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Developmental Biology

चिक कपाल तंत्रिका शिखा सेल संस्कृतियों की तैयारी और रूपात्मक विश्लेषण

Published: June 27, 2022 doi: 10.3791/63799
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 2,3
1Department of Biology and Neuroscience Program, Hamline University, 2Department of Genetics, Cell Biology and Development, University of Minnesota, 3Developmental Biology Center, University of Minnesota

Summary

यह बहुमुखी प्रोटोकॉल चूजा भ्रूण से कपाल तंत्रिका सिलवटों के छांटना के माध्यम से प्रीमाइग्रेटरी तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) के अलगाव का वर्णन करता है। चढ़ाना और इनक्यूबेशन पर, प्रवासी एनसीसी तंत्रिका गुना एक्सप्लांट्स से उभरते हैं, जिससे सरलीकृत 2 डी वातावरण में सेल आकृति विज्ञान और प्रवास के आकलन की अनुमति मिलती है।

Abstract

कशेरुक विकास के दौरान, तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) बड़े पैमाने पर पलायन करती हैं और विभिन्न कोशिका प्रकारों में अंतर करती हैं जो क्रानियोफेशियल कंकाल और परिधीय तंत्रिका तंत्र जैसी संरचनाओं में योगदान करती हैं। जबकि 3 डी भ्रूण के संदर्भ में एनसीसी माइग्रेशन को समझना महत्वपूर्ण है, 2 डी संस्कृति में प्रवासी कोशिकाओं को अलग करना भ्रूण के अध्ययन के पूरक, दृश्य और कार्यात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक एनसीसी संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए चिक कपाल तंत्रिका सिलवटों को अलग करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है। प्रवासी एनसीसी एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित सब्सट्रेट पर चढ़ाया गया तंत्रिका गुना एक्सप्लांट्स से निकलते हैं। इसके परिणामस्वरूप छितरे हुए, अनुयायी एनसीसी आबादी होती है जिसका आकलन धुंधला और मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है। यह सरलीकृत संस्कृति दृष्टिकोण अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसे अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एनसीसी उत्प्रवास और प्रवासी व्यवहार का मूल्यांकन समय-चूक इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है या जीन अभिव्यक्ति (जैसे, डीएनए, मॉर्फोलिनो, या सीआरआईएसपीआर इलेक्ट्रोपोरेशन) के अवरोधकों या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ को शामिल करके कार्यात्मक रूप से पूछताछ की जा सकती है। इसकी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, यह विधि कपाल एनसीसी विकास की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करती है।

Introduction

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुक भ्रूण में एक क्षणिक कोशिका आबादी हैं। एनसीसी तंत्रिका प्लेट की सीमाओं पर निर्दिष्ट किए जाते हैं और पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूबसे पलायन करने के लिए एक उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरते हैं 1. ईएमटी के बाद, एनसीसी पूरे भ्रूण में बड़े पैमाने पर फैलते हैं, अंततः विभिन्न संरचनाओं में अंतर और योगदान देते हैं, जिसमें क्रैनियोफेशियल कंकाल, हृदय का बहिर्वाह पथ और परिधीय तंत्रिका तंत्र का बहुमतशामिल है। सेल ध्रुवीयता, साइटोस्केलेटन और आसंजन गुणों में परिवर्तन एक प्रीमाइग्रेटरी से प्रवासी सेल आबादी में इस बदलाव को रेखांकित करता है3. एनसीसी ईएमटी और माइग्रेशन का अध्ययन सेल गतिशीलता के मौलिक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और जन्म दोषों और कैंसर मेटास्टेसिस को रोकने और इलाज के प्रयासों को सूचित करता है।

जबकि विवो विश्लेषण भ्रूण के संदर्भ में एनसीसी विकास प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, इन विट्रो विधियां दृश्य और भौतिक पहुंच प्रदान करती हैं जो अतिरिक्त प्रयोगात्मक मार्गों की सुविधा प्रदान करती हैं। एक सरलीकृत 2 डी वातावरण में, एनसीसी आकृति विज्ञान, साइटोस्केलेटल संरचनाएं और पलायन की दूरी का मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, गतिशील एनसीसी के प्रवासी व्यवहार पर आनुवंशिक या घुलनशील कारक गड़बड़ी के प्रभावों का विश्लेषण 4,5,6,7,8,9,10 किया जा सकता है। इसके अलावा, पृथक प्रीमिग्रेटरी या प्रवासी एनसीसी को प्रोटिओमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग 7,11 के माध्यम से एनसीसी के विकासात्मक विनियमन का अध्ययन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट पद्धतियों के लिए एकत्र, पूल और उपयोग किया जा सकता है। जबकि विभिन्न विकासात्मक मॉडल जीवों 12,13,14 से कपाल एनसीसी तैयार करने के तरीके उपलब्ध हैं, यह लेख उन लोगों के लिए दृष्टिकोण के यांत्रिकी को प्रदर्शित करता है जो पहले चिकी भ्रूण से कपाल एनसीसी संस्कृति सीखते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल लड़की कपाल एनसीसी संस्कृतियों (चित्रा 1) तैयार करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक का वर्णन करता है। क्योंकि एनसीसी एक संस्कृति सब्सट्रेट पर प्रत्यारोपित तंत्रिका सिलवटों से आसानी से पलायन करते हैं, चूजा एनसीसी स्वाभाविक रूप से भ्रूण के ऊतकों से अलग हो जाते हैं, और प्राथमिक संस्कृतियां आसानी से उत्पन्न होती हैं। जैसा कि मिडब्रेन एनसीसी कपाल तंत्रिका सिलवटों (ट्रंक15 में लंबे, सेल-बाय-सेल डेलेमिनेशन के विपरीत) से बड़े पैमाने पर पलायन करते हैं, इन संस्कृतियों में मुख्य रूप से प्रवासी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं, प्रारंभिक तंत्रिका गुना छांटना प्रीमाइग्रेटरी एनसीसी के लिए एक संग्रह विधि प्रदान करता है। चिक कपाल तंत्रिका सिलवटों को विच्छेदन और संवर्धन के लिए एक बुनियादी विधि विस्तृत है, और इस विधि पर विभिन्न अनुप्रयोगों और विविधताओं के लिए सुझाव दिए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: लड़की कपाल तंत्रिका गुना संस्कृति प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन (ए, बी) कपाल तंत्रिका सिलवटों (नीले रंग में उल्लिखित) पांच सोमाइट्स (ए में पृष्ठीय दृश्य में दिखाया गया है) के साथ एक लड़की भ्रूण से उत्पादित कर रहे हैं। ग्रे बैंड, कार्डियक अर्धचंद्र। (सी) जब फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया जाता है, तो प्रवासी तंत्रिका शिखा कोशिकाएं तंत्रिका सिलवटों से निकलती हैं और सब्सट्रेट पर फैल जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

