P / S som möjligt. Placera vecken/vikarna mot mitten av den FN-belagda täckglaset.
    OBS: En eller några neurala veck kan pläteras på en 12 mm täckglas i en 19 mm brunn, upp till 50 på en 35 mm platta.
  4. Efter att ha låtit explanterna sätta sig i 10-15 minuter, placera dem i en fuktad kammare vid 38 ° C (100 ° F) genom att långsamt och försiktigt bära odlingsskålarna med pläterade neurala veck. Detta minimerar förskjutningen av neurala veck i brunnarna, vilket säkerställer att de förblir dispergerade och fäster vid eventuella täckglas.
    OBS: Vid användning av L15 (inte DMEM) kan explantodlingsrätter också inkuberas i en ägginkubator med en täckt bricka med fuktade pappershanddukar.
  5. Inkubera neurala vikkulturer i den fuktade inkubatorn under varaktigheten av aktiv migration (ca 16-20 h totalt, Figur 4).

7. Fixering och färgning av odlade migrerande NCC för morfologisk analys

  1. Ta bort odlingsmediet med en Pasteur-pipett och skölj brunnarna med filtersteriliserad 1x PBS.
  2. Tillsätt 4% paraformaldehyd i 15 min vid rumstemperatur.
    OBS: Fixeringstiden kan behöva bestämmas experimentellt. Det är också möjligt att tillsätta paraformaldehyd direkt till media i 10 min (50:50), ta bort och ersätta med outspädd 4% paraformaldehyd i 10 min för att behålla mer känsliga cellulära strukturer.
  3. Ta bort paraformaldehyd och skölj tre gånger med 1x PBS.
  4. Fläcka fasta NCC med ett lämpligt färgämne för morfologisk bedömning. Som ett exempel beskrivs färgning med Oregon Green konjugerat falloidin här.
    OBS: Visualisering av aktincytoskelettet med falloidin19 avslöjar den strukturella komplexiteten hos migrerande NCC med relativt enhetlig färgningsintensitet; Falloidin kan dock inte markera alla cellområden. Färgämnen som märker plasmamembranet (t.ex. vetegroddaragglutinin eller DiI) eller cytoplasma kan också användas, men komplicerar avbildningen av fina utsprång i förhållande till den starkt färgande cellkroppen. Dessutom kan immunofluorescens utföras samtidigt för att märka neurala vapenceller med HNK-1 eller för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett protein av intresse 7,20.
    1. Ta bort den slutliga PBS-sköljningen och tillsätt PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% serum (FBS eller från ett annat djur som är lämpligt för kostaining med en antikropp) för att täcka täckglasen och inkubera i 10 minuter på en plattformsskakare vid rumstemperatur.
    2. Pipet 200 nM Oregon Green konjugerat falloidin (utspätt i PBST + 5% serum) på en slät yta (t.ex. flexibel paraffintätningsfilm) för varje täckglas. För en 12 mm täckglas, pipettera en volym på 30 μl.
    3. Använd ett par pincett, ta bort täckglaset från PBST + 5% serum, så att cellerna behåller orienteringen av cellerna uppåt. Rör kort vid kanten på täckglaset till en känslig uppgiftstorkare för att transportera bort överflödig vätska.
    4. Placera försiktigt varje täckbladscellsida ner på droppen av utspädd falloidin. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur. Håll täckglasen i mörkret under färgning (täck med en aluminiumfolieklädd skål eller placera i en låda).
    5. Under inkubationen tillsätt PBST till odlingsskålens brunnar (750 μL PBST för varje brunn på en 24-brunnsplatta).
    6. Efter inkubationsperioden, lyft av täckglasen från färgningslösningen och lägg tillbaka dem i odlingsskålen och vänd täckglaset så att cellsidan är uppe. Se till att täckglaset är täckt med PBST och placera det på en plattformsskakare i 10 minuter, håll täckglasen täckta och i mörkret. Ta bort PBST och upprepa detta steg två gånger, totalt tre 10 min tvättar.
    7. Placera en droppe (per täckglas) monteringsmedia (se materialtabell) på ett mikroskopglas. 25 μl volym fungerar bra för en 12 mm täckglas.
    8. Efter den sista tvätten med PBST, rör vid kanten på täckglaset till en känslig uppgiftstorkare för att ta bort överflödig vätska och håll reda på cellsidan på täckglaset.
    9. Montera täckglascellens sida nedåt genom att långsamt sänka täckglaset i vinkel mot monteringsmediet för att undvika att skapa bubblor. Låt mediet ställas in före avbildning.

