Summary
Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.
Abstract
Tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren migreren neurale crestcellen (NCC's) uitgebreid en differentiëren ze in verschillende celtypen die bijdragen aan structuren zoals het craniofaciale skelet en het perifere zenuwstelsel. Hoewel het van cruciaal belang is om NCC-migratie te begrijpen in de context van een 3D-embryo, vergemakkelijkt het isoleren van migrerende cellen in 2D-cultuur visualisatie en functionele karakterisering, als aanvulling op embryonale studies. Het huidige protocol demonstreert een methode voor het isoleren van kuiken craniale neurale plooien om primaire NCC-culturen te genereren. Migrerende NCC's komen voort uit neurale vouwexplantaten die op een met fibronectine gecoat substraat zijn geplaatst. Dit resulteert in verspreide, aanhangende NCC-populaties die kunnen worden beoordeeld door kleuring en kwantitatieve morfologische analyses. Deze vereenvoudigde cultuurbenadering is zeer aanpasbaar en kan worden gecombineerd met andere technieken. NCC-emigratie en migratiegedrag kunnen bijvoorbeeld worden geëvalueerd door time-lapse-beeldvorming of functioneel worden bevraagd door remmers of experimentele manipulaties van genexpressie op te nemen (bijv. DNA, morfolino of CRISPR-elektroporatie). Vanwege zijn veelzijdigheid biedt deze methode een krachtig systeem voor het onderzoeken van craniale NCC-ontwikkeling.
Introduction
Neurale kamcellen (NCC's) zijn een voorbijgaande celpopulatie in gewervelde embryo's. NCC's worden gespecificeerd aan de randen van de neurale plaat en ondergaan een epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) om te migreren vanuit de dorsale neurale buis1. Na EMT verspreiden NCC's zich uitgebreid door het embryo, waardoor uiteindelijk onderscheid wordt gemaakt en wordt bijgedragen aan verschillende structuren, waaronder het craniofaciale skelet, het uitstroomkanaal van het hart en het grootste deel van het perifere zenuwstelsel2. Veranderingen in celpolariteit, het cytoskelet en adhesie-eigenschappen liggen ten grondslag aan deze verschuiving van een premigratory naar een migrerende celpopulatie3. Het bestuderen van NCC EMT en migratie biedt inzicht in fundamentele mechanismen van celmotiliteit en informeert inspanningen om geboorteafwijkingen en kankermetastase te voorkomen en te behandelen.
Hoewel in vivo analyse van vitaal belang is voor het begrijpen van NCC-ontwikkelingsprocessen in een embryonale context, bieden in vitro methoden visuele en fysieke toegankelijkheid die aanvullende experimentele wegen mogelijk maakt. In een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen NCC-morfologie, cytoskeletstructuren en gemigreerde afstand worden geëvalueerd. Bovendien kunnen de effecten van genetische of oplosbare factorverstoring op migratiegedrag van beweeglijke NCC's worden geanalyseerd 4,5,6,7,8,9,10. Bovendien kunnen geïsoleerde premigratory of migrerende NCC's worden verzameld, gepoold en gebruikt voor high-throughput methodologieën om de ontwikkelingsregulatie van NCC's te bestuderen door middel van proteomische, transcriptomische en epigenomische profilering 7,11. Hoewel er methoden beschikbaar zijn voor het bereiden van craniale NCC's van verschillende ontwikkelingsmodelorganismen 12,13,14, demonstreert dit artikel de mechanica van de aanpak voor degenen die voor het eerst leren om craniale NCC te kweken uit kuikenembryo's.
Het huidige protocol beschrijft een veelzijdige techniek voor het bereiden van kuiken craniale NCC-culturen (figuur 1). Omdat NCC's gemakkelijk migreren van geëxplanteerde neurale plooien naar een kweeksubstraat, scheiden kuiken-NCC's zich op natuurlijke wijze van embryonaal weefsel en worden primaire culturen gemakkelijk gegenereerd. Aangezien midbrain NCCs massaal migreren uit de craniale neurale plooien (in tegenstelling tot de langdurige, cel-voor-cel delaminatie in de stam15), bestaan deze culturen voornamelijk uit migrerende craniale neurale crest-cellen, waarbij initiële neurale vouwexcisie een verzamelmethode biedt voor premigratory NCC's. Een basismethode voor het ontleden en kweken van kuiken craniale neurale plooien is gedetailleerd en suggesties voor verschillende toepassingen en variaties op deze methode worden aangeboden.