गैलस गैलस नस्लों की किसी भी किस्म का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें व्हाइट लेगहॉर्न, गोल्डन सेक्स लिंक या रोड आइलैंड रेड शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चिकन अंडे विभिन्न नस्लों के थे और स्थानीय खेतों और हैचरी सहित कई स्रोतों से प्राप्त किए गए थे।

1. समाधान और सामग्री की तैयारी

  1. 123.3 एमएम एनएसीएल, 1.53 एमएम सीएसीएल 2, 4.96 एमएमकेसीएल, 0.809 एमएम ना2एचपीओ 4, और 0.147 एमएम केएच2पीओ4 को मिलाकर रिंगर का समाधान तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)। पीएच को 7.4 में समायोजित करें और 100 एमएल बोतलों में फ़िल्टर निष्फल करें। एक साफ, शुष्क स्थान पर स्टोर करें। बोतलों को साबुन से न धोएं (टिशू कल्चर कांच के बने पदार्थ के रूप में इलाज करें)।
  2. एमएल स्टॉक समाधान फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) ( सामग्री की तालिका देखें) बाँझ रिंगर के समाधान में एफएन को भंग करके तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 4 वर्षों के लिए स्थिर) पर 100 μL विभाज्य में स्टोर करें।
  3. स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% एफबीएस, और 10% चूजा भ्रूण निकालने12 के साथ एल 15 मीडिया को पूरक करके पूर्ण संस्कृति मीडिया तैयार करें। 3 एमएल विभाज्य बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि संस्कृतियों को सीओ2 इनक्यूबेटर में ऊष्मायन किया जाता है, तो डीएमईएम / एफ 12 को एल 15 के लिए प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होती है, जिसे हवा के लिए बफर किया जाता है।
  4. 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान तैयार करें। पीएच को 7.4 में समायोजित करें। 10 एमएल विभाज्य बनाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड को एक धूआं हुड में संभाला जाना चाहिए।
  5. फिल्टर पेपर समर्थन फ्रेम तैयार करें (लंबी धुरी पर अतिव्यापी दो या तीन छिद्रित छेद के साथ कागज के लगभग 1 सेमी x 1.5 सेमी आयत)।
    1. एक मानक तीन-छेद पंच का उपयोग करके फिल्टर पेपर के एक बड़े टुकड़े के किनारे के साथ पंच छेद, छिद्रित किनारे को एक पट्टी में काट / ट्रिम करें, और फिर छेद के बीच की पट्टी को आयतों में काटें ~ लंबाई में 1.5 सेमी। उपयोग करने से पहले आटोक्लेव फ़िल्टर पेपर (वैकल्पिक)।
  6. ठीक संदंश (# 5), कुंद संदंश, विच्छेदन कैंची, वसंत कैंची, और तेज टंगस्टन सुइयों सहित विच्छेदन उपकरण इकट्ठा16.

2. भ्रूण इनक्यूबेशन

  1. ऊपर वर्णित किसी भी स्रोत से निषेचित अंडे प्राप्त करें।
  2. निषेचित अंडे को 38 डिग्री सेल्सियस (100 डिग्री फ़ारेनहाइट) पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर के अंदर एक ईमानदार स्थिति (नुकीले अंत के साथ अंडे के ऊर्ध्वाधर की लंबी धुरी नीचे /
  3. चार से सात सोमाइट्स बनने तक सेते हैं (चरण 8 +-9)17, जिसमें लगभग 35 घंटे लगते हैं।
    नोट: इनक्यूबेशन समय तनाव, मुर्गियों की उम्र, मौसम, आदि के आधार पर काफी भिन्न हो सकता है, और प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रोग्राम करने योग्य आउटलेट टाइमर वांछित समय प्राप्त करने के लिए रात के दौरान इनक्यूबेशन शुरू करने के लिए उपयोगी होते हैं।
  4. इनक्यूबेटर से हटाने के बाद, 70% इथेनॉल के साथ अंडे को अच्छी तरह से स्प्रे करें और उन्हें गोले कीटाणुरहित करने के लिए सूखने दें।
    नोट: भ्रूण तुरंत एकत्र किया जा सकता है, लेकिन अंडे को कमरे के तापमान पर ठंडा करने से संग्रह के दौरान जर्दी और भ्रूण के नुकसान की नाजुकता कम हो जाती है।

3. संस्कृति व्यंजनों की तैयारी

  1. डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए उपयुक्त तंत्रिका गुना संस्कृति व्यंजन ( सामग्री की तालिका देखें) का चयन करें।
    1. संस्कृतियों के लिए जो तय और सना हुआ होगा, बहु-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति व्यंजनों में रखे ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करें।
      नोट: अच्छी तरह से आकार से मेल खाने वाले कवरलिप्स द्रव मिश्रण के साथ कम स्थानांतरित हो जाएंगे, जिससे एक्सप्लांट्स को शिफ्ट होने की संभावना कम हो जाएगी और डिश तल के बजाय कवरस्लिप का पालन करने की अधिक संभावना होगी।
    2. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ लाइव इमेजिंग के लिए ग्लास-बॉटम सिंगल चैंबर या विभाजित चैंबर व्यंजन ( सामग्री की तालिका देखें) का चयन करें।
    3. एक ईमानदार या स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर लाइव इमेजिंग के लिए, 6-, 12-, या 24-अच्छी तरह से ऑप्टिकली उपयुक्त टिशू कल्चर प्लेटों का उपयोग करें।
    4. उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए प्रवासी तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर संग्रह के लिए प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन का चयन करें।
  2. बाँझ रिंगर के समाधान की 100 मिलीलीटर की बोतल में पेनिसिलिन के 10 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μg / एमएल जोड़ें (उदाहरण के लिए, रिंगर के पी / एस बनाने के लिए 10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन के 100 μL और 10,000 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन)। 1 सप्ताह के भीतर रिंगर के पी / एस का उपयोग करें।
  3. बर्फ पर एफएन के 1 मिलीग्राम / एमएल के विभाज्य को पिघलाएं। एफएन के 10-100 μg / एमएल की एकाग्रता के लिए रिंगर के पी / एस के साथ पतला।
  4. कुएं या पकवान के तल को कवर करने के लिए पर्याप्त एफएन समाधान पिपेट करें। उदाहरण के लिए, 24-अच्छी तरह से प्लेट में 100 μL प्रति अच्छी तरह से, 35 मिमी पकवान के लिए 500 μL।
  5. तंत्रिका सिलवटों को विच्छेदन करते समय कम से कम 1 घंटे के लिए 38 डिग्री सेल्सियस (100 डिग्री फारेनहाइट) पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर (या आसुत जल-लथपथ पेपर तौलिए के साथ एक कवर ट्रे) में एफएन समाधान के साथ ढक्कन और व्यंजन या प्लेटों को बदलें।