8. Morfologisk bedömning av odlade migrerande NCC

  1. Bild färgade celler och exportera som .tiff filer.
    OBS: Ett 40x-mål fungerar bra för bildkulturer, men mål som sträcker sig från 10x (för att fånga ett helt fält av migrerande NCC) till 100x (enstaka NCC) kan användas för att samla in bilder för morfologisk bedömning. Bilder i den aktuella studien togs med hjälp av en inverterad multimodal bildplattform (se materialförteckning).
  2. Ladda upp bilderna till ett bildanalysprogram (ImageJ21, se Materialförteckning). Klicka på Bild > duplicera för att skapa en andra kopia av varje bild som ska användas för analys, vilket lämnar originalet oredigerat, eftersom de flesta bildbehandlingar inte kan vändas.
  3. Klicka på Bild > Justera > ljusstyrka / kontrast och använd skjutstänger för att justera ljusstyrkan eller kontrasten på bilderna.
  4. Konvertera bilderna till gråskala enligt stegen nedan.
    1. Om bilder exporteras i RGB laddas de upp i RGB som en sammanslagen kanal. För att separera bilderna, klicka på Bild > färg > Delade kanaler för att få enkanaliga gråskalebilder.
    2. Om bilderna redan är separerade går du till Bild > Skriv > 8-bitars för att konvertera fil till gråskala.
  5. Klicka på Bild > Justera > tröskelvärde för att konvertera till en binär bild där pixlar identifieras som celler (förgrund; svart) eller bakgrund (vit). Använd skjutfältet och / eller klicka på Auto för att välja tröskelinställningen som tydligt definierar celler från bakgrunden.
    1. Om cellerna överlappar varandra eller om färgningen inte är kontinuerlig kan det vara nödvändigt att bearbeta vidare med hjälp av funktionerna Vattendelare eller Fyllningshål22. Detta kommer att separera celler från varandra eller fylla i luckor i celler som ska analyseras. Klicka på Process > Binary > Make Binary för att först konvertera bilden till ett 8-bitars binärt format. Klicka sedan på Process > Binary > Watershed eller Fill Holes.
      OBS: Programvaran passar bäst för var signaler måste separeras eller fyllas i, som kan justeras ytterligare med hjälp av plug-ins om det behövs.
  6. Välj de mätningar som ska fångas. Klicka på Analysera > ställa in mätningar och markera rutorna för formbeskrivare för analys av cirkularitet (cirkularitet), bildförhållande (AR), rundhet (rund) och soliditet.
    OBS: Andra mätningar kan också inkluderas, som Area och Perimeter, beroende på vilken typ av analys som behövs.
  7. Klicka på Analysera > analysera partiklar och ställ in parametrarna från menyn "Analysera partiklar".
    1. Under "Storlek", uppskatta grovt hur stora cellerna eller partiklarna av intresse är i pixlar, eftersom bakgrundssignal eller mindre cellskräp också kommer att inkluderas om parametern Storlek förblir inställd på 0-Infinity (till exempel inställd som 500-Infinity i figur 5).
      OBS: Justering av storleken till ett snävare intervall kan utesluta mindre eller större partiklar än de som behövs för analys.
    2. Under "Cirkularitet", lämna vid 0-1,0 för att mäta alla cellformer i bilden.
    3. Under "Visa" väljer du Nakna konturer från rullgardinsmenyn för att inspektera cellkonturerna som valts med funktionen "Analysera partiklar". Skanna konturerna för att säkerställa att överlappande celler särskiljs, men celler delas inte i onödan. Markera också menyrutorna för "Visa resultat", "Sammanfatta" och "Lägg till i chef".
  8. När alla parametrar har ställts in klickar du på Ok.
    OBS: Fyra separata fönster dyker upp och visar (1) de nakna konturerna av cellerna som identifieras i bilden, (2) cellerna som räknas i bilden, (3) resultaten av varje cells mätningar och (4) en sammanfattning av det totala antalet celler som räknats och deras genomsnittliga mätningar.
    1. Om skräp räknades räknades överlappande celler som en, enstaka celler räknades som multiplar, eller många celler utelämnades från räkningen, gå tillbaka till den ursprungliga, oredigerade bilden, gör en annan dubblett och justera "Tröskel" eller andra parametrar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En översikt över detta protokoll visas i figur 1. De inkuberade äggen öppnades och äggulan, med embryot på ytan, isolerades genom att försiktigt hälla i handflatan på en handske (figur 2A,B). Efter att ha rensat bort albuminet (figur 2C) applicerades filterpappersramar på äggulans membran som omger embryot för att underlätta skärning och lyftning av embryot från äggulan, som börjar spillas bort när äggulans membran har skurits (figur 2D,E).