Figuur 1: Schematisch overzicht van het kuiken craniale neurale vouwcultuurprotocol. (A,B) Craniale neurale plooien (omlijnd in blauw) worden weggesneden uit een kuikenembryo met vijf somites (weergegeven in dorsale weergave in A). Grijze banden, cardiale halve maan. (C) Wanneer ze op fibronectine worden geplaatst, komen migrerende neurale kamcellen uit de neurale plooien en verspreiden zich op het substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Elke variëteit van Gallus gallus rassen kan worden gebruikt, met inbegrip van White Leghorn, Golden Sex Link, of Rhode Island Red. De kippeneieren die in deze studie werden gebruikt, waren van verschillende rassen en verkregen uit meerdere bronnen, waaronder lokale boerderijen en broederijen.
1. Bereiding van oplossingen en materialen
- Bereid de oplossing van Ringer door 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2HPO4 en 0,147 mM KH2PO4 te mengen (zie Materiaaltabel). Stel de pH in op 7,4 en filter steriliseer in flessen van 100 ml. Bewaren op een schone, droge plaats. Was flessen niet met zeep (behandel als tissuekweekglaswerk).
- Bereid 1 mg/ml stamoplossing fibronectine (FN) (zie materiaaltabel) door FN op te lossen in steriele Ringer-oplossing en bewaar in 100 μL aliquots bij -80 °C (stabiel gedurende ten minste 4 jaar).
- Bereid complete kweekmedia voor door L15-media aan te vullen met 0,8% L-glutamine, 0,08% penicilline / streptomycine, 10% FBS en 10% kuikenembryo-extract12. Maak aliquots van 3 ml en bewaar bij -20 °C of -80 °C.
OPMERKING: Als culturen worden geïncubeerd in een CO2-incubator , moet DMEM / F12 worden vervangen door L15, dat wordt gebufferd voor lucht. - Bereid 4% paraformaldehyde-oplossing in 1x PBS. Stel de pH in op 7,4. Maak aliquots van 10 ml en bewaar ze bij -20 °C.
LET OP: Paraformaldehyde moet in een zuurkast worden gehanteerd. - Bereid filterpapiersteunframes voor (ongeveer 1 cm x 1,5 cm rechthoeken papier met twee of drie geponste gaten die elkaar overlappen op de lange as).
- Pons gaten langs de rand van een groot stuk filterpapier met behulp van een standaard pons met drie gaten, snijd / trim de geponste rand in een strook en snijd vervolgens de strook tussen de gaten in rechthoeken ~ 1,5 cm lang. Autoclaaf filterpapier voor gebruik (optioneel).
- Verzamel dissectiegereedschappen, waaronder fijne tangen (# 5), stompe tangen, dissectiescharen, veerscharen en geslepen wolfraamnaalden16.
2. Embryo-incubatie
- Verkrijg bevruchte eieren uit een van de hierboven genoemde bronnen.
- Plaats de bevruchte eieren in een rechtopstaande positie (lange as van het ei verticaal met het puntige uiteinde naar beneden / stompe kant naar boven) in een bevochtigde incubator bij 38 ° C (100 ° F).
- Incubeer totdat zich vier tot zeven somites hebben gevormd (stadia 8+-9)17, wat ongeveer 35 uur duurt.
OPMERKING: De incubatietijd kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de stam, leeftijd van de kippen, het seizoen, enz., En moet experimenteel worden bepaald. Programmeerbare uitlaattimers zijn handig voor het initiëren van incubatie tijdens de nacht om de gewenste timing te verkrijgen. - Na het verwijderen uit de incubator, besproei de eieren grondig met 70% ethanol en laat ze drogen om de schelpen te desinfecteren.
OPMERKING: Embryo's kunnen onmiddellijk worden verzameld, maar door eieren af te laten koelen tot kamertemperatuur neemt de kwetsbaarheid van de dooiers en het verlies van embryo's tijdens het verzamelen af.
3. Bereiding van cultuurgerechten
- Selecteer neurale vouwcultuurschalen (zie Tabel met materialen) die geschikt zijn voor de downstream-toepassing.
- Voor culturen die worden gefixeerd en gebrandschilderd, gebruikt u glazen afdekplaten die in weefselkweekschalen met meerdere putten worden geplaatst.
OPMERKING: Coverslips die overeenkomen met de putgrootte zullen minder bewegen met vloeistofmenging, waardoor explants minder snel verschuiven en meer kans hebben om zich aan de coverslip te hechten in plaats van aan de bodem van de schotel. - Selecteer schotels met glazen bodem en één kamer of schotels met een gedeelde kamer (zie Materiaaltabel) voor live beeldvorming met een omgekeerde microscoop.
- Gebruik voor live beeldvorming op een rechtopstaande of stereomicroscoop 6-, 12- of 24-wells optisch geschikte weefselkweekplaten.
- Selecteer plastic weefselkweekschalen voor de massaverzameling van migrerende neurale crest-cellen voor high-throughput analyses.