4. लड़की भ्रूण का अलगाव

  1. अंडे के अभिविन्यास को बनाए रखने के लिए ध्यान रखें (भ्रूण इनक्यूबेशन के दौरान जर्दी के शीर्ष पर तैरता है)। खोल में एक छोटे से छेद को प्रहार करने के लिए कैंची या कुंद संदंश का उपयोग करें, अंडे की लंबाई के बारे में 1/4-1/3।
    1. ध्यान से छोटे छेद में कैंची या कुंद संदंश की नोक डालें, जर्दी को बाधित नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें, और अंडे के चारों ओर अंडे के छिलके के माध्यम से कटौती करें, अंडे के छिलके (चित्रा 2 ए) के शीर्ष को हटा दें।
  2. अलगाव के लिए भ्रूण की स्थिति।
    नोट: यदि भ्रूण आदर्श रूप से खोल कप में स्थित नहीं है, तो ध्यान से जर्दी बारी करने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें, तो भ्रूण शीर्ष पर है। वैकल्पिक रूप से, जर्दी को एक दस्ताने, कप किए गए हाथ में डालें, जर्दी को तोड़ने के लिए सावधान रहें और एल्बुमिन को दूर करने की अनुमति दें (चित्रा 2 बी)। फिर, जर्दी को हाथ से हाथ में ले जाकर भ्रूण को तैनात किया जा सकता है।
  3. भ्रूण (चित्रा 2 सी) को कवर जर्दी की सतह पर बनी हुई किसी भी अतिरिक्त एल्बुमिन को मिटाने के लिए बंद कुंद संदंश के फ्लैट किनारे का धीरे-धीरे उपयोग करके भ्रूण तैयार करें। एक नाजुक कार्य वाइपर के साथ कोमल दबाव का उपयोग करके अतिरिक्त एल्बुमिन को भी हटाया जा सकता है।
    नोट: एक बार एल्बुमिन को साफ करने के बाद, जर्दी की सतह चिकनी के बजाय बनावट दिखाई देनी चाहिए। पर्याप्त एल्बुमिन को मिटाने में विफलता धारा 4, चरण 4 में फिल्टर पेपर समर्थन के आसंजन को बाधित करेगी।
  4. फ्रेम की खिड़की में भ्रूण के साथ, भ्रूण पर एक फिल्टर पेपर समर्थन फ्रेम रखने के लिए संदंश का प्रयोग करें। जर्दी पर पालन करने के लिए फिल्टर पेपर पर धीरे-धीरे दबाएं।
  5. विच्छेदन कैंची (चित्रा 2 डी) के साथ फिल्टर पेपर फ्रेम के बाहर चारों ओर कटौती। फ्रेम के किनारे को समझने के लिए संदंश या कैंची युक्तियों का प्रयोग करें और धीरे जर्दी (चित्रा 2 ई) से भ्रूण दूर लिफ्ट। एक कोण पर दूर उठाने से भ्रूण को जर्दी से साफ करने में मदद मिलेगी।
  6. एस (चित्रा 2 एफ) से भरे 60 मिमी या 100 मिमी पेट्री डिश में पेपर फ्रेम साइड डाउन (भ्रूण वेंट्रल साइड अप) के साथ भ्रूण रखें। आरएनए- या प्रोटीन-संवेदनशील डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए इकट्ठा होने पर भ्रूण के पकवान को बर्फ पर रखें।
    नोट: भ्रूण उदर पक्ष रखने में विफलता उन्हें अपने पेपर फ्रेम से अलग करने का जोखिम उठाती है। तंत्रिका गुना विच्छेदन चरणों में जाने से पहले कई भ्रूणों को 1 घंटे तक रिंगर के पी / एस में एकत्र और संग्रहीत किया जा सकता है।

5. विदारक तंत्रिका सिलवटों

  1. एस समाधान युक्त एक साफ पकवान के लिए एक भ्रूण स्थानांतरण और संदंश के साथ फिल्टर पेपर फ्रेम पकड़कर भ्रूण कुल्ला और धीरे से भ्रूण के दृश्य को अस्पष्ट है कि दूर किसी भी जर्दी को साफ करने के लिए आगे और पीछे स्विंग। रिंगर के पी / एस का आदान-प्रदान करें या एक ताजा पकवान में स्थानांतरित करें यदि यह बादल बन जाता है।
  2. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण पृष्ठीय/फ्रेम पक्ष की स्थिति। कागज फ्रेम पर भ्रूण को छोड़कर इसे तना हुआ और जगह में आयोजित रखने के लिए, तंत्रिका सिलवटों को उजागर करने के लिए संदंश का उपयोग करके विटेलिन झिल्ली को हटा दें।
    नोट: यदि भ्रूण पेपर फ्रेम से गिरता है, तो इसे डिश में फ्लैट रखा जा सकता है या विच्छेदन के लिए एक सिल्गार्ड लेपित डिश18 पर पिन किया जा सकता है।
  3. वसंत कैंची या एक तेज टंगस्टन सुई का उपयोग करके, मिडब्रेन तंत्रिका सिलवटों को सावधानीपूर्वक उत्पादित करें। विस्तारित ऑप्टिक पुटिकाओं के लिए ऊतक दुम और हिंडब्रेन के लिए रोस्ट्रल शामिल करें, जहां रोम्बोमेर कसना अभी दिखाई देने लगा है (कार्डियक अर्धचंद्र भी एक उपयोगी संकेतक है, चित्रा 3 बी, सी)। न्यूनतम दूषित तंत्रिका ट्यूब और गैर तंत्रिका एक्टोडर्म (चित्रा 3 सी) के साथ तंत्रिका गुना के पृष्ठीय-सबसे पहलू का उपयोग करने के लिए ध्यान रखें।
  4. पी 20 पिपेटर या एक बाँझ, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके रिंगर के पी / एस युक्त एक साफ पकवान में तंत्रिका सिलवटों को स्थानांतरित करें जर्दी रिंगर के पी / एस के साथ कुल्ला (यह ऊतक को चिपकने से रोकने के लिए प्लास्टिक या ग्लास को अवरुद्ध करता है)। अतिरिक्त सिलवटों को विच्छेदन करते समय बर्फ पर एकत्रित सिलवटों को स्टोर करें।

6. चढ़ाना तंत्रिका सिलवटों

  1. पूर्ण संस्कृति मीडिया (अनुभाग 1, चरण 3) का एक विभाज्य पिघलना। पेनिसिलिन के 100 यू / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / एमएल जोड़ें और फ़िल्टर निष्फल करें। अन्य चरणों का प्रदर्शन करते समय 37-38 डिग्री सेल्सियस पर तैयार मीडिया रखें।
  2. इनक्यूबेटर से संस्कृति व्यंजन निकालें (धारा 3, चरण 5)। एक पिपेटर या पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, कवरलिप्स, व्यंजन या कुओं से एफएन समाधान को हटा दें। एस के साथ एफएन-लेपित सब्सट्रेट को धोने के बाद, व्यंजनों या कुओं में पूर्ण संस्कृति मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें (24-अच्छी तरह से प्लेट में कुओं के लिए 500 μL, 35 मिमी डिश या छह-अच्छी तरह से प्लेट के लिए 2 एमएल)।
    नोट: छोटी मात्रा महंगे अभिकर्मकों को संरक्षित कर सकती है (उदाहरण के लिए, 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए 200 μL जितना कम) लेकिन यह सुनिश्चित करें कि वाष्पीकरण से बचने के लिए पकवान पर्याप्त रूप से आर्द्र है।
  3. एक पी 20 या पी 200 पिपेटर का उपयोग करके, सबसे पहले, प्लास्टिक को अवरुद्ध करने और ऊतक को चिपकने से रोकने के लिए जर्दी रिंगर के पी / एस के साथ पिपेट टिप कुल्ला। फिर, एफएन लेपित कवरलिप्स पर पृथक तंत्रिका सिलवटों को स्थानांतरित करें, जितना संभव हो उतना कम रिंगर के पी / एफएन-लेपित कवरस्लिप के केंद्र की ओर गुना (ओं) को रखें।
    नोट: एक या कुछ तंत्रिका सिलवटों को 19 मिमी अच्छी तरह से 12 मिमी कवरस्लिप पर चढ़ाया जा सकता है, 35 मिमी प्लेट पर 50 तक।
  4. एक्सप्लांट्स को 10-15 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति देने के बाद, उन्हें धीरे-धीरे और सावधानीपूर्वक मढ़वाया तंत्रिका सिलवटों के साथ संस्कृति व्यंजनों को ले जाकर 38 डिग्री सेल्सियस (100 डिग्री फ़ारेनहाइट) पर एक आर्द्र कक्ष में रखें। यह कुओं में तंत्रिका सिलवटों के स्थानांतरण को कम करेगा, यह सुनिश्चित करेगा कि वे बिखरे रहें और किसी भी कवरलिप्स का पालन करें।
    नोट: एल 15 (डीएमईएम नहीं) का उपयोग करते समय, एक्सप्लांट संस्कृति व्यंजनों को सिक्त पेपर तौलिए के साथ एक कवर ट्रे का उपयोग करके अंडे के इनक्यूबेटर में भी इनक्यूबेट किया जा सकता है।
  5. सक्रिय प्रवास की अवधि के लिए आर्द्र इनक्यूबेटर में तंत्रिका गुना संस्कृतियों सेते हैं (लगभग 16-20 घंटे कुल, चित्रा 4)।

7. रूपात्मक विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत प्रवासी एनसीसी का फिक्सिंग और धुंधला होना