Figure 2
Figur 2: Isolering av fyra till sju somitkycklingembryon. Befruktade ägg inkuberades i 35 timmar. Ett ägg öppnades med trubbiga pincett (A) och äggulan hälldes i en handske (B). Överskott av albumin avlägsnades (C) så att ett filterpappersstöd (D, infällt) skulle fästa vid äggulan. Embryot skars från äggulan (D), lyftes av (E) och placerades i Ringers P/S (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter sköljning av embryot och förflyttning för att rengöra Ringers P/S var neurala veck synliga i de isolerade embryona (figur 3A). Dessa veck innehåller premigrativa kraniala neurala vapenceller. När isolerade neurala veck har tagits ut från ett embryo (figur 3B,C) och samlats in (figur 3D) kan de pläteras för att skapa migrerande NCC-kulturer.

Figure 3
Figur 3: Dissektion av kyckling dorsala neurala veck. Fjädersaxen arbetade i Ringers P/S och användes för att skära ut neurala veck. (A) Embryo dorsal vy, främre mot toppen av figuren. Neurala veck verkar mer ogenomskinliga än den omgivande vävnaden. Midbrain neurala veck ligger bakom de optiska loberna (rosa) och främre till hjärtmånen (gul). (B) Dorsalvy av embryot efter att neurala veck avlägsnats, vilket visar excisionsgränser. (C) Sidovy av embryot med neurala veck avlägsnade. Dissektionstekniken tar bort dorsala neuralröret och undviker ventrala och icke-neurala rörstrukturer. (D) Isolerade neurala veck i Ringers P/S. Skalstång = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

När neurala veck pläterades på FN började NCC dyka upp från vidhäftande neurala vikplanter inom 3-4 h efter inkubation (figur 4A), och migrationen slutfördes efter cirka 20 timmar (figur 4B). HNK-1-färgning, som märker migrerande NCC20, var uppenbar i de flesta celler i kulturen (figur 4D). Ett negativt resultat inträffade när neurala veck inte kunde fästa vid täckglaset, eller ingen NCC emigrerade från explanten (data visas inte). NCC analyserades genom att fixera kulturerna, färga för trådformigt aktin och utföra olika mätningar i ImageJ för att utvärdera NCC-morfologi och migration (figur 5). Medelarean för de 69 analyserade cellerna var 802,11 ± 69,65 μm 2, med ett intervall från 60,27-2664,53 μm2, fördelat som visas i stapeldiagrammet och fioldiagrammet (figur 5C). Cirkularitet (formel: cirkularitet = 4π (area / omkrets²)), ett mått som återspeglar en cells utsprång, varierade från 0,101-0,875, med ett genomsnitt på 0,38 ± 0,15. Lägre värden indikerar en långsträckt form, medan ett värde på 1 indikerar en perfekt cirkel. Som framgår av fiolplottet uppvisar de flesta celler en långsträckt form (figur 5D). Ett annat mått på cellform är bildförhållandet (AR), som är cellens huvudaxel dividerat med den mindre axeln. Ett AR-värde på 1 indikerar en symmetrisk form23. Migrerande NCC inom detta område hade en genomsnittlig AR på 2,13 ± 0,11, med värden från 1,14-5,59 (figur 5E). Med hjälp av dessa kvantitativa mått på NCC-morfologi kan rigorösa jämförelser göras mellan experimentella förhållanden och olika publicerade studier.

Figure 4
Figur 4: Migrerande NCC kommer från odlade neurala veck. Brightfield-bilder av pläterade neurala veck efter 3 timmars inkubation (A) och 20 h inkubation (B). Skalstreck = 200 μm. (C,D) Neuralvecket är till stor del dispergerat efter 20 timmars inkubation men finns kvar på höger sida av dessa bilder. Skalstreck = 500 μm. Migrerande NCC är synliga med DAPI (C) och HNK-1 färgning (D). HNK-1 immunfärgning bekräftar att odlade celler är migrerande NCC. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Morfologisk bedömning av odlade migrerande NCC. (A) Falloidinfärgning av trådformigt aktin i NCC migrerade från en neural vik efter 20 timmar i odling. Skalstreck = 50 μm. (B) Tröskelbild med celler som ser svarta ut och bakgrunden vit. Gula konturer omger objekt som räknas som celler och celler numreras. (C–E) Diagramalternativ för att visa morfologiska bedömningsdata. Stapeldiagram och fioldiagram skapades från mätningar av de 69 celler som visas i panel B för att visa arean (μm2, C), cirkulariteten (D) och bildförhållandet (E) för de uppmätta cellerna. Stapeldiagram visar medelvärden med felstaplar som representerar medelfelet till vänster om varje panel. Fiolplottar skapades med app.rawgraphs.io. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tekniken som beskrivs här ger en anpassningsbar metod för att isolera kycklingneurala veck och plätera dem för att skapa kulturer av migrerande kraniala NCC. Dessa kulturer ger förenklade 2D-förhållanden för enkel analys av kyckling NCC-migration och morfologi som kan komplettera mer tekniskt utmanande i ovo-avbildningsmetoder24,25,26. Även om denna in vitro-metod är relativt enkel, beror konsekventa resultat på högkvalitativa ägg och reagenser. Dessutom, på grund av den inneboende variationen hos kulturerna, kräver reproducerbarhet experimentell upprepning och kvantifiering.