- Voor culturen die worden gefixeerd en gebrandschilderd, gebruikt u glazen afdekplaten die in weefselkweekschalen met meerdere putten worden geplaatst.
- Voeg 10 U / ml penicilline en 10 μg / ml streptomycine toe aan een fles steriele Ringer's oplossing van 100 ml (bijvoorbeeld 100 μl van 10.000 U / ml penicilline en 10.000 μg / ml streptomycine, om Ringer's P / S te maken). Gebruik Ringer's P/S binnen 1 week.
- Ontdooi een aliquot van 1 mg/ml FN op ijs. Verdun met Ringer's P/S tot een concentratie van 10-100 μg/ml FN.
- Pipetteer voldoende FN-oplossing om de bodem van de put of schotel te bedekken. Bijvoorbeeld 100 μL per put in een 24-well plaat, 500 μL voor een 35 mm schotel.
- Vervang het deksel en incubeer gerechten of borden met FN-oplossing in een bevochtigde incubator (of een afgedekte lade met gedestilleerde, in water gedrenkte papieren handdoeken) bij 38 ° C (100 ° F) gedurende ten minste 1 uur terwijl neurale plooien worden ontleed.
4. Isolatie van kuikenembryo's
- Zorg ervoor dat de oriëntatie van het ei behouden blijft (het embryo drijft tijdens de incubatie naar de top van de dooier). Gebruik een schaar of stompe tang om een klein gaatje in de schaal te prikken, ongeveer 1/4-1/3 van de weg langs de lengte van het ei.
- Steek voorzichtig de punt van een schaar of stompe tang in het kleine gaatje, zorg ervoor dat de dooier niet wordt verstoord en snijd door de eierschaal rond het ei en verwijder de bovenkant van de eierschaal (figuur 2A).
- Plaats het embryo voor isolatie.
OPMERKING: Als het embryo zich niet ideaal in de schaalbeker bevindt, gebruik dan een stompe tang om de dooier voorzichtig te draaien, zodat het embryo bovenaan staat. U kunt de dooier ook in een gehandschoende, gecupte hand gieten, waarbij u oppast dat de dooier niet breekt en de albumine wegloopt (figuur 2B). Vervolgens kan het embryo worden gepositioneerd door de dooier van hand naar hand te bewegen. - Bereid het embryo voor door voorzichtig de platte rand van een gesloten stompe tang te gebruiken om overtollig albumine dat achterblijft op het oppervlak van de dooier dat het embryo bedekt, weg te vegen (figuur 2C). Overtollig albumine kan ook worden verwijderd met zachte druk met een delicate taakwisser.
OPMERKING: Zodra albumine is opgeruimd, moet het oppervlak van de dooier er gestructureerd uitzien in plaats van glad. Als u niet voldoende albumine wegveegt, wordt de hechting van de filterpapiersteun in sectie 4, stap 4, geremd. - Gebruik een tang om een filterpapieren steunframe over het embryo te plaatsen, met het embryo in het raam van het frame. Druk zachtjes op het filterpapier om het op de dooier te plakken.
- Knip rond de buitenkant van het filterpapierframe met een dissectieschaar (figuur 2D). Gebruik een tang of schaarpunten om de rand van het frame vast te pakken en til het embryo voorzichtig weg van de dooier (figuur 2E). Door onder een hoek weg te tillen, wordt het embryo netjes uit de dooier verwijderd.
- Plaats het embryo met de papierframezijde naar beneden (embryo ventrale kant naar boven) in een petrischaal van 60 mm of 100 mm gevuld met Ringer's P/S (figuur 2F). Bewaar de schaal met embryo's op ijs als het wordt verzameld voor een RNA- of eiwitgevoelige downstream-toepassing.
OPMERKING: Als u embryo's niet ventraal naar boven plaatst, loopt u het risico dat ze van hun papieren frames worden losgemaakt. Meerdere embryo's kunnen tot 1 uur worden verzameld en opgeslagen in Ringer's P / S voordat ze naar de neurale vouwdissectiestappen gaan.
5. Neurale plooien ontleden
- Breng een embryo over naar een schone schaal met Ringer's P / S-oplossing en spoel het embryo door het filterpapierframe met een tang vast te houden en voorzichtig heen en weer te zwenken om alle dooier weg te nemen die het zicht op het embryo verduistert. Ruil de Ringer's P/S of breng over naar een vers gerecht als het troebel wordt.
- Plaats het embryo dorsaal/frame met de zijkant naar boven onder een ontleedmicroscoop. Laat het embryo op het papieren frame liggen om het strak uitgerekt en op zijn plaats te houden, verwijder het vitellinemembraan met behulp van een tang om de neurale plooien bloot te leggen.
OPMERKING: Als het embryo van het papieren frame valt, kan het plat in de schaal worden gelegd of worden vastgepind op een sylgard-gecoate schaal18 voor dissectie. - Gebruik een veerschaar of een geslepen wolfraamnaald om de neurale plooien van de middenhersenen voorzichtig weg te snijden. Neem weefsel caudaal op aan de uitdijende optische blaasjes en rostral aan de achterhersenen, waar rhombomeervernauwingen net beginnen te verschijnen (de cardiale halve maan is ook een nuttige indicator, figuur 3B, C). Zorg ervoor dat u het dorsale aspect van de neurale vouw wegsnijdt met minimale vervuilende neurale buis en niet-neuraal ectoderm (figuur 3C).
- Breng de neurale plooien over naar een schone schaal met Ringer's P / S met behulp van een P20-pipettor of een steriele, glazen Pasteur-pipet gespoeld met dooier Ringer's P / S (dit blokkeert het plastic of glas om te voorkomen dat het weefsel plakt). Bewaar verzamelde plooien op ijs terwijl extra plooien worden ontleed.
6. Plating neurale plooien
- Ontdooi een aliquot van complete cultuurmedia (paragraaf 1, stap 3). Voeg 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine toe en filtersteriliseer. Houd voorbereide media op 37-38 °C terwijl u andere stappen uitvoert.
- Verwijder kweekschalen uit de incubator (sectie 3, stap 5). Verwijder met behulp van een pipettor of Pasteur-pipet de FN-oplossing uit coverslips, schotels of putten. Voeg na het spoelen van het FN-gecoate substraat met Ringer's P/S een geschikt volume complete kweekmedia toe aan de schotels of putten (500 μL voor putten in een 24-well plaat, 2 ml voor een 35 mm schaal of een zes-well plaat).
OPMERKING: Kleinere volumes kunnen dure reagentia behouden (bijvoorbeeld zo laag als 200 μL voor een 24-well plaat), maar zorgen ervoor dat het gerecht voldoende bevochtigd is om verdamping te voorkomen. - Gebruik een p20- of p200-pipettor om eerst de pipetpunt af te spoelen met de P / S van de dooier Ringer om het plastic te blokkeren en te voorkomen dat het weefsel plakt. Breng vervolgens de geïsoleerde neurale plooien over op de FN-gecoate coverslips en zorg ervoor dat de P / S van Ringer zo min mogelijk wordt overgedragen. Plaats de vouw(en) in het midden van de FN-gecoate coverslip.
OPMERKING: Een of enkele neurale plooien kunnen worden verguld op een 12 mm coverslip in een put van 19 mm, tot 50 op een plaat van 35 mm. - Nadat u de explantaten 10-15 minuten hebt laten bezinken, plaatst u ze in een bevochtigde kamer bij 38 ° C (100 ° F) door de kweekschalen langzaam en voorzichtig met vergulde neurale plooien te dragen. Dit minimaliseert het verschuiven van neurale plooien in de putten, zorgt ervoor dat ze verspreid blijven en zich hechten aan eventuele coverslips.
OPMERKING: Bij gebruik van L15 (niet DMEM) kunnen explantcultuurschalen ook worden geïncubeerd in een eierincubator met behulp van een afgedekte lade met bevochtigde papieren handdoeken. - Incubeer neurale vouwculturen in de bevochtigde incubator voor de duur van actieve migratie (ongeveer 16-20 uur totaal, figuur 4).
7. Fixatie en kleuring van gekweekte migrerende NCC's voor morfologische analyse
- Verwijder de kweekmedia met een Pasteur pipet en spoel de putjes af met filter-gesteriliseerde 1x PBS.
- Voeg 4% paraformaldehyde toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De fixatietijd moet mogelijk experimenteel worden bepaald. Het is ook mogelijk om paraformaldehyde rechtstreeks aan media toe te voegen gedurende 10 minuten (50:50), te verwijderen en te vervangen door onverdunde 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten om meer delicate cellulaire structuren te behouden. - Verwijder paraformaldehyde en spoel drie keer met 1x PBS.
- Beits vaste NCC's met een geschikte kleurstof voor morfologische beoordeling. Als voorbeeld, kleuring met Oregon Green geconjugeerd falloïdine wordt hier beschreven.
OPMERKING: Het visualiseren van het actinecytoskelet met falloïdine19 onthult de structurele complexiteit van migrerende NCC met relatief uniforme kleuringsintensiteit; phalloidine kan echter niet alle celgebieden markeren. Kleurstoffen die het plasmamembraan labelen (bijv. Tarwekiem agglutinine of DiI) of cytoplasma kunnen ook worden gebruikt, maar bemoeilijken de beeldvorming van fijne uitsteeksels ten opzichte van het fel kleurende cellichaam. Bovendien kan immunofluorescentie gelijktijdig worden uitgevoerd om neurale crest-cellen te labelen met HNK-1 of om de subcellulaire lokalisatie van een eiwit van belang te bepalen 7,20.- Verwijder de uiteindelijke PBS-spoeling en voeg PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% serum (FBS of van een ander dier dat geschikt is om met een antilichaam te planten) toe om de coverslips te bedekken en gedurende 10 minuten te incuberen op een platformschudder bij kamertemperatuur.
- Pipet 200 nM Oregon Green geconjugeerd falloïdine (verdund in PBST + 5% serum) op een glad oppervlak (zoals flexibele paraffineafdichtingsfilm) voor elke coverslip. Pipetteer voor een afdeklip van 12 mm een volume van 30 μL.
- Verwijder met behulp van een tang de coverslip van het PBST + 5% serum en zorg ervoor dat de oriëntatie van de cellen naar boven gericht blijft. Raak kort de rand van de afdekplaat aan op een delicate taakwisser om overtollige vloeistof af te voeren.
- Plaats elke coverslip celzijde voorzichtig naar beneden op de druppel verdund falloïdine. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Houd de coverslips in het donker tijdens het kleuren (dek af met een met aluminiumfolie bedekte schaal of plaats in een lade).
- Voeg tijdens de incubatie PBST toe aan de putten van de kweekschaal (750 μL PBST voor elke put van een bord met 24 putten).
- Na de incubatietijd til je de coverslips van de kleuringsoplossing en plaats je ze terug in de kweekschaal, waarbij je de coverslip omdraait zodat de celkant omhoog is. Zorg ervoor dat de coverslip bedekt is met PBST en plaats deze gedurende 10 minuten op een platform shaker, waarbij de coverslips bedekt en in het donker blijven. Verwijder PBST en herhaal deze stap twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten van 10 minuten.
- Plaats één druppel (per coverslip) van montagemedia (zie Materiaaltabel) op een microscoopglaasje. 25 μL volume werkt goed voor een 12 mm coverslip.
- Na de laatste wasbeurt met PBST raakt u de rand van de afdeksel aan op een delicate taakwisser om overtollige vloeistof te verwijderen en de celzijde van de afdekplaat bij te houden.
- Monteer de coverslipcel met de zijkant naar beneden door de coverslip langzaam onder een hoek op de montagemedia te laten zakken om te voorkomen dat er bubbels ontstaan. Laat de media instellen voordat u de afbeelding maakt.
8. Morfologische beoordeling van gekweekte migrerende NCC's
- Afbeelding gekleurd cellen en exporteren als .tiff bestanden.
OPMERKING: Een 40x-doelstelling werkt goed voor beeldvormingsculturen, maar doelstellingen variërend van 10x (om een heel veld van migrerende NCC's vast te leggen) tot 100x (enkele NCC's) kunnen worden gebruikt om beelden te verzamelen voor morfologische beoordeling. Beelden in deze studie werden vastgelegd met behulp van een omgekeerd multimodaal beeldvormingsplatform (zie Materiaaltabel). - Upload de afbeeldingen naar een beeldanalysesoftware (AfbeeldingJ21, zie Materiaaltabel). Klik op Afbeelding > Dupliceren om een tweede kopie van elke afbeelding te maken om te gebruiken voor analyse, waardoor het origineel onbewerkt blijft, omdat de meeste beeldverwerking niet kan worden teruggedraaid.
- Klik op Afbeelding > > helderheid / contrast aanpassen en gebruik schuifbalken om de helderheid of het contrast van de afbeeldingen aan te passen.
- Converteer de afbeeldingen naar grijswaarden volgens de onderstaande stappen.
- Als afbeeldingen in RGB worden geëxporteerd, worden ze in RGB geüpload als een samengevoegd kanaal. Om de afbeeldingen te scheiden, klikt u op Afbeelding > Kleur > Kanalen splitsen om grijswaardenafbeeldingen met één kanaal te verkrijgen.
- Als afbeeldingen al gescheiden zijn, gaat u naar Afbeelding > Typ > 8-bits om het bestand naar grijswaarden te converteren.
- Klik op Afbeelding > > drempel aanpassen om te converteren naar een binaire afbeelding waarbij pixels worden geïdentificeerd als cellen (voorgrond; zwart) of achtergrond (wit). Gebruik de schuifbalk en/of klik op Automatisch om de drempelinstelling te selecteren die cellen vanaf de achtergrond duidelijk definieert.
- Als cellen elkaar overlappen of de kleuring niet continu is, kan het nodig zijn om verder te verwerken met behulp van de functies Watershed of Fill Holes22. Dit zal cellen van elkaar scheiden of gaten in cellen opvullen die moeten worden geanalyseerd. Klik op Process > Binary > Make Binary om de afbeelding eerst om te zetten in een 8-bits binair formaat. Klik vervolgens op Process > Binary > Watershed of Fill Holes.
OPMERKING: De software is het beste geschikt voor waar signalen moeten worden gescheiden of ingevuld, die indien nodig verder kunnen worden aangepast met behulp van plug-ins.
- Als cellen elkaar overlappen of de kleuring niet continu is, kan het nodig zijn om verder te verwerken met behulp van de functies Watershed of Fill Holes22. Dit zal cellen van elkaar scheiden of gaten in cellen opvullen die moeten worden geanalyseerd. Klik op Process > Binary > Make Binary om de afbeelding eerst om te zetten in een 8-bits binair formaat. Klik vervolgens op Process > Binary > Watershed of Fill Holes.
- Selecteer de metingen die moeten worden vastgelegd. Klik op Analyseren > Metingen instellen en vink de vakjes Vormbeschrijvingen aan voor analyse van Circulariteit (Cirkel.), Beeldverhouding (AR), Rondheid (Ronding) en Soliditeit.
OPMERKING: Andere metingen kunnen ook worden opgenomen, zoals gebied en perimeter, afhankelijk van het type analyse dat nodig is. - Klik op Analyseren > Deeltjes analyseren en stel de parameters in het menu "Deeltjes analyseren" in.
- Schat onder "Grootte" ruwweg hoe groot de cellen of interessante deeltjes in pixels zijn, omdat achtergrondsignaal of kleiner celafval ook wordt opgenomen als de parameter Grootte blijft ingesteld op 0-Oneindig (bijvoorbeeld ingesteld als 500-Oneindig in Figuur 5).
OPMERKING: Als u de grootte aanpast aan een kleiner bereik, kunnen kleinere of grotere deeltjes worden uitgesloten dan de deeltjes die nodig zijn voor analyse. - Laat onder "Circulariteit" op 0-1,0 staan om alle celvormen in de afbeelding te meten.
- Selecteer onder "Tonen" de optie Kale contouren in het vervolgkeuzemenu om de celcontouren te inspecteren die zijn geselecteerd met de functie "Deeltjes analyseren". Scan de contouren om ervoor te zorgen dat overlappende cellen worden onderscheiden, maar cellen niet onnodig worden gedeeld. Vink ook de menuvakken aan voor "Weergaveresultaten", "Samenvatten" en "Toevoegen aan manager".
- Schat onder "Grootte" ruwweg hoe groot de cellen of interessante deeltjes in pixels zijn, omdat achtergrondsignaal of kleiner celafval ook wordt opgenomen als de parameter Grootte blijft ingesteld op 0-Oneindig (bijvoorbeeld ingesteld als 500-Oneindig in Figuur 5).
- Zodra alle parameters zijn ingesteld, klikt u op OK.
OPMERKING: Er verschijnen vier afzonderlijke vensters met (1) de kale contouren van de cellen die in de afbeelding zijn geïdentificeerd, (2) de cellen die in de afbeelding zijn geteld, (3) de resultaten van de metingen van elke cel en (4) een samenvatting van het totale aantal cellen dat is geteld en hun gemiddelde metingen.- Als puin werd geteld, werden overlappende cellen als één geteld, werden afzonderlijke cellen geteld als veelvouden of werden veel cellen weggelaten uit de telling, ga terug naar de oorspronkelijke, onbewerkte afbeelding, maak een ander duplicaat en pas "Drempel" of andere parameters aan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1. De bebroede eieren werden geopend en de dooier, met het embryo op het oppervlak, werd geïsoleerd door voorzichtig in de palm van een gehandschoende hand te gieten (figuur 2A, B). Na het opruimen van het albumine (figuur 2C), werden filterpapierframes aangebracht op het dooiermembraan rond het embryo om het snijden en optillen van het embryo uit de dooier te vergemakkelijken, die begint weg te morsen zodra de dooiermembranen zijn doorgesneden (figuur 2D, E).
Figuur 2: Isolatie van vier tot zeven somietkuikenembryo's. Bevruchte eieren werden gedurende 35 uur bebroed. Een ei werd geopend met een stompe tang (A) en de dooier werd in een gehandschoende hand gegoten (B). Overtollig albumine werd verwijderd (C) zodat een filterpapiersteun (D, inzet) zich aan de dooier zou hechten. Het embryo werd uit de dooier (D) gesneden, opgetild (E) en in Ringer's P/S (F) geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na het spoelen van het embryo en het reinigen van Ringer's P/S waren neurale plooien zichtbaar in de geïsoleerde embryo's (figuur 3A). Deze plooien bevatten premigratory cranial neural crest cellen. Eenmaal weggesneden uit een embryo (figuur 3B, C) en verzameld (figuur 3D), kunnen geïsoleerde neurale plooien worden verguld om migrerende NCC-culturen te creëren.
Figuur 3: Dissectie van dorsale neurale plooien van kuikens. Werkend in Ringer's P / S, werden veerscharen gebruikt om neurale plooien te verwijderen. (A) Embryo dorsale weergave, voorste naar de bovenkant van de figuur. Neurale plooien lijken ondoorzichtiger dan het omliggende weefsel. Neurale plooien in de middenhersenen liggen achter de optische kwabben (roze) en voorste op de hartsikkel (geel). (B) Dorsale weergave van het embryo nadat neurale plooien waren verwijderd, met excisiegrenzen. (C) Lateraal zicht op het embryo met verwijderde neurale plooien. De dissectietechniek verwijdert de dorsale neurale buis en vermijdt ventrale en niet-neurale buisstructuren. (D) Geïsoleerde neurale plooien in Ringer's P/S. Schaalbalk = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toen neurale plooien op FN werden verguld, begonnen NCC's binnen 3-4 uur na incubatie uit aanhangende neurale vouwexplantaten te verschijnen (figuur 4A) en werd de migratie na ongeveer 20 uur voltooid (figuur 4B). HNK-1-kleuring, die migrerende NCC's20 labelt, was duidelijk in de meeste cellen in de cultuur (figuur 4D). Een negatief resultaat trad op wanneer neurale plooien zich niet aan de coverslip hechtten, of er geen NCC emigreerde uit de explant (gegevens niet getoond). NCC's werden geanalyseerd door de culturen te fixeren, te kleuren voor filamenteuze actine en verschillende metingen uit te voeren in ImageJ om de NCC-morfologie en migratie te evalueren (figuur 5). Het gemiddelde oppervlak van de 69 geanalyseerde cellen was 802,11 ± 69,65 μm2, met een bereik van 60,27-2664,53 μm2, verdeeld zoals weergegeven in het staafdiagram en vioolplot (figuur 5C). Circulariteit (formule: circulariteit = 4π(oppervlakte/omtrek²)), een maat die de uitsteeksel van een cel weergeeft, varieerde van 0,101-0,875, met een gemiddelde van 0,38 ± 0,15. Lagere waarden duiden op een langwerpige vorm, terwijl een waarde van 1 een perfecte cirkel aangeeft. Zoals blijkt uit de vioolplot, vertonen de meeste cellen een langwerpige vorm (figuur 5D). Een andere maat voor de celvorm is de beeldverhouding (AR), de hoofdas van de cel gedeeld door de kleine as. Een AR-waarde van 1 duidt op een symmetrische vorm23. Migrerende NCC's op dit gebied hadden een gemiddelde AR van 2,13 ± 0,11, met waarden variërend van 1,14-5,59 (figuur 5E). Met behulp van deze kwantitatieve metingen van NCC-morfologie kunnen rigoureuze vergelijkingen worden gemaakt tussen experimentele omstandigheden en verschillende gepubliceerde studies.
Figuur 4: Migrerende NCC's komen voort uit gekweekte neurale plooien. Brightfieldbeelden van vergulde neurale plooien na 3 uur incubatie (A) en 20 uur incubatie (B). Schaalbalk = 200 μm. (C,D) De neurale vouw is grotendeels verspreid na 20 uur incubatie, maar blijft aanwezig aan de rechterkant van deze beelden. Schaalbalk = 500 μm. Migrerende NCC's zijn zichtbaar met DAPI (C) en HNK-1 kleuring (D). HNK-1 immunostaining bevestigt dat gekweekte cellen migrerende NCC's zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Morfologische beoordeling van gekweekte migrerende NCC's. (A) Falloidinekleuring van filamenteus actine in NCC's migreerde na 20 uur in cultuur uit een neurale plooi. Schaalbalk = 50 μm. (B) Drempelafbeelding met cellen die zwart lijken en de achtergrond wit. Gele contouren omringen objecten die als cellen worden geteld en cellen zijn genummerd. (C-E) Grafische opties om morfologische beoordelingsgegevens weer te geven. Staafdiagrammen en vioolplots werden gemaakt van metingen van de 69 cellen in paneel B om het gebied (μm2, C), circulariteit (D) en beeldverhouding (E) van de gemeten cellen weer te geven. Staafdiagrammen tonen gemiddelde waarden met foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde aan de linkerkant van elk deelvenster vertegenwoordigen. Vioolplots werden gemaakt met app.rawgraphs.io. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven techniek biedt een aanpasbare methode om kuikenneuraalplooien te isoleren en te platen om culturen van migrerende craniale NCC's te creëren. Deze culturen bieden vereenvoudigde 2D-voorwaarden voor eenvoudige analyse van NCC-migratie en morfologie van kuikens die een aanvulling kunnen vormen op de meer technisch uitdagende ovo-beeldvormingsmethoden 24,25,26. Hoewel deze in vitro methode relatief eenvoudig is, zijn consistente resultaten afhankelijk van hoogwaardige eieren en reagentia. Bovendien vereist reproduceerbaarheid, vanwege de inherente variabiliteit van de culturen, experimentele herhaling en kwantificering.
De hechting van neurale plooien aan FN is essentieel voor NCC-migratie in cultuur. Af en toe zullen explantaten zich niet goed hechten en zal de neurale vouw wegdrijven of geen / weinig migrerende NCC's produceren. Dit kan gebeuren wanneer een schedelneuraalplooi niet met de zijkant naar beneden landt; probeer de explantaten in het kweekvat te oriënteren voorafgaand aan de incubatie en laat ze 10-15 minuten bezinken voordat ze worden verplaatst. Door vloeistofmenging tijdens de overdracht naar de incubator zullen sommige neurale plooien zich echter onvermijdelijk van tijd tot tijd suboptimaal hechten. Wanneer hechting en migratie problematisch zijn voor een heel experiment, kan dit een weerspiegeling zijn van oud FN (gebruik een verse aliquot van de -80 °C voor elk experiment), kweekmedium met verlopen componenten (bewaar media bereid in aliquots van experimentformaat bij -20 °C en voeg vers antibioticum toe op het moment van gebruik) of gebruik van coverslips die niet geschikt zijn voor celkweek (bijvoorbeeld, cellen hechten zich niet aan coverslips voor histologie). Een besmette incubator kan er ook voor zorgen dat hele NCC-kweekexperimenten mislukken.
Naast het produceren van verspreide NCC's in cultuur en het mogelijk maken van analyse van migrerende NCC-morfologie, is dit protocol ook een startpunt voor vele andere experimenten. Explantaten die op coverslips zijn geplaatst, kunnen ook worden verwerkt voor immunofluorescentie (na sectie 7, stap 3) om de subcellulaire lokalisatie van een eiwit van belang te bepalen7. Hoewel analyse van morfologie en migratieafstand mogelijk is in vaste culturen, zoals hier beschreven, maakt time-lapse beeldvorming van NCC's tijdens cultuurincubatie (sectie 6, stap 5) aanvullende gegevensverzameling mogelijk over directionaliteit en persistentie van migratie en dynamiek van celmotiliteit (metingen van membraanuitsteeksel, adhesie, enz.) 14,24,27. Voorbijgaande genetische manipulatie van embryo's kan worden bereikt door elektroporatie18,28 van reagentia (morfolineos29, DNA-expressieconstructen of CRISPR-vectoren30) in Hamburger en Hamilton stadium 4+17. Deze geëlektropoleerde embryo's kunnen vervolgens in het protocol worden gebruikt om migrerende NCC-culturen te creëren met functieverlies of overexpressie van interessante genen. Functionele analyse kan ook worden bereikt door chemische remmers toe te voegen aan de media van NCC-culturen 7,27 (rubriek 6, stap 2). Populatieniveau profilering van NCC's door middel van -omics-niveau analyses vereist de verzameling van NCC's als grondstof 7,11,31. Hoewel markers zijn gebruikt om NCC's te isoleren door fluorescentie-geactiveerde celsortering31, vereist dit gespecialiseerde flowcytometrieapparatuur en enzymatische dissociatie van cellen. Het volgen van de hier beschreven methoden om dorsale neurale plooien zorgvuldig te verwijderen (het minimaliseren van de verzameling van de ventrale neurale buis en niet-neurale ectodermcellen) biedt een goedkope methode om premigratory NCCs11 te verzamelen (sectie 5, stap 4). Het verzamelen van NCC's na verspreiding in cultuur (sectie 6, stap 5) levert een relatief zuivere populatie van natuurlijk gescheiden, migrerende NCC's op voor verdere analyse (HNK-1-kleuring, een marker van migrerende NCC's, in de meerderheid van gekweekte cellen in figuur 4D; zoals in7). Ten slotte kunnen deze variaties in combinatie worden gebruikt. Immunofluorescentie of time-lapse beeldvorming kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de effecten van genexpressiemanipulaties of de toevoeging van remmers te evalueren27. Over het algemeen biedt dit aanpasbare, goedkope protocol de middelen om de morfologie van wild-type craniale migrerende NCC's in cultuur te beoordelen met meerdere potentiële wijzigingen om verschillende experimentele doelen te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We bedanken Corinne A. Fairchild en Katie L. Vermillion, die hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van onze versie van het chick cranial neural fold culture protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
- Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
- McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
- Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
- Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
- Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
- Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
- Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
- Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
- Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T.
- Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
- Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
- McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
- Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
- Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
- Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).