  1. एक पाश्चर पिपेट के साथ संस्कृति मीडिया निकालें और फिल्टर निष्फल 1x पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें।
    नोट: निर्धारण समय प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। अधिक नाजुक सेलुलर संरचनाओं को बनाए रखने के लिए 10 मिनट (50:50) के लिए सीधे मीडिया में पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ना, हटाना और 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ बदलना भी संभव है।
  3. पैराफॉर्मलडिहाइड निकालें और 1एक्स पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला।
  4. रूपात्मक मूल्यांकन के लिए एक उपयुक्त डाई के साथ दाग तय एनसीसी। एक उदाहरण के रूप में, ओरेगन ग्रीन संयुग्मित फालोइडिन के साथ धुंधला होना यहां विस्तृत है।
    नोट: फालोइडिन19 के साथ एक्टिन साइटोस्केलेटन की कल्पना अपेक्षाकृत समान धुंधला तीव्रता के साथ प्रवासी एनसीसी की संरचनात्मक जटिलता को प्रकट करती है; हालाँकि, फालोइडिन सभी सेल क्षेत्रों को उजागर नहीं कर सकता है। प्लाज्मा झिल्ली (जैसे, गेहूं के रोगाणु एग्लूटिनिन या डीआईआई) या साइटोप्लाज्म को लेबल करने वाले रंगों का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उज्ज्वल धुंधला कोशिका शरीर के सापेक्ष ठीक फलाव की इमेजिंग को जटिल बनाते हैं। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस को एचएनके -1 के साथ तंत्रिका शिखा कोशिकाओं को लेबल करने या ब्याज 7,20 के प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए समवर्ती रूप से किया जा सकता है।
    1. अंतिम पीबीएस कुल्ला निकालें और पीबीएस + 0.5% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) + 5% सीरम (एफबीएस या एंटीबॉडी के साथ कॉस्टेनिंग के लिए उपयुक्त किसी अन्य जानवर से) कवर्लिप्स को कवर करने और कमरे के तापमान पर एक मंच शेकर पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. ओरेगन ग्रीन संयुग्मित फालोइडिन के पिपेट 200 एनएम (पीबीएसटी + 5% सीरम में पतला) प्रत्येक कवरस्लिप के लिए एक चिकनी सतह (जैसे लचीली पैराफिन सीलिंग फिल्म) पर। एक 12 मिमी कवरस्लिप के लिए, पिपेट एक 30 μL मात्रा।
    3. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके, पीबीएसटी + 5% सीरम से कवरस्लिप को हटा दें, ऊपर की ओर सामना करने वाली कोशिकाओं के अभिविन्यास को बनाए रखना सुनिश्चित करें। अतिरिक्त तरल को बंद करने के लिए एक नाजुक कार्य वाइपर के लिए कवरस्लिप के किनारे को संक्षेप में स्पर्श करें।
    4. धीरे-धीरे प्रत्येक कवरस्लिप सेल पक्ष को पतला फालोइडिन की बूंद पर रखें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। धुंधला होने के दौरान कवरलिप्स को अंधेरे में रखें (एल्यूमीनियम पन्नी से ढके पकवान के साथ कवर करें या दराज में रखें)।
    5. इनक्यूबेशन दौरान, संस्कृति पकवान के कुओं में पीबीएसटी जोड़ें (24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए पीबीएसटी के 750 μL)।
    6. इनक्यूबेशन अवधि के बाद, धुंधला समाधान से कवरलिप्स उठाएं और उन्हें संस्कृति पकवान में वापस रखें, कवरस्लिप को फ्लिप करें ताकि सेल पक्ष ऊपर हो। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप पीबीएसटी के साथ कवर किया गया है और कवरलिप्स को कवर और अंधेरे में रखते हुए, 10 मिनट के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म शेकर पर रखें। पीबीएसटी निकालें और कुल तीन 10 मिनट धोने के लिए, इस चरण को दो बार दोहराएं।
    7. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते मीडिया (सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद (प्रति कवरस्लिप) रखें। 25 μL वॉल्यूम 12 मिमी कवरस्लिप के लिए अच्छी तरह से काम करता है।
    8. पीबीएसटी के साथ अंतिम धोने के बाद, कवरस्लिप के सेल पक्ष का ट्रैक रखते हुए, अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक नाजुक कार्य वाइपर में कवरस्लिप के किनारे को स्पर्श करें।
    9. बुलबुले बनाने से बचने के लिए बढ़ते मीडिया पर एक कोण पर कवरस्लिप को धीरे-धीरे कम करके कवरस्लिप सेल साइड को माउंट करें। इमेजिंग से पहले मीडिया को सेट करने की अनुमति दें।

8. सुसंस्कृत प्रवासी एनसीसी का रूपात्मक मूल्यांकन

  1. छवि दाग कोशिकाओं और .tiff फ़ाइलों के रूप में निर्यात।
    नोट: इमेजिंग संस्कृतियों के लिए एक 40x उद्देश्य अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन रूपात्मक मूल्यांकन के लिए छवियों को इकट्ठा करने के लिए 10x (प्रवासी एनसीसी के पूरे क्षेत्र को कैप्चर करने के लिए) से 100x (एकल एनसीसी) तक के उद्देश्यों का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में छवियों को एक उल्टे मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके कैप्चर किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. छवियों को एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में अपलोड करें (इमेजजे21, सामग्री की तालिका देखें)। विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए प्रत्येक छवि की दूसरी प्रति लिपि बनाने के लिए छवि > डुप्लिकेट पर क्लिक करें, इस प्रकार मूल असंपादित छोड़ दें, क्योंकि अधिकांश छवि प्रसंस्करण को उलट नहीं किया जा सकता है।
  3. छवि पर क्लिक करें > चमक /कंट्रास्ट > समायोजित करें और छवियों की चमक या विपरीत समायोजित करने के लिए स्लाइडिंग बार का उपयोग करें।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए छवियों को ग्रेस्केल में कनवर्ट करें।
    1. यदि छवियों को आरजीबी में निर्यात किया जाता है, तो वे आरजीबी में एक मर्ज किए गए चैनल के रूप में अपलोड करेंगे। छवियों को अलग करने के लिए, एकल-चैनल ग्रेस्केल छवियों को प्राप्त करने के लिए छवि > रंग > स्प्लिट चैनल पर क्लिक करें।
    2. यदि छवियाँ पहले से ही अलग हैं, तो फ़ाइल को ग्रेस्केल में कनवर्ट करने > लिए छवि > टाइप > 8-बिट पर जाएँ।
  5. छवि पर क्लिक करें > बाइनरी छवि में परिवर्तित करने के लिए > थ्रेसहोल्ड समायोजित करें जहां पिक्सेल को कोशिकाओं (अग्रभूमि; काला) या पृष्ठभूमि (सफेद) के रूप में पहचाना जाता है। स्लाइडिंग बार का उपयोग करें और / या थ्रेशोल्ड सेटिंग का चयन करने के लिए ऑटो पर क्लिक करें जो पृष्ठभूमि से कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से परिभाषित करता है।
    1. यदि कोशिकाएं अतिव्यापी हैं या धुंधला निरंतर नहीं है, तो वाटरशेड या फिल होल्सफ़ंक्शंस 22 का उपयोग करके आगे की प्रक्रिया करना आवश्यक हो सकता है। यह कोशिकाओं को एक दूसरे से अलग करेगा या विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं के भीतर अंतराल को भर देगा। प्रक्रिया > बाइनरी पर क्लिक करें > पहले छवि को 8-बिट बाइनरी प्रारूप में परिवर्तित करने के लिए बाइनरी बनाएं। फिर प्रोसेस > बाइनरी > वाटरशेड या फिल होल्स पर क्लिक करें।
      नोट: सॉफ़्टवेयर अपने सबसे अच्छे फिट बना देगा जहां संकेतों को अलग करने या भरने की आवश्यकता होती है, जिसे यदि आवश्यक हो तो प्लग-इन का उपयोग करके आगे समायोजित किया जा सकता है।
  6. कैप्चर किए जाने वाले मापों का चयन करें। विश्लेषण > सेट माप पर क्लिक करें और परिपत्रता (सर्क), पहलू अनुपात (एआर), गोलाई (गोल), और दृढ़ता के विश्लेषण के लिए आकार वर्णनकर्ता बक्से की जांच करें।
    नोट: अन्य माप भी शामिल किया जा सकता है, जैसे क्षेत्र और परिधि, आवश्यक विश्लेषण के प्रकार के आधार पर।
  7. विश्लेषण > विश्लेषण कणों पर क्लिक करें, और "कणों का विश्लेषण करें" मेनू से पैरामीटर सेट करें।
    1. "आकार" के तहत, मोटे तौर पर अनुमान लगाएं कि पिक्सेल में रुचि की कोशिकाएं या कण कितने बड़े हैं, पृष्ठभूमि सिग्नल या छोटे सेल मलबे को भी शामिल किया जाएगा यदि आकार पैरामीटर 0-इन्फिनिटी पर सेट रहता है (उदाहरण के लिए, चित्रा 5 में 500-इन्फिनिटी के रूप में सेट)।
      नोट: आकार को एक तंग सीमा में समायोजित करना विश्लेषण के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में छोटे या बड़े कणों को बाहर कर सकता है।
    2. "परिपत्रता" के तहत, छवि में सभी सेल आकृतियों को मापने के लिए 0-1.0 पर छोड़ दें।
    3. "दिखाएँ" के तहत, " कणों का विश्लेषण करें" फ़ंक्शन के साथ चयनित सेल रूपरेखा का निरीक्षण करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू से नंगे रूपरेखा का चयन करें। यह सुनिश्चित करने के लिए रूपरेखा स्कैन करें कि अतिव्यापी कोशिकाएं प्रतिष्ठित हैं, लेकिन कोशिकाओं को अनावश्यक रूप से विभाजित नहीं किया गया है। साथ ही, "प्रदर्शन परिणाम", "सारांशित करें", और "प्रबंधक में जोड़ें" के लिए मेनू बॉक्स की जाँच करें।
  8. एक बार जब सभी पैरामीटर सेट हो जाते हैं, तो ओके पर क्लिक करें।
    नोट: चार अलग-अलग खिड़कियां पॉप अप होंगी, (1) छवि में पहचानी गई कोशिकाओं की नंगे रूपरेखा, (2) छवि में गिनी जाने वाली कोशिकाएं, (3) प्रत्येक सेल के माप के परिणाम, और (4) गिनी गई कोशिकाओं की कुल संख्या और उनके औसत माप का सारांश।
    1. यदि मलबे की गिनती की गई थी, तो अतिव्यापी कोशिकाओं को एक के रूप में गिना जाता था, एकल कोशिकाओं को गुणकों के रूप में गिना जाता था, या कई कोशिकाओं को गिनती से छोड़ दिया जाता था, मूल, असंपादित छवि पर वापस जाते हैं, एक और डुप्लिकेट बनाते हैं, और "थ्रेसहोल्ड" या अन्य मापदंडों को समायोजित करते हैं।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। इनक्यूबेटेड अंडे खोले गए थे, और जर्दी, सतह पर भ्रूण के साथ, धीरे-धीरे एक दस्ताने वाले हाथ (चित्रा 2 ए, बी) की हथेली में डालकर अलग किया गया था। एल्बुमिन (चित्रा 2 सी) को साफ़ करने के बाद, फिल्टर पेपर फ्रेम भ्रूण के चारों ओर जर्दी झिल्ली पर लागू किए गए थे ताकि जर्दी से भ्रूण को काटने और उठाने की सुविधा मिल सके, जो जर्दी झिल्ली काटने के बाद फैलना शुरू हो जाता है (चित्रा 2 डी, ई)।

Figure 2
चित्रा 2: चार से सात सोमाइट लड़की भ्रूण का अलगाव। निषेचित अंडे 35 घंटे के लिए ऊष्मायन किया गया था। एक अंडा कुंद संदंश (ए) के साथ खोला गया था, और जर्दी को एक दस्ताने वाले हाथ (बी) में डाला गया था। अतिरिक्त एल्बुमिन को हटा दिया गया था (सी) ताकि एक फिल्टर पेपर समर्थन (डी, इनसेट) जर्दी का पालन करेगा। भ्रूण को जर्दी (डी) से काट दिया गया था, उठाया गया था (ई), और रिंगर के पी / एस (एफ) में रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

भ्रूण को धोने और रिंगर के पी / एस को साफ करने के लिए आगे बढ़ने के बाद, तंत्रिका सिलवटों पृथक भ्रूण (चित्रा 3 ए) में दिखाई दे रहे थे। इन सिलवटों में प्रीमाइग्रेटरी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं। एक बार एक भ्रूण (चित्रा 3 बी, सी) से उत्पादित और एकत्र (चित्रा 3 डी), प्रवासी एनसीसी संस्कृतियों बनाने के लिए पृथक तंत्रिका सिलवटों चढ़ाया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: लड़की पृष्ठीय तंत्रिका सिलवटों का विच्छेदन। रिंगर के पी / एस में काम करते हुए, वसंत कैंची का उपयोग तंत्रिका सिलवटों को उत्पादित करने के लिए किया गया था। (ए) भ्रूण पृष्ठीय दृश्य, आकृति के शीर्ष की ओर पूर्वकाल। तंत्रिका सिलवटें आसपास के ऊतकों की तुलना में अधिक अपारदर्शी दिखाई देती हैं। मिडब्रेन तंत्रिका सिलवटें ऑप्टिक लोब (गुलाबी) के पीछे और कार्डियक अर्धचंद्र (पीले) के पूर्वकाल में होती हैं। (बी) तंत्रिका सिलवटों को हटाने के बाद भ्रूण का पृष्ठीय दृश्य, छांटना सीमाओं को दर्शाता है। (सी) तंत्रिका सिलवटों के साथ भ्रूण के पार्श्व दृश्य को हटा दिया। विच्छेदन तकनीक पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब को हटा देती है, उदर और गैर-तंत्रिका ट्यूब संरचनाओं से बचती है। (डी) रिंगर के पी /एस स्केल बार = 300 μm में पृथक तंत्रिका सिलवटों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जब तंत्रिका सिलवटों एफएन पर चढ़ाया गया था, एनसीसी इनक्यूबेशन (चित्रा 4 ए) के 3-4 घंटे के भीतर अनुयायी तंत्रिका गुना एक्सप्लांट्स से उभरने लगे, और माइग्रेशन लगभग 20 घंटे (चित्रा 4 बी) के बाद पूरा हो गया था। एचएनके -1 धुंधला, जो प्रवासी एनसीसी20 को लेबल करता है, संस्कृति (चित्रा 4 डी) में अधिकांश कोशिकाओं में स्पष्ट था। एक नकारात्मक परिणाम तब हुआ जब तंत्रिका सिलवटें कवरस्लिप का पालन करने में विफल रहीं, या एक्सप्लांट से कोई एनसीसी नहीं आया (डेटा नहीं दिखाया गया)। एनसीसी का विश्लेषण संस्कृतियों को ठीक करके, फिलामेंटस एक्टिन के लिए धुंधला करके, और एनसीसी आकृति विज्ञान और माइग्रेशन (चित्रा 5) का मूल्यांकन करने के लिए इमेजजे में विभिन्न माप करके किया गया था। विश्लेषण किए गए 69 कोशिकाओं का औसत क्षेत्र 802.11 ± 69.65 μm 2 था, जिसमें 60.27-2664.53 μm2 की सीमा थी, जैसा कि बार ग्राफ और वायलिन प्लॉट (चित्रा 5 सी) में दिखाया गया है। वृत्ताकारता (सूत्र: वृत्ताकारता = 4π (क्षेत्रफल/परिधि²)), एक माप जो किसी कोशिका की फलावता को दर्शाता है, 0.101-0.875 से लेकर 0.38 ± 0.15 के औसत के साथ। निचले मान एक लम्बी आकृति को इंगित करते हैं, जबकि 1 का मान एक परिपूर्ण वृत्त को इंगित करता है। जैसा कि वायलिन प्लॉट में स्पष्ट है, अधिकांश कोशिकाएं एक लम्बी आकृति (चित्रा 5 डी) प्रदर्शित करती हैं। सेल आकार का एक अन्य उपाय पहलू अनुपात (एआर) है, जो मामूली अक्ष द्वारा विभाजित सेल का प्रमुख अक्ष है। 1 का एआर मान एक सममित आकार23 को इंगित करता है। इस क्षेत्र में प्रवासी एनसीसी में 2.13 ± 0.11 का औसत एआर था, जिसमें 1.14-5.59 (चित्रा 5 ई) से लेकर मान थे। एनसीसी आकृति विज्ञान के इन मात्रात्मक उपायों का उपयोग करके, प्रयोगात्मक स्थितियों और विभिन्न प्रकाशित अध्ययनों के बीच कठोर तुलना की जा सकती है।

Figure 4
चित्रा 4: प्रवासी एनसीसी सुसंस्कृत तंत्रिका सिलवटों से उभरते हैं। इनक्यूबेशन (ए) के 3 घंटे और इनक्यूबेशन (बी) के 20 घंटे के बाद मढ़वाया तंत्रिका सिलवटों की ब्राइटफील्ड छवियां। स्केल बार = 200 μm। (सी, डी) तंत्रिका गुना काफी हद तक इनक्यूबेशन के 20 घंटे के बाद बिखरा हुआ है लेकिन अवशिष्ट रूप से इन छवियों के दाईं ओर मौजूद है। स्केल बार = 500 μm। प्रवासी एनसीसी डीएपीआई (सी) और एचएनके -1 धुंधला (डी) के साथ दिखाई देते हैं। एचएनके -1 इम्यूनोस्टेनिंग पुष्टि करता है कि सुसंस्कृत कोशिकाएं प्रवासी एनसीसी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: सुसंस्कृत प्रवासी एनसीसी का रूपात्मक मूल्यांकन। (ए) एनसीसी में फिलामेंटस एक्टिन का फालोइडिन धुंधला संस्कृति में 20 घंटे के बाद एक तंत्रिका गुना से स्थानांतरित हो गया। स्केल बार = 50 μm। (बी) काले और पृष्ठभूमि सफेद दिखाई देने वाली कोशिकाओं के साथ थ्रेसहोल्ड छवि। पीली रूपरेखा कोशिकाओं के रूप में गिनी जाने वाली वस्तुओं को घेरती है, और कोशिकाओं को गिना जाता है। (सी-ई) रूपात्मक मूल्यांकन डेटा प्रदर्शित करने के लिए ग्राफिंग विकल्प। बार रेखांकन और वायलिन भूखंडों को मापा कोशिकाओं के क्षेत्र (μm2, C), परिपत्रता (डी), और पहलू अनुपात (ई) को चित्रित करने के लिए पैनल बी में दिखाए गए 69 कोशिकाओं के माप से बनाया गया था। बार ग्राफ़ प्रत्येक पैनल के बाईं ओर माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि सलाखों के साथ औसत मान दिखाते हैं। वायलिन भूखंडों को app.rawgraphs.io के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित तकनीक चिक तंत्रिका सिलवटों को अलग करने और प्रवासी कपाल एनसीसी की संस्कृतियों को बनाने के लिए उन्हें चढ़ाने की एक अनुकूलनीय विधि प्रदान करती है। ये संस्कृतियां चूजा एनसीसी माइग्रेशन और आकृति विज्ञान के आसान विश्लेषण के लिए सरलीकृत 2 डी स्थितियां प्रदान करती हैं जो ओवो इमेजिंग विधियों24,25,26 में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पूरक हो सकती हैं। हालांकि यह इन विट्रो विधि अपेक्षाकृत सरल है, लगातार परिणाम उच्च गुणवत्ता वाले अंडे और अभिकर्मकों पर निर्भर करते हैं। इसके अलावा, संस्कृतियों की अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के कारण, प्रजनन क्षमता के लिए प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति और मात्रा की आवश्यकता होती है।

संस्कृति में एनसीसी प्रवास के लिए एफएन के लिए तंत्रिका सिलवटों का आसंजन आवश्यक है। कभी-कभी, एक्सप्लांट ठीक से पालन नहीं करेंगे, और तंत्रिका गुना या तो तैर जाएगा या कुछ प्रवासी एनसीसी का उत्पादन नहीं करेगा। यह तब हो सकता है जब एक कपाल तंत्रिका गुना कट साइड को नहीं उतरता है; इनक्यूबेशन से पहले संस्कृति पोत में एक्सप्लांट्स को उन्मुख करने की कोशिश करें और उन्हें स्थानांतरित करने से पहले 10-15 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। हालांकि, इनक्यूबेटर में स्थानांतरण के दौरान द्रव मिश्रण के कारण, कुछ तंत्रिका सिलवटें अनिवार्य रूप से समय-समय पर उप-इष्टतम रूप से पालन करेंगी। जब आसंजन और माइग्रेशन एक पूरे प्रयोग के लिए समस्याग्रस्त होते हैं, तो यह पुराने एफएन को प्रतिबिंबित कर सकता है (प्रत्येक प्रयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से एक ताजा विभाज्य का उपयोग करें), समाप्त घटकों के साथ संस्कृति माध्यम (-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग के आकार के विभाज्य में तैयार मीडिया स्टोर करें और उपयोग के समय ताजा एंटीबायोटिक जोड़ें) या सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त नहीं कवरलिप्स का उपयोग (उदाहरण के लिए, कोशिकाएं ऊतक विज्ञान के लिए कवरलिप्स का पालन नहीं करेंगी)। एक दूषित इनक्यूबेटर भी पूरे एनसीसी संस्कृति प्रयोगों को विफल करने का कारण बन सकता है।

संस्कृति में बिखरे हुए एनसीसी का उत्पादन करने और प्रवासी एनसीसी आकृति विज्ञान के विश्लेषण की अनुमति देने के अलावा, यह प्रोटोकॉल कई अन्य प्रयोगों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु भी है। ब्याज 7 के प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए कवरलिप्स पर चढ़ाया गया एक्सप्लांट्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (धारा 7, चरण 3 के बाद) के लिए भी संसाधितकिया जा सकता है। जबकि आकृति विज्ञान और माइग्रेशन दूरी का विश्लेषण निश्चित संस्कृतियों में संभव है, जैसा कि यहां वर्णित है, संस्कृति इनक्यूबेशन (धारा 6, चरण 5) के दौरान एनसीसी की समय-चूक इमेजिंग दिशात्मकता और माइग्रेशन की दृढ़ता और सेल गतिशीलता की गतिशीलता पर अतिरिक्त डेटा संग्रह की अनुमति देती है (झिल्ली फलाव, आसंजन, आदि का माप) 14,24,27. हैमबर्गर और हैमिल्टन चरण 4 +17 में अभिकर्मकों (मॉर्फोलिनोस 29, डीएनए अभिव्यक्ति निर्माण, या सीआरआईएसपीआर वैक्टर30) के इलेक्ट्रोपोरेशन 18,28 द्वारा भ्रूण के क्षणिक आनुवंशिक हेरफेर को प्राप्त किया जा सकता है। इन इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूणों का उपयोग प्रोटोकॉल में प्रवासी एनसीसी संस्कृतियों को हानि-ऑफ-फ़ंक्शन या ब्याज के जीन के ओवरएक्सप्रेशन के साथ बनाने के लिए किया जा सकता है। कार्यात्मक विश्लेषण एनसीसी संस्कृतियों7,27 (धारा 6, चरण 2) के मीडिया में रासायनिक अवरोधकों को जोड़कर भी प्राप्त किया जा सकता है। ओमिक्स स्तर के विश्लेषण के माध्यम से एनसीसी की जनसंख्या-स्तरीय प्रोफाइलिंग के लिए कच्चे माल के रूप में एनसीसी के संग्रह की आवश्यकता होती है। जबकि मार्करों का उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग31 के माध्यम से एनसीसी को अलग करने के लिए किया गया है, इसके लिए विशेष प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण और कोशिकाओं के एंजाइमी पृथक्करण की आवश्यकता होती है। पृष्ठीय तंत्रिका सिलवटों को सावधानीपूर्वक उत्पादित करने के लिए यहां वर्णित विधियों का पालन करना (उदर तंत्रिका ट्यूब और गैर-तंत्रिका एक्टोडर्म कोशिकाओं के संग्रह को कम करना) प्रीमाइग्रेटरी एनसीसी11 (धारा 5, चरण 4) एकत्र करने के लिए एक सस्ती विधि प्रदान करता है। संस्कृति में फैलाव के बाद एनसीसी एकत्र करना (धारा 6, चरण 5) आगे के विश्लेषण के लिए स्वाभाविक रूप से अलग, प्रवासी एनसीसी की अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी की आपूर्ति करता है (एचएनके -1 धुंधला, प्रवासी एनसीसी का एक मार्कर, चित्रा 4 डी में सुसंस्कृत कोशिकाओं के बहुमत में;जैसा कि 7 में है)। अंत में, इन विविधताओं का उपयोग संयोजन में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस या समय-चूक इमेजिंग का उपयोग जीन अभिव्यक्ति जोड़तोड़ के प्रभावों या अवरोधकोंके अलावा 27 का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह अनुकूलनीय, सस्ती प्रोटोकॉल विभिन्न प्रयोगात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए कई संभावित संशोधनों के साथ संस्कृति में जंगली प्रकार के कपाल प्रवासी एनसीसी की आकृति विज्ञान का आकलन करने के साधन प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम कोरिन ए फेयरचाइल्ड और केटी एल वर्मिलियन को धन्यवाद देते हैं, जिन्होंने चिक कपाल तंत्रिका गुना संस्कृति प्रोटोकॉल के हमारे संस्करण को विकसित करने में भाग लिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software  Zeiss Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl2 Sigma-Aldrich C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided) MatTek; Cell Vis P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis)
X000NOK1OJ (Cellvis)		 Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass Carolina Biological Supply Company 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter 
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Alternative for L15 media
Egg incubator Sportsman 1502
FBS  Life Technologies 10437-028
Fibronectin Fisher Scientific CB-40008A
Filter paper Whatman grade 3MM chromatography
Forceps (blunt) Fisher Scientific; Thomas Scientific 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine) Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Image J https://fiji.sc/ Free image analysis software
KCl Sigma-Aldrich P3911
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
L15 media Invitrogen 11415064
L-glutamine Invitrogen 25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) Vector Laboratories; Thermofisher Scientific H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9638
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140-148 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes VWR (or similar) 60 mm, 100 mm
Phalloidin Sigma-Aldrich P1951 multiple flurophores available
Pin holder Fine Science Tools 26016-12 For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection) Fine Science Tools 14061-10
Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard Krayden Sylgard 184
Syringe Filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes Sarstedt 83-3900 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Tungsten wire Variety of sources 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

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References

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Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).

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