Vidhäftningen av neurala veck till FN är avgörande för NCC-migration i kulturen. Ibland kommer explanter inte att fästa ordentligt, och neuralvecket kommer antingen att flyta bort eller producera inga / få migrerande NCC. Detta kan hända när en kranial neural vik inte landar snittsidan nedåt; Försök att orientera explanterna i odlingskärlet före inkubation och låt dem sätta sig i 10-15 min innan du flyttar dem. På grund av vätskeblandning under överföring till inkubatorn kommer emellertid vissa neurala veck oundvikligen att fästa suboptimalt från tid till annan. När vidhäftning och migration är problematiska för ett helt experiment kan detta återspegla gammal FN (använd en ny alikvot från -80 °C för varje experiment), odlingsmedium med utgångna komponenter (lagringsmedier beredda i alikvoter i experimentstorlek vid -20 °C och tillsätt färskt antibiotikum vid användningstillfället) eller användning av täckglas som inte är lämpliga för cellodling (t.ex. celler kommer inte att fästa vid täckglas för histologi). En förorenad inkubator kan också orsaka att hela NCC-odlingsexperiment misslyckas.

Förutom att producera dispergerade NCC i odling och möjliggöra analys av migrerande NCC-morfologi, är detta protokoll också en utgångspunkt för många andra experiment. Explanter pläterade på täckglas kan också bearbetas för immunofluorescens (efter avsnitt 7, steg 3) för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett protein av intresse7. Medan analys av morfologi och migrationsavstånd är möjliga i fasta kulturer, som beskrivs här, möjliggör time-lapse-avbildning av NCC under odlingsinkubation (avsnitt 6, steg 5) ytterligare datainsamling om riktning och persistens av migration och dynamik i cellmotilitet (mätningar av membranutsprång, vidhäftning etc.) 14,24,27. Övergående genmanipulation av embryon kan uppnås genom elektroporering 18,28 av reagenser (morpholinos29, DNA-uttryckskonstruktioner eller CRISPR-vektorer30) vid Hamburger och Hamilton steg 4+17. Dessa elektroporerade embryon kan sedan användas i protokollet för att skapa migrerande NCC-kulturer med funktionsförlust eller överuttryck av gener av intresse. Funktionell analys kan också uppnås genom att tillsätta kemiska hämmare till mediet i NCC-kulturerna 7,27 (avsnitt 6, steg 2). Profilering på populationsnivå av NCC genom analyser på -omics-nivå kräver insamling av NCC som råmaterial 7,11,31. Medan markörer har använts för att isolera NCC genom fluorescensaktiverad cellsortering31, kräver detta specialiserad flödescytometriutrustning och enzymatisk dissociation av celler. Att följa de metoder som beskrivs här för att noggrant skära ut dorsala neurala veck (minimera insamling av ventrala neurala rör och icke-neurala ektodermceller) ger en billig metod för att samla in premigrativa NCC11 (avsnitt 5, steg 4). Insamling av NCC efter spridning i odling (avsnitt 6, steg 5) ger en relativt ren population av naturligt segregerade, migrerande NCC för vidare analys (HNK-1-färgning, en markör för migrerande NCC, i majoriteten av odlade celler i figur 4D; som i7). Slutligen kan dessa variationer användas i kombination. Till exempel kan immunofluorescens eller time-lapse-avbildning användas för att utvärdera effekterna av genuttrycksmanipulationer eller tillsats av hämmare27. Sammantaget ger detta anpassningsbara, billiga protokoll medel för att bedöma morfologin hos vildtypskraniella migrerande NCC i kultur med flera potentiella modifieringar för att uppnå olika experimentella mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi tackar Corinne A. Fairchild och Katie L. Vermillion, som deltog i utvecklingen av vår version av chick cranial neural fold culture protocol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
  2. Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
  3. Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
  4. McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
  5. Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
  6. Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
  7. Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
  8. Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  9. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
  10. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
  11. Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
  12. Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
  13. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
  14. Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
  15. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
  16. Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
  19. Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
  20. Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
  23. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  24. Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  25. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
  26. McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
  27. Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
  28. Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  29. Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
  30. Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
  31. Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 184
Beredning och morfologisk analys av kycklingkraniala neurala vapencellkulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacques-Fricke, B. T.,… More

Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